نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته دکتری گروه بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا همدان
2 عضو هیات علمی گروه بیوشیمی و معاون پژوهشی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان
3 عضو هیات علمی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان هرمزگان
4 مدیر کل دفتر برنامه ریزی و پژوهشی وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
5 عضو هیات علمی گروه بیوتکنولوژی دانشگاه بوعلی سینا همدان
چکیده
بیماری دیابت نوع دو، ناشی از اختلال در عملکرد و ترشح انسولین و به دنبال آن افزایش میزان قند خون است که به سومین عامل مرگ و میر در جهان تبدیل شدهاست. مشتقات فعال اکسیژن از جمله عوامل آسیب و مرگ برنامهریزی شده سلولی و دیابت می-باشند. اثرات جانبی مخرب مصرف داروهای سنتزی بر بیماران، تحقیقات را به سمت داروهای طبیعی متمایل کردهاست. در این تحقیق، فعالیت آنتیدیابتی و آنتیاکسیدانی سه عصاره متانولی، اتیلاستاتی و انهگزانی دو گونه ماکروجلبک Palisada perforata و Sargassum angostifolium بررسی شدهاست. نمونههای جلبک پس از جمعآوری از سواحل خلیجفارس و آمادهسازی، به روش پرکولاسیون عصارهگیری شدند. فعالیت مهارکنندگی آنزیم آلفاآمیلاز غلظتهای مختلف نمونهها بر اساس روش DNS و ظرفیت آنتیاکسیدانی آنها نیز براساس دو روش تخریب رادیکال آزاد ABTS+ و احیاکنندگی FRAP بررسی شد. عصاره اتیلاستات S. angostifolium و P. perforata به ترتیب بیشترین و کمترین فعالیت بازدارندگی آنزیم آلفا آمیلاز را نشان دادند (P<0.05). همچنین بالاترین ظرفیت آنتیاکسیدانی پاکسازی +ABTS و احیاکنندگی FRAP به ترتیب در نمونه-های اتیلاستات S. angostifoliumو P. perforata مشاهده شد (P<0.05). به طورکلی عصارههای قطبی و نیمه قطبی در هر دو گونه فعالیت آنتیاکسیدانی بالاتری را نسبت به عصاره غیرقطبی آن گونه نشان دادند و گونه S. angostifolium بالاترین فعالیت را برای هر دو سنجش مهار آنزیم آلفاآمیلاز و تخریب رادیکال آزاد ABTS+ نشان داد. دو گونه جلبک خوراکی مورد تحقیق با نشان دادن فعالیت قابل توجه آنتیدیابتی و آنتیاکسیدانی، با تحقیقات تکمیلی دارای پتانسیل کاربرد مستقیم در رژیم غذایی و همچنین استفاده در صنایع پزشکی و داروسازی میباشند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evaluation of antioxidant and a-amylase inhibitory activity of two species Sargassum angostifolium and Palisada perforata
نویسندگان [English]
1 Bu Ali sina University
4 Bu Ali Sina University
5 Bu Ali Sina University
چکیده [English]
Type2 Diabetes mellitus is a metabolic disorder characterized by hyperglycemia that results from deficiency of insulin secretion, becoming the third leading cause of death in the world. Reactive oxygen species result in extensive oxidative damage that in turn leads to serious damages in the cells including apoptosis and diabetic. Considering to side effect of synthetic medicines, there has been increased interest in using of natural medicines. In the present investigation, in vitro antioxidant and antidiabetic activity of methanolic, ethyl acetate and n-hexane extracts of two macroalgae species Sargassum angostifolium and Palisada perforata from the Persian Gulf were analyzed. Algae samples collected from Persian Gulf coasts were extracted by Percolation method. -amylase inhibition activity of samples was analyzed using the DNSA method and also their antioxidant activity was analyzed using the ABTS radical scavenging and FRAP reducing activity methods. The ethyl acetate extracts of S. angostifolium and P. perforata showed the highest and lowest enzyme inhibition activity, respectively (P<0.05). Also the highest ABTS+ scavenging and FRAP reducing were observed in the ethyl acetate extracts of S. angostifolium and P. perforata, respectively (P<0.05). Generally, polar and semi polar extracts of two macroalgae species significantly showed the higher antioxidant activity comparing to their nonpolar extracts. Also S. angostifolium exhibited the highest activity in both free radical scavenging and -amylase inhibition assays. However, enzyme inhibition and antioxidant activity of two edible studied algae revealed that these macroalgae species can be used directly in human diet and also indirectly in medical and pharmaceutical application.
کلیدواژهها [English]
ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی و مهار آنزیم آلفا آمیلاز دو گونه
Sargassum angustifolium و Palisada perforata
کیانا پیریان1، سهیلا معین2*، جلوه سهرابیپور3، رضا ربیعی3 و خسرو پیری1
1 همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی گیاهی
2 بندرعباس، دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان، دانشکده پزشکی، گروه بیوشیمی و مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی
3 بندرعباس، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان هرمزگان،بخش گیاه پزشکی
تاریخ دریافت: 21/2/95 تاریخ پذیرش: 5/7/95
چکیده
بیماری دیابت نوع دو، ناشی از اختلال در عملکرد و ترشح انسولین و به دنبال آن افزایش میزان قند خون است که به سومین عامل مرگ و میر در جهان تبدیل شدهاست. مشتقات فعال اکسیژن از جمله عوامل آسیب و مرگ برنامهریزی شده سلولی و دیابت میباشند. اثرات جانبی مخرب مصرف داروهای سنتزی بر بیماران، تحقیقات را به سمت داروهای طبیعی متمایل کردهاست. در این تحقیق، فعالیت آنتیدیابتی و آنتیاکسیدانی سه عصاره متانولی، اتیلاستاتی و انهگزانی دو گونه ماکروجلبک Palisada perforataو Sargassum angustifoliumبررسی شدهاست. نمونههای جلبک پس از جمعآوری از سواحل خلیجفارس و آمادهسازی، به روش پرکولاسیون عصارهگیری شدند. فعالیت مهارکنندگی آنزیم آلفاآمیلاز غلظتهای مختلف نمونهها بر اساس روش ADNS و ظرفیت آنتیاکسیدانی آنها نیز براساس دو روش تخریب رادیکال آزادABTS+ و احیاکنندگی FRAP بررسی شد. عصاره اتیلاستات S. angustifolium و P. perforata به ترتیب بیشترین و کمترین فعالیت بازدارندگی آنزیم آلفا آمیلاز را نشان دادند (P<0.05). همچنین بالاترین ظرفیت آنتیاکسیدانی پاکسازی +ABTS و احیاکنندگی FRAP به ترتیب در نمونههای اتیلاستات S. angustifoliumو P. perforata مشاهده شد (P<0.05). به طورکلی عصارههای قطبی و نیمه قطبی در هر دو گونه فعالیت آنتیاکسیدانی بالاتری را نسبت به عصاره غیرقطبی آن گونه نشان دادند و گونه
S. angustifolium بالاترین فعالیت را برای هر دو سنجش مهار آنزیم آلفاآمیلاز و تخریب رادیکال آزاد ABTS+نشان داد. دو گونه جلبک خوراکی مورد تحقیق با نشان دادن فعالیت قابل توجه آنتیدیابتی و آنتیاکسیدانی، با تحقیقات تکمیلی دارای پتانسیل کاربرد مستقیم در رژیم غذایی و همچنین استفاده در صنایع پزشکی و داروسازی میباشند.
واژه های کلیدی: ماکروجلبک، خلیج فارس، آنزیم آلفا آمیلاز، Sargassum angustifolium، Palisada perforata
* نویسنده مسئول، تلفن: 09171127539 ، پست الکترونیکی: Soheila_9@yahoo.com
مقدمه
امروزه بیماریهایی همچون دیابت و نارساییهای قلبی و عروقی که از عوامل ناتوانی و مرگ زودرس افراد میباشند به دلیل تغییرات در الگوهای غذایی و رفتاری افراد از قبیل تمایل به رژیمهای غذایی پرکالری و غنی از اسیدهای چرب اشباع، کم تحرکی و کاهش فعالیت بدنی، به طور قابل توجهی در سرتاسر جهان در حال افزایش هستند (37). بیماری دیابت نقص متابولیکی است که در اثر اختلال در عملکرد و ترشح انسولین و به دنبال آن افزایش قند خون ایجاد میشود. این بیماری بعد از سرطان و بیماریهای قلبی و عروقی در جایگاه سومین عامل مرگ و میر افراد قرار میگیرد. با توجه به افزایش روز افزون جمعیت جهانی بیماران دیابتی، تخمین زدهشدهاست که تا سال 2030 تعداد بیماران دیابتی به 366 میلیون نفر خواهد رسید (31). دیابت نوع دو از بیماریهای رایج است که عموماً با یک دوره قبل از دیابتی (pre-diabetes) شروع میشود، به طوری که در این دوره میزان قند خون قبل از مصرف مواد غذایی تنها کمی بیشتر از حد نرمال است و حذف کامل گلوکز مصرفی از خون به خوبی انجام نمیشود (35). افزایش بیش از حد گلوکز مصرفی در خون سبب تسریع در روند بیماری دیابت و به دنبال آن نارساییهای قلبی عروقی، کلیوی و ناتوانیهای عصبی میگردد که همگی از عوارض طولانی مدت بیماری دیابت هستند (7). بیماری دیابت از طریق تزریق انسولین یا مصرف خوراکی داروهای ضد دیابت از قبیل sulfonylureas و biguanide قابل درمان است اما متاسفانه مصرف طولانی مدت داروهای سنتزی جهت درمان بیماری دیابت اثرات جانبی سوئی بر بیماران به جای میگذارد (40). مشتقات فعال اکسیژن (reactive oxygen species) و رادیکالهای آزاد از جمله عوامل آسیب و مرگ برنامه ریزی شده سلولی، بیماریهای قلبی-عروقی، سرطان، دیابت وغیره میباشد (47). استرسهای اکسیداتیو با القای برخی از فرآیندهای سلولی از جمله عوامل تشدید کننده یا شروع کننده بیماری دیابت به شمار میآیند. مطالعات نشان دادهاند، بالا بودن دائمی و مزمن قند خون در بیماران دیابتی سبب افزایش سطح استرس اکسیداتیو و در نتیجه اختلال در سیستم دفاعی آنتیاکسیدانی طبیعی بدن و تجمع و افزایش رادیکالهای آزاد در بدن خواهد شد (25). مشتقات فعال اکسیژن ترشح شده از میتوکندری منبع ایجاد استرس اکسیداتیو و متعاقباً سبب شروع دیابت نوع یک از طریق آپوپتوزیس سلولهای بتا پانکراس و شروع دیابت نوع دو از طریق مقاومت به انسولین خواهند شد (22). آنتیاکسیدانها به دو دسته آنتیاکسیدانهای شیمیایی و طبیعی تقسیم میشوند که در این میان آنتیاکسیدانهای شیمیایی مانند هیدروکسی انیزول بوتیلید(BHA)، هیدروکسی تولوئن بوتیلتید (BHT) و پروپیل گالات (PG)و غیره با وجود کاربرد فراوان در صنایع دارویی و غذایی اما متاسفانه اثرات جانبی مضری مانند سرطان از آنها گزارش شدهاست (42). بنابراین با توجه به اثرات جانبی مضری که مصرف طولانی مدت داروهای سنتزی ضد دیابتی و آنتیاکسیدانی بر بیماران به جای میگذارند، تحقیقات بسیاری جهت شناسایی ترکیبات طبیعی دارای خاصیت ضد دیابتی و آنتیاکسیدانی در حال انجام است. با افزایش آگاهی و تمایل روزافزون افراد جهت جایگزینی داروهای سنتزی با ترکیبات طبیعی و آنتی اکسیدانها در راستای درمان بیماریها از جمله دیابت در سالهای اخیر محققین بسیاری توجه خود را به منابع با ارزش طبیعی معطوف کردهاند. مطالعات نشان دادهاند برخی از مواد غذایی همچون مخمر سویا (10). سیب زمینی شیرین (24)، چای (47)، پروتئین ماهی (23) و ماکروجلبکها (17) که دارای این ترکیبات طبیعی هستند، دارای خاصیت ضد دیابتی میباشند. موادغذایی دارای خواص ضد دیابتی عموماً با مهار فعالیت دو آنزیم گلوکوزیداز و آلفاآمیلاز که آنزیمهای هیدرولیزکننده کربوهیدراتها هستند، از بالا رفتن قند خون جلوگیری میکنند (39).
ماکروجلبکها از جمله منابع دریایی پایدار تولید کننده ترکیبات بیوشیمیایی هستند که توانایی تولید دامنه وسیعی از متابولیتهای ثانویه فعال بیولوژیکی را دارا میباشند. شناسایی و جداسازی بسیاری از ترکیبات فعال بیولوژیک در جلبکها اخیراً توجه بسیاری از محققین را به خود جلب کردهاست (30). ماکروجلبکها سرشار از ترکیبات متنوعی از جمله استروئیدها، ترپنوئیدها، فلوروتانین، کارتنوئید، اسیدهای آمینه، الکانها، کتونها، ترکیبات فنلی وغیره میباشند که جایگاه ویژهای را در صنایع غذایی، بهداشتی، آرایشی و به ویژه داروسازی و پزشکی به خود اختصاص دادهاند (48). ماکروجلبکها را میتوان براساس رنگدانهای که تولید میکنند به سه گروه ماکروجلبکهای سبز، قرمز و قهوهای تقسیمبندی کرد. ماکروجلبکهای قهوهای دارای ترکیبات متنوع پلیساکاریدی ازجمله لامینارین، فوکوایدان و آلژینات هستند که خواص بیولوژیک متعددی را نشان دادهاند (33). مطالعات نشان داده اند فوکوزانتین موجود در ماکروجلبکهای قهوهای علاوه بر ممانعت از تجمع چربی و پیشگیری از چاقی به عنوان ترکیب ضد دیابتی نیز مؤثر میباشد (42). فوکوئیدانها، گروههای پلیساکاریدی هستند که با داشتن دو زیرواحد مهم L-فوکوز و سولفات استرها دارای خواص بیولوژیکی متعددی از جمله آنتیاکسیدانی، ضد دیابت، ضد التهاب میباشند که این ترکیبات را میتوان تنها در ماکروجلبکهای قهوهای یافت (43). ماکروجلبکهای قرمز با داشتن برخی ترکیبات خاص از جمله فیکوبیلیپروتئینها و میزان بالای ترکیبات پلیفنلی و پروتئینی عموماً خواص بیولوژیک مؤثری از قبیل آنتیاکسیدانی، آنتیباکتریال و ضدسرطانی را نشان دادهاند (44). ترکیبات پلیفنلی موجود در ماکروجلبکهای قرمز نیز به عنوان یکی از ترکیبات مؤثر بر دیابت از طریق اثر بر آنزیمهای هضم کننده نشاسته شناخته شدهاند (20). سواحل خلیجفارس و دریای عمان در جنوب ایران دارای تنوع بالایی از گونههای مختلف ماکروجلبکی هستند به طوری که تاکنون 250 گونه از آنها شناسایی شدهاند (38). با توجه به وجود ترکیبات ضد دیابتی ارزشمند در ماکروجلبکها در این تحقیق برای اولین بار خواص آنتیاکسیدانی (مهار رادیکال آزاد ABTS+ و احیاکنندگی FRAP) و ضد دیابتی (مهار آنزیم آلفا آمیلاز) عصارههای انهگزانی، متانولی و اتیلاستاتی دو گونه مهم ماکروجلبک قرمز (Palisada perforate (Bory) K. W. Nam) و قهوه ای (Sargassum angustifolium C. Agardh) خلیج فارس، بررسی شدند.
مواد و روشها
جمعآوری و آمادهسازی نمونهها: جمعآوری و آمادهسازی گونههای جلبکی: نمونههای جلبک از آبهای خلیجفارس از استان هرمزگان، از مناطق جزرو مدی سواحل بندرعباس (N27○9.56'E56○14.26')و بندر لنگه (N26○33.46'E54○53.57') جمعآوری شدند. نمونههای جمعآوری شده جهت حذف ذرات شن، اپیفیتها و صدفها با آب دریا شسته و در کیسههای پلاستیکی برچسبگذاری شده به آزمایشگاه منتقل و در آنجا جهت حذف دقیق نمکها و ذرات شن و ماسه با آب مقطر به خوبی شسته شدند. شیتهای هرباریومی از نمونهها تهیه و پس از کد گذاری در مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان هرمزگان نگهداری شدند. نمونهها براساس صفات مرفولوژیکی و سلولی توسط کلیدهای شناسایی معتبر شناسایی شدند (11). پس از خشک شدن نمونهها در دمای اتاق، نمونههای خشک شده، پودر و جهت آنالیزهای بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
عصارهگیری: جهت تهیه عصارههای غیر آبی از نمونهها از سه حلال هگزان، اتیل استات، متانول به ترتیب قطبیت استفاده شد. بدین منظور 30 گرم از نمونه خشک و پودر شده هریک از جلبکها در حلالهای هگزان، اتیل استات، متانولی به ترتیب در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت قرار گرفتند. تمامی عصارههای به دستآمده به صورت جداگانه توسط کاغذ صافی واتمن صاف و توسط دستگاه روتاری (Strike 102، ایتالیا) در شرایط خلاء تبخیر شدند. عصارههای تغلیظ شده تا انجام آزمایشات در یخچال دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
بررسی مهار آنزیم آلفاآمیلاز توسط مهارکننده آکاربوز به عنوان استاندارد: بررسی مهار آنزیم آلفاآمیلاز بر اساس روش هنساواسدی و همکاران (12) با کمی تغییرات انجام شد. در این آزمایش آکاربوز که از مهارکنندههای سنتزی قوی آنزیم آلفا آمیلاز است به عنوان مهار کننده استاندارد، نشاسته به عنوان سوبسترا و محلول رنگی DNSA (Dinitrosalicylic acid) به عنوان متوقف کننده واکنش و شناسایی کننده مالتوز آزاد شده در واکنش، در نظر گرفته شدند. جهت انجام واکنش آنزیم آلفا آمیلاز (EC 3.2.1.1) با غلظت unit/mL 1 در سدیم فسفات بافر 02/0 مولار با pH 9/6 تهیه گردید. جهت انجام آزمایش20 میکرولیتر از هریک از غلظتهای مختلف آکاربوز (mg mL-1 3-2-1-5/0-25/0-1/0) به همراه 200میکرولیتر نشاسته 1 درصد (w/v) و 200 میکرولیتر آنزیم آلفا آمیلاز unit mL-1 1 به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد جهت انجام واکنش انکوبه شدند. سپس جهت توقف و اندازهگیری میزان مالتوز موجود در واکنش، محلول DNSA به مخلوط واکنش اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای 85 درجه سانتیگراد جهت توقف کامل واکنش قرارگرفتند. پس از انکوباسیون، در نهایت جذب نمونهها در طول موج 540 نانومتری اندازهگیری شد.
بررسی مهار آنزیم آلفا آمیلاز توسط نمونهها: سنجش میزان بازدارندگی آنزیم آلفا آمیلاز توسط عصارهها بر اساس روش رنگ سنجی DNSA و با اندازهگیری میزان کاهش آزادسازی مالتوز از نشاسته انجام میگیرد. بدین منظور 20 میکرولیتر از غلظتهای مختلف عصاره
(mg mL-1 6 و 4، 2، 1، 5/0، 25/0) به 200 میکرولیتر نشاسته 1 درصد (w/v) و 200 میکرولیتر آنزیم آلفا آمیلاز unit/mL 1 اضافه شد و نمونهها به مدت 10دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از انکوباسیون واکنش با اضافه کردن محلول DNSA به نمونهها و انکوباسیون به مدت 15 دقیقه درحمام آب گرم 85 درجه سانتیگراد، متوقف شد. در نهایت پس از انکوباسیون و سرد شدن نمونهها، میزان جذب آنها در طول موج 540 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خواندهشد.
در کلیه آزمایشات یک مخلوط واکنش بدون داشتن آنزیم آلفا آمیلاز که دارای صفر درصد فعالت آنزیمی است به عنوان کنترل کننده منفی (بلانک) و یک مخلوط واکنش دیگر بدون مهارکننده که دارای صد در صد فعالیت آنزیمی است به عنوان کنترل کننده مثبت در نظر گرفته شد.
بررسی درصد مهار کنندگی نمونهها: میزان مالتوز نمونهها بر اساس منحنی کالیبراسیون مالتوز که بر مبنای 0- 70 درصد (V/W) است، محاسبه گردید. سپس میزان مهار براساس فرمول زیر یرای هریک از نمونهها و استاندارد محاسبه شد.
درصد واکنش – 100= درصد مهار
ارزیابی فعالیت مهار رادیکال آزاد +ABTS: ABTS+ 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) رادیکال آزادی است که با گرفتن الکترون از رنگ سبز پر رنگ به رنگ سبز کمرنگ یا بی رنگ تغییر رنگ میدهد. در این تحقیق ظرفیت تخریب رادیکال آزادABTS+ در نمونهها بر اساس روش آرنا و همکاران (4) با اندکی تغییرات انجامشد. جهت انجام آزمایش، ابتدا دو محلول پایه ABTS (4/7 میلیمولار) و پتاسیم پرسولفات (6/2 میلیمولار) تهیه شدند و در ادامه با مخلوط کردن دو محلول پایه به مقدار مساوی با یکدیگر، محلولABTS+ تهیه گردید. به منظور تکمیل واکنش، محلول اصلی به مدت 16 ساعت در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری شد. پس از 16 ساعت، جذب محلول تهیه شده با رقیق شدن توسط متانول96 درصد به جذب 00/1 در طول موج 734 نانومتر رساندهشد. جهت بررسی ظرفیت آنتی اکسیدانی عصارهها، 2/0 میلیلیتر از هریک از غلظتهای مختلف عصارهها (mg mL-1 6 و 3، 5/1) به 4 میلیلیتر از محلول تازه تهیه شدهABTS+ اضافه و پس از نگهداری به مدت 6 دقیقه در تاریکی، جذب نمونههادر 734 نانومتر اندازهگیری شد. در این آزمایش کوئرستین به عنوان استاندارد آنتیاکسیدانی و مخلوط واکنش بدون مهارکننده به عنوان کنترل در نظر گرفتهشد. ظرفیت آنتیاکسیدانی نمونهها براساس فرمول زیر محاسبه گردید ) A میزان جذب نمونه و کنترل میباشد).
100 ´ (کنترلA/نمونهA)-1)=درصد احیاکنندگی
ارزیابی ظرفیت احیاکنندگی FRAP: اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی احیاء آهن FRAP (Ferric reducing ability of plasma) غلظتهای مختلف (mg mL-1 5/1 و3 ،6) سه عصاره متانولی، اتیلاستاتی و انهگزانی هریک از دو گونه جلبک مطالعه شده براساس روش بنزی و استرین (5) انجام شد. در این سنجش 02/0 میلیلیتر عصاره به همراه 1میلی لیتر از محلول کار FRAP تهیه شده مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای محیط قرار گرفتند. پس از گذشت 5 دقیقه، جذب نمونهها در طول موج 593 نانومتر اندازهگیری شد. ماده استاندارد آسکوربیک اسید نیز همراه با نمونهها سنجیده شد و ظرفیت احیاکنندگی FRAP نمونهها براساس معادله خط به دست آمده برای ظرفیت احیاکنندگی آسکوربیک اسید به صورت میکروگرم آسکوربیک اسید بر میلیگرم عصاره بیان گردید.
تجزیه و تحلیل آماری
تمامی آزمایشات در سه تکرار صورت گرفت و نتایج به صورت میانگین سه تکرار بیان گردیدند. IC50 و EC50 نمونهها به ترتیب توسط آنالیز همبستگی خطی حاصل از مقادیر درصد مهار آنزیم آلفا آمیلاز و درصد احیاکنندگی ABTS برای غلظتهای مختلف نمونهها، تعیین شد. دادههای حاصل توسط نرم افزار SPSS بر اساس تجزیه واریانس فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی مورد بررسی قرارگرفتند و مقایسه میانگینها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن درسطح معنیداری P<0.05انجام شد.
نتایج
بررسی مهار آنزیم آلفا امیلاز: در این مطالعه اثر مهار کنندگی آنزیم آلفا آمیلاز توسط غلظتهای مختلف سه عصاره هگزانی، اتیل استاتی و متانولی حاصل از دو جلبکP. perforata (قرمز) و S. angustifolium (قهوهای) براساس میزان تبدیل نشاسته به مالتوز بررسی شد. همان طور که در شکل 1 نشان داده شدهاست، با افزایش غلظت عصارهها (mg mL-1 6 و 4، 2، 1، 5/0، 25/0) میزان مهار آنزیمی نیز افزایش مییابد. اثر مهارکنندگی عصارههای متانولی، اتیل استاتی و انهگزانی جلبک قهوهای
S .angustifolium، به ترتیب درغلظتهای کمتر از
mg mL-15/0، 25/0 و 2 متوقف گردید.
شکل1- بررسی میزان مهار آنزیم آلفا آمیلاز توسط غلظتها مختلف عصارههای متانولی (ME)، اتیل استاتی (EA) و هگزانی (NH) دو جلبک
S. angustifolium و P. perforata
همچنین در جلبک قرمزP . perforata اثر مهارکنندگی درغلظتهای کمتر از mg mL-1 1، 5/0 و 25/0 به ترتیب در عصارههای متانولی، اتیل استاتی و انهگزانی مشاهده نشد. فقط عصاره اتیل استاتی S. angustifolium و انهگزانی
P. perforata در غلظت mg mL-1 25/0 اثر مهارکنندگی نشان دادند. عصارههای متانولی و انهگزانی
S. angustifolium در غلظت mg mL-1 6، اثر مهارکنندگی یکسانی (40 درصد) را نشان دادند در حالی که عصاره اتیل استاتی آن در همان غلظت دو برابر قدرت مهارکنندگی (88 درصد) را نشان داد. در جلبک
P. perforata هریک از عصارههای متانولی، اتیل استاتی و انهگزانی در غلظت mg mL-1 6 به ترتیب میزان مهارکنندگی متفاوتی در حدود 55، 27 و 75 درصد را نشان دادند.
در شکل 2، غلظتی از عصاره که دارای 50 درصد قدرت مهارکنندگی آنزیم آلفا آمیلاز است (IC50) برای هریک از عصارههای متانولی، اتیل استاتی و ان هگزانی دو گونه جلبک S. angustifolium , P. perforata محاسبه و با IC50 آکاربوز (استاندارد) مقایسه شدهاند. به طور کلی رنج IC50 عصارههای مختلف دو گونه جلبک مورد مطالعه بینmg mL-1 22/0±33/6-32/0±43/1به دست آمد که همگی با میزان IC50 به دست امده برای آکاربوز
mg mL-1 07/0±75/0 اختلاف معنی داری را نشان دادند. در جلبک S. angustifolium، IC50دو عصاره ان هگزانی و متانولی با یکدیگر اختلاف معنیداری را نشان ندادند درحالی که عصاره اتیل استاتی به طور معنی داری با کمترین IC50 (mg mL-132/0±43/1)، بیشترین مهار آنزیم آلفا آمیلاز را نسبت به دو عصاره دیگر نشان داد. در جلبک P. perforata، سه عصاره از نظر میزان بازدارندگی آنزیم آلفا آمیلاز اختلاف معنی داری را نشان دادند به طوری که عصاره ان هگزانی با کمترین IC50 (25/0±51/2) بالاترین میزان بازدارندگی و عصاره اتیل استاتی باIC50 در حدود mg mL-1 31/0±3/6 کمترین میزان بازدارندگی را نشان دادند. به طورکلی در بین دو گونه جلبک و عصارههای آنها، عصاره اتیل استاتی S. angustifolium با کمترین IC50 (mg mL-132/0±43/1) و عصاره اتیل استاتی
P. perforata با بیشترین IC50 (mg mL-1 31/0±3/6) به ترتیب بیشترین و کمترین فعالیت بازدارندگی آنزیم آلفا آمیلاز را نشان دادند.
شکل2- مقایسه میزان - IC50مهار آنزیم آلفا آمیلاز توسط عصارههای متانولی (ME)، اتیل استاتی (EA) و ان هگزانی (NH) دو جلبک
S. angustifolium و P. perforata است و آکاربوز به عنوان استاندارد استفاده شدهاست. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنیدار بین نمونهها میباشد (P<0.05).
بررسی ظرفیت مهار رادیکال آزاد ABTS+: در بررسی فعالیت آنتیاکسیدانی غلظتهای مختلف (mg mL-1 6 و 3، 5/1) سه عصاره متانولی، اتیل استاتی و انهگزانی دو گونه جلبک P. perforata و S. angustifolium، نتایج نشان دادند همراه با افزایش غلظت نمونهها میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی نیز افزایش مییابد (شکل 3). همان طور که در شکل 3 نشان دادهشدهاست، در گونه P. perforata دو عصاره اتیل استاتی و متانولی در هر سه غلظت فعالیت یکسانی را در مهار رادیکال آزاد نشان دادند (50/81 -14/31) درصد و همچنین عصاره انهگزانی آن فعالیت آنتیاکسیدانی پایینتری را نسبت به دو عصاره دیگر نشان داد (P<0.05). در حالی که در گونه S. angustifolium عصاره اتیل استاتی> متانولی > انهگزانی در هر سه غلظت به ترتیب افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی متفاوتی را نشان دادند (P<0.05).
شکل 3- بررسی میزان بازدارندگی رادیکال آزاد ABTS+ توسط ماده استاندارد کوئرستین (QE) و همچنین غلظتها مختلف عصارههای متانولی (ME)، اتیل استاتی (EA) و هگزانی (NH) دو گونه جلبک S. angustifolium و P. perforata
در شکل 4، غلظتی از عصاره که جهت احیاکنندگی 50 درصد رادیکال آزاد ABTS+ لازم است (EC50)، برای هریک از عصارههای متانولی، اتیلاستاتی و انهگزانی دو گونه جلبک S. angustifolium و , P. perforata نشان داده شدهاست که همگی با EC50 کوئرستین (استاندارد) مقایسه شدهاند. EC50 عصارههای مختلف دو گونه جلبک مورد مطالعه در محدودهmg mL-1 12/0±38/4-08/0±70/0 قرار گرفتند. در جلبک S. angustifolium هر سه عصاره از نظر ظرفیت آنتیکسیدانی اختلاف معنیداری را با یکدیگر و با کوئرستین نشان دادند که در این میان عصاره اتیل استاتی با کمترین mg mL-1 08/0±70/0= EC50 بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی را نسبت به دو عصاره متانولی و انهگزانی (mg mL-1 33/0±73/6 و23/0±84/3= (EC50 و همچنین کوئرستین (mg mL-1 10/0±50/1= (EC50نشان داد (P<0.05). در جلبک
P. perforataدو عصاره متانولی و اتیلاستاتی با EC50 در حدود (15/0±30/1= (EC50 اختلاف معنیداری را با کوئرستین ( mg mL-110/0±50/1= (EC50 نشان ندادند (P<0.05). به طورکلی در بین دو گونه جلبک و عصارههای آنها، عصاره اتیلاستاتی و انهگزانی
S. angustifolium به ترتیب با کمترین EC50
( mg mL-108/0±70/0) بیشترین EC50 (mg mL-1 33/0±73/6) به ترتیب بیشترین و کمترین ظرفیت آنتیاکسیدانی را نشان دادند. در میان نمونهها تنها عصاره اتیل استاتی S. angustifolium ظرفیت آنتیاکسیدانی بالاتری را نسبت به استاندارد کوئرستین نشان داد.
شکل 4- مقایسه میزان - EC50مهارکنندگی رادیکال آزاد ABTS+ عصارههای متانولی (ME)، اتیل استاتی (EA) و ان هگزانی (NH) دو جلبک
S. angustifolium و P. perforata و کوئرستین به عنوان استاندارد. حروف ( (a, b, c, dمتفات نشان دهنده اختلاف معنیدار بین نمونهها است (P<0.05).
بررسی ظرفیت احیاکنندگی FRAP: همان طور که در شکل 5 نشان داده شدهاست، در سنجش ظرفیت احیاکنندگی FRAP غلظتهای مختلف (1mg mL- 5/1 و 3، 6) سه عصاره متانولی،اتیلاستاتی و انهگزانی دو گونه جلبک سنجیده شده براساس استاندارد آسکوربیک اسید، همراه با افزایش غلظت نمونهها سنجش احیاکنندگی آنها نیز افزایش یافتهاست. به طوری که ظرفیت احیاکنندگی کلیه نمونهها در غلظت mg mL-1 6 به طور قابل توجهی بسیار بالاتر از غلظت mg mL-15/1سنجیده شد. آنالیزها نشان دادند، نه تنها غلظتهای مختلف هر نمونه ظرفیت احیاکنندگی متفاوتی را نشان دادند بلکه ظرفیت احیاکنندگی هر یک از نمونهها در عصارههای مختلف آن نیز تفاوت معنیداری را نشان دادند (P<0.05).
شکل 5- بررسی میزان ظرفیت احیاکنندگی FRAP توسط غلظتهای مختلف سه عصاره متانولی (ME)، اتیل استاتی (EA) و هگزانی (NH) دو گونه جلبک S. angustifolium و P. perforata
در جدول 1 ظرفیت احیاکنندگیFRAP نمونهها براساس میکروگرم آسکوربیک اسید بر میلیگرم عصاره خشک
(mg ASA/ mg)جهت مقایسه بهتر نمونهها آمدهاست. عصاره اتیل استاتی گونه P. perforata با نشان دادن ظرفیت احیاکنندگی mg ASA/mg 53/32 به طور معنیداری بالاترین ظرفیت احیاکنندگی و عصاره انهگزانی هر دو گونه P. perforata (mg ASA/mg20/7) و
S. angustifolium ( mg ASA/mg72/8) پایینترین ظرفیت احیاکنندگی را در میان کلیه نمونهها نشان دادند (P<0.05). ظرفیت احیاکنندگی سه عصاره بررسی شده در گونه
S. angustifolium به ترتیب افزایش به صورت متانول> اتیلاستات > انهگزان و در گونه P. perforata به صورت اتیلاستات> متانول > انهگزان،سنجیده شد (P<0.05).
جدول1- مقایسه ظرفیت احیاکنندگی FRAP عصارههای متانولی، اتیل استاتی و ان هگزانی دو گونه جلبک S. angustifolium و P. perforata براساس میکروگرم آسکوربیک اسید بر میلیگرم عصاره (mg ASA/ mg).
گونه |
عصاره |
||
متانول |
اتیل استات |
انهگزان |
|
S. angustifolium |
b53/20 |
c54/14 |
d72/8 |
P. perforata |
b17/21 |
a53/32 |
d20/7 |
a, b, c, dحروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنیدار بین نمونهها است (P<0.05).
بحث
در بیماران دیابتی نوع 2 کنترل سطح گلوکز در پلاسما بعد از صرف غذا از اولین و مهمترین مراحل درمانی میباشد که بدین منظور یکی از راههای درمانی، ممانعت از عملکرد آنزیمهای دخیل در متابولیسم کربوهیدراتها جهت جلوگیری از افزایش گلوکز ناشی از غذا میباشد (17). آلفا آمیلاز از جمله آنزیمهای کلیدی در هضم کربوهیدراتها میباشد که هیدرولیز اتصالات گلیکوزیدی 1,4-D-α موجود در ترکیبات نشاستهای )آمیلوز و آمیلوپکتین(، گلیکوژن و الیگوساکاریدهای مختلف را کاتالیز میکند و با تولید الیگوساکاریدهای کوتاه، مالتوز وگلوکز سبب افزایش سطح گلوکز خون میشوند (37). بازدارندههای آلفا آمیلاز با ممانعت از عملکرد آلفاآمیلاز سبب کاهش جذب گلوکز از روده و متعاقباً مانع از افزایش سریع سطح گلوکز خون میشوند. در این مطالعه اثر سه عصاره متانولی، اتیل استاتی و ان هگزانی دو جلبک S. angustifolium و P. perforata سنجیده شد. نتایج نشان دادند همراه با افزایش غلظت نمونهها میزان بازدارندگی نیز افزایش مییابد که این روند با نتایج نوسو و همکاران (27) کاملا ًمطابقت دارد. مطالعات متعددی خاصیت مهار آنزیم آلفاآمیلاز توسط ماکروجلبکها را گزارش دادهاند (27، 28 و 29). در این مطالعه همه نمونهها فعالیت مهار آنزیم آلفاآمیلاز را نشان دادند و IC50 نمونهها در رنج mg mL-131/0±3/6-32/0±43/1به دستآمدکه این میزان با نتایج سنتیل و همکاران (36) که IC50 مهار آنزیم آلفا آمیلاز را در عصاره آبی ماکروجلبک قرمزGracilaria corticataو Gracilaria edulis، جلبک سبز Ulva lactuca و جلبک قهوهای Sargassum polycystum بینmg mL-1 83- 60 گزارش دادهاند و همچنین با نتایج کومار و سودا (16) که مهار آنزیمی عصاره اتیل استاتی ( mg mL-13/0) سه گونه جلبک Gracilaria gracilis، recimosaChondrococcusو hornemanni Chondrococcus را به ترتیب 81، 73 و 94 درصد گزارش دادهاند، قابل مقایسه است. اختلافات بین نتایج به دست آمده در مطالعات مختلف را میتوان علاوه بر گونه جلبکی به نحوه عصارهگیری و نوع حلال به کاربرده شده در هر مطالعه نیز مرتبط دانست (34). همان طور که در نتایج این مطالعه نیز مشاهده میشود، میزان فعالیت مهارکنندگی سه حلال مختلف مورد استفاده جهت عصارهگیری یک گونه اختلاف معنیداری را در مهار آنزیم نشان دادند. این چنین اختلافات در بسیاری از مطالعات صورت گرفته، بر روی یک گونه که دارای حلال و شرایط عصارهگیری متفاوتی هستند معمول است (1 و 2). به عنوان مثال میزان IC50 مهار آنزیم آلفا آمیلاز عصاره آبی جلبکAscophyllum nodosum (mg phenol mL-1 34/1) در مطالعات لی و همکاران (20)، ده برابر بیشتر از عصاره الکلی همین جلبک توسط نواسا و همکاران (27)، گزارش شدهاست. نحوه عصارهگیری استفاده شده در این مطالعه به صورت پرکولاسیون و بدون در نظر گرفتن ماده خاصی میباشد، در حالی که در بسیاری از مطالعات که عصارهگیری خالصتر و یا با هدف استخراج ماده خاصی بودهاست نتایج متمایزتری را نشان دادهاند به عنوان مثال لی و همکاران (19) IC50 مهار آنزیم آلفاآمیلاز را توسط عصاره حاوی پلوروتاتین خالص از جلبک قهوهای
Ecklonia cava در حدود mg mL-1 90 گزارش دادهاند که این میزان بسیار کمتر از نتایج به دست آمده در این مطالعه میباشد.
بررسی مهار رادیکال آزاد ABTS+ روش بسیار مناسبی جهت سنجش ظرفیت آنتیاکسیدانی از طریق اهدای هیدروژن و شکستن زنجیره اکسیداتیو میباشد. با توجه به نتایج به دست آمده در این تحقیق، عصاره اتیل استاتی و متانولی هر دو گونه فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد بالاتری را نسبت به عصاره غیرقطبی انهگزانی گونه مربوطه نشان دادند که این نتایج کاملاً با نتایج دیگر محققین که ظرفیت بالای آنتیاکسیدانی عصارههای قطبی و نیمه قطبی را در گیاهان دیگر گزارش دادهاند، مطابقت دارد (9، 13 و 32). تحقیقات به عمل آمده یکی از دلایل ظرفیت بالای پاکسازی رادیکال آزاد در عصارههای قطبی و نیمه قطبی را وجود ترکیبات پلیفنلی در این عصارهها دانستهاند. ترکیبات فنلی به علت وجود گروههای هیدروکسیلی در موقعیتهای ارتو و پارای آنها، نقش مهمی را در پاکسازی رادیکالهای آزاد ایفاء میکنند (9 و 18). در بسیاری از مطالعات صورت گرفته جلبکهای قهوهای فعالیت بالای پاکسازی رادیکال آزاد را نشان دادهاند (8، 11، 43 و 44). در این تحقیق نیز با وجودی که هر دو گونه جلبک ظرفیت پاکسازی رادیکال آزاد بالایی را نشان دادند اما جلبک قهوهای S. angustifolium به طور معنیداری ظرفیت پاکسازی بالاتری را نسبت به جلبک قرمز P. perforata نشان داد.
مشتقات فعال اکسیژن با حمله به ماکرومولکولهای حیاتی بدن از جمله کربوهیدراتها، لیپیدها، پروتئینها و DNA سبب استرس اکسیداتیو و به دنبال آن بروز ناهنجاریها و بیماریهای مختلف از جمله دیابت میشوند و همچنین از سوی دیگر بسیاری از ناهنجاری و بیماریها از جمله دیابت با افزایش سطح مشتقات فعال اکسیژن در سلول سبب بروز استرس اکسیداتیو میشوند (45 و 46). در این تحقیق عصاره اتیلاستاتی جلبک S. angustifolium در میان نمونههای مورد مطالعه، بالاترین فعالیت را در هر دو سنجش ضددیابتی و آنتیاکسیدانی ABST+ نشان داد. با توجه به اثرات متقابل بین بیماری دیابت و استرس اکسیداتیو میتوان گفت ممکن است عصاره و گونه دارای فعالیت آنتیاکسیدانی یا ضد دیابتی بتواند به ترتیب دارای فعالیت ضد دیابتی و آنتیاکسیدانی نیز باشد چرا که مهار و کنترل یکی سبب مهار و کنترل دیگری نیز میشود که البته برای اثبات مسلم این موضوع به تحقیقات بیشتر و کاملتری نیاز میباشد.
در روش FRAPاز رادیکالهای آزاد جهت تعیین پتانسیل آنتیاکسیدانها استفاده نمیشود، بلکه از یک واکنش اکسیداسیون احیاء استفاده میشود که با تغییر رنگ همراه است. در این روش توانایی احیاء شدن آهن فریک + 3 Fe به آهن فروسFe+ 2 توسط ترکیبات آنتیاکسیدانی در نمونه، اندازهگیری میشود به طوری که زمانی که احیاء کننده واکنش )آنتی اکسیدان (الکترون خود را اهداء میکند ماده رنگی تولید میشود که از طریق آن میتوان با سنجش شدت رنگ تولید شده پیشرفت واکنش را اندازه گرفت (6). همان طور که نتایج نشان دادند همانند ظرفیت پاکسازی رادیکال آزاد همه نمونهها در رنج غلظتی سنجیده شده فعالیت احیاکنندگی قابل توجهی را نشان دادند. بسیاری از مطالعات انجام شده در زمینه بررسی فعالیت احیاکنندگیFRAP گونههای جلبک، ظرفیت احیاکنندگی قابل توجهی را برای آنها گزارش دادهاند (14 و 15). بر خلاف ظرفیت پاکسازی رادیکالABTS+ که جلبک قهوهای S. angustifolium بالاترین ظرفیت آنتیاکسیدانی را نشان داد، در سنجش ظرفیت احیاکنندگی FRAP، جلبک قرمز P. perforata بالاترین ظرفیت احیاکنندگی را نسبت به دیگر نمونهها نشان داد. پس میتوان گفت پتانسیل آنتی اکسیدانی یک ماده آنتی اکسیدان برعلیه رادیکالهای آزاد، ضرورتا ًبا توانایی آن ماده در احیاء آهن فریک به آهن فروس با هم برابر نمی باشد. همان طور که نتایج نشان دادند عصاره اتیلاستاتی P. perforata بالاترین و عصاره انهگزانی دو گونه P. perforata و S. angustifolium پایینترین فعالیت احیاکنندگی را نشان دادند (P<0.05). مطالعات نشان دادهاند نوع حلال مورد استفاده در عصاره گیری بر فعالیت آنتیاکسیدانی بسیار مؤثر میباشد (1) به طوری که در بسیاری تحقیقات صورت گرفته ظرفیت احیاکنندگی عصارههای قطبی و نیمه قطبی بیشتر از عصارههای غیرقطبی گزارش شدهاست (26). نتایج این تحقیق همانند نتایج ظرفیت پاکسازی رادیکال آزاد، در دو گونه بررسی شده عصارههای قطبی (متانولی) و نیمه قطبی (اتیلاستاتی) نسبت به عصاره غیر قطبی (انهگزانی) فعالیت احیاکنندگی بالاتری را نشان دادند. علت فعالیت بالای عصارههای قطبی و نیمه قطبی را میتوان به دلیل توانایی استخراج ترکیبات فعال فنلی، فلاونوئیدی، کارتنوئیدها و بسیاری از ترکیبات فعال دیگر توسط این حلالها دانست (41). البته در برخی مطالعات انجام شده عصارههای غیر قطبی فعالیت بالاتری را نسبت به عصارههای قطبی و نیمه قطبی نشان دادهاند. به عنوان مثال لیم و همکاران (21) فعالیت احیاکنندگی FRAP عصاره غیر قطبی دیکلرومتان گونهSargassum siliquastrum را قویتر از عصاره متانولی آن گزارش دادهاند. بنابراین میتوان گفت با توجه به اینکه براساس نوع گونه گیاهی ترکیبات استخراج شده توسط حلالهای عصارهگیری متفاوت است، بنابراین تفاوت در اثر آنتی اکسیدانی یک حلال از گونههای مختلف ماکروجلبکی به دلیل تفاوت در ترکیبات استخراج شده توسط آن حلال می باشد (3). به طورکلی جلبکها با تولید متابولیتهای اختصاصی و مکانیسمهای دفاعی ویژه قادر به رشد در شرایط مختلف و متغیر محیطی هستند، آنها با تولید آنتیاکسیدانها و ترکیبات با وزن مولکولی پایین قادر به پاکسازی رادیکالهای آزاد و غیرفعال کردن مشتقات فعال اکسیژن (ROS) در شرایط استرس محیطی هستند (33).
نتیجهگیری
به طورکلی فعالیت مهار آنزیم آلفا آمیلازی و آنتیاکسیدانی جلبکها علاوه بر نوع گونه جلبکی بلکه به نوع حلال و روش سنجش فعالیت آنها، نیز بستگی دارد. در این تحقیق با وجودی که عصارههای قطبی و نیمه قطبی نسبت به عصاره غیرقطبی فعالیت زیستی بالاتری را نشان دادند اما به طورکلی دو جلبک خوراکی S. angustifolium و P. perforata با نشان دادن فعالیت مهار آنزیم آلفا امیلاز و ظرفیت آنتیاکسیدانی پاکسازی رادیکال آزاد ABTS+ و احیاکنندگی FRAP قابلیت قرارگرفتن در رژیم غذایی بیماران دیابتی جهت مهار آنزیم آلفا آمیلاز در بیماران دیابتی و همچنین به عنوان ترکیبات آنتیاکسیدانی قابلیت کاربرد در صنایع پزشکی و داروسازی را دارا میباشند. البته مطالعات بیشتری جهت خالصسازی ترکیبات مؤثر در این جلبکها و همچنین سنجش آنتیاکسیدانی و مهارآنزیمی آنها به صورت زیستی جهت اطمینان از عدم حساسیت جانداران به آنها، پیشنهاد میشود.