بررسی اثر انجماد شیشه­ای بر میزان بیان نشانگرهای اختصاصی پرتوانی، Oct4 و Nanog در بلاستوسیستهای موش سوری 

پریسا فتحعلی­زاده¹، مجتبی دشتی­زاد^2*، گلناز اسعدی تهرانی¹ و مرتضی دلیری جوپاری² 

¹ زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد زنجان، گروه ژنتیک 

² تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 9/9/93                  تاریخ پذیرش: 26/11/93 

چکیده

از زمان اولین انجماد شیشه­ای رویان موش در سال 1985، تلاشهای قابل توجهی برای توسعه و بهبود این تکنیک صورت گرفته است اما همچنان انجماد با اعمال آسیبهای جدی بیوشیمیایی و کروموزومی بر روی رویان می­تواند باعث تغییراتی در الگوی بیان ژنهای دخیل در تکوین و عملکرد، کاهش لانه­گزینی و نهایتاً مرگ رویان گردد. هدف از این مطالعه بررسی تأثیرات انجماد شیشه­ای بر زنده­مانی و رشد و بررسی بیان ژنهای تخصصی پرتوانی مؤثر در تکوین رویان از جمله ژنهای Oct4 و Nanog در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شده موش بود. پس از تحریک تخمک­گذاری موشهای ماده و استحصال بلاستوسیست، فرآیند انجماد با حضور دی­متیل سولفوکسید 15 درصد، اتیلن­گلیکول 15 درصد و ساکارز 5/0 مولار به عنوان مواد سرما­محافظ در محیطهای انجمادی انجام شد و بلاستوسیستها با قرار­گیری روی Cryotop، به درون ازت مایع منتقل گشتند. فرآیند ذوب نیز با شست­و­شوی رویانها در محیط ذوب حاوی ساکارز 1 مولار صورت پذیرفت. نهایتا میزان زنده­مانی، خروج بلاستوسیستها از زونا و نیز بیان ژنهای Oct4 و Nanog به روش   real time- PCR در بلاستوسیستهای منجمد- ذوب شده و شاهد ارزیابی شد. نرخ زنده­مانی و خروج بلاستوسیستها از زونا در تیمار انجماد نسبت به بلاستوسیستهای منجمد نشده به طور معنی­داری کاهش یافتند (81/5±43/94 درصد در مقابل 100 درصد برای زنده­مانی و 76/11±78/57 درصد در مقابل80/5± 88/86 درصد برای خروج بلاستوسیست از زونا). همچنین بیان ژنهای Nanog و Oct4 افزایش یافت. با توجه به یافته­های این آزمایش می­توان گفت که انجماد شیشه­ای بلاستوسیست موش سوری در مرحله بلاستوسیست می­تواند باعث تغییر بیان ژن و کیفیت رویان گردد.

واژه های کلیدی: انجماد شیشه­ای، بلاستوسیست موش، ژنهای Oct4 و Nanog 

* نویسنده مسئول، 09123211058  ، پست الکترونیکی: dashtizad@nigeb.ac.ir

مقدمه 

با موفقیت لقاح آزمایشگاهی (In vitro Fertilization: IVF) وتولد اولین نوزاد زنده پستانداران، در سال 1959 (3)، این روش به عنوان یکی از تکنیکهای کمک باروری معرفی گردید و امروزه در مراکز درمان ناباروری به صورت رایج مورد استفاده قرار می­گیرد. از طرفی در مواردی­ که تعداد رویانهای تشکیل شده بیش از تعداد مورد نیاز جهت انتقال به رحم باشند، ضرورت حفظ و نگهداری آنها به منظور استفاده در دوره­های درمانی بعدی (در صورت شکست) بیش از پیش اهمیت می­یابد. این امر می­تواند از طریق تکنیک انجماد میسر گردد که برای اولین بار در سال 1971 به لانه­گزینی موفق، در رویان پستانداران (بلاستوسیست موش) منجر گردید (36). از آن پس نیز انجماد گامت و رویان در گونه­های مختلف پستانداران درزمینه­هایی نظیر طب تولیدمثل، پرورش حیوانات، حفظ تغییرات ژنتیکی، به تعویق انداختن انتقال رویان در بیمارانی که در معرض خطر بالایی از سندرم تحریک بیش از حد تخمدان هستند، حفظ باروری بیمارانی که در حال آماده شدن برای شیمی درمانی و یا پرتو درمانی هستند و نیز برای داوطلبین اهداء گامت و رویان به کار گرفته شده است (21). در طی فرآیند انجماد به دلیل حضور آب درون سلولی و تشکیل کریستالهای یخ، استفاده از مواد سرما محافظ (Cryoprotective Agents: CPAs) الزامی است. اما از سوی دیگر نشان داده شده است که غلظت بالای این CPAs می­تواند اثر سمی برای سلول به همراه داشته باشد (18). در دهه اخیر پیشرفتهای زیادی در علم زیست شناسی انجماد برای حفظ سلامت گامت و رویان انسانی و حیوانی به روشهای انجماد آهسته و انجماد شیشه­ای صورت پذیرفته است. در روش انجماد آهسته از ﻏﻠﻈتهای ﭘﺎیﻴﻦ CPAs ﺑــﺎ نرخ برودتی به میزان 1/0 تا 3/0 درجه سانتی گراد در دقیقه به منظور جلوگیری ازتشکیل کریستالهای یخ استفاده می­شود. اما غلظت­ پایین CPAs و نرخ برودتی کم از طرفی و افزایش زمانی که رویان در معرض محدوده دمایی خطرناک انجماد و ذوب (15 تا 6- درجه سانتی گراد) قرار می­گیرد از طرفی دیگر، باعث تشکیل ﻛﺮﻳﺴﺘﺎلهای ﻳـﺦ داﺧـﻞ و ﺧـﺎرج ﺳﻠﻮﻟﻲ و در نهایت آسیب به ساختار رویان می­گردد (12 و 23). لذا اﻣــﺮوزه بتدریج این تکنیک جای خود را به انجماد شیشه­ای داده است که اوﻟـﻴﻦ ﺑـﺎر در ﺳـﺎل 1937 ﺗﻮﺳــﻂ Luyet و همکارانش ﻣﻄــﺮح گردید (19). در این تکنیک ﺑــﻪ دلیل ﻏﻠﻈﺖ ﺑﺎﻻی CPAs، امکان غوطه­وری مستقیم رویان به داخل ازت مایع مقدور می­باشد. نتیجه این امر افزایش چشمگیر در نرخ برودتی به میزان 20,000 درجه سانتی گراد در دقیقه و ﺗﺒــﺪﻳﻞ ﻳﻜﺒــﺎره ﻣﺤـﻴﻂ اﻃـﺮاف آن ﺑــﻪ ﻳــﺦ ﻓﺎﻗــﺪ ﻛﺮﻳﺴﺘﺎل است (2). پس از اولین انجماد موفق رویان پستانداران در سال 1985 (28)، این نوع انجماد تاکنون هم درمورد تخمک و هم درمورد رویان با موفقیت صورت گرفته است. اما چالش همیشگی در این زمینه، کسب نرخ بالای بقاء و افزایش احتمال موفقیت درلانه­گزینی پس از ذوب و انتقال است. در این میان، رویانهای منجمد و ذوب شده در مراحل اولیه تسهیم (4-8 سلولی)، دارای نرخ بقای بالایی هستند ولی از طریق ویژگیهای مورفولوژیکی قابل پیش­بینی در ادامه روند تکاملی نیستند و ریسک عدم موفقیت در حاملگی را بالا می­برند. در مقابل، بلاستوسیست بهترین مرحله برای انتقال رویان با پتانسیل تکوینی مناسب است. با این گزینش می­توان تعداد  رویانهای انتقال یافته و ریسک ابتلا به چند قلوزایی را کاهش داد (37). همچنین با توجه به کوچک شدن اندازه بلاستومرها، کاهش میزان آب درون سلولی و افزایش نسبت سطح به حجم در طی فرآیند تسهیم، انتظار می­رود نرخ زنده­مانی رویانهای ذوب شده بلاستوسیست بیشتر از مراحل قبلی باشد.

اما در کنار این مزیتها، نرخ بقای بلاستوسیست پس از ذوب پایین است. از دلایل آن می­توان به حفره مملو از مایع بلاستوسل اشاره کرد که سرعت انتقال مواد ضد یخ و مولکولهای آب را کاهش و در نتیجه پتانسیل تشکیل کریستالهای یخ را افزایش می­دهد. برای رفع این مشکل باید از غلظتهای بالاتر  CPAsاستفاده نمود و یا رویان را مدت زمان بیشتری در معرض این مواد قرار داد، که هر دو خود از عوامل آسیب­زا محسوب می­شوند (1).

روشهای اﻧﺠﻤﺎد، ﻋﻠﻲرﻏﻢ ﻧﻘﺶ ﻏﻴﺮﻗﺎﺑﻞ اﻧﻜـﺎرشان در درﻣﺎن اﻓﺮاد ﻧﺎﺑﺎرور، ﺑﻪ دﻟﻴﻞ اﺛﺮات CPAs و ﺗﻐﻴﻴـﺮات ﺷﺪﻳﺪ ﺑﺮودﺗﻲ و ﺣﺮارﺗﻲ ﻣﻲﺗﻮانند ﺗأﺛﻴﺮهای ﻧـﺎﻣﻄﻠﻮﺑﻲ ﺑـﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎر ﺳﻠﻮل داﺷﺘﻪ و منجر به آﺳﻴﺐ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﺑﻪ ﻃﺮق ﻣﺨﺘﻠﻒ گردد. به عبارتی انجماد با اعمال آسیبهای جدی بیوشیمیایی و کروموزومی بر روی رویان می­تواند با تغییر در الگوی بیان ژنی، موجب کاهش رشد و قابیت لانه­گزینی و نهایتاً مرگ رویان گردد (7). به نظر می­رسد انجماد با اثر بر بیان ژنهای دخیل در تکوین، توسعه و عملکرد رویان از جمله ژنهای پر­توانی توده داخلی بلاستوسیست می­تواند بر کیفیت رویان اثر­گذار باشد. از مهم ترین ژنهای مؤثر در ایجاد و حفظ ویژگی پرتوانی سلولهای بنیادی و تکامل اولیه رویان قبل ازلانه­گزینی، می­توان به ژنهای تخصصی پرتوانی از جمله Oct4 و Nanog اشاره کرد که در توده سلولی داخلی بلاستوسیست (Inner Cell Mass:) بیان می گردند (22). نقص و یا عدم بیان ژن Oct4 منجر به تولید بلاستوسیستهایی خواهد شد که ICM آنها قدرت تمایز به سایر سلول­ها مانند اپی­بلاست و کیسه زرده را ندارد و در مراحل اولیه تکامل رویانی و پیش از لانه­گزینی از بین خواهند رفت (14). همچنین بلاستوسیست­های موش­ فاقد هر دو الل Nanog،ICM  و تروفواکتودرم (Trophectoderm: TE) نرمال خواهند داشت اما این رویانها بعد از لانه­گزینی به دلیل نقص در اپی­بلاست  از بین می­روند (30).

در این تحقیق کیفیت بلاستوسیستهای ذوب شده از لحاظ مورفولوژیک با سنجش نرخ زنده­مانی، بازگشت رویانها به شکل طبیعی و نرخ خروج از زونا و نیز از طریق روشهای مولکولی با بررسی بیان فاکتورهای Oct4 و Nanog به عنوان نشانگرهای تخصصی پرتوانی، ارزیابی گردید.

مواد و روشها

استحصال بلاستوسیست: در این مطالعه از موشهای ماده نژاد  NMRIبا سن 8-7 هفته استفاده گردید. تمامی مراحل کار با موش طبق دستورالعمل کمیته اخلاق و ایمنی زیستی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری صورت پذیرفت. تخمک­گذاری موشهای ماده با تزریق IU (International Unit) 8 هورمون PMSG (Pregnant MareSerumGonadotropin) (Folligon^®, A007A02, Intervet) در روز اول و 47 ساعت پس از آن IU 8 هورمون  hCG(Human Chorionic Gonadotropin) (Pregnyl^®, 111, DarouPakhsh) به صورت داخل صفاقی انجام شد. پس از آن، موشهای ماده با موش نر (10-12 هفته) از همان نژاد درون یک قفس قرار داده شدند و جفت­گیری با تشکیل پلاک واژنی موشهای ماده در صبح روز بعد، تأیید گردید. موشهای باردار سه و نیم روزه، به روش جابه جایی مهره گردن کشته شدند. بعد از جراحی و جداسازی لوله­های رحمی، با فشار تزریق محیط­ کشت M2 (Modified Krebs-Ringer solution with HEPES buffer: M2 medium)(27) به همراه سدیم پیروات (Sodium Pyruvate) (P-4562, Sigma) و آلبومین سرم گاوی (Bovine Serum Albumin: BSA)10106,GibcoBRL) ) به این لوله­ها، بلاستوسیستها از انتهای رحم خارج شده و جمع­آوری گردیدند. تمامی مراحل استحصال بلاستوسیست در دمای 37 درجه سانتی گراد صورت گرفت.

انجماد شیشه­ای: تمام فرآیندهای انجماد و ذوب جنین مطابق روش کار معرفی شده توسط Kuwayama و Vajta با مختصر تغییراتی صورت پذیرفت (14). محلولهای متعادل­سازی، انجماد، ذوب و رقیق­سازی با استفاده از محیط کشت TCM199  (22340-020, Gibco) همراه با 20% سرم جنین گاو (10270, Gibco) به عنوان محیط پایه آماده گشتند. فرآیند انجماد در دمای اتاق (27-22 درجه سانتی گراد) انجام شد. رویانها در محیط متعادل­سازی حاوی 5/7درصد دی­متیل سولفوکساید (D-2650, Sigma)   و 5/7درصد اتیلن­گلیکول (Sigma, 324558) محلول در محیط پایه برای 15 دقیقه قرار داده شدند. پس از آن رویانها به مدت یک دقیقه در قطرات کوچکی از محیط انجماد شامل 15 درصد DMSO، 15 درصد  EGو ساکارز 5/0 مولار (S-9378, Sigma) محلول در محیط پایه شست و شو داده شدند. در نهایت بلاستوسیستها (8-5 عدد) با کمترین حجم ممکن از محیط انجماد روی کرایوتاپ (Kitazato، 81115 -81111) به عنوان حامل انجماد قرار داده شدند.

کرایوتاپ به سرعت درون ظرف حاوی ازت مایع فرو برده شد و پس از گذشت چند ثانیه، سرپوش پلاستیکی روی آن قرار گرفت. در نهایت، کرایوتاپهای حاوی بلاستوسیست، به مخزن اصلی ازت مایع منتقل گشتند. پس از نگهداری رویانها در حدود یک ماه، فرآیند ذوب انجام شد. برای این کار کرایوتاپ به سرعت از ازت مایع خارج و برای مدت یک دقیقه به محلول ذوب شامل محلول یک مولار ساکارز از محیط پایه (37 درجه سانتی گراد) انتقال و سپس برای 3 دقیقه به محیط رقیق­سازی حاوی ساکارز 5/0 مولارشست و شو داده شدند. در پایان پس از شست و شوی بلاستوسیستها در محیط پایه به مدت 10 دقیقه، رویانها در محیط کشت  KSOM(Synthetic oviductal medium, enriched with potassium: KSOM medium)(15) بهمراه سدیم پیروات، آلبومین سرم گاوی، فاکتور ­رشد اپیدرمی (E-4127, Sigma) و جنتامایسین (L0011-010, Bio- West) در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد ، 5 درصد CO₂ و رطوبت 95 درصد نگه داشته شدند.

استخراج  RNAو ساخت cDNA: استخراج RNA از بلاستوسیستهای تمامی تیمارها­ (شاهد، انجماد و سمیت مواد سرما محافظ) با استفاده از کیت RNaesy Plus Micro Kit^® (74034, Qiagen) صورت پذیرفت. برای واکنش رونویسی معکوس،RNA  استخراج شده هر گروه به همراه توالی شش­تایی تصادفی (J208, Bioneer)  به ترکیب واکنش در کیت (K-2101, Bioneer) اضافه شد. محلول واکنش در 15 درجه سانتی گراد برای مدت 3 دقیقه و متعاقبا در 60 درجه سانتی گراد برای یک ساعت انکوبه شد.

طراحی پرایمر: پرایمر­های رفت و برگشت ژنهای Oct4، Nanog و β2m (Beta-2-Microglobulin) با استفاده از برنامه­های Gene Runner و Primer BLAST مطابق جدول 1 طراحی و تأیید گشتند. در طراحی پرایمر سعی بر آن شد که فاکتور­هایی نظیر طول پرایمر، طول قطعه حاصل از تکثیر، درصد بازهای آلی سیتوزین و گوانین و نیز وجود توالیهای تکراری، پالیندرومی وانتهای سنجاق سری مورد توجه قرار گیرد.

جدول 1- مشخصات پرایمر­های طراحی شده برای ژنهای Oct4، Nanog و β2m

واکنش زنجیره­ای پلیمراز در زمان واقعی (Real time-PCR): پس از راه­اندازی تکثیر و اطمینان از مواد و شرایط با انجام روش PCR (Polymerase Chain Reaction)، بیان سه ژن Oct4،Nanog  و β2m با استفاده از کیت (25344, Intron) حاوی رنگ  SYBR Green Iاز طریق روش مقایسه­ای CT واکنش real time- PCR در دستگاه ترموسیکلر (Applied Bio Systems StepOne, USA) ارزیابی گردید. تعداد 40 سیکل تکثیر در دمای Annealing 55 درجه سانتی گراد صورت پذیرفت. این واکنش برای هر یک از تیمار­ها با 3 بار تکرار انجام شد.

طراحی آزمایشات: بلاستوسیستهای استحصال شده با کیفیت مناسب از لحاظ ظاهر انتخاب و به طور تصادفی به سه گروه تقسیم شدند. در گروه اول، فرآیند انجماد شیشه­ای و ذوب روی بلاستوسیستها انجام گردید. در گروه دوم، به منظور بررسی میزان سمیت CPAs، بلاستوسیستها در معرض محیطهای انجماد و ذوب بدون غوطه­وری در ازت مایع قرار گرفتند.

سپس بلاستوسیستهای تیمار شده در هر دو گروه از لحاظ نرخ زنده­مانی، خروج بلاستوسیست از زونا و میزان بیان ژنهای اختصاصی پرتوانی، Oct4 و Nanog با یکدیگر و گروه شاهد (گروه سوم) مقایسه گردیدند.

تجزیه و تحلیل داده­ها: با استفاده از تست  One-Way ANOVAو به دنبال آن تست Duncan، آنالیز داده­های سلولی و مولکولی صورت پذیرفت و تفاوتها در 05/0P< معنی­دار در­نظر گرفته شدند. برای این منظور از نرم­افزار آماری SPSS, ver. 16.0  استفاده گردید.

نتایج

بخش سلولی: در مجموع تعداد 740 عدد بلاستوسیست موش مورد بررسی قرار گرفت. در این میان رویانهایی که دارای ICM بزرگ با تعداد سلولهای زیاد و نیز فاقد نشانی از شکل غیر نرمال، آسیب غشایی، آسیب اتصالات سلولی و تکه­تکه شدن یا انحطاط سیتوپلاسم بودند، از لحاظ مورفولوژیکی طبیعی تلقی شدند. نرخ زنده­مانی بلاستوسیستها با بررسی احیای حفره بلاستوسل در 3 ساعت پس از انجام تیمار­ها ارزیابی گردید. برای رسیدن به اطلاعات بیشتری از زنده­مانی بلاستوسیست­های احیاء نشده در این مدت، این رویانها در درون انکوباتور با درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 97 درصد و CO₂ به میزان 5 درصد کشت داده شدند و 12 ساعت بعد مجددا مورد ارزیابی قرار گرفتند.

بر اساس نتایج به دست آمده در جدول 2، نرخ زنده­مانی و خروج بلاستوسیستها از زونا پس از انجام انجماد نسبت به گروه­ شاهد به طور معنی­داری کاهش یافتند (81/5±43/94 درصد در مقابل 100 درصد برای نرخ زنده­مانی و 76/11±78/57 درصد در مقابل 80/5± 88/86 درصد برای نرخ خروج بلاستوسیست از زونا). این میزان در تیمار سمیت به ترتیب 69/1±97/94 درصد و  9/11± 35/61 درصد بود که هر دو با کاهش معنی­داری نسبت به گروه شاهد روبرو گردیدند. اما نکته قابل توجه اینکه، با وجود کمتر بودن نرخ زنده­مانی و خروج بلاستوسیستها از زونا در رویانهای منجمد- ذوب شده نسبت به تیمار سمیت، این اختلاف معنی­دار نمی­باشد.

جدول 2- اثر انجماد شیشه­ای و سمیت مواد سرما­محافظ بر کیفیت بلاستوسیستهای درون­تنی موش

داده­ها از ترکیب نمونه­های 5 تکرار بدست آمدند. a و b در هر ستون نسبت به هم تفاوت معنی­دار دارند (05/0P< در تست ANOVA وDuncan)

بخش مولکولی: مطابق نتایج به دست آمده در نمودار 1، در گروه انجمادی به ترتیب افزایش 703/1 و 538/2 برابری بیان در ژنهای Nanog و Oct4 مشاهده می­گردد و این میزان در تیمار سمیت نیز به ترتیب 241/2 و 317/1 می­باشد.

نمودار 1- تغییر بیان ژن Nanog و Oct4 پس از انجماد شیشه­ای و اثر­کرد مواد سرما­محافظ در بلاستوسیست­ موش

داده­ها حاصل از 3 تکرار real time- PCR می­باشند.a، b و  cنسبت به هم تفاوت معنی­دار دارند (05/0P< در تست ANOVA و Duncan)