نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری بیوشیمی دانشگاه گیلان
2 استادیار بیوشیمی گروه زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه گیلان
چکیده
تحقیقات گستردهای برروی پایدار ی پروتئازها درحلالهای آلی انجام شده است، زیرا این آنزیمها کاربردهای فراوانی درحلالهای آلی دارند. الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا ازجمله Zn-متالوپروتئازهای مقاوم به حلالهای آلی است. اما، آنزیم همولوگ آن، ترمولیزین باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس، دارای پایداری دمایی بالا است درحالیکه پایداری بسیار کمی در حلالهای آلی دارد. این آنزیم از نظر صنعتی مهم بوده و به ویژه در سنتز پپتید کاربرد دارد. در این تحقیق الاستاز نوترکیب خالص گردید و با ترمولیزین در حضور حلالهای آلی مختلف مورد مطالعات مقایسه ای قرار گرفت. بدین منظور، فعالیت آنزیمها در غلظتهای V/V)% 50-0 )از حلالهای آلی اتانول، متانول، ایزوپروپانول، دی متیل فرمامید، گلیسرول و اتیلن گلیکول اندازهگیری شد. فعالیت الاستاز در حضور همه حلالهای آلی، به کار رفته به جز اتانول، در تمامی غلظتها نه تنها کاهش نیافته بلکه روند افزایشی را نشان داده، در حالی که فعالیت ترمولیزین در شرایط مشابه کاملا از دست رفت. از سوی دیگر، فعالیت الاستاز در حضور DTT 1 میلی مولاردر تمام حلالها به شدت کاهش یافت. با توجه به اینکه الاستاز دارای یک پیوند دی سولفیدی در دمین آمینوترمینال و یک پیوند دی سولفیدی در دمین کربوکسی ترمینال میباشد میتوان پیشنهاد نمود که دلیل پایداری الاستاز در حلالهای آلی وجود این پیوندهای دیسولفیدی میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
comparable studies on the stability of proteases from Pseudomonas aeruginosa against thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus in the presence of organic solvents
نویسندگان [English]
2 assistant professor in the field of biochemistery
چکیده [English]
Extensive research has been conducted on the stability of proteases in organic solvents, because they have numerous applications in organic media. Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus is a highly thermostable Zn-metalloprotease and is applied in industry for peptide synthesis, a reaction essentially performs in organic media. However, thermolysin has low stability at organic solvents.In contrast, its homologous enzyme, Pseudomonas aeruginosa elastase (PAE) is an organic solvent stable protease. In the present study, recombinant PAE was purified and compared with thermolysin in different organic solvents. For this purpose, activity of enzymes was measured in ethanol, methanol, isopropanol, dimethylformamide, glycerol and ethylenglycol (0-50 % (V/V)). Except isopropanol and ethanol, not only the elastase activity was not decreased, but also strongly increased in organic solvents. However, activity of thermolysin was abolished in all organic solvents. In the presence of DTT 1mM, the PAE activity was notably decreased in organic solvents. Considering that PAE contains two disulfide bonds at N- and C-terminal domains, it may suggest that disulfide bonds play a role in organic solvent stability of PAE.
کلیدواژهها [English]
مطالعات مقایسهای مقاومت پروتئازحاصل ازسودوموناس آئروجینوزا در مقایسه با ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس در حلالهای آلی
افسانه صدرممتاز و سید محسن اصغری*
رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 12/8/94 تاریخ پذیرش: 18/10/94
چکیده
تحقیقات گستردهای برروی پایداری پروتئازها درحلالهای آلی انجام شده است، زیرا این آنزیمها کاربردهای فراوانی درحلالهای آلی دارند. الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا ازجمله Zn-متالوپروتئازهای مقاوم به حلالهای آلی است. اما، آنزیم همولوگ آن، ترمولیزین باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس، دارای پایداری دمایی بالاست درحالیکه پایداری بسیار کمی در حلالهای آلی دارد. این آنزیم از نظر صنعتی مهم بوده و به ویژه در سنتز پپتید کاربرد دارد. در این تحقیق الاستاز نوترکیب خالص گردید و با ترمولیزین در حضور حلالهای آلی مختلف مورد مطالعات مقایسه ای قرار گرفت. بدین منظور، فعالیت آنزیمها در غلظتهای (V/V) 50-0 درصد از حلالهای آلی اتانول، متانول، ایزوپروپانول، دی متیل فرمامید، گلیسرول و اتیلن گلیکول اندازهگیری شد. فعالیت الاستاز در حضور همه حلالهای آلی، به کار رفته به جز اتانول، در تمامی غلظتها نه تنها کاهش نیافته بلکه روند افزایشی را نشان داده، در حالی که فعالیت ترمولیزین در شرایط مشابه کاملاً از دست رفت. از سوی دیگر، فعالیت الاستاز در حضور DTT 1 میلی مولاردر تمام حلالها به شدت کاهش یافت. با توجه به اینکه الاستاز دارای یک پیوند دی سولفیدی در دمین آمینوترمینال و یک پیوند دی سولفیدی در دمین کربوکسی ترمینال میباشد میتوان پیشنهاد نمود که دلیل پایداری الاستاز در حلالهای آلی وجود این پیوندهای دیسولفیدی میباشد.
واژه های کلیدی: متالو پروتئاز، ترمولیزین، الاستاز، حلال آلی، فعالیت آنزیمی
* نویسنده مسئول، تلفن:09122432070 ، پست الکترونیکی: sm_asghari@guilan.ac.ir
مقدمه
پروتئازها یکی از مهمترین رده از آنزیمهای هیدرولیتیک هستند که براساس فعالیت کاتالیتیک به انواعی همچون متالوپروتئازها، سرین پروتئازها و سیستئین پروتئازها و آسپارتیک پروتئازها تقسیم میشوند (6). این دسته از آنزیمها پیوندهای پپتیدی را در محیط آبی هیدرولیز کرده و در محیطهای غیر آبی سنتز میکنند (5، 9، 20 و 21). این آنزیمها گسترهای از کاربردها را در فرآیندهای صنعتی مانند صنایع شوینده، غذایی کاغذ، چرم و دارویی دارند (11). همچنین از آنها در سنتز پپتید، تشخیص معرفها، تعیین توالی پروتئیین و بازیافت silver از فیلمهای فتوگرافیک و x-rayاستفاده میشود (22). پایداری حرارتی دربسیاری از پروتئازها مانند ترمولیزین به اتصال آنها به یون(های) کلسیم وابسته است. فعالیت کاتالیتیک پروتئازهای خانواده ترمولیزین (TLPs) وابسته به یون روی در جایگاه فعال میباشد. ترمولیزین در عدم حضور آب فعالیت کمی داشته یا غیر فعال است (8 و 26). به سبب کاربرد صنعتی، به ویژه برای سنتز پپتید در حضور برخی حلالهای آلی، فعالیت پروتئازهای خانواده ترمولیزین در حلال آلی بسیار مورد توجه محققین بوده است (12 و 18). از جمله پروتئازهای پایدار در محیطهای آلی، سودوموناس آئروجینوزا میباشد (4 و 10). در تحقیق حاضر فعالیت آنزیم الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا (24) در مقایسه با ترمولیزین[Ec 3.4.24.27] (3) در حضور حلالهای آلی بررسی و نقش پیوند دی سولفیدی در پایداری الاستاز مورد مطالعه قرار گرفته است (17). از جمله دلایل انتخاب و مقایسه این دو آنزیم در کنار هم در تحقیق حاضر و همچنین مطابق مطالعات انجام شده (17) نشان داده است، توالی آمینواسیدی پروتئاز الاستاز بسیار مشابه ترمولیزین است. همولوژی ساختار اول 33 درصد و ساختار سه بعدی کلی پروتئاز الاستاز بسیار شبیه به ترمولیزین است (شکل1).
شکل1- مقایسه ساختار 3 بعدی الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا با ترمولیزین
مواد و روشها
مواد: آنزیم ترمولیزین از شرکت سیگما و کازئین، CaCl2، تریس و سایر مواد استفاده شده از شرکت مرک آلمان خریده شد.
بیان و خالص سازی: در مطالعات قبلی ژن الاستاز حاصل از Pseudomonas aeruginosa سویه PTCC1430 در pET21a+ کلون شد و سپس در E.coli بیان گردید. در این تحقیق بهینه سازی تولید انجام گردید. بنابر نتایج بهینه سازی بهترین زمان برای بیان 10 ساعت، دمای بهینه جهت تولید آنزیم 37 درجه سانتی گراد، غلظت بهینه IPTG برابر 1 میلی مولار تعیین گردید. سپس با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی با ستون نیکل-سفارز تخلیص انجام شد (15). در این مرحله با استفاده از بافر شستشو سایر پروتئینها از ستون عبور کرده و تنها پروتئین الاستاز به علت وجود دنباله هیستیدینی به ستون متصل میشود. در مرحله بعد به کمک بافر جداکننده در حضور غلظت بالای ایمیدازول جداسازی انجام شد. نمونههای خالص شده روی ژل SDS-PAGE 12 درصد بررسی شد. پروتئینهای خالص شده سپس دیالیز شدند.
سنجش فعالت آنزیمی: فعالیت الاستاز و ترمولیزین با روش Endpoint تعیین شد. پیش ماده استفاده شده برای واکنش، کازئین 1 درصد (W/V) بود. از تریس 20 میلی مولار با 5/7=pH به عنوان بافر و از تری کلرواستیک اسید (TCA) 10 درصد به عنوان متوقف کننده واکنش استفاده شد. واکنش پروتئولیز، 10 دقیقه در 60 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از پایان واکنش، به اندازه حجم محیط سنجش (250 میکرولیتر)، TCA اضافه شد. پس از متوقف کردن واکنش، مقدار جذب در طول موج 280 نانومتر به عنوان فعالیت آنزیم در نظر گرفته شد (21). برای به دست آوردن واحد فعالیت آنزیمی، منحنی استاندارد غلظتهای تیروزین رسم شد. همچنین در مورد DTT، بعد ازطی زمان 10 دقیقه انکوباسیون پروتئین در مجاورت DTT 1 میلی مولار در دمای اتاق در حضور و عدم حضور حلالهای آلی قرار گرفت و سنجش فعالیت آنزیمی انجام شد.
بررسی مقاومت آنزیم در حلالهای آلی: پروتئینهای خالص الاستاز و ترمولیزین در غلظتهای (v/v %)50-0 از حلالهای اتانول، متانول، ایزوپروپانول، گلیسرول، اتیلن گلیکول و دی متیل فرمامید تحت شرایط ثابت غلظت آنزیم تعیین فعالیت شدند. با بررسی Log P این حلالها (23) رنج متنوعی از حلالهای غیرقطبی تا قطبی را شامل میشوند، که رفتار آنزیم را با توجه به ساختارهای سطحی پروتئین و ویژگیهای پیوند دی سولفیدی به طور قابل ملاحظهای متأثر می سازد. همچنین آنزیم ترمولیزین در محیط برخی از حلالهای آلی منتخب (اتانول،متانول، ایزوپروپانول و ...) در این تحقیق سنتز پپتید را نیز انجام میدهد که از جمله کاربردهای صنعتی مهم این آنزیم می باشد (14). برای سنجش مقاومت آنزیم در حلال آلی، سوبسترای مورد استفاده کازئین (1% w/v) و بافر مورد استفاده تریس 20 میلی مولار با pH برابر با 8 و زمان سنجش آنزیمی 10 دقیقه میباشد. فعالیت آنزیم به صورت درصد فعالیت باقی مانده در مقایسه با کنترل (بدون حلال آلی) گزارش گردید (23).
نتایج
میزان فعالیت باقی مانده آنزیم الاستاز و ترمولیزین در
حضور غلظتهای مختلف حلال آلی اتانول، متانول، ایزوپروپانول،گلیسرول، دی متیل فرمامید و اتیلن گلیکول در مورد هر دو آنزیم در مقایسه با حالت کنترل تعیین گردید (شکل 2و3). همانطور که در یافتهها مشاهده میشود در مورد آنزیم الاستاز (شکل 2) هیچ یک از حلالهای آلی فعالیت آنزیم را از بین نبردند و فقط اتانول و ایزوپروپانول در برخی غلظتها موجب کاهش فعالیت آنزیم شدند و در سایر موارد فعالیت افزایش یافته است. در مقابل، فعالیت آنزیم ترمولیزین در تمامی غلظتهای حلالهای آلی کاهش یافته است (شکل 3) (5).
همان گونه که در مقدمه ذکر شد، الاستاز دارای دو پیوند دی سولفیدی در دمین آمینو- و کربوکسی ترمینال است (16) درحالیکه این پیوندها در ترمولیزین وجود ندارد. جهت بررسی نقش این پیوند در پایداری الاستاز در برابر حلالهای آلی، فعالیت الاستاز در غلظت (V/V) 50 درصد و در حضور mM DTT 1 بررسی گردید. DTT موجب احیای دی سولفید و شکسته شدن این پیوند میشود. بنابراین، انتظار میرود الاستاز در حضور آن فاقد پیوند دیسولفیدی باشد. نتایج این بررسی آشکار ساخت که پایداری الاستاز در حضور حلالهای آلی به شدت وابسته به پیوند دی سولفیدی میباشد (13) (جدول 1). در تمامی موارد، فعالیت آنزیم در حضور حلال آلی به شدت کاهش یافت و حتی در مورد ایزوپروپانول و اتانول این میزان به صفر رسید.
بحث
میکروارگانیسم ها مهمترین و ایده آل ترین منبع تولید کننده آنزیمهای مختلف با دامنه کاربردهای گسترده به شمار می آیند. از مزایای آنزیمهای میکروارگانیسم ها می توان به امکان کنترل فیزیولوژیکی و فیزیکو شیمیایی، تنوع آنزیمی و مقادیر بالای تولید اشاره نمود(1). در این راستا، جداسازی و غربالگری آنزیمهای جدید با خصوصیات موثر و بهینه از میکروارگانیسمهای ساکن طبیعت به عنوان اولین مرحله در مسیر تحقیق و توسعه محصولات آنزیمی محسوب می شود (2).
شکل2- فعالیت باقیمانده الاستاز در حضور غلظتهای مختلف حلالهای آلی (a) دی متیل فرمامید، (b) گلیسرول، (c) اتیلن گلیکول، (d) ایزوپروپانول، (e) اتانول، (f) متانول.
شکل3- فعالیت باقیمانده ترمولیزین در حضور غلظتهای مختلف حلالهای آلی (a) متانول، (b) اتانول، (c) ایزوپروپانول، (d) اتیلن گلیکول، (e) گلیسرول، (f) دی متیل فرمامید
جدول1- مقایسه فعالیت باقیمانده آنزیم الاستاز در حضورDTT mM 1در حضور و عدم حضور حلالهای آلی در دمای اتاق. |
||||||
اتانول |
ایزوپروپانول |
متانول |
اتیلن گلیکول |
گلیسرول |
DMF |
درصد حلال نوع |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
0% * |
50 (صفر) |
56 (صفر) |
250 (11) |
115 (34) |
116 (23) |
133 (18) |
50% |
* در عدم حضور حلاهای آلی، mM DTT 1تاثیر معنی داری بر فعالیت آنزیم نداشته است. |
همان طور که اشاره شد دو پروتئین ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس و الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا، علی رغم، همولوژی در ساختار و ترادف آمینواسیدی تفاوتهای فراوانی در پایداری نسبت به حلالهای آلی نشان میدهند (19). بیشتر تفاوت این دو پروتئین مربوط به دمین آمینوترمینال آنها میباشد.
در تحقیق حاضر، در تمامی حلالهای آلی فعالیت الاستاز به طور قابل ملاحظهای بیشتر از ترمولیزین بوده است. در حلالهای دی متیل فرمامید، متانول و اتیلن گلیکول فعالیت آنزیم مقادیری بالاتر از کنترل (عدم حلال آلی) را نشان داده است این نشان میدهد که تغییرات ساختاری ناشی از حلال آلی حتی اثرات مطلوبی بر فعالیت این آنزیم داشته است. در مقابل، فعالیت آنزیم ترمولیزین در حضور این حلالها کاهش یافته است. این نتیجه پیشنهاد میکند که حلالهای آلی موجب اثرات ساختاری نامطلوب و در نتیجه کاهش فعالیت در ترمولیزین شده است.از سوی دیگر، در حلالهای آلی ایزوپروپانول و اتانول هر دو آنزیم دچار کاهش فعالیت شدند. با این حال، در این حلالها نیز آنزیم الاستاز به طور قابل ملاحظهای پایدارتر از ترمولیزین بوده است. جهت بررسی دقیق اثر حلالهای آلی بر فعالیت و پایداری آنزیمها لازم است به میزان قطبیت حلالها توجه گردد. پارامتری که میزان قطبیت حلالهای آلی را به طور کمی بیان میدارد Log P نام دارد که عبارت است از لگاریتم بر پایه 10 ثابت تفکیک (P) که به عنوان نسبت غلظت حلال آلی به غلظت فاز آبی تعریف میشود:
Partition coefficient (P) = [organic] / [aqueous]
هر چه میزان Log P بزرگتر باشد، میزان قطبیت حلال آلی کمتر است. براساس این تعریف Log P حلالهای مورد استفاده در تحقیق حاضر به صورت اتانول< ایزوپروپانول< اتیلن گلیکول< گلیسرول< DMF< متانول میباشد. به عبارت دیگر ایزوپروپانول غیرقطبی ترین و گلیسرول قطبی ترین حلال مورد استفاده نسبت به آب است. بنابراین ارتباط مستقیم و مشخصی مابین قطبیت حلال آلی و مقاومت آنزیم به حلال آلی مشاهده نمیگردد. این در حالی است که پاژنگ و همکاران (23) بیان داشتند که در مورد آنزیم ترمولیزین هر چه Log P افزایش یابد مهار نیز بیشتر خواهد شد که در این تحقیق به این مهم نیز دست یافته شد. مطالعات انجام شده پس از شکسته شدن پیوند دیسولفیدی توسط DTT آشکار ساخت که پایداری قابل ملاحظه الاستاز تا حد زیادی وابسته به پیوند دیسولفیدی است. با در نظر گرفتن این نکته که الاستاز دارای 2 پیوند دی سولفیدی در دمینهای آمینو- و کربوکسی ترمینال میباشد و این یافته که شکسته شدن این پیوندها موجب کاهش شدید پایداری الاستاز برابر حلالهای آلی شده است. مهندسی آنزیم ترمولیزین دارای پیوندهای دی سولفیدی در نواحی متناظر با الاستاز میتواند منجر به دستیابی به آنزیمهایی با پایداری بیشتر در جهت کاربردهای صنعتی از جمله سنتز پپتید در حلالهای آلی گردد (17). با بررسی Log P حلالهای مورد استفاده در این تحقیق و از طرفی وابسته بودن مکانیسم عملکرد حلالهای آلی، به ساختار سطحی پروتئین و همچنین تغییرات ناشی از تشکیل پیوند دی سولفیدی در آرایش ساختاری آنزیم، پی به ویژگی و تأثیر هر حلال با وجود قطبیت و هیدروفوبیسیته اش بر فعالیت و پایداری آنزیم در محیط آن حلال برده شد.
تشکر و قدردانی: نویسندگان مقاله کمال تشکر و قدردانی را از آزمایشگاه بیوشیمی دانشکده علوم پایه و معاونت پژوهشی دانشگاه گیلان ابراز میدارند.
1- شهباز محمدی، ح. و امیدی نیا، ا. 1387. جداسازی، غربالگری و تعیین خصوصیات آنزیمی میکروارگانیسمهای تولید کننده آمینواسید دهیدروژنازها از نمونههای خاک ایران. مجله زیست شناسی ایران. جلد 21، شماره 1، ص 94-104.
2- مشایخی، ف.، امیدی نیا، ا.، شهباز محمدی، ح.، ابراهیمی راد، م.، حسین خانی، س. و گره گوریان، آ. 1389. تخلیص و بازیافت آلکالین پروتئاز مقاوم به حرارت در سامانه های دوفازی آبی. مجله زیست شناسی ایران.جلد23،شماره3،ص367-376.