نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.
2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی.
چکیده
در این مطالعه، برهمکنش بین آلبومین سرم انسانی (HSA) با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (CuO) با استفاده از روش طیفسنجی فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک بررسی گردید. نتایج نشان داد که در حضور این نانوذره، نشر فلورسانس ذاتی پروتئین کاهش مییابد که با غلظت نانوذره در محیط هماهنگ است. بر اساس نتایج مربوط به ثابت سرعت خاموشی (Kq) چنین استنباط میشود که مکانیسم برهمکنش از نوع پایا (Static) است. پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی (H°∆) و آنتروپی (S°∆) میانکنش بین نانوذره با HSA بترتیب 06/18- (KJ mol-1) و 0195/0 (KJ mol-1 K) محاسبه گردید که نشان دهنده نقش مهم میانکنشهای الکتروستاتیک در این اتصال میباشد. در این میانکنش، علامت منفی مربوط به تغییرات انرژی آزاد (G°∆) بیانگر انرژیزا بودن واکنش و تمایل این ذره به اتصال با HSA میباشد. همچنین افزایش نشر فلورسانس ANS در حضور نانوذره بیانگر افزایش هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین میباشد. بر اساس نتایج بدست آمده چنین استنباط میشود که ساختار HSA در حضور این نانوذره دچار تغییر شده که می-تواند بر عملکرد آن نیز تاثیر گذارد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Study of the CuO nanoparticles interaction with human serum albumin using fluorescence technique
چکیده [English]
In this study, interaction between human serum albumin and CuO nanoparticle (NP) at different concentrations was studied using fluorescence method under the simulative physiological condition. The results showed the intrinsic fluorescence reduced in the presence of the NP as the manner increase NP concentration in media. According to the results of quenching rate constant (Kq), it deduced that the interaction take place through static mechanism. Thermodynamic parameters including enthalpy and entropy were calculated as -18.06 (KJ mol-1) and 0.0195 (KJ mol-1 K) respectively, which shows the importance of electrostatic interaction in HAS and NP interaction. Affinity of this particle to HAS deduced as the negative sign of free energy (∆G°) that shows the interaction is exergonic process. Evaluation of ANS fluorescence intensity indicated that hydrophobicity of the surface protein increased in the presence of the NP. Based on the results it established, the protein structure chnaged in the presence of NP which may be affected its function.
کلیدواژهها [English]
مطالعه میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سرم انسانی با استفاده از تکنیک فلورسانس
علی ریاحی مدوار1* و علیرضا قاسمی نسب2
1کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.
2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 31/5/95 تاریخ پذیرش: 21/9/95
چکیده
در این مطالعه، برهمکنش بین آلبومین سرم انسانی (HSA) با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (CuO) با استفاده از روش طیف سنجی فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک بررسی گردید. نتایج نشان داد که در حضور این نانوذره، نشر فلورسانس ذاتی پروتئین کاهش مییابد که با غلظت نانوذره در محیط هماهنگ است. بر اساس نتایج مربوط به ثابت سرعت خاموشی (Kq) چنین استنباط میشود که مکانیسم برهمکنش از نوع پایا (Static) است. پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی (H°∆) و آنتروپی (S°∆) میانکنش بین نانوذره با HSA به ترتیب 06/18- (KJ mol-1)و 0195/0 (KJ mol-1 K) محاسبه گردید که نشان دهنده نقش مهم میانکنشهای الکتروستاتیک در این اتصال میباشد. در این میانکنش، علامت منفی مربوط به تغییرات انرژی آزاد (G°∆) بیانگر انرژیزا بودن واکنش و تمایل این ذره به اتصال با HSA میباشد. همچنین افزایش نشر فلورسانس ANS در حضور نانوذره بیانگر افزایش هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین میباشد. بر اساس نتایج به دست آمده چنین استنباط میشود که ساختار HSA در حضور این نانوذره دچار تغییر شده که میتواند بر عملکرد آن نیز تأثیر گذارد.
واژههای کلیدی: آلبومن سرم انسانی، خاموشی، فلورسانس، نانو ذره اکسید مس.
* نویسنده مسئول، تلفن: 03433776611، پست الکترونیکی: riahi.ali@gmail.com
مقدمه
علم نانوتکنولوژی به ساختار و عملکرد مواد و ترکیباتی میپردازد که حداقل یکی از ابعاد عملکردی آنها بین 1 تا 100 نانومتر باشد (4) .استفاده از نانوذرات به دلیل ویژگیهای منحصر بهفرد آنها، که خود ناشی از اندازه و ابعاد آنهاست، به طور روز افزون در حال افزایش است (26). تاکنون سمیت نانوذرات برای ردههای سلولی پستانداران (7)، خرچنگها (5)، ماهیها (14)، گیاهان (20) و موشها (38) گزارش شده است. مطالعات مختلف حاکی از اثرات مضر و زیانبار ترکیبات نانویی مختلف همچون نانولولههای کربنی و اکسید تیتانیوم بر روی سلولهای جانوری در محیط آزمایشگاه و همچنین بر اندامهای مختلف بدن جانوران از قبیل ریه میباشد (10 و 20). همچنین، پتانسیل ایجاد خطر توسط نانوذرات برای سلامتی انسان، به دلیل سمیتی که بر سلولهای ریه (34) و سلولهای قرمز خون (28) نشان دادند، را دارا میباشند.
نانوذرات فلزی با سطح ویژه بالا و واکنشپذیری سطحی بالا، نه تنها میتواند به تنهایی توسط تماس فیزیکی معمولی جذب شوند بلکه میتوانند با پروتئینهای زیستی میانکنش دهند و توسط سلولها جذب گردند (32). درک بهتر رابطه متقابل نانوذرات و سلولهای زنده میتواند منجر به پیشرفت در درک دریافتها، تواناییهای تشخیصی و درمانی جدید از قبیل دارورسانی هدفمند، ژن درمانی و تشخیص سلاحهای بیولوژیک شود (24). سریم اکسید در مقیاس نانو میتواند با سرم آلبومین گاوی واکنش دهد و توسط سلولهای سرطانی ریه جذب شود (23). اخیراً مطالعات گستردهای بر روی میانکنش نانوذرات با پروتئینها انجام شده است (6، 25،29 و 37).
آلبومین سرم انسانی (HSA) پروتئینی کروی با 585 اسیدآمینه، جزء فراوانترین پروتئین موجود در پلاسمای خون است و حدود 80 درصد فشار اسمزی خون را تأمین مینماید (21). این پروتئین با دارا بودن سه جایگاه اتصال اختصاصی (I، II و III) که هر کدام از آنها دارای دو زیر دُمین A و B میباشند (8 و 11)، نقش مهمی در انتقال و پخش داروها در خون دارد (8). تحقیقات زیادی بر روی میانکنش بین HSA و مولکولهای دارویی با استفاده از تکنیک فلورسانس انجام شده است (9 و 18). میانکنش بین یک مشتق آکریدین (Acridine) و HSA با استفاده از مطالعات اسپکتروفتومتری فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک، نشان داد که این میانکنش از طریق مکانیسم پایا و با استفاده از پیوندهای هیدروژنی و میانکنشهای هیدروفوب انجام میگیرد (9). اساساً در اتصال لیگاند به پروتئین چهار نوع میانکنش غیرکوالانسی شامل پیوندهای هیدروژنی، نیروی واندروالسی، میانکنشهای هیدروفوبی و الکتروستاتیک میتواند دخیل باشند. از روی علامت و بزرگی پارامترهای ترمودینامیکی (آنتالپی و آنتروپی) میتوان به نوع نیروی دخیل در میانکنشهای لیگاند- پروتئین در یک واکنش پیبرد. Ross و Subramanian (27) علامت و اهمیت پارامترهای ترمودینامیکی در ارتباط با انواع مختلف میانکنشهایی که در روند اتصال به پروتئینها ممکن است رخ دهد را مشخص کردند؛ اگر آنتالپی و آنتروپی هر دو بزرگتر از صفر باشند؛ نوع میانکنش هیدروفوب میباشد. اگر هر دو پارامتر مذکور کوچکتر از صفر باشند میانکنش واندروالسی و پیوند هیدروژنی در اتصال نقش دارند و اگر آنتالپی کوچکتر از صفر و آنتروپی بزرگتر از صفر باشد، میانکنشهای الکتروستاتیک عامل اصلی اتصال میباشد. مطالعات مختلف بیانگر این است که در اتصال نانوذرات به پروتئینهای مکانیسمها و نیروهای مختلف درگیرند. به عنوان مثال،Roy و Das (29) نشان دادند که میانکنش بین نانوذرات نقره با سرم آلبومین گاوی از طریق مکانیسم پویا با استفاده از میانکنشهای هیدروفوب و الکتروستاتیک انجام میشود. در مطالعات انجام شده توسط Zhang و همکاران در سال 2015 مشخص گردید که میانکنش نانوذرات Fe2O3 با پروتئین فیبرینوژن اساساً از طریق پیوند هیدروژنی صورت میگیرد (37). همچنین مطالعات انجام شده توسط Bhogale و همکاران در سال 2014 نشان داد که میانکنش بین نانوذرات مس (با اندازه حدود 5/7 نانومتر) با سرم آلبومین گاوی از طریق مکانسیم پایا و با استفاده از میانکنشهای هیدروفوب صورت میگیرد (6).
در این مطالعه، میانکنش آلبومین سرم انسانی با غلظتهای مختلف نانوذره CuO در شرایط شبه فیزیولوژیک با استفاده از تکنیک فلورسانس مورد آنالیز قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد مورد استفاده در این تحقیق شامل سرم آلبومین انسانی (جرم مولکولی 65400 دالتون) و8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) از شرکت سیگما تهیه شدند. نمکهای فسفات شامل K2HPO4 و KH2PO4 از شرکت مرک تهیه شدند. نانوذره اکسید مس (CuO) با درصد خلوص 2/99 درصد، میانگین اندازه 60 نانومتر و مساحت سطح m2g-155 از شرکت NaBond Technology تهیه گردید.
برای اندازه گیری شدت فلورسانس از اسپکتروفلورومتر VarianCary Eclipse ساخت کشور استرالیا استفاده شد.
آمادهسازی مواد: استوک HAS با غلظت 5/0 میلیمولاردر بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار با 4/7pH= تهیه شد. همچنین استوک یک میکرومولار نانوذره اکسید مس در بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار در 4/7pH= تهیه شد. به منظور تهیه سوسپانسیون یک دست از نانوذره، استوک تهیه شده به مدت پنج دقیقه با فاصله زمانی یک دقیقه استراحت با استفاده از دستگاه سونیکاتور در یخ سونیکت گردید.
اندازهگیری شدت فلورسانس ذاتی HSA در میانکنش با نانو ذره اکسید مس: جهت مطالعه برهمکنش نانوذره اکسید مس باHSA آزمایش به این صورت انجام شد:
طول موج تحریک : 295 نانومتر، محدوده طول موج نشر: 500-300 نانومتر، سرعت اسکن (Scan Speed):500 نانومتر بر دقیقه وSlit (پهنای باند نور تابیده شده یا ثبت شده توسط دتکتور): 5 نانومتر.
در سل کوارتز یک سانتیمتری، حجم نهایی 5/2 میلیلیتر از بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار با pH برابر 4/7، پروتئین با غلظت نهایی میکرومولار و نانوذره با غلظتهای نهایی صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار اضافه شد، پس از 10 دقیقه انکوبه شدن در دمای 298 درجه کلوین طیف فلورسانس ذاتی پروتئین در طول موج تحریک 295 نانومتر ثبت گردید. علاوه بر این، فلورسانس ذاتی پروتئین در دماهای 303 و 310 درجه کلوین در حضور غلظتهای مختلف این نانو ذره اندازهگیری شد.
بررسی نوع مکانیسم میانکنش (پایایا پویا): جهت بررسی نوع مکانسیم میانکنش نانوذره با پروتئین، نمودار استرن-ولمر مربوط به هر یک از دماها، بر حسب شدت فلورسانس در طول موج 340 نانومتر و غلظت نانوذره (نانومولار) ترسیم گردید. پس از به دست آوردن معادله خط مربوط به نمودار، ثابتهای خاموشی بر اساس معادله 1 محاسبه گردید.
معادله 1
در این معادله؛ F0 و F به ترتیب شدتهای فلورسانس پروتئین در عدم حضور و حضور خاموش کننده، kq؛ ثابت سرعت خاموشی پروتئین،KSV؛ ثابت نمودار استرن- ولمر (عکس مولار بر ثانیه)، [Q]؛ غلظت خاموش کننده برحسب مولار میباشند (13، 18). متوسط نیمه عمر پروتئین بدون خاموش کننده (5 نانوثانیه) (35) میباشد. برای محاسبه مقدارkq از معادله 2 استفاده شد.
معادله 2
بر اساس معادله 3 میتوان ثابت اتصال و تعداد جایگاههای اتصال پروتئین برای یک لیگاند را محاسبه نمود.
معادله 3
در این معادله F0 و F به ترتیب شدتهای فلورسانس در عدم حضور و حضور خاموش کننده، Ka؛ ثابت اتصال برحسب مولار و n؛ تعداد جایگاههای اتصالی پروتئین برای هر لیگاند میباشد (16).
تعیین پارامترهای ترمودینامیکی: جهت تعیین نیروهای دخیل در میانکنش پروتئین با نانوذره، پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی و آنتروپی با استفاده از معادله 4 محاسبه شدند.
معادله 4
در این معادله؛ K: ثابت استرن ولمر در دماهای مختلف برحسب عکس مولار، DH0: تغییرات آنتالپی استاندارد واکنش بر حسب کالری بر مول بر درجه کلوین، DS0: تغییرات آنتروپی استاندارد واکنش بر حسب (مول.کلوین بر ژول) وR: ثابت گازها (مول.کلوین بر ژول) است (9، 30).
مقدار تغییرات انرژی آزاد گیبس استاندارد (کیلوکالری بر مول) از معادله 5 محاسبه گردید.
معادله 5
اندازهگیری فلورسانس ANS: فلورسانس ANS در غلظت پروتئینی یک میکرومولار و غلظت 30 میکرومولار ANS در بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار با 4/7 pH= در حضور و عدم حضور نانوذره ( 2 نانومولار) با شرایط زیر انجام شد.
طول موج تحریک : 350 نانومتر، محدوده طول موج نشر: 400-600 نانومتر، سرعت اسکن: 500 نانومتر بر دقیقه،Slit (پهنای باند نور تابیده شده یا ثبت شده توسط دتکتور): 5 نانومتر.
نتایج
تغییرات فلورسانس ذاتی HSAدر حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس: همان طور که در شکل 1 قابل مشاهده است، با افزایش غلظت نانوذره در محیط شدت فلورسانس در طول موج تحریکی 295 نانومتر کاهش یافته است. نتایج به دست آمده از معادله استرن-ولمر در طول موج نشری 340 نانومتر بر حسب غلظتهای مختلف نانوذره نشان میدهد که میزان خاموش شدگی نشر فلورسانس با غلظت نانوذره تقریباً رابطه خطی داشته و هماهنگ با افزایش غلظت نانو ذره در محیط میزان نشر نیز کاهش مییابد (شکل 2).
شکل1- اثر غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) بر طیف نشری فلورسانس ذاتیHSA در طول موج تحریکی 295 نانومتر (دمای 298 درجه کلوین، بافر فسفات 50 میلیمولار و 4/7pH=).
شکل 2- نمودار استرن-ولمر برهمکنش غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) با HSA (طول موج نشر: 345 نانومتر، بافر پتاسیم فسفات 50 میلیمولار، 4/7pH= و دمای 298 درجه کلوین).
فلورسانس ذاتی HSA در حضور نانو ذره اکسید مس در دماهای 298، 303 و 310 درجه کلوین: تأثیر دما بر میانکنش پروتئین با نانوذره اکسید مس، با اندازهگیری شدت فلورسانس ذاتی HSA در طول موج 295 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت. همانند آنچه در شکل 1 مشاهده میگردد، در دماهای بالاتر نیز با افزایش غلظت نانوذره در محیط شدت فلورسانس کاهش یافت. از مقایسه نمودارهای استرن-ولمر به دست آمده درطول موج نشری 340 نانومتر، مشاهده میگردد که با افزایش دما، میزان کاهش شدت فلورسانس کمتر شده است (شکل 3).
شکل 3- مقایسه نمودار استرن-ولمر برهمکنش پروتئین HSA با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) در دماهای 280 درجه کلوین (♦)، 303 درجه کلوین (¡) و 310 درجه کلوین (▲).
تعیین نوع میانکنش HSA و نانوذره اکسید مس: ثابت خاموشی استرن-ولمر (Ksv) و ثابت سرعت خاموشی فلورسانس (Kq) از روی معادله خط مربوط به هریک از نمودارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف در جدول 1 نشان داده شده است. همان طور که در جدول قابل مشاهده است هر دو ثابت خاموشی و ثابت سرعت با افزایش دما کاهش یافته است.
جدول 1- ثابتهای خاموشی میانکنش HSA با نانوذره اکسید مس
Kq (1х1017L mol-1 s-1) |
Ksv (1х109 L mol-1) |
دما (کلوین) |
8/8 |
4/4 |
298 |
8/6 |
4/3 |
303 |
6/4 |
3/2 |
310 |
تعیین پارامترهای ترمودینامیکی در میانکنش HSA و نانوذره اکسید مس: با استفاده از معادله خط به دست آمد از نمودار وانتهوف (شکل 4)، و بر اساس معادله 4، آنتالپی و آنتروپی میانکنش نانوذره اکسید آهن با HSA محاسبه گردید (جدول 2). همان طور که در جدول قابل مشاهده است علامت H∆ منفی و علامت S∆ مثبت میباشد.
از طرف دیگر بر اساس معادله 5، مقدار تغییرات انرژی آزاد برای این میانکنش در دماهای مختلف محاسبه گردید. همان طور که در جدول 2 مشاهده میگردد علامت این پارامتر منفی بوده و با افزایش دما افزایش یافته است.
شکل 4- نمودار وانتهوف مربوط به میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سوم انسانی.
جدول 2- پارامترهای ترمودینامیکی میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سوم انسانی
∆S )kJ mol-1 K) |
∆H )kJ mol-1) |
G∆ )kJ mol-1) |
(کلوین) دما |
0195/0 |
06/18- |
87/23- |
298 |
96/23- |
303 |
||
1/24- |
310 |
تعیین ثابت اتصال و جایگاههای اتصال نانوذره بر روی HSA: مقادیر Ka و n برای برهمکنش نانوذره اکسید مس به پروتئین سرم آلبومین انسانی در جدول 3 نشان داده شده است. همان طور که در جدول مشاهده می گردد با افزایش دما ثابت اتصال و همچنین n افزایش مییابد (به استثنای n در دمای 310 درجه کلوین که نسبت به دمای 303 درجه کاهش نشان میدهد).
جدول 3 -ثابت اتصال و تعداد جایگاه برای نانوذره اکسید مس با HSA
n |
Ka (1х109 M-1) |
(کلوین) دما |
442/0 |
63/9 |
298 |
794/0 |
18/21 |
303 |
720/0 |
98/27 |
310 |
فلورسانس ANS در حضور و عدم حضور نانو ذره اکسید مس: همان طور که در شکل 5 مشاهده میگردد شدت فلورسانس ANS در حضور پروتئین HAS نسبت به ANS به تنهایی افزایش یافته است. همین طور، نشر این فلوروفور در حضورپروتئین میانکنش داده با نانوذره نسبت به پروتئین تنها بیشتر شده است.
شکل 5- فلورسانس ANS به تنهایی، در حضور HSA و در حضور HSA ترکیب شده با نانوذره اکسید مس.
بحث
اگرچه نانوفناوری دارای مزایا و پتانسیلهای زیادی است اما سمیت ناشی از باقیماندههای نانو ذرات یک نگرانی بزرگ است (22). آلبومین فراوانترین پروتئین در پلاسما است که نقشهای فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی مختلفی دارد. این پروتئین نقش مهمی در انتقال و پخش داروهای موجود در خون دارد (8). نظر به اینکه، غیر از داروها، مولکولهای دیگر نیز امکان اتصال به این پروتئین را دارند، مطالعه اتصال مولکولهای کوچک به این پروتئین اهمیت زیادی دارد (9). تولید و استفاده بیش از حد نانوذرات منجر به راهیابی این ذرات به اکوسیستمهای مختلف میشود و این در حالی است که از سرنوشت این ذرات پس از ورود به اکوسیستم اطلاعات کامل و جامعی در دست نیست (22). مطالعات انجام شده توسط امجدی و همکاران نشان داد که نانواکسید مس علاوه بر مهار رشد باکتری اشریشیاکلی باعث تغییر توالی DNA آن در برخی نقاط میشود (1).
تکنیک فلورسانس به دلیل حساسیت و دقت یک ابزار قدرتمند جهت مطالعه برهمکنش مولکولهای کوچک با پروتئینها به حساب میآید (33). در ساختار HSA یک مولکول تریپتوفان در موقعیت 214 وجود دارد که فلورسانس ذاتی آن به لیگاندهای پیوند شدة مجاور حساس است (15).
همان طور که در نتایج مشاهده میگردد با افزایش غلظت نانوذره در محیط، شدت فلورسانس ذاتی پروتئین HSA (در طول موج 295 ناتومتر) در دمای 298 درجه کلوین کاهش یافته است (شکل 1). کاهش نشر فلورسانس ذاتی این پروتئین (مربوط به تریپتوفان) در حضور نانوذرات طلا نیز گزارش شده است (31). از نمودار استرن-ولمر مربوط به طیف فلورسانس ذاتی پروتئین چنین استنباط میشود که بین خاموشی فلورسانس با غلظت نانوذره تقریباً رابطه خطی وجود دارد. همچنین رابطه مشابهی بین میزان خاموشی و غلظت نانوذره در دماهای بالاتر (303 و 310 درجه کلوین) نیز مشاهده گردید.
نتایج منتشر شده توسط Huang و همکاران در سال 2015 نشان داد که خاموشی فلورسانس HSA توسط کوانتوم دات CdTe:Zn2+ تابعی از غلظت بوده و با افزایش غلظت کوانتم دات میزان نشر فلورسانس ذاتی تریپتوفان کاهش مییابد (16). این مشاهدات با نتایج به دست آمده در این تحقیق مطابقت دارد. بر اساس نمودار استرن-ولمر مربوط به خاموشی فلورسانس در دماهای مختلف (شکل 3) چنین مشاهده میشود که با افزایش دما شیب نمودار مربوطه کاهش مییابد. به عبارت دیگر، با افزایش دما، میزان خاموشی فلورسانس ذاتی مربوط به تریپتوفان در حضور غلظتهای مختلف نانوذره به صورت تابعی از غلظت نانو ذره کاهش مییابد.
پارامترهای مربوط به ثابت خاموشی شامل Ksv و Kq که از معادله خط مربوط به هر یک از نمودارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف به دست آمد نشان داد که با افزایش دما از 298 درجه کلوین به 310 درجه کلوین این پارامترها کاهش مییابند (جدول 1). نتایج مشابهی در اتصال کوانتوم دات CdTe:Zn2+ به HSA توسط Huang و همکاران گزارش شد. آنها کاهش این پارامترها را به مکانسیم پایا میانکنش بین کوانتوم دات و HSA مرتبط دانستند (16). از طرف دیگر، با توجه به اینکه ثابت سرعت خاموشی (Kq) در تمامی دماها از ثابت سرعت (maximum diffusion rate constant) یا Kq مربوط به این مولکول زیستی (2.0×1010L mol-1 s-1) بیشتر است پیشنهاد میشود که خاموشی فلورسانس HSA از طریق مکانسیم پایا انجام میشود (9، 12، 16 و 18). علامت منفی مربوط به مقدار انرژی آزاد شده (G∆) و علامت مثبت تغییرات آنتروپی (DS) در میانکنش HSA با این نانوذره، بیانگر خود به خودی بودن واکنش میباشد (16).
بر اساس ثابت مربوط به نموارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف (9)، پارامترهای ترمودینامیکی از روی معادله خط مربوط به نمودار وانتهوف محاسبه شدند (جدول 2). همان طور که در جدول نشان داده شده است، آنتالپی کوچکتر از صفر و آنتروپی بزرگتر از صفر میباشد، بنابراین نتیجهگیری میشود که میانکنشهای الکتروستاتیک عامل اصلی اتصال نانوذره با پروتئین میباشند (27). این نتایج با نتایج منتشر شده توسط Huang و همکاران در سال 2015 مطابقت دارد. آنها نشان دادند که اتصال این پروتئین با کوانتوم دات CdTe:Zn2+ از طریق میانکنشهای الکتروستاتیک صورت میگیرد (16). در حالی که مطالعات Rabbani و همکاران نشان داد که میانکنش اتصال نانوذرات اکسید مس با آنزیم بتا گالاکتوزیداز از طریق پیوند هیدروژنی و نیروهای واندروالس انجام می شود (25). به نظر میرسد که نوع مکانسیم اتصال و نیروهای دخیل در اتصال تابعی از اندازه، غلظت و همچنین ماهیت نانوذره در محیط باشد.
مطالعات انجام شده توسط ایرانفر و همکاران نشان داند که با تغییر اندازه نانوذره نقره در محیط رفتارهای متفاوتی رخ میدهد، به طوری که با افزایش اندازه نانوذره نقره در حضور Ciprofloxacin، ثابت سرعت خاموشی و همچنین ثابت معادله استرن-ولمر افزایش مییابد. آنها نتیجه گرفتند که نانوذرات با ابعاد مختلف عملکردهای متفاوتی در محلول پروتئینی دارد که میتواند با لایههای مختلف آبپوشی اطراف آنها مرتبط باشد (17).
ANS یک فلوروفور هیدروفوب است که پس از اتصال به محیطهای هیدروفوب نشر آن افزایش مییابد (3 و 34). همان طور که در نتایج نشان داده شده است نشر این فلوروفور پس از اتصال به پروتئین متصل شده به نانوذره نسبت به پروتئین میانکنش نداده افزایش یافته است. این مشاهدات با نتایج منتشر شده توسط Sen و همکاران مغایرت دارد. آنها مشاهده کردند طیف نشری فلورسانس ANS در پروتئین متصل شده به نانوذرات طلا نسبت به پروتئین متصل نشده به نانوذره کمتر است (31). افزایش نشر فلورسانس این فلوروفور، نشان دهنده این واقعیت است که میزان هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین در اثر میانکنش با این ذره افزایش یافته است که با نتایج به دست آمده از طیف فلورسانس ذاتی در حضور غلظتهای مختلف نانوذره همخوانی دارد. تغییر ساختار HSA پس از اتصال به نانوذرات طلا توسط Sen و همکاران در سال 2011 گزارش شده است. آنها مشاهده کردند که در حضور نانوذرات طلا میزان آلفا هلیکس ساختار پروتئین HAS کاهش مییابد (31). از طرف دیگر، مطالعات انجام شده توسط شارقی و همکاران نشان داد که نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن بر پایداری آنزیم پپسین تأثیر ندارد (2).
در مجموع این مشاهدات بیانگر تغییر ساختار پروتئین پس از اتصال به نانوذره اکسید مس میباشد که میتواند عملکرد آن را تحت تأثیر قرار دهد. لذا مهم است که جنبههای محیطی، سلامتی و ایمنی در مراحل ابتدایی استفاده از نانومواد درنظر گرفته شود (5).
تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت مالی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته با قررداد شماره 4031/1 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام میدارند.