نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد زنجان، گروه ژنتیک، زنجان، ایران
2 هیئت علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه زیست فناوری دام
3 هیئت علمی دانشگاه آزاد زنجان
4 هیئت علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
چکیده
مقدمه: از زمان اولین انجماد شیشهای رویان موش در سال 1985، تلاشهای قابل توجهی برای توسعه و بهبود این تکنیک صورت گرفته است اما همچنان انجماد با اعمال آسیبهای جدی بیوشیمیایی و کروموزومی بر روی رویان میتواند باعث تغییراتی در الگوی بیان ژنهای دخیل در تکوین و عملکرد، کاهش لانهگزینی و نهایتا مرگ رویان گردد. هدف از این مطالعه بررسی تاثیرات انجماد شیشهای بر زندهمانی و رشد و بررسی بیان ژنهای تخصصی پرتوانی موثر در تکوین رویان از جمله ژنهای Oct4 و Nanog در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شدهی موش بود. روش کار: پس از تحریک تخمکگذاری موشهای ماده و استحصال بلاستوسیست، فرآیند انجماد با حضور دیمتیل سولفوکسید 15%، اتیلنگلیکول 15% و ساکارز 5/0 مولار به عنوان مواد سرمامحافظ در محیطهای انجمادی انجام شد و بلاستوسیستها با قرارگیری روی Cryotop، به درون ازت مایع منتقل گشتند. فرآیند ذوب نیز با شستوشوی رویانها در محیط ذوب حاوی ساکارز 1 مولار صورت پذیرفت.
نهایتا میزان زندهمانی، خروج بلاستوسیستها از زونا و نیز بیان ژنهای Oct4 و Nanog به روش real time- PCR در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شده و شاهد ارزیابی شد. نتایج: نرخ زندهمانی و خروج بلاستوسیستها از زونا در تیمار انجماد نسبت به بلاستوسیستهای منجمد نشده بطور معنیداری کاهش یافتند (81/5±43/94% در مقابل 100% برای زندهمانی و 76/11±78/57% در مقابل80/5± 88/86% برای خروج بلاستوسیست از زونا). همچنین بیان ژنهای Nanog و Oct4 افزایش یافت. نتیجهگیری: با توجه به یافتههای این آزمایش میتوان گفت که انجماد شیشهای بلاستوسیست موش سوری در مرحلهی بلاستوسیست میتواند باعث تغییر بیان ژن و کیفیت رویان گردد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
The effect of vitrification on pluripotency specific genes, Oct4 and Nanog in mouse blastocysts
نویسندگان [English]
1 Department of Genetics, Zanjan Branch, Islamic Azad University, Zanjan, Iran
چکیده [English]
Introduction: From the first vitrification of mouse embryos in 1985, considerable efforts have been made to develop and improve cryopreservation techniques, but still biochemical and fetal chromosomal abnormalities caused by vitrification can cause changes in the pattern of genes expression involved in embryonic development and function, reduced implantation and fetal death. The purpose of this study was to investigate the effects of vitrification on survival and the expression of pluripotency specific genes like Oct4 and Nanog in the vitrified-warmed mouse blastocysts. Methods & Materials: Harvested blastocysts from superovulated female mice were vitrified in the presence of dimethyl sulfoxide 15%, ethylene glycol 15% and sucrose 0.5 M as cryoprotectants and vitrified in liquid nitrogen after loading on Cryotop. Thawing process was performed by immersing the blastocysts in thawing solution prepared using sucrose 1 M. Survival and hatching rates were evaluated and also the Oct4 and Nanog genes expression in vitrified- thawed and fresh blastocysts (control group) were assessed by real time-PCR method. Results: Survival and hatching rates decreased significantly in vitrified blastocysts compared with control group (94.43± 5.81% vs. 100% for survival and 57.78± 11.76% vs. 86.88± 5.80% for hatching). Also increased expression of Nanog and Oct4 genes were observed in vitrified- warmed blastocysts. Conclusion: Considering the results of this study, it can be said that vitrification of mouse embryo at the blastocyst stage can change gene expression and quality of the embryo.
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر انجماد شیشهای بر میزان بیان نشانگرهای اختصاصی پرتوانی، Oct4 و Nanog در بلاستوسیستهای موش سوری
پریسا فتحعلیزاده1، مجتبی دشتیزاد2*، گلناز اسعدی تهرانی1 و مرتضی دلیری جوپاری2
1 زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد زنجان، گروه ژنتیک
2 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
تاریخ دریافت: 9/9/93 تاریخ پذیرش: 26/11/93
چکیده
از زمان اولین انجماد شیشهای رویان موش در سال 1985، تلاشهای قابل توجهی برای توسعه و بهبود این تکنیک صورت گرفته است اما همچنان انجماد با اعمال آسیبهای جدی بیوشیمیایی و کروموزومی بر روی رویان میتواند باعث تغییراتی در الگوی بیان ژنهای دخیل در تکوین و عملکرد، کاهش لانهگزینی و نهایتاً مرگ رویان گردد. هدف از این مطالعه بررسی تأثیرات انجماد شیشهای بر زندهمانی و رشد و بررسی بیان ژنهای تخصصی پرتوانی مؤثر در تکوین رویان از جمله ژنهای Oct4 و Nanog در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شده موش بود. پس از تحریک تخمکگذاری موشهای ماده و استحصال بلاستوسیست، فرآیند انجماد با حضور دیمتیل سولفوکسید 15 درصد، اتیلنگلیکول 15 درصد و ساکارز 5/0 مولار به عنوان مواد سرمامحافظ در محیطهای انجمادی انجام شد و بلاستوسیستها با قرارگیری روی Cryotop، به درون ازت مایع منتقل گشتند. فرآیند ذوب نیز با شستوشوی رویانها در محیط ذوب حاوی ساکارز 1 مولار صورت پذیرفت. نهایتا میزان زندهمانی، خروج بلاستوسیستها از زونا و نیز بیان ژنهای Oct4 و Nanog به روش real time- PCR در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شده و شاهد ارزیابی شد. نرخ زندهمانی و خروج بلاستوسیستها از زونا در تیمار انجماد نسبت به بلاستوسیستهای منجمد نشده به طور معنیداری کاهش یافتند (81/5±43/94 درصد در مقابل 100 درصد برای زندهمانی و 76/11±78/57 درصد در مقابل80/5± 88/86 درصد برای خروج بلاستوسیست از زونا). همچنین بیان ژنهای Nanog و Oct4 افزایش یافت. با توجه به یافتههای این آزمایش میتوان گفت که انجماد شیشهای بلاستوسیست موش سوری در مرحله بلاستوسیست میتواند باعث تغییر بیان ژن و کیفیت رویان گردد.
واژه های کلیدی: انجماد شیشهای، بلاستوسیست موش، ژنهای Oct4 و Nanog
* نویسنده مسئول، 09123211058 ، پست الکترونیکی: dashtizad@nigeb.ac.ir
مقدمه
با موفقیت لقاح آزمایشگاهی (In vitro Fertilization: IVF) وتولد اولین نوزاد زنده پستانداران، در سال 1959 (3)، این روش به عنوان یکی از تکنیکهای کمک باروری معرفی گردید و امروزه در مراکز درمان ناباروری به صورت رایج مورد استفاده قرار میگیرد. از طرفی در مواردی که تعداد رویانهای تشکیل شده بیش از تعداد مورد نیاز جهت انتقال به رحم باشند، ضرورت حفظ و نگهداری آنها به منظور استفاده در دورههای درمانی بعدی (در صورت شکست) بیش از پیش اهمیت مییابد. این امر میتواند از طریق تکنیک انجماد میسر گردد که برای اولین بار در سال 1971 به لانهگزینی موفق، در رویان پستانداران (بلاستوسیست موش) منجر گردید (36). از آن پس نیز انجماد گامت و رویان در گونههای مختلف پستانداران درزمینههایی نظیر طب تولیدمثل، پرورش حیوانات، حفظ تغییرات ژنتیکی، به تعویق انداختن انتقال رویان در بیمارانی که در معرض خطر بالایی از سندرم تحریک بیش از حد تخمدان هستند، حفظ باروری بیمارانی که در حال آماده شدن برای شیمی درمانی و یا پرتو درمانی هستند و نیز برای داوطلبین اهداء گامت و رویان به کار گرفته شده است (21). در طی فرآیند انجماد به دلیل حضور آب درون سلولی و تشکیل کریستالهای یخ، استفاده از مواد سرما محافظ (Cryoprotective Agents: CPAs) الزامی است. اما از سوی دیگر نشان داده شده است که غلظت بالای این CPAs میتواند اثر سمی برای سلول به همراه داشته باشد (18). در دهه اخیر پیشرفتهای زیادی در علم زیست شناسی انجماد برای حفظ سلامت گامت و رویان انسانی و حیوانی به روشهای انجماد آهسته و انجماد شیشهای صورت پذیرفته است. در روش انجماد آهسته از ﻏﻠﻈتهای ﭘﺎیﻴﻦ CPAs ﺑــﺎ نرخ برودتی به میزان 1/0 تا 3/0 درجه سانتی گراد در دقیقه به منظور جلوگیری ازتشکیل کریستالهای یخ استفاده میشود. اما غلظت پایین CPAs و نرخ برودتی کم از طرفی و افزایش زمانی که رویان در معرض محدوده دمایی خطرناک انجماد و ذوب (15 تا 6- درجه سانتی گراد) قرار میگیرد از طرفی دیگر، باعث تشکیل ﻛﺮﻳﺴﺘﺎلهای ﻳـﺦ داﺧـﻞ و ﺧـﺎرج ﺳﻠﻮﻟﻲ و در نهایت آسیب به ساختار رویان میگردد (12 و 23). لذا اﻣــﺮوزه بتدریج این تکنیک جای خود را به انجماد شیشهای داده است که اوﻟـﻴﻦ ﺑـﺎر در ﺳـﺎل 1937 ﺗﻮﺳــﻂ Luyet و همکارانش ﻣﻄــﺮح گردید (19). در این تکنیک ﺑــﻪ دلیل ﻏﻠﻈﺖ ﺑﺎﻻی CPAs، امکان غوطهوری مستقیم رویان به داخل ازت مایع مقدور میباشد. نتیجه این امر افزایش چشمگیر در نرخ برودتی به میزان 20,000 درجه سانتی گراد در دقیقه و ﺗﺒــﺪﻳﻞ ﻳﻜﺒــﺎره ﻣﺤـﻴﻂ اﻃـﺮاف آن ﺑــﻪ ﻳــﺦ ﻓﺎﻗــﺪ ﻛﺮﻳﺴﺘﺎل است (2). پس از اولین انجماد موفق رویان پستانداران در سال 1985 (28)، این نوع انجماد تاکنون هم درمورد تخمک و هم درمورد رویان با موفقیت صورت گرفته است. اما چالش همیشگی در این زمینه، کسب نرخ بالای بقاء و افزایش احتمال موفقیت درلانهگزینی پس از ذوب و انتقال است. در این میان، رویانهای منجمد و ذوب شده در مراحل اولیه تسهیم (4-8 سلولی)، دارای نرخ بقای بالایی هستند ولی از طریق ویژگیهای مورفولوژیکی قابل پیشبینی در ادامه روند تکاملی نیستند و ریسک عدم موفقیت در حاملگی را بالا میبرند. در مقابل، بلاستوسیست بهترین مرحله برای انتقال رویان با پتانسیل تکوینی مناسب است. با این گزینش میتوان تعداد رویانهای انتقال یافته و ریسک ابتلا به چند قلوزایی را کاهش داد (37). همچنین با توجه به کوچک شدن اندازه بلاستومرها، کاهش میزان آب درون سلولی و افزایش نسبت سطح به حجم در طی فرآیند تسهیم، انتظار میرود نرخ زندهمانی رویانهای ذوب شده بلاستوسیست بیشتر از مراحل قبلی باشد.
اما در کنار این مزیتها، نرخ بقای بلاستوسیست پس از ذوب پایین است. از دلایل آن میتوان به حفره مملو از مایع بلاستوسل اشاره کرد که سرعت انتقال مواد ضد یخ و مولکولهای آب را کاهش و در نتیجه پتانسیل تشکیل کریستالهای یخ را افزایش میدهد. برای رفع این مشکل باید از غلظتهای بالاتر CPAsاستفاده نمود و یا رویان را مدت زمان بیشتری در معرض این مواد قرار داد، که هر دو خود از عوامل آسیبزا محسوب میشوند (1).
روشهای اﻧﺠﻤﺎد، ﻋﻠﻲرﻏﻢ ﻧﻘﺶ ﻏﻴﺮﻗﺎﺑﻞ اﻧﻜـﺎرشان در درﻣﺎن اﻓﺮاد ﻧﺎﺑﺎرور، ﺑﻪ دﻟﻴﻞ اﺛﺮات CPAs و ﺗﻐﻴﻴـﺮات ﺷﺪﻳﺪ ﺑﺮودﺗﻲ و ﺣﺮارﺗﻲ ﻣﻲﺗﻮانند ﺗأﺛﻴﺮهای ﻧـﺎﻣﻄﻠﻮﺑﻲ ﺑـﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎر ﺳﻠﻮل داﺷﺘﻪ و منجر به آﺳﻴﺐ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﺑﻪ ﻃﺮق ﻣﺨﺘﻠﻒ گردد. به عبارتی انجماد با اعمال آسیبهای جدی بیوشیمیایی و کروموزومی بر روی رویان میتواند با تغییر در الگوی بیان ژنی، موجب کاهش رشد و قابیت لانهگزینی و نهایتاً مرگ رویان گردد (7). به نظر میرسد انجماد با اثر بر بیان ژنهای دخیل در تکوین، توسعه و عملکرد رویان از جمله ژنهای پرتوانی توده داخلی بلاستوسیست میتواند بر کیفیت رویان اثرگذار باشد. از مهم ترین ژنهای مؤثر در ایجاد و حفظ ویژگی پرتوانی سلولهای بنیادی و تکامل اولیه رویان قبل ازلانهگزینی، میتوان به ژنهای تخصصی پرتوانی از جمله Oct4 و Nanog اشاره کرد که در توده سلولی داخلی بلاستوسیست (Inner Cell Mass:) بیان می گردند (22). نقص و یا عدم بیان ژن Oct4 منجر به تولید بلاستوسیستهایی خواهد شد که ICM آنها قدرت تمایز به سایر سلولها مانند اپیبلاست و کیسه زرده را ندارد و در مراحل اولیه تکامل رویانی و پیش از لانهگزینی از بین خواهند رفت (14). همچنین بلاستوسیستهای موش فاقد هر دو الل Nanog،ICM و تروفواکتودرم (Trophectoderm: TE) نرمال خواهند داشت اما این رویانها بعد از لانهگزینی به دلیل نقص در اپیبلاست از بین میروند (30).
در این تحقیق کیفیت بلاستوسیستهای ذوب شده از لحاظ مورفولوژیک با سنجش نرخ زندهمانی، بازگشت رویانها به شکل طبیعی و نرخ خروج از زونا و نیز از طریق روشهای مولکولی با بررسی بیان فاکتورهای Oct4 و Nanog به عنوان نشانگرهای تخصصی پرتوانی، ارزیابی گردید.
مواد و روشها
استحصال بلاستوسیست: در این مطالعه از موشهای ماده نژاد NMRIبا سن 8-7 هفته استفاده گردید. تمامی مراحل کار با موش طبق دستورالعمل کمیته اخلاق و ایمنی زیستی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری صورت پذیرفت. تخمکگذاری موشهای ماده با تزریق IU (International Unit) 8 هورمون PMSG (Pregnant MareSerumGonadotropin) (Folligon®, A007A02, Intervet) در روز اول و 47 ساعت پس از آن IU 8 هورمون hCG(Human Chorionic Gonadotropin) (Pregnyl®, 111, DarouPakhsh) به صورت داخل صفاقی انجام شد. پس از آن، موشهای ماده با موش نر (10-12 هفته) از همان نژاد درون یک قفس قرار داده شدند و جفتگیری با تشکیل پلاک واژنی موشهای ماده در صبح روز بعد، تأیید گردید. موشهای باردار سه و نیم روزه، به روش جابه جایی مهره گردن کشته شدند. بعد از جراحی و جداسازی لولههای رحمی، با فشار تزریق محیط کشت M2 (Modified Krebs-Ringer solution with HEPES buffer: M2 medium)(27) به همراه سدیم پیروات (Sodium Pyruvate) (P-4562, Sigma) و آلبومین سرم گاوی (Bovine Serum Albumin: BSA)10106,GibcoBRL) ) به این لولهها، بلاستوسیستها از انتهای رحم خارج شده و جمعآوری گردیدند. تمامی مراحل استحصال بلاستوسیست در دمای 37 درجه سانتی گراد صورت گرفت.
انجماد شیشهای: تمام فرآیندهای انجماد و ذوب جنین مطابق روش کار معرفی شده توسط Kuwayama و Vajta با مختصر تغییراتی صورت پذیرفت (14). محلولهای متعادلسازی، انجماد، ذوب و رقیقسازی با استفاده از محیط کشت TCM199 (22340-020, Gibco) همراه با 20% سرم جنین گاو (10270, Gibco) به عنوان محیط پایه آماده گشتند. فرآیند انجماد در دمای اتاق (27-22 درجه سانتی گراد) انجام شد. رویانها در محیط متعادلسازی حاوی 5/7درصد دیمتیل سولفوکساید (D-2650, Sigma) و 5/7درصد اتیلنگلیکول (Sigma, 324558) محلول در محیط پایه برای 15 دقیقه قرار داده شدند. پس از آن رویانها به مدت یک دقیقه در قطرات کوچکی از محیط انجماد شامل 15 درصد DMSO، 15 درصد EGو ساکارز 5/0 مولار (S-9378, Sigma) محلول در محیط پایه شست و شو داده شدند. در نهایت بلاستوسیستها (8-5 عدد) با کمترین حجم ممکن از محیط انجماد روی کرایوتاپ (Kitazato، 81115 -81111) به عنوان حامل انجماد قرار داده شدند.
کرایوتاپ به سرعت درون ظرف حاوی ازت مایع فرو برده شد و پس از گذشت چند ثانیه، سرپوش پلاستیکی روی آن قرار گرفت. در نهایت، کرایوتاپهای حاوی بلاستوسیست، به مخزن اصلی ازت مایع منتقل گشتند. پس از نگهداری رویانها در حدود یک ماه، فرآیند ذوب انجام شد. برای این کار کرایوتاپ به سرعت از ازت مایع خارج و برای مدت یک دقیقه به محلول ذوب شامل محلول یک مولار ساکارز از محیط پایه (37 درجه سانتی گراد) انتقال و سپس برای 3 دقیقه به محیط رقیقسازی حاوی ساکارز 5/0 مولارشست و شو داده شدند. در پایان پس از شست و شوی بلاستوسیستها در محیط پایه به مدت 10 دقیقه، رویانها در محیط کشت KSOM(Synthetic oviductal medium, enriched with potassium: KSOM medium)(15) بهمراه سدیم پیروات، آلبومین سرم گاوی، فاکتور رشد اپیدرمی (E-4127, Sigma) و جنتامایسین (L0011-010, Bio- West) در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد ، 5 درصد CO2 و رطوبت 95 درصد نگه داشته شدند.
استخراج RNAو ساخت cDNA: استخراج RNA از بلاستوسیستهای تمامی تیمارها (شاهد، انجماد و سمیت مواد سرما محافظ) با استفاده از کیت RNaesy Plus Micro Kit® (74034, Qiagen) صورت پذیرفت. برای واکنش رونویسی معکوس،RNA استخراج شده هر گروه به همراه توالی ششتایی تصادفی (J208, Bioneer) به ترکیب واکنش در کیت (K-2101, Bioneer) اضافه شد. محلول واکنش در 15 درجه سانتی گراد برای مدت 3 دقیقه و متعاقبا در 60 درجه سانتی گراد برای یک ساعت انکوبه شد.
طراحی پرایمر: پرایمرهای رفت و برگشت ژنهای Oct4، Nanog و β2m (Beta-2-Microglobulin) با استفاده از برنامههای Gene Runner و Primer BLAST مطابق جدول 1 طراحی و تأیید گشتند. در طراحی پرایمر سعی بر آن شد که فاکتورهایی نظیر طول پرایمر، طول قطعه حاصل از تکثیر، درصد بازهای آلی سیتوزین و گوانین و نیز وجود توالیهای تکراری، پالیندرومی وانتهای سنجاق سری مورد توجه قرار گیرد.
جدول 1- مشخصات پرایمرهای طراحی شده برای ژنهای Oct4، Nanog و β2m
ژن |
پرایمر |
توالی'3 به '5 |
طول توالی (nt) |
دمای Tm (Melting Temperature) (C°) |
طول محصول حاصل از تکثیر(nt) |
Oct4 |
پرایمر رفت |
AGCATTGAGAACCGTGTGAGG |
21 |
8/59 |
120 |
پرایمر برگشت |
TCGAACCACATCCTTCTCTAGC |
22 |
3/60 |
||
Nanog |
پرایمر رفت |
GCCTCCAGCAGATGCAAGAA |
20 |
4/59 |
154 |
پرایمر برگشت |
GGTGCTGAGCCCTTCTGAAT |
20 |
4/59 |
||
β2m |
پرایمر رفت |
CCTGGTCTTTCTGGTGCTTGT |
21 |
8/59 |
118 |
پرایمر برگشت |
GCAGTTCAGTATGTTCGGCTTC |
22 |
3/60 |
واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی (Real time-PCR): پس از راهاندازی تکثیر و اطمینان از مواد و شرایط با انجام روش PCR (Polymerase Chain Reaction)، بیان سه ژن Oct4،Nanog و β2m با استفاده از کیت (25344, Intron) حاوی رنگ SYBR Green Iاز طریق روش مقایسهای CT واکنش real time- PCR در دستگاه ترموسیکلر (Applied Bio Systems StepOne, USA) ارزیابی گردید. تعداد 40 سیکل تکثیر در دمای Annealing 55 درجه سانتی گراد صورت پذیرفت. این واکنش برای هر یک از تیمارها با 3 بار تکرار انجام شد.
طراحی آزمایشات: بلاستوسیستهای استحصال شده با کیفیت مناسب از لحاظ ظاهر انتخاب و به طور تصادفی به سه گروه تقسیم شدند. در گروه اول، فرآیند انجماد شیشهای و ذوب روی بلاستوسیستها انجام گردید. در گروه دوم، به منظور بررسی میزان سمیت CPAs، بلاستوسیستها در معرض محیطهای انجماد و ذوب بدون غوطهوری در ازت مایع قرار گرفتند.
سپس بلاستوسیستهای تیمار شده در هر دو گروه از لحاظ نرخ زندهمانی، خروج بلاستوسیست از زونا و میزان بیان ژنهای اختصاصی پرتوانی، Oct4 و Nanog با یکدیگر و گروه شاهد (گروه سوم) مقایسه گردیدند.
تجزیه و تحلیل دادهها: با استفاده از تست One-Way ANOVAو به دنبال آن تست Duncan، آنالیز دادههای سلولی و مولکولی صورت پذیرفت و تفاوتها در 05/0P< معنیدار درنظر گرفته شدند. برای این منظور از نرمافزار آماری SPSS, ver. 16.0 استفاده گردید.
نتایج
بخش سلولی: در مجموع تعداد 740 عدد بلاستوسیست موش مورد بررسی قرار گرفت. در این میان رویانهایی که دارای ICM بزرگ با تعداد سلولهای زیاد و نیز فاقد نشانی از شکل غیر نرمال، آسیب غشایی، آسیب اتصالات سلولی و تکهتکه شدن یا انحطاط سیتوپلاسم بودند، از لحاظ مورفولوژیکی طبیعی تلقی شدند. نرخ زندهمانی بلاستوسیستها با بررسی احیای حفره بلاستوسل در 3 ساعت پس از انجام تیمارها ارزیابی گردید. برای رسیدن به اطلاعات بیشتری از زندهمانی بلاستوسیستهای احیاء نشده در این مدت، این رویانها در درون انکوباتور با درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 97 درصد و CO2 به میزان 5 درصد کشت داده شدند و 12 ساعت بعد مجددا مورد ارزیابی قرار گرفتند.
بر اساس نتایج به دست آمده در جدول 2، نرخ زندهمانی و خروج بلاستوسیستها از زونا پس از انجام انجماد نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری کاهش یافتند (81/5±43/94 درصد در مقابل 100 درصد برای نرخ زندهمانی و 76/11±78/57 درصد در مقابل 80/5± 88/86 درصد برای نرخ خروج بلاستوسیست از زونا). این میزان در تیمار سمیت به ترتیب 69/1±97/94 درصد و 9/11± 35/61 درصد بود که هر دو با کاهش معنیداری نسبت به گروه شاهد روبرو گردیدند. اما نکته قابل توجه اینکه، با وجود کمتر بودن نرخ زندهمانی و خروج بلاستوسیستها از زونا در رویانهای منجمد- ذوب شده نسبت به تیمار سمیت، این اختلاف معنیدار نمیباشد.
جدول 2- اثر انجماد شیشهای و سمیت مواد سرمامحافظ بر کیفیت بلاستوسیستهای درونتنی موش
گروه آزمایشی |
تعداد بلاستوسیست |
نرخ زندهمانی (%) |
میزان خروج بلاستوسیست از زونا (%) |
شاهد |
220 |
a 100% |
a 80/5 ± 88/86% |
انجماد شیشهای |
198 |
b 81/5 ± 43/94% |
b 76/11 ± 78/57% |
سمیت مواد سرمامحافظ |
220 |
b 69/1 ± 97/94% |
b 9/11 ± 35/61% |
دادهها از ترکیب نمونههای 5 تکرار بدست آمدند. a و b در هر ستون نسبت به هم تفاوت معنیدار دارند (05/0P< در تست ANOVA وDuncan)
بخش مولکولی: مطابق نتایج به دست آمده در نمودار 1، در گروه انجمادی به ترتیب افزایش 703/1 و 538/2 برابری بیان در ژنهای Nanog و Oct4 مشاهده میگردد و این میزان در تیمار سمیت نیز به ترتیب 241/2 و 317/1 میباشد.
نمودار 1- تغییر بیان ژن Nanog و Oct4 پس از انجماد شیشهای و اثرکرد مواد سرمامحافظ در بلاستوسیست موش
دادهها حاصل از 3 تکرار real time- PCR میباشند.a، b و cنسبت به هم تفاوت معنیدار دارند (05/0P< در تست ANOVA و Duncan)
بحث
نتایج اولیه حاصل از انتقال رویان در مراحل مختلف تکامل رویانی، بعد از فرآیند انجماد و ذوب بیانگر نرخ پایینترحاملگی در انتقال رویان مرحلهی بلاستوسیست نسبت به مراحل قبلی میباشد که به نوعی با نتایج به دست آمده در این مطالعه همسو است. در سال 1996، Vanderzwalmenو همکارانش نرخ موفقیت حاملگی را از انتقال بلاستوسیستهای رشد یافته منجمد و ذوب شده، 8 درصد و در مراحل مرولا و بلاستوسیست اولیه به ترتیب 29 و 25 درصد گزارش نمودند (33). این مقادیر در سالهای بعد بواسطه بهینه شدن تکنیک انجماد، افزایش یافت به گونهای که در سال 2002 همین محقق میزان حاملگی ناشی از انتقال رویان ذوب شده بلاستوسیست را 14 درصد گزارش نمود. این در حالی است که همچنان این میزان کمتر از بلاستوسیست اولیه (27 درصد) و مرولا (28 درصد) میباشد (32). علاوه بر نرخ زندهمانی، میزان خروج از زونا نیز در بلاستوسیستهای منجمد و ذوب شده کاهش چشمگیری مییابد که میتواند منجر به کاهش در میزان حاملگی گردد. نتایج حاصل از این طرح نیز نشان دهنده کاهش معنیداری در نرخ زندهمانی (به ترتیب 81/5 ± 43/94 درصد در مقابل 100 درصد) و خروج بلاستوسیست از زونا (به ترتیب 76/11 ± 78/57 درصد در مقابل 80/5 ± 88/86 درصد) در بلاستوسیستهای منجمد و ذوب شده میباشند. همچنین در آزمایش دیگری که توسط Mukaida در سال 2006 صورت گرفت، نرخ زندهمانی بلاستوسیستهای رشد یافته (86 درصد) و در حال خروج از زونا (82 درصد) پس از انجماد شیشهای به طور معنیداری کمتر از مراحل قبل (97 درصد) گزارش گردید (24). در طی روند تکامل رویان در این تحقیق پیش از لانهگزینی هرچه به مراحل انتهایی نزدیکتر میشویم، انتظار میرود با توجه به افزایش در تعداد و نسبت سطح به حجم بلاستومرها، انجماد با موفقیت بیشتری صورت پذیرد. این روند تا مرحله 8 سلولی مشاهده میشود اما در مرولا به علت تغییر در ساختار اتصالی و تراکم بلاستومرها، امکان تبادل CPAs با درون سلول کاهش مییابد. در این حالت میزان آب درون سلولی به میزان بالایی باقی مانده و در نتیجه کاهش نرخ زندهمانی رویان بعد از ذوب رخ خواهد داد.
در انجماد بلاستوسیست نیز به علت افزایش در تعداد و نسبت سطح به حجم سلولها، انتظار به تبادل آسانتر CPAs و در نتیجه افزایش شانس زندهمانی رویانهای ذوب شده میرود (16)؛ اما بر خلاف انتظار، کاهش معنیدار کیفیت رویان در این مرحله مشاهده میگردد. دلیل این امر را میتوان در تغییر ساختار همراه با تشکیل و گسترش حفره بلاستوسل مملو از مایع تا حجم تقریبی دو سوم کل رویان جستوجو نمود (32). حضور حفره مملو از مایع میتواند از یک سو به عنوان یک سد، مانع دسترسی CPAs به سلولهای درونی رویان گردد و از سویی دیگر، احتمال تشکیل کریستالهای یخ را در حین فرآیند انجماد و ذوب افزایش بخشد. برای غلبه بر این مشکل میبایست غلظت CPAs و یا زمان مجاورسازی با نمونه را افزایش داد که هر دو روش منجر به بالا رفتن غلظت CPAs از آستانه تحمل سمیت سلول میگردند و متعاقباً مرگ رویان را به دنبال خواهند داشت.
راهکاری که برای کاهش میزان سمیت CPAs پیشنهاد گردید، ترکیب چند ماده سرما محافظ است به طوری که با وجود غلظت بالای مجموع مواد سرما محافظ، غلظت هر کدام به تنهایی زیر آستانه سمیت سلولی باشد (1). به طور مثال در برخی از روش کارهای انجماد شیشهای، از ترکیب EG و DMSO استفاده شده است که نتیجه آن، رسیدن به غلظت مناسب از CPAs برای ممانعت از تشکیل کریستالهای یخ و در عین حال، کاهش سمیت هر کدام از مواد سرما محافظ بود که نوع و غلظت CPAs بسته به گونه و مراحل مختلف رویانی میتواند متفاوت باشد (25). در تحقیق حاضر نیز از ترکیب EG،DMSO و سوکروز به عنوان CPAs استفاده گردید که در سال 2005 توسط Kuwayama و Vajta معرفی شد. به منظور ارزیابی سمیت ترکیب و غلظت CPAs استفاده شده، مطالعه جداگانهای از نرخ زندهمانی و خروج بلاستوسیست از زونا در تیمار سمیت نسبت به گروه انجماد صورت پذیرفت که تفاوت معنیداری در نتایج مشاهده نگردید (به ترتیب 69/1 ± 97/94 درصد در مقابل81/5 ± 43/94 درصد و 9/11 ± 35/61 درصد در مقابل 76/11 ± 78/57 درصد).
برای کسب بهترین نرخ انجماد، علاوه بر نوع و غلظت مناسب CPAs، روش انجماد و حامل مناسب نیز از اهمیت بالایی برخوردار است. مطابق گزارشات موجود، انجماد شیشهای به عنوان یک روش کارآمد برای نگهداری رویان شناخته میشود. برای نمونه، در سال 2005 گزارشی از مقایسه دو تکنیک انجماد آهسته و شیشهای توسط Kuwayama منتشر شد. در این تحقیق نرخ زندهمانی بلاستوسیستهای انسانی منجمد و ذوب شده در دو تکنیک انجماد آهسته و شیشهای، به ترتیب 84 و 90 درصد بود که این، کارآیی بهتر انجماد شیشهای نسبت به آهسته را نشان میدهد.
در طراحی و ساخت حاملهای انجماد نیز همواره شرایطی مورد توجه قرار میگیرد که امکان تماس مستقیم رویان با کمترین حجم محلول انجماد با منبع سرما فراهم گردد. از جمله این حاملها میتوان به Open Pulled Straw، Hemi-straw،Electron Microscopy Grids ، Cryoloop و Cryotopاشاره نمود (26 و 34). در مقایسهای که بین حاملهای مختلف صورت گرفت، نرخ زندهمانی بالایی از بلاستوسیست در گونههای مختلف پس از انجماد شیشهای با استفاده از Cryotop مشاهده گردید (13). بنابراین به نظر میرسد که Cryotop ازحاملهای سیستم باز میتواند یک حامل مناسب برای فرآیند انجماد شیشهای بلاستوسیست باشد (11).
یکی از دغدغههای اصلی انجماد، تولیدرویانهایی باکیفیت خوب و بدون کاهش قابلیت رشد بعد از ذوب است. اما استرس ایجاد شده به واسطه شوک دمایی و تشکیل کریستالهای یخ باعث تغییرات جدی کروموزومی، مورفولوژیکی و بیوشیمیایی در رویان میگردد. این تغییرات میتوانند باعث ایجاد پلی پلوئیدی، اختلالات اپیژنتیکی و نیز تغییر در الگوی بیان ژنی قبل از لانهگزینی گردند که اکثریت این ژنها در رشد و تکوین جنین نقش دارند (29).
بنابراین علاوه بر بررسیهای سلولی تأثیرات انجماد بلاستوسیست به واسطه تشکیل کریستال یخ و سمیت مواد سرما محافظ مورد استفاده، ارزیابی مولکولی نیز میتواند به درک بهتر اثرات این تکنیک کمک نماید. با توجه به تغییرات ناگهانی شرایط محیطی و حرارتی در طی انجماد که میتواند به عنوان یک شوک بر رویان اثرگذار باشد، کاهش بیان ژنهای فعال و مؤثر در رشد و تکامل در این مرحله انتظار میرود اما بر خلاف آن، افزایش بیان ژنها در نتایج این تحقیق حاصل شده است.
در تحقیقات مختلف نشان داده شده است که کاهش در تعداد سلولهای ICMدر رویان گاو (9)، آسیب به DNA در بلاستوسیست موش (17) و قطعه قطعه شدن DNA در هسته بلاستوسیست خوک (6) میتواند از عوارض انجماد رویان باشد (39). در رابطه با تغییر بیان ژن نیز، Sudano و همکارانش در سال 2012 نشان دادند که انجماد شیشهای رویان، بیان ژنهای درگیر در آپوپتوز، شوک حرارتی، تمایز سلولها و تشکیل جفت را تغییر میدهد که این امر میتواند بر قابلیت زندهمانی پس از انجماد تأثیرگذار باشد. موافق با نتایج به دست آمده در این تحقیق از جهت افزایش بیان ژن در رویانهای منجمد و ذوب شده،XUE-Ming Zhao وهمکارانش در 2012 به کاهش سطح متیلاسیون پروموتر ژنهای پرتوانی بلاستوسیست از جمله ژنهای Oct4 (از 85 درصد به 5/62 درصد) و Nanog (از 5/77 درصد به 55 درصد) در بلاستوسیستهای منجمد و ذوب شده موش اشاره نمودند و نتیجه این کاهش متیلاسیون را افزایش معنیدار بیان ژنهای Oct4 و Nanog بیان کردند (39). در سال 2011، Milroy نیز در تحقیق خود کاهش سطح متیلاسیون پروموتور ژنهای Oct4 و Sox2(20) موشی را گزارش نمود؛ اما نتایج آزمایشات وی افزایش بیان در ژن Sox2 را نشان نداد. همچنین در این آزمایش بر خلاف نظر XUE-Ming Zhao، تفاوت معنیداری در متیلاسیون پروموترژن Nanog در زایگوتهای منجمد و ذوب شده موش مشاهده نگردید.
به گفته Gao، الگوی بیانی سه ژن Oct4، Nanog و Sox2 در بلاستوسیست خوک مستقیماً در ارتباط با متیلاسیون نمیباشد (8) و این احتمال وجود دارد که سطح بیان این ژنها توسط اصلاحات هیستونی تنظیم گردند(5 و 35). تفاوت در نتایج تحقیقات فوق میتواند به دلیل نوع گونه (خوک در مقابل موش)، اندازه ناحیه پروموتر و تفاوت در مرحله رویانی باشد (39). همچنین تحقیقی به منظور بررسی پروفایل ژنی رویانهای 8 سلولی منجمد شده موش توسط Stergiou در سال 2004 صورت گرفت که در آن، افزایش بیان در گروههای ژنی آپوپتوز، ژنهای مربوط به استرس و متابولیسم مشاهده گردید. به گزارش این محقق، این افزایش بیان میتواند به منظور سنتز مولکولهای مقاوم به سرما برای جبران کاهش دما در انجماد باشد (31). در سال 1987،Hanyside کاهش تعداد کل سلولهای بلاستوسیست (115 در مقابل 5/126) و رده ICM و همچنین کاهش در نسبت سلولهای ICM به TE را پس از انجماد 8 سلولی موش مشاهده کرد. ایشان و برخی محققین دیگر دلایل احتمالی این کاهش را آپوپتوز سلولهای ICM(10)، تسهیم با تأخیر و اختصاصیت نابجای سلولهای ICM و TE(21) دانستند. در جهت رد این نظریه، Ray در سال 1995 بیان کرد که تسهیم با تأخیر نمیتواند تنها دلیل کاهش تعداد سلولهای ICM و نسبت ICM به TE باشد زیرا در نهایت، تسهیم با اندکی تأخیر رخ داده و تأثیری بر تعداد سلولها نخواهد داشت. اما انجماد میتواند با تأثیر بر جای گیری نادرست بلاستومرها در جایگاه صحیح خود، باعث اختصاصیت نابجای سلولهای ICM و TE و یا تأخیر در آن گردد (4).
در نهایت این گونه میتوان نتیجهگیری کرد که در پی اختصاصیت نابجای سلولهای ICM و TE و نیز آپوپتوز سلولهای ICM و به موجب آن تغییر در تعداد بلاستومرها، ردهزایی بلاستوسیست به طور صحیح انجام نشده و از این طریق میزان بیان ژنهای بیان شونده در هر رده سلولی دچار تغییر میگردد. از جهتی دیگر، متیلاسیون پروموتر ژنها و اصلاحات هیستونی نیز میتوانند بیان ژنها را تحت تأثیر قرار دهند. بنابراین مطالعات بیشتری برای بررسی عوامل فوق جهت درک بهتر علل و چگونگی تغییرات بیان ژن پس از فرآیند منجمد و ذوب نیاز است.
تشکر و قدردانی
این تحقیق در قالب طرح پژوهشی به شناسه 444 و با حمایت مالی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری صورت پذیرفته است. نگارندگان، مراتب تشکر و قدردانی خود را از همکاری صمیمانه آقایان دکتر مهدی شمسآرا، دکتر هادی حجاریان، احسان هاشمی و دکتر آیدین رحیم طایفه اعلام مینماید.