تکوین پرچم، تخمک و گامتوفیت نر و ماده در آلاله آبیBatrachium fluitans 

پگاه رجبی فر^۱ وعبدالکریم چهرگانی راد^۲*

^۱ بروجرد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بروجرد، گروه زیست شناسی

^۲ همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 20/3/95                تاریخ پذیرش: 24/7/95 

چکیده

اگرچه تیره آلاله ( Ranunculaceae ) به دلیل داشتن ویژگیهای تکاملی جالب موضوع مطالعات مختلف بوده است، اما مطالعات تکوینی در برخی از سرده­های آن به طور محدود  صورت گرفته و برخی از سرده­های آن تا کنون مطالعه نشده­اند. در این پژوهش مراحل و چگونگی تکوین پرچم و تخمک در گیاه آلاله آبی Batrachiumfluitansبررسی شد. گلها و غنچه­ها در مراحل مختلف نموی برداشت، در فیکساتور  FAA₇₀ تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شد. نمونه ها پس از آب­گیری و قالب­گیری در پارافین با میکروتوم برش گیری و رنگ آمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. لامهای تهیه شده از مراحل مختلف تکوینی با دقت با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی، و از مراحل تکوینی مورد نظر عکس تهیه شد. بر اساس نتایج حاصل از این بررسی، در گونه مورد مطالعه تخمک از نوع واژگون است. سلول مگاسپور موقعیت لایه سوم تا چهارم زیر اپیدرمی دارد، تقسیم میوز منجر به تولید تترادهای خطی و یا T شکل می­شود. موقعیت مگاسپور عملکردی از نوع بنی است، تکوین کیسه رویانی از تیپ پلی گونوم تبعیت می کند و لقاح سلول تخم ضمیمه بر تخم اصلی مقدم است. نتایج نشان داد تکوین پرچمها با پدید آمدن توده­های سلولی بیضی شکلی بر روی نهنج آغاز می­شود و تعداد پرچمها پنج عدد است که خامه را در بر گرفته­اند. لایه­های بساک از بیرون به داخل شامل یک لایه سلول اپیدرمی، یک لایه مکانیکی، یک لایه میانی (موقت) و یک لایه تاپی در مجاورت سلولهای مادر گرده می­باشد. سلولهای لایه تاپی در مراحل مختلف نمو بساک و دانه­های گرده در جای خود ثابت باقی مانده و تحلیل نمی­روند و این لایه از نوع ترشحی است. تتراد­های میکروسپوری از نوع تتراهدرال هستند. میکروسپورها در زمان آزاد شدن واکوئله نبوده، دارای شکل منظم، سیتوپلاسم متراکم و هسته مشخص در وسط هستند. دانه های گرده بالغ از نوع دو سلولی هستند.

واژه های کلیدی: تیره آلاله، تکوین ، تخمک، کیسه رویانی، دانه گرده.

* نویسنده مسئول، تلفن: 38381058-081، پست الکترونیکی:   a.chehregani@gmail.com

مقدمه

در راسته Ranunculales تیره آلاله موقعیت فیلوژنتیک برجسته‌ای داشته و به نظر می‌رسد پایه و اساس یودایکت‌ها باشد. این تیره یک تیره بزرگ با پراکنش جهانی است  (28،27،9،12). این تیره تنوع وسیعی را در ویژگیهای ریختی به ویژه در نوع میوه و سازمان یابی گل نشان می دهد و به همین دلیل طبقه­بندیهای متعددی براساس ویژگیهای ریخت شناختی  (29،14،13). ویژگیهای ملکولی (25،15) و ترکیبی از ویژگیهای ریخت شناختی و ملکولی انجام شده است (39).  این تیره توسط Tamura (29) بر اساس عدد کروموزومی، برچه و نوع میوه  به سه زیر تیره و یازده طایفه تقسیم شده است.

گیاهان تیره آلاله همزمان دارای ویژگیهای متعدد ابتدایی و پیشرفته ریخت شناختی و رویان شناختی هستند: گلهای منظم یا نامنظم دو یا تک جنسی، برچه های آزاد یا پیوسته، فولیکولهای چند برچه­ای یا فندقه­های تک برچه­ای، تخمکهای کم یا پرخورش تک یا دو پوسته­ای، تکوین کیسه رویانی از نوع Polygonum یا Allium، و آنتی­پودهای پایدار یا ناپایدار از آن جمله است (38،16).  

وجود پلی­پلوئیدی مکرراً در انواع سلولهای کیسه رویانی نظیر آنتی‌پودها، سینرژید‌ها، آندوسپرم و سوسپانسور گزارش شده است (19،10) و ارتباط آشکاری بین درجه پلی­پلوئیدی این سلولها و طول مدت زمان زندگی‌ آنها وجود دارد، که نقش تغذیه‌ای‌ آنها را پیشنهاد می‌کند (22). وقوع آندو پلی پلوئیدی در سلولهای آنتی‌پود، در اعضای این خانواده بسیار شاخص است (34،33). سقط جنین و تخمک نیز در گیاهان این تیره گزارش شده است (6). هدف این مقاله مطالعه مراحل تکوین تخمک،  کیسه رویانی،  پرچم و دانه گرده در گونه   B.fluitans به منظور توسعه دانش رویان شناسی این تیرهاست. بعلاوه، آشکار ساختن خصوصیات تکوینی گامتوفیت نر و ماده  سبب فهم بهتری از رده­بندی تیره آلاله خواهد شد.

موادوروشها

گلها و جوانه­های گونه مورد مطالعه در اوایل بهار از زیستگاههای طبیعی این گونه دراطراف شهربروجرد جمع آوری شد. گلها و غنچه­ها در مراحل مختلف تکوین جهت تثبیت در (Formalin, Acetic acid, Ethanol) FAA₇₀ قرار داده­شد، سپس ذخیره­سازی در الکل 70 درصد صورت گرفت. پس از قالب گیری با پارافین، برش­گیری نمونه­ها در قالب­های پارافین با میکروتوم (Microm DC, Dideh Sabz, Iran )  با ضخامت  μm10-7 صورت گرفت  (42). رنگ آمیزی برشهای تهیه شده پس از پارافین زدایی و آب­دهی با روش رنگ­آمیزی مضاعف هسته و سیتوپلاسم توسط هماتوکسیلین و ائوزین صورت گرفت (43) . نمونه­های مورد مطالعه با میکروسکوپ نوری  Axiostar Plus  Zeiss (Germany) بررسی شد و عکس­برداری به کمک دوربین دیجیتال مدل (Japan) Canon G₁₁   انجام گرفت. 

نتایج 

تکوین تخمک: تخمکها به صورت برجستگیهای کوچک کم و بیش کروی تا بیضی شکل  در جدار تخمدان پدیدار می­شود (شکل1).  تخمدان از نوع فوقانی، تک برچه­ای و تک خانه­ای است و هر حفره تخمدان یک ردیف تخمکی دارد (شکل2). برچه شامل تعداد زیادی تخمک است. تخمکها در تخمدان به طور واژگون و آویخته در یک ردیف قرار دارند. جایگزینی تخمکها در تخمدان از نوع جداری است. پریموردیوم تخمک دارای 7-4 ردیف سلولی است (شکل2). درB.fluitans  چندینسلول آرکئوسپوری وجود دارد (شکل 3) و تنها یکی از این سلولها به طور مستقیم به مگاسپوروسیت تمایز می‌یابد. سلول مادر مگاسپور در نمونه مورد مطالعه، در لایه چهارم است (شکل 4). پریموردیوم تخمک، خمیدگی را از همان مراحل اولیه آغاز می­کند. هنگامی که پریموردیوم تخمکی کشیده می شود، در بخش میانی آن ابتدا پوسته خارجی بنیان گذاری می­شود (شکل 3). بعد از مدتی، با توسعه پوسته خارجی، پوسته درونی در بخش درونی پوسته خارجی تشکیل می­شود (شکل­ 4). در نمونه مورد مطالعه، تخمک از نوع دو پوششی، پرخورش و واژگون است (شکل 5). میکروپیل به وسیله پوسته داخلی که متشکل از 2 لایه است، شکل می­گیرد و از نوع خطی صاف است (شکل 6). پوسته خارجی ضخیم و متشکل از 4 تا 5 لایه سلولی است. از درونی ترین لایه پوسته درونی، لایه اندوتلیوم تشکیل می شود. سلولهای این لایه به صورت شعاعی امتداد یافته و دارای هسته کاملاً واضح و سیتوپلاسمی متراکم هستند (شکل­ 7).

مگاسپورزایی و نمو گامتوفیت ماده: سلول مادر مگاسپور به وسیله چندین لایه از سلولهای خورش احاطه می­شود، بنابراین تخمک از نوع پرخورش است. سلول مادر مگاسپور از نظر اندازه رشد می­کند و با حجم زیاد، هسته درشت، سیتوپلاسم متراکم و شکل چند وجهی خود از سایر سلولهای خورش قابل تشخیص است (شکل 3). حضور کلاهک خورشی از این مرحله دیده می­شود که بین 4-2 لایه است. مگاسپوروسیت با انجام میوز مگاسپورها را تشکیل می­دهد که ضمن رشد گامتوفیت ماده یا کیسه رویانی را تولید می­کنند.

شکل ۱-۶) مراحل بنیان گذاری مادگی و تخمک: ۱) تشکیل پریموردیوم‌های تخمکی در مادگی؛ ۲) رشد پریموردیوم تخمکی و بسته شدن برچه؛ ۳) بنیان گذاری سلول­مگاسپورورسیت (mmc)، (NC و پوسته تخمک (In)؛ ۴ ) دیاد خطی طولی؛ F) دیاد خطی طولی؛ ۵ ) در این شکل تترادها از نوع T شکل هستند ؛ ۶) تحلیل سه سلول تترادی و باقی ماندن یکی از آنها و عملکرد به عنوان سلول مادر کیسه رویانی (بزرگنمایی 400×).

شکلهای ۷-۱۴: برخی مراحل تکوینی تخمک و کیسه رویانی. ۷)  کیسه رویانی دو هسته ای در تخمک با پوسته های (In) رشد یافته ودسته آوندی (VB) قابل مشاهده است؛۸ ) کیسه رویانی 8 هسته­ای قبل از  بلوغ و سلولی شدن؛ ۹) آغاز سلولی شدن و بلوغ کیسه رویانی. دستگاه تخم  (Eg)‌ و سلولهای آنتی پود (Ant) در حال سازمان یابی قابل مشاهده است؛ ۱۰) کیسه رویانی بالغ با ساختار سلولی شده. سه سلول آنتی­پود (Ant) با آرایش مثلثی به همراه زوائد سیتوپلاسمی در حال تحلیل در این شکل دیده می­شود. هسته هر سه سلول قابل رؤیت می­باشد. دستگاه تخم (Eg) متشکل از دو سلول همراه و سلول تخم­زا و همچنین هسته های قطبی (PN) قابل مشاهده است.  ۱۱) تلفیق دو هسته قطبی (PN)  همزمان با لقاح آنها با اسپرم دیده می شود. ۱۲) مشاهده لقاح دو هسته قطبی با یک اسپرم (SP) قابل مشاهده است.  ۱۳ و ۱۴) مراحل اولیه رویان­زایی با تقسیمات سلول تخم پیش رویان (Em) و سوسپانسور (Su) به وجود آمده است (بزرگنمایی 400×). 

اولین تقسیم میوزی مگاسپوروسیت موجب تشکیل دو هسته هاپلوئید  و پس از سیتوکینز دو سلول دیاد هاپلویید (شکل 4) می­گردد. در نمونه لام­های تهیه شده از مراحل تکوین تخمک در این گیاه هم ازدیاد طولی و ازدیاد عرضی  مشاهده شد. دومین تقسیم میوزی موجب تشکیل چهار سلول تتراد می­شود. انواع تترادها را در این نمونه می‌توان مشاهده کرد از جمله نوع خطی طولی ، خطی عرضی (4 سلول کنار هم)، T شکل و چهار وجهی (شکل­5). از چهار سلول حاصل از میوز، سه سلول تحلیل می روند وفقط یک سلول (مگاسپور عملکردی) باقی می ماند. در این نمونه موقعیت سلول باقیمانده یا مگاسپور عملکردی سفتی (میکروپیلی) است. در  B.fluitans وقتیمیوز با تشکیل تتراد به پایان می­رسد، پوسته تخمک حدوداً 4/3 جسم تخمک را می پوشاند (شکل 5 و 6). مگاسپور عملکردی سه تقسیم میتوزیمتوالی را انجام می­دهد  و کیسه رویانی دو هسته­ای ، کیسه رویانی چهار هسته­ای (شکل 7) و در نهایتکیسه رویانی هشت هسته­ای (شکل 8) را به وجود می­آورد سیتو کینز در کیسه رویانی رخ داده و منجر به سلولی شدن آن می شود و کیسه رویانی هفت سلولی (شکل 9) به وجود می­آید. سه سلول در قطب مجاور سفت  استقرار می یابند و دستگاه تخم زا را به وجود می آورند. دستگاه تخم زا شامل یک سلول تخم­زای  بزرگ و گلابی شکل است و به واسطه داشتن یک هسته درشت و یک واکوئل بزرگ قابل تشخیص است، و دو سلول کناری (سینرژیدها) است (شکل 10). در قطب بنی، سلولهای آنتی­پود به وجود می­آید که آنها نیز آرایشی مثلثی شکل دارند، در نمونه مورد بررسی این سلولها غول پیکر بوده، از قدرت رنگ پذیری بالایی برخوردارند و به سمت مرکز کیسه رویانی مهاجرت می کنند (شکل 10). سلولهای آنتی­پودی بر روی پوستامنت واقع شده­اند. پوستامنت برجسته می­شود و آنتی­پود­ها را به طرف مرکز کیسه رویانی می­راند. سلولهای آنتی­پود، بزرگترین سلولهای کیسه رویانی هستند. سیتوپلاسم آنها متراکم است و هسته­ کروی یا بیضی شکل دارند. شمار این سلولها و تعداد هسته­ آنها در طی تکوین (نموشان) افزایش نمی­یابد اما آنها به طور قابل ملاحظه­ای بزرگ می­شوند و دارای هسته حجیمی هستند که نمایان­گر وجود پلی پلوئیدی در آنها است. یک یا دو عدد از سلولهای آنتی­پودی بعد از لقاح همچنان حضور دارند و در واقع پایا هستند. توسعه آنتی­پود­ها همراه با واکوئل سازی در سیتوپلاسم و افزایش در ابعاد هسته و هستک است (شکل­ 10). هسته های قطبی در کیسه رویانی در راس سلولهای آنتی­پودی قرار گرفته (شکل 11) و به زودی به هم ملحق می‌شوند تا هسته ثانویه و سلول مرکزی  (شکل 12) را تشکیل ‌دهند. سلول مرکزی (هسته ثانویه) ارتباطات سیتوپلاسمی با آنتی­پود­ها برقرار می­نماید، در واقع این ارتباطات سیتوپلاسمی بین کلیه سلولهای کیسه رویانی برقرار است. سپس سلول مرکزی مهاجرت کرده و در زیر دستگاه تخم قرار می‌گیرد. در  B.fluitans هسته ثانویه قبل از لقاح تشکیل می‌شود. به دنبال ورود لوله گرده به تخمک (شکلهای 12- 14) و انجام لقاح مضاعف، سلول تخم و سلول مادر آندوسپرم تشکیل می­شود. با اولین تقسیم سلول تخم، سلول راسی و قاعده­ای شکل می­گیرد (شکل 13). ادامه تقسیمات، رویان را ایجاد می­کند (شکل 14). با تشکیل کیسه رویانی و سلولهایی که قابلیت لقاح را دارند، یعنی تخم­زا (هاپلوئید) و هسته­دوتایی (دیپلوئید) تکوین تخمک به پایان می­رسد. در طی بلوغ کیسه رویانی کلاهک خورشی تحلیل می­رود. در این گونه تکوین کیسه­رویانی از تیپ پلی­گونوم پیروی می­کند. کیسه رویانی در طی بلوغ گلابی شکل شده و بسیار عریض می­گردد.

تکوین پرچم، بساک و دانه گرده: تکوین پرچمها با پدید آمدن توده­های سلولی بیضی شکلی بر روی نهنج آغاز می‍شود، این توده­ها از سلولهای مشابهی تشکیل شده­اند (شکل 1). این توده­های سلولی شروع به رشد و تمایز می‍کنند و برجستگیهایی در طرفین آنها به وجود می­آید که محل تشکیل بساک خواهند بود، بساک از نوع چهار کیسه گرده­ای (تتراسپورانژی) است (شکل 15).

شکلهای ۲۲ ـ۱۵) برخی از مراحل تکوین دانه گرده و بساک در آلاله آبی

۱۵) بساک در حال تکوین  دارای چهار کیسه گرده. ۱۶) سلولهای مادر گرده (PMC) در یک کیسه گرده بساک دیده می شوند که آماده تقسیم میوز هستند. در اطراف آنها لایه کالوزی تشکیل شده است (X400) ۱۷) اوایل مرحله پروفازI  در سلولهای مادر گرده (X1000). ۱۸) سلولهای مادر گرده در اواخر مرحله پروفاز میوز I . ۱۹) مرحله متافاز  در سلولهای مادر گرده و صفحه متافازی از زوایای مختلف قابل رویت است. ۲۰) سلولهای مادر گرده در مرحله آنافاز میوز. ۲۱)  سلولهای مادر گرده در مرحله آنافاز میوز. سلولهای تاپی نیز در تصویر دیده می شوند.۲۲) دو کیسه گرده با سلولهای در حال میوز دیده می شوند (بزرگنمایی 400×).

تعداد پرچمها در گونه مورد بررسی پنج عدد است که خامه را در بر گرفته­اند. در طرح اولیه پرچمها برخی از سلولهای زیر اپیدرمی به آرکئوسپورها تمایز می­یابند، سپس هر یک از آنها با تقسیمات مماسی خود بافت هاگ زا و لایه­های جداری میکروسپورانژ را به وجود می­آورند. سلول هاگ زا با تقسیمات میتوزی تکثیر می­یابد و توده­ای از سلولهای مادر گرده را با هسته حجیم ایجاد می­کنند که رنگ­پذیری بالایی را نشان می­دهند ( شکل 15). سلولهای حاشیه­ای نیز با تقسیمات میتوزی خود لایه­های تشکیل­دهنده دیواره بساک را بنیان­گذاری می­کند ( شکل 15). این لایه­ها از بیرون به داخل شامل یک لایه سلول اپیدرمی، یک لایه مکانیکی، یک لایه میانی (موقت) و یک لایه تاپی در مجاورت سلولهای مادر گرده می­باشد. اپیدرم در این گونه فاقد هر گونه تزئین و کرک می­باشد. لایه میانی در این نمونه نازک و دارای یاخته­های کشیده می­باشد. یاخته­های لایه تاپی کروی-بیضی، غالباً دو هسته­ای یا تک هسته­ای هستند و به سمت حفره داخل بساک رشد می­کنند (شکل 17 و 16). یاخته­های لایه تاپی در مراحل مختلف نمو بساک و دانه­های گرده در جای خود ثابت باقی مانده و تحلیل نمی­روند ( شکلهای 18-19) بنابراین این لایه از نوع ترشحی است. همزمان با بلوغ میکروسپورها به دانه گرده ترشحات لایه تاپی در لابه لای میکروسپورها قابل مشاهده است (شکل 24). در مرحله دانه­های گرده تک یاخته­ای و دو یاخته­ای، یاخته­های لایه تاپی تقریباً تحلیل می­روند اما هنوز بقایایی از آنها قابل مشاهده است (شکل 25). لایه موقت در همان مراحل اولیه تکوین گرده­ها به مصرف می­رسد. لایه مکانیکی هم در مرحله دانه­های گرده تک یاخته­ای و دو یاخته­ای ضخیم شدگی فیبری را تشکیل می­دهد (شکل27).

یاخته­های هاگ زای تشکیل یافته از یاخته­های آرکئوسپور مستقیماً به میکروسپوروسیت تمایز می­یابد، این سلولها دارای هسته درشت و رنگ­پذیری بالایی دارند و هسته در وسط واقع شده که نشان­دهنده آمادگی این سلولها برای تقسیم می باشد (شکل 16). در طی فرآیند میکروسپورزایی، میوز در هر میکروسپور آغاز می­شود به طوری که پروفاز I (شکل 17 و 18(، متافازI (شکل 19)، آنافاز I (شکل 20) و تلوفاز I (شکل 21) دو سلول n کروموزومی تشکیل می­دهند. سپس وارد دومین تقسیم میوزی می­شوند و در طی مراحل متافاز II ، آنافاز II و تلوفاز II (شکل 22) تتراد­ها را به وجود می­آورند. تتراد­های میکروسپوری از نوع تتراهدرال (شکل 23) هستند. کمی بعد از ورود سلولهای مادر گرده به میوز دیواره کالوزی با حجم زیاد دراطراف آنها تشکیل می­شود . در مرحله بعد دیواره کالوزی تحلیل رفته و سلولهای تشکیل دهنده تترادها از هم جدا می­شوند و میکروسپورهای جوان آزاد می­شوند، که در زمان آزاد شدن واکوئله نبوده، دارای شکل منظم، سیتوپلاسم متراکم و هسته مشخص در وسط هستند (شکل 25). میکروسپورها میزان نشاسته­ای شدن بالایی را نشان می­دهند. به تدریج تزئینات اگزین در میکروسپورها تشکیل می­شود( شکل 26). تقسیم سلول میکروسپوروسیت دو هسته نابرابر را به وجود می­آورد: یک هسته بزرگ رویشی و یک هسته زایشی کوچک که منجر به تشکیل دانه گرده دو هسته­ای و در نهایت دو یاخته­ای می­شود (شکلهای 27 و 28). دانه­های گرده بالغ سه شیاره بوده که محل رویش لوله گرده هستند، اما در این گونه دانه گرده از نظر اندازه و تعداد شیارها متفاوت بوده، تعداد شیارها از 5-3 متغیر بوده و همچنین در مقایسه با  دانه­های گرده سه شیاره دارای اندازه بزرگتری هستند (شکل 28).

بحث 

در خانواده Ranunculaceae توالی بنیان گذاری مارپیچی اندامهای گل یک الگو است (۲3) و یک سطح سیستماتیکی پایین را نشان می­دهد (8). در بازال آنژیوسپرم­ها تخمکهای پرخورش غالب هستند (24) و تیره آلاله در بین تاکسونهای ابتدایی دو لپه­ای­ حجیم­ترین خورش را دارد.

شکلهای ۲۸-۲۳) برخی از مراحل تکوین دامنه گرده آلاله آبی

۲۳) تقسیم دوم میوز همراه با سیتوکینز همزمان موجب تشکیل تتراد در بساک شده است.  ۲۴) لایه کالوزی اطراف تترادها در حال تحلیل است و میکروسورهای در حال رهایی دیده می شوند. ۲۵) میکروسپورهای آزاد شده تک هسته ای دیده می شوند. ۲۶) میکروسپورهای در حال بلوغ دیده می شوند. آنها با یک تقسیم میتوز به حالت دوهسته ای در آمده اند. بقایای سلولهای لایه تاپی هنوز قابل رویت است.   ۲۷) کیسه گرده بالغ که فقط لایه مکانیکی آن باقی مانده است و بقیه لایه های دیواره بساک از بین رفته اند. دانه های گرده بالغ دو هسته ای در آن مشهود است. ۲۸)  دانه های گرده بالغ دو سلولی در این گونه قابل رویت است (بزرگنمایی تصاویر 23 تا 27 400× بزرگنمایی تصویر 28، 400×).