شناسایی مکان های ژنی کنترل کننده زمان گلدهی در توتون تیپ شرقی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی

2 عضو هیات علمی دانشگاه ارومیه و مدیر گروه بیوتکنولوژی کشاورزی پژوهشکده زیست فن آوری دانشگاه

3 عضو هیات علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه مراغه

چکیده

به منظور شناسایی مکان های ژنی مرتبط با گلدهی در توتون تیپ شرقی، جمعیت ژنتیکی شامل ۱۰۰ فرد 2F حاصل از تلاقی دو ژنوتیپ توتون شرقیSPT 406 (والد پدری) وBasma Seres 31 (والد مادری) برای صفت روز تا شروع گلدهی مورد ارزیابی قرار گرفتند. در آزمایشات مولکولی نقشه پیوستگی جمعیت 2F با ۲۳ نشانگر SSR و ۲۹ نشانگرISSR تهیه گردید که cM 570.8 از ژنوم توتون را پوشش می داد. با استفاده از روش های مکان یابی فاصله ای ساده و مرکب به ترتیب ۹ و ۲ QTL برای صفت مورد مطالعه شناسایی گردید. در این مطالعه، بیشترین تعداد QTL در گروه پیوستگی شماره پنج شناسایی شد. QTL های qDF5-3 و qDF2-2، شناسایی شده با روش مکان یابی فاصله ای ساده، به ترتیب با توجیه 0.8 و ۳۶ درصد از تغییرات فنوتیپی صفت )2(R، به ترتیب کوچکترین و بزرگترین QTL های شناسایی شده می باشند. درصد تغییرات فنوتیپی توجیه شده )2(R توسط QTL های شناسایی شده با روش مکان یابی فاصله ای مرکب (qDF5-1 و qDF5-2)، به ترتیب 1.95 و 15.34 درصد بود. نتایج نشان داد که مکان هایی با اثرات ژنی افزایشی و غالبیت در کنترل ژنتیکی صفت روز تا شروع گلدهی در توتون تیپ شرقی نقش دارند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification of genetic loci controlling flowering time in oriental-type tobacco

نویسندگان [English]

  • Reza Darvishzadeh 2
  • hamid hatami 3

2 Urmia university

چکیده [English]

In order to identify genetic loci associated with flowering time in oriental-type tobacco, the genetic population comprising 100 F2 individuals from the cross between two oriental-type genotypes Basma Seres 31 (maternal) × SPT 406 (paternal) were evaluated for days to flowering character. In molecular experiment, linkage map with 23 SSR and 29 ISSR markers were prepared which covered 570/8 cM of tobacco genome. Using interval and composite interval mapping procedures, 9 and 2 QTLs were identified for studied character, respectively. In this study, the most identified QTLs were located on linkage group 5. Genetic loci qDF5-3 and qDF2-27, identified via interval mapping, with 0.8 and 36 percent of R2 were the minor and major QTLs, respectively. According to results, the percentage of phenotypic variance (R2) explained by identified QTLs through composite interval mapping (qDF5-1 and qDF5-2), ranged from 1.95 to 15.34. Results revealed the role of both additive and dominance effects in genetic control of days to flowering in oriental-type tobacco.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Composite interval mapping
  • genetic population
  • interval mapping
  • microsatellite

شناسایی مکانهای ژنی کنترل کننده زمان گلدهی در توتون تیپ شرقی 

فرامرز هوشیاردل۱، رضا درویش زاده1* و حمید حاتمی ملکی2

1 ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی

2 مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 25/11/92              تاریخ پذیرش: 23/12/93 

چکیده

به منظور شناسایی مکانهای ژنی مرتبط با گلدهی در توتون تیپ شرقی، جمعیت ژنتیکی شامل ۱۰۰ فرد 2F حاصل از تلاقی دو ژنوتیپ توتون شرقیSPT 406  (والد پدری) وBasma seres 31  (والد مادری) برای صفت روز تا شروع گلدهی مورد ارزیابی قرار گرفتند. در آزمایشات مولکولی نقشه پیوستگی جمعیت 2F با ۲۳ نشانگر SSR و ۲۹ نشانگرISSR  تهیه گردید که cM  8/570 از ژنوم توتون را پوشش می داد. با استفاده از روشهای مکان یابی فاصله ای ساده و مرکب به ترتیب ۹ و ۲ QTL برای صفت مورد مطالعه شناسایی گردید. در این مطالعه، بیشترین تعداد QTL در گروه پیوستگی شماره پنج شناسایی شد. QTL های qDF5-3 و qDF2-2، شناسایی شده با روش مکان یابی فاصله ای ساده، به ترتیب با توجیه 8/0 و ۳۶ درصد از تغییرات فنوتیپی صفت )2(R، به ترتیب کوچکترین و بزرگترین QTL های شناسایی شده می باشند. درصد تغییرات فنوتیپی توجیه شده )2(R توسط QTL های شناسایی شده با روش مکان یابی فاصله ای مرکب (qDF5-1 و qDF5-2)، به ترتیب 95/1 و 34/15 درصد بود. نتایج نشان داد که مکان هایی با اثرات ژنی افزایشی و غالبیت در کنترل ژنتیکی صفت روز تا شروع گلدهی در توتون تیپ شرقی نقش دارند.

واژه های کلیدی: توتون، جمعیت ژنتیکی، صفات کمّی، مکان­یابی ژن، نشانگرهای مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 04432779558 پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

مقدمه  

 

جنس Nicotiana از خانواده Solanaceae دارای بیش از ۶۴ گونه است که دو گونه آمفی دیپلوییدtabacum  و rustica (48=n2) در مقایسه با سایر گونه های موجود در این جنس به طور گسترده ای کشت می گردند (36). توتون (Nicotiana tabacum L.) از مهم­ترین محصولات غیر غذایی در بخش کشاورزی در جهان و ایران بوده که در بیش از ۱۰۰ کشور جهان در سطحی بالغ بر 2/4 میلیون هکتار کشت می­گردد (2). این گیاه همچنین به عنوان یک گیاه مدل در اکثر مطالعات زیست گیاهی و زراعت مولکولی برای تولید مواد تجاری مهمی نظیر داروها و واکسنها استفاده می شود (15). در میان تیپهای مختلف رشدی توتون، توتونهای شرقی به دلیل داشتن بوی مطلوب از اجزای اصلی سازنده خرمن سیگارت در صنعت می باشند (14).

در بین صفات مختلف گیاهی، گلدهی یکی از مراحل مهم در چرخه زندگی گیاه بوده (3) و صفاتی مانند عملکرد، کیفیت محصول و مقاومت به تنشهای محیطی، وابستگی زیادی به زمان گلدهی دارند (13). گلدهی نشانه انتقال گیاه از مرحله رویشی به مرحله زایشی می باشد (26). گلدهی صفت کلیدی در سازگاری گیاه و هدف عمده در به نژادی گیاهان محسوب می گردد (3). تاریخ گلدهی توسط محرکهای محیطی تحت تأثیر قرار می گیرد که فتوپریودیسم یکی از عوامل تعیین کننده آن است (29). بیشتر گونه­های گیاهی درجات مختلفی از فتوپریودیسم را نشان می­دهند که کنترل کننده زمان یا تاریخ گلدهی می باشد (29). طبق تحقیقات حاتمی ملکی و همکاران (24) تنوع ژنتیکی قابل ملاحظه ای در ژرم پلاسم توتون شرقی موجود در کشور برای صفت تاریخ گلدهی وجود داشته و این صفت همبستگی معنی داری با سایر صفات زراعی در توتون دارد. همچنین طبق مطالعات وایت و همکاران (35) بین صفت روز تا گلدهی با صفات عرض برگ، تعداد برگ و عملکرد برگ خشک توتون همبستگی معنی­داری وجود دارد. بنابراین می­توان استنباط نمود که صفت روز تا گلدهی جزء صفات مهم در توتون می­باشد. به دلیل توارث پلی­ژنیک صفت، امکان بهبود آن به وسیله اصلاح کلاسیک دشوار می­باشد (39). پیشرفتهای اخیر در زیست­شناسی مولکولی و روشهای آماری برای مکان­یابی QTL امکان تشخیص فاکتورهای مؤثر بر زمان گلدهی را فراهم نموده است (39). آگاهی از تعداد ژنهای کنترل کننده، جایگاه کروموزومی آنها و سهم نسبی هر یک از ژنها در تظاهر و توزیع فنوتیپی می­تواند در کارهای به نژادی آتی مورد استفاده قرار گیرد. روشهای تجزیه QTL با شناسایی مکانهای ژنی کنترل کننده صفات می تواند به فهم کنترل ژنتیکی آنها و توسعه استراتژیهای گزینش به کمک نشانگر کمک نماید (28). جمعیتهای مختلفی جهت مکان­یابی QTL­ها مورد استفاده قرار می­گیرند که هر یک دارای مزایا و معایبی می­باشند. از جمله جمعیتهای مورد استفاده در تهیه نقشه­های ژنتیکی جمعیت ۲F بوده که از خودگشنی نسل ۱F حاصل از تلاقی دو والد منتخب حاصل می­شود. از معایب نسل ۲F، وجود تعداد میوز کمتر نسبت به نسلهای پیشرفته می­باشد، فلذا ممکن است نشانگرهایی که در فاصله دور از QTL قرار گرفته­اند به صورت پیوسته با آن باقی بمانند که این ممکن است باعث اختلال در مکان­یابی QTL شود. از دیگر معایب این جمعیتها، اندازه­گیری صفات بر مبنای تک بوته است که در رابطه با صفات کمی که به شدت تحت تأثیر شرایط محیطی قرار می گیرند می تواند باعث اریبی در نتایج شود و به همین دلیل بهتر است مکان­یابی QTL با استفاده از خانواده های 3:2F صورت گیرد و برای گزینش بر­اساس نشانگر، نشانگر هایی معرفی شوند که وابسته به نسل نباشند. با توجه به اینکه در نسل ۲F، QTL­های شناسایی شده ممکن است پایدار و از طرفی تکرار­پذیر نباشند، استفاده از این جمعیتها برای انجام مطالعات پایه­ای در گیاهانی که گزارشات کمی در مورد شناسایی QTLها و نحوه اثرات آنها وجود دارد مناسب است. در مکان­یابی QTL با استفاده از نسل ۲­F در کنار اثرات افزایشی، اثرات غالبیت ژنهای کنترل­کننده صفات نیز قابل برآورد است. تهیه نقشه پیوستگی و شناسایی QTL ها در گیاهان مختلفی انجام گرفته است ولی در مورد توتون این مطالعات محدود بوده است که یکی از دلایل آن می تواند اندازه بزرگ ژنوم توتون در خانواده Solanaceae در مقایسه با سایر گیاهان این خانواده باشد. شناسایی  QTLهای کننده صفات مختلفی از قبیل مقدار نیکوتین، پتاسیم و قند موجود در برگ توتون (12 و 28)، مقاومت به بیماری لکه برگی (34) و مقدار تجمع کلر در برگ توتون (25) انجام گرفته است. علی رغم این مطالعات، QTL ای برای صفت تاریخ گلدهی در توتون گزارش نگردیده است. در سایر انواع گیاهان خانواده Solanaceae از قبیل گوجه فرنگی (11، 17، 18، 23، 27، 31 و 33) و بادمجان (21) مطالعات مکان­یابی QTL برای صفت گلدهی انجام گرفته است. به عنوان نمونه فرری و همکاران (21) در مطالعه­ای که روی بادمجان انجام دادند، هشت QTL برای صفت روز تا گلدهی شناسایی نمودند که در هفت گروه پیوستگی پراکنده بودند. این مطالعه با هدف شناسایی QTLهای کنترل کننده صفت روز تا گلدهی در یک جمعیت 2F حاصل از تلاقی دو ژنوتیپ توتون شرقی شاملBasma seres 31  (والد مادری) وSPT 406  (والد پدری) انجام گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی و ارزیابی فنوتیپی: در این مطالعه، دو ژنوتیپ توتون شرقی شاملBasma seres 31  و SPT 406 که براساس مطالعات قبلی توسط حاتمی ملکی و همکاران (2) از نظر اکثر صفات آگرومورفولوژیک به ویژه صفت روز تا گلدهی  با همدیگر متفاوت بوده و در دو انتهای توزیع صفات قرار داشتند، انتخاب گردیدند. دو ژنوتیپ  SPT 406(والد پدری و زود گل ده) وBasma seres 31 (والد مادری و دیر گل ده) با همدیگر تلاقی داده شده و از خودگشنی بوته های 1F حاصل از تلاقی این والدین، ۱۰۰ فرد 2F جهت تهیه نقشه پیوستگی مورد استفاده قرار گرفتند. اندازه جمعیت مورد استفاده در تهیه نقشه های ژنتیکی معمولاً بین 100 تا 300 فرد یا لاین متغییر است (7، 8). به هر حال هر چقدر اندازه جمعیت بیشتر، وضوع نقشه بیشتر و مکان یابی QTL با دقت بیشتری انجام می گیرد (20، 32). زمانی که افراد جمعیت 2F در مرحله چهار برگی بودند، نمونه برگی به منظور استخراج DNA تهیه شد. در این مطالعه، صفت زمان گلدهی به صورت تعداد روز تا شروع گلدهی ثبت گردید.  

استخراج DNA ژنومی و انجام واکنش زنجیره ایی پلیمراز با آغازگرهای  SSRو  ISSR:  DNA ژنومی از گیاهان والدینی و افراد 2F به روش دلاپورتا و همکاران (16) استخراج گردید. ۱۶۲ جفت آغازگر SSR مربوط به نقشه ژنتیکی بیندلر و همکاران (9) و ۸۰ نشانگر ISSR مربوط به دانشگاه برتیش کلمبیا از نظر چندشکلی در والدین جمعیت، مورد آزمون قرار گرفتند. لازم به ذکر است که واکنشهای زنجیره ای پلی مراز با استفاده از آغازگرهای SSR و ISSR به ترتیب با روش ایک و همکاران (19) و یانگ و همکاران (36) انجام گرفت. تعیین ژنوتیپ افراد 2F با استفاده از نشانگرهای SSR و ISSR ی که در والدین جمعیت چند شکلی نشان داده بودند انجام گرفت.

تهیه نقشه پیوستگی و شناسایی  QTLهای زمان گلدهی: نقشه پیوستگی با استفاده از داده های حاصل از انگشت نگاری افراد جمعیت با نشانگرهای چند شکل، به وسیله نرم افزار CarthaGene 1.2.2 (22) و با استفاده از تابع نقشه کوسامبی، حداقل LOD برابر با سه و حداکثر فاصله برابر با ۵۰ سانتی مورگان تهیه شد. شناسایی  QTLهای کنترل کننده صفت مورد مطالعه با استفاده از نقشه پیوستگی تهیه شده و ارزش اندازه گیری شده صفت در افراد جمعیت به روش مکان یابی فاصله ای (30) و مکان یابی فاصله ای مرکب (37، 38) و با استفاده از نرم افزار  WinQTL cartographer 2.5 (6) انجام شد. در این مطالعه نام گذاریQTL  ها به صورت (QTL + نام صفت + شماره گروه پیوستگی + شماره  QTL در گروه پیوستگی) انجام گرفت. در این نام گذاری،QTL  با حرف کوچک "q" مشخص شده و اگر بیش از یکQTL  در یک گروه پیوستگی قرار داشته باشد به ترتیب با شماره های یک، دو و غیره نشان داده می شوند.

نتایج و بحث

ارزیابی زمان گلدهی در جمعیت در حال تفرق 2F : نتایج این تحقیق نشان داد که بین والدین جمعیت در حال تفرق 2F، اختلاف معنی داری در سطح احتمال پنج درصد برای صفت روز تا شروع گلدهی وجود دارد (جدول ۱). وجود اختلاف معنی دار  بین والدین امکان مکان­یابی QTL های کنترل­کننده صفت مزبور را فراهم می نماید. اختلاف بین میانگین والدین و میانگین افراد 2F نیز معنی دار بود (جدول ۱) که می­تواند، به علت وجود تفرق در نسل 2F، اثرات افزایشی، غالبیت و اپیستازی مکانهای ژنی باشد. با توجه به توزیع فراوانی پیوسته افراد 2F و موقعیت والدین برای صفت روز تا شروع گلدهی (شکل ۱)، صفت مورد مطالعه یک صفت کمی و پلی ژنیک است. تعدادی از افراد 2F دارای ارزش فنوتیپی خارج از محدوده ارزش فنوتیپی والدین می باشند (شکل ۱) که نشان دهنده وجود پدیده تفکیک متجاوز در این صفت است. تفکیک متجاوز نشان می دهد که اللهای هر دو والد در بروز صفت گلدهی دخالت داشته و ترکیب آنها منجر به ایجاد ارزشهای فنوتیپی بالاتر و یا پایین تر در مقایسه با والدها می­شود (5).

 

 

شکل ۱- توزیع فراوانی صفت روز تا گلدهی در جمعیت در حال تفرق 2F حاصل از تلاقی بین Basma seres 31 (والد مادری) و SPT 406 (والد پدری). ارزش فنوتیپی والدین با پیکان نشان داده شده­است.

 

وجود تفکیک متجاوز برای صفت مقدار تجمع کلر در برگ توتونهای شرقی نیز گزارش گردیده است (25). سود ژنتیکی که از اختلاف بین میانگین ۱۰ درصد از بهترین 2F ها با میانگین والدین محاسبه می شود معنی دار است (جدول ۱) که بیانگر امکان تغییر میانگین جمعیت نسل بعد از لحاظ این صفت می باشد.

شناسایی QTL های کنترل کننده زمان گلدهی : نتایج نشان داد که ۲۳ جفت آغازگر SSR از ۱۶۲ جفت آغازگر SSR و ۲۹ آغازگر ISSR از ۸۰ آغازگر ISSR مورد مطالعه، بین والدین جمعیت 2F، چندشکل می باشند. میزان چندشکلی برای نشانگر SSR، 2/14 درصد و برای نشانگر ISSR، 2/36 درصد به دست آمد. در شکل های 2 و 3 انگشت نگاری تعدادی از ژنوتیپهای 2 F با نشانگر های SSR و ISSR نشان داده شده است. با استفاده از ۵۲ آغازگر چند شکل (SSR ۲۳ و  ISSR۲۹)، نقشه پیوستگی توتون شرقی ترسیم گردید که شامل هفت گروه پیوستگی بود و 8/570 سانتی­مورگان از ژنوم توتون شرقی را پوشش می داد (شکل 4). در نقشه پیوستگی تهیه شده (شکل 4)، تعداد 34 (20 نشانگر SSR و 14 نشانگر ISSR) نشانگر در 7 گروه پیوستگی قرار گرفتند و 18 نشانگر به دلیل عدم پیوستگی با سایر نشانگرها در گروههای پیوستگی قرار نگرفتند. اشباع نقشه با تعداد نشانگر های بیشتر باعث خواهد شد به تعداد کروموزومها در حالت هاپلوئیدی گیاه (n=24)، گروههای پیوستگی تشکیل شود. در این صورت به احتمال زیاد نشانگرهایی که در مرحله نخست وارد گروههای پیوستگی نشده اند وارد نقشه اشباع می شوند. تعداد نشانگرها در گروههای پیوستگی حداقل دو عدد و حداکثر ۱۲عدد بوده و میانگین فاصله بین دو نشانگر 3/17 سانتی مورگان است (شکل 4). نام گذاری گروههای پیوستگی براساس وجود نشانگر مشترک با گروههای پیوستگی موجود درنقشه مرجع تهیه شده توسط بیندلر و همکاران (9 و 10) انجام شد.

جدول۱-  پارامترهای ژنتیکی صفت روز تا گلدهی در جمعیت 2F توتون شرقی حاصل از تلاقی بین Basma seres 31 (والد مادری) و SPT 406 (والد پدری) و والدین آنها

Item

زمان گلدهی

Basma seres 31(P1)

1/110

SPT406(P2)

1/90

P1-P2

۲۰

P

1/100

Max

۱۱۸

Min

۹۱

F2

56/108

F2ـ P

46/8

10%best F2

4/117

GG10%= 10%best F2 - P

3/17

STDEV

53/5

LSD0.05

05/2

P: میانگین والدین، F2: میانگین افراد F2، : 10%best F2 میانگین 10 درصد از بهترین افراد F2 انتخابی برای صفت مورد مطالعه، GG10%: بازده ژنتیکی زمانی که 10 درصد از بهترین افراد F2 انتخابی با میانگین والدین مقایسه شوند، STDEV:­ انحراف­ معیار­.

نتایج مکان­یابی QTL با استفاده از روش مکان­یابی ساده نشان داد که تعداد 16 QTL مرتبط با صفت مورد مطالعه در گروه­های پیوستگی مختلف پراکنده اند و بیشترین تعداد QTLها در گروه پیوستگی 4 شناسایی شد (نتایج منتشر نشده). با استفاده از روشهای IM و CIM به ترتیب ۹ و ۲ QTL برای صفت روز تا شروع گلدهی شناسایی شد (جدول ۲). ­QTLهای شناسایی شده بوسیله روش IM در گروههای پیوستگی یک، دو، سه، پنج و هفت قرار دارند (شکل 4). با استفاده از روش IM، ناحیه کروموزومی شناسایی شده qDF5-3 و qDF2-2  با 0.8 و ۳۶ درصد اثر فنوتیپی به ترتیب کوچکترین و بزرگترین QTL های شناسایی شده هستند که در گروههای پیوستگی دو و پنج قرار دارند (جدول۲).

 

 

جدول ۲- موقعیت و اثر QTL های شناسایی شده برای صفت روز تا گلدهی در جمعیت 2F توتون شرقی حاصل از تلاقی بین Basma seres 31 (والد مادری) و SPT 406 (والد پدری).

روش

QTL

گروه پیوستکی

نشانگر

موقعیت

LOD

اثر افزایشی

اثر غالبیت

R2

IM

qDF1-1

۱

۲

۱۷

2.64

2.19-

2.42

12.70

 

qDF7-1

۷

۱

۳

3.73

2.97-

20. 61-

16.90

 

qDF2-1

۲

۱

۷

4.86

2.28-

2.34-

14.60

 

qDF2-2

۲

۲

38.9

4.54

4.51-

2.78

۳۶

 

qDF5-1

۵

۱

۲۰

4.21

2.45

1.81

17.10

 

qDF5-2

۵

۴

43.9

3.88

3.06-

0.99

23.6

 

qDF5-3

۵

۶

83.7

4.90

0.70-

5.88-

0.80

 

qDF5-4

۵

۱۰

171.1

3.27

3.63

2.66-

23.06

 

qDF3-1

۳

۱

۲۶

3.48

3.14

0.55

18.03

CIM

qDF5-1

۵

۷

90.4

4.09

1.73-

3.86-

1.95

 

qDF5-2

۵

۸

127.1

3.23

3.54-

1.06-

15.34

QTL: quantitative trait loci, LOD: log10 likelihood ratio (likelihood that the effect occurs by linkage/likelihood that the effect occurs by chance), R2: percentage of phenotypic variance explained by the individual QTLs. IM: interval mapping, CIM: composite interval mapping.

 

 

شکل 2- الگوی باندی مربوط به آغازگر  PT30346از نشانگرهای SSR در تعدادی از افراد جمعیتF2  توتون شرقی حاصل از تلاقی [Basma seres 31 (♀) × SPT 406 (♂)]

 

 

شکل 3- الگوی باندی مربوط به آغازگر UBC810 از نشانگرهای ISSR در تعدادی از افراد جمعیتF2  توتون شرقی حاصل از تلاقی [Basma seres 31 (♀) × SPT 406 (♂)]

 

 

مقدار اثرات افزایشی و غالبیت برای QTL qDF5-3 به ترتیب 7/0(-) و 7/5(-) و برای QTL qDF2-2 به ترتیب 5/4(-) و 7/2 می باشد (جدول ۲). QTL های شناسایی شده با استفاده از روش CIM، در گروه پیوستگی شماره پنج قرار دارند که 95/1 و 3/15 درصد از تغییرات فنوتیپی صفت روز تا شروع گلدهی در توتون های شرقی را توجیه می نمایند (جدول ۲). مقدار اثرات افزایشی و غالبیت QTL های شناسایی شده از طریق CIM، به ترتیب 7/1(- ) و 8/3(-)  برای qDF5-1  و 5/3(-) و 06/1(-) برای qDF5-2 می­باشد (جدول ۲). علامت منفی برای اثرات افزایشی و غالبیت نشان­دهنده این است که این اثرات از والد مادری Basma Seres 31 به نتاج منتقل گردیده است. با توجه به جدول ۲، از میان QTL های شناسایی شده،  qDF5-3و qDF1-1 با مقدار 9/4 و 6/2 بیشترین و کمترین مقدار LOD را دارند. در این مطالعه، بیشترین تعداد QTL شناسایی شده در گروه پیوستگی شماره پنج قرار دارد (شکل 4). در این تحقیق QTLهایی با اثرات کوچک شناسایی شدند که در کنترل صفت نقش داشتند که تأییدی بر وجود سیستم کنترل چندژنی است. در نقشه تهیه شده با توجه به تعداد پایین نشانگرها و فاصله زیاد آنها از یکدیگر این احتمال وجود دارد که در نسلهای بعد به دلیل کراسینگ­اور ارتباط بین QTL با نشانگر شکسته شود. در حقیقت تعدادی از QTL های شناسایی شده وابسته به نسل باشند. همچنین در این نسل به دلیل نداشتن تکرار در اندازه گیری فنوتیپ و اثرات شدید محیطی، احتمال دارد در شناسایی QTL اریب وارد شده و نشانگرهای کاذب شناسایی شوند. بنابراین پیشنهاد می­شود مکان­یابی QTL در نسلهای پیشرفته تر با تهیه نقشه اشباع (نقشه با تراکم نشانگر بیشتر) و تهیه فنوتیپی که میانگین چندین تکرار است انجام شود. در نسلهای پیشرفته به دلیل وقوع نوترکیبیهای بیشتر و تثبیت آللها احتمال شکستگی ارتباط بین نشانگر و QTL کمتر است. QTLهای شناسایی شده در چنین شرایطی از اعتبار بیشتری برخوردار خواهند بود و پتانسیل استفاده در گزینش به کمک نشانگر را دارند.

 

 

شکل 4- نقشه پیوستگی حاصل از نشانگرهای SSR وISSR  در جمعیت 2F توتون شرقی حاصل از تلاقی بین Basma seres 31 (والد مادری) و SPT 406 (والد پدری) تهیه شده با استفاده از نرم­افزار CarthaGene 1.2.2.

 

مطالعات مربوط به مکان­یابی QTL در گیاهان مختلف و توسط افراد مختلف انجام شده است در مطالعه ای، سوموقات و همکاران (33) روی گوجه فرنگی دو QTL برای صفت تاریخ گلدهی گزارش نمودند که در گروههای پیوستگی چهار و یک قرار داشتند و به ترتیب 5/3 و 6/6 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه می نمودند. میزان اثر افزایشی اینQTLها به ترتیب 2/1 و 05/2 بودند (33). همچنین، جمینز-گومز و همکاران (27) دو QTL برای صفت روز تا گلدهی در گوجه فرنگی شناسایی کردند که این QTL ها در مجموع 3/55 درصد از تنوعات فنوتیپی را توجیه می نمودند. در مطالعه ایی که فرری و همکاران (21) در گیاه بادمجان انجام دادند، تعداد هشت QTL شناسایی گردید که از ۲۰ الی ۲۸ درصد از تغییرات فنوتیپی صفت گلدهی را توجیه می نمودند و بیشترین تعداد این QTL ها در گروه پیوستگی پنج قرار داشتند. طبق تحقیقات فرری و همکاران (21) دو عدد از این QTL ها با مکانهایی که صفت گلدهی را در گوجه فرنگی کنترل می نمودند هم مکان بودند یعنی دو QTL در گروه پیوستگی پنج به طور مشترک تاریخ گلدهی را در گوجه فرنگی و بادمجان کنترل می نمایند به طوری که در گیاه بادمجان ۴۱ درصد و در گیاه گوجه فرنگی ۱۸ درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه می نمایند. در مطالعه ای، عبدالهی مندولکانی و عزیزی (4) از طریق تجزیه ارتباط، نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورفولوژیک در یونجه را شناسایی کردند. بیکی و همکاران (1) از نشانگرهای ISSR برای بررسی تنوع وراثتی ارقام زراعی و گونه­های خودروی جنس Crocus استفاده کردند و گزارش نمودند که نشانگرهای ISSR سودمندی بالایی در گروه بندی گونه های Crocus و تحلیل روابط ژنتیکی آنها دارند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که صفت روز تا شروع گلدهی در توتونهای شرقی، یک صفت کمی می باشد که توسط ژنهای با اثرات افزایشی و غالبیت کنترل می شود. با استفاده از نشانگرهای مولکولی SSR و ISSR می توان مکانهای ژنی کنترل کننده صفاتی نظیر گلدهی را در توتونهای شرقی شناسایی نمود. در صورتی که پایداری مکانهای ژنی شناسایی شده در این تحقیق توسط مطالعات بعدی نیز اثبات شود، می توان از این نشانگرهای همبسته در گزینش به کمک نشانگر در توتون استفاده نمود.  

1-بیکی، ا.ح.، عباسپور، ن. و مظفری، ج. (1392). بررسی تنوع وراثتی ارقام زراعی و گونه­های خودروی جنس Crocus با استفاده از نشانگر ISSR در ایران. پژوهشهای سلولی و ملکولی. 26: 164-173.
 2- حاتمی ملکی، ح.، کریم زاده، ق.، درویش زاده، ر. و علوی، ر. (۱۳۹۱). تنوع ژنتیکی توتون های شرقی با استفاده از روش های آماری چند متغیره. پژوهش های زراعی ایران.۱۰: ۱۰۶-۱۰۰.
 3- شعف، س. (۱۳۹۰). نقشه­یابی ارتباطی ژن­های زمان گلدهی در جو. رساله دکتری. دانشگاه تهران.
4- عبدالهی مندولکانی، ب. و عزیزی، ح. (1393). شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورفولوژیک در جمعیتهای یونجه زراعی (Medicago sativa L.). پژوهشهای سلولی و ملکولی. 27: 260-268.
5- محمدی، و.، قنادها، م. ر.، زالی، ع.، یزدی صمدی، ب. و برن، پ. (۱۳۸۴). نقشه یابی QTLهای صفات مورفولوژیکی گندم. علوم کشاورزی ایران. ۳۶: ۱۴۵-۱۵۷.
 
6- Basten, C.J., Weir, B.S. and Zeng, Z.B. (2001). QTL Cartographer: a Reference Manual and Tutorial for QTL  Mapping. Department of Statistics, North Carolina State University, USA. 395 Pp.
7- Beavis, W.D. (1994). The power and deceit of QTL experiments: lessons from comparative QTL studies. Proc. 49th Annu. Corn and Sorghum Industry Res. Conf., Chicago, 49:250-266.
8- Beavis, W.D. (1998). QTL analysis: Power, precision, and accuracy. In A.H. Paterson (ed.) Molecular dissection of complex traits. CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 145-161.
9- Bindler, G., Hoeven, R., Gunduz, I., Plieske, J., Ganal, L., Rossi, L., Gadani, F. and Donini, P. (2007). A microsatellite marker based linkage map of tobacco. Theoretical and Applied Genetics. 114: 341–349.
10- Bindler, G., Plieske, J., Bakaher, N., Gunduz, I., Ivanov, N., Vander Hoeven, R., Ganal, M. and Donini, P.  (2011). A high density genetic map of tobacco (Nicotiana  tabacum  L.) obtained from large scale  microsatellite marker development. Theoretical and Applied Genetics. 123: 219–230.
11- Cagas, C.C., Lee, O.N., Nemoto, K. and Sugiyama, N. (2008). QTL analysis of flowering time and related traits in an interspecies cross of tomato (Solanum lycopersicum × Solanum pimpinellifolium). Scientia Horticulturae. 116: 144–151.
12- Chai, C.C., Chai, L.G., Cai, C.C., Lin, G.P., Wang, Y. and Xu, F.S. (2009). Construction of genetic linkage map of burley tobacco (Nicotiana tabacum L.) and genetic dissection of partial traits. Acta Agronomica  Sinica. 35: 1646–1654.
13- Cheng, L., Wang, Y., Zhang, C., Wu, C., Xu, J., Zhu, H., Leng, J., Bai, Y., Guan, R., Hou, W., Zhang, L. and Han, T. (2011). Genetic analysis and QTL detection of reproductive period and post-flowering photoperiod responses in soybean. Theoretical and Applied Genetics. 123: 421–429.
14- Darvishzadeh, R., alavi, S.R. and Sarafi, A. (2009). Genetic variability for chlorine concentration in oriental tobacco genotypes. Archives of Agronomy and Soil Science. 57: 167-177.
15- Davalieva, K., Maleva, L., Filiposki, K., Spiroski, O. and Efremov, G.d. (2010). Genetic variability of Macedonian tobacco varieties determined by microsatellite marker analysis. Diversity. 2: 439-449.
16- Dellaporta, S.L., Wood, J. and Hicks, J.B. (1983). A plant DNA mini-preparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter. 1: 19–21. 
17- De vicente, M.C. and Tanksley, S.D. (1993). QTL analysis of transgressive segregation in an interspecific tomato cross. Genetics. 134: 585–596.
18- Doganlar, S., Frary, A., Ku, H.M. and Tanksley, S.D. (2002). Mapping quantitative trait loci in inbred backcross lines of Lycopersicon pimpinellifolium (LA1589). Genome. 45: 1189–1202.
19- Ek, M., Eklund, R., Ven Post, R., Dayteg, C., Henriksson, T., Weibull, P., Ceplitis, A., Isaak, P. and Tuvesson, S. (2005). Microsatellite markers for powdery mildew resistance in pea (Pisum sativum L.). Hereditas. 142: 86-91.
20- Ferreira A, da Silva MF, da Costa e Silva L, Cruz CD (2006). Estimating the effects of population size and type on the accuracy of genetic maps. Genetics and Molecular Biology. 29: 182-192.
21- Frary, A., Doganlar, S., Daunay, M.C. and Tanksley, S.D. (2003). QTL analysis of morphological traits in eggplant and implications for conservation of gene function during evolution of Solanaceous species. Theoretical and Applied Genetics. 107: 359-370.
22- Givry, S.D., Bouchez, M., Chabrier, P., Milan, D. and Schiex, T. (2005). Carthagene: multipopulation integrated genetic and radiation hybrid mapping. Bioinformatics. 21: 1703–1704.
23- Grandillo, S. and Tanksley, S.D. (1996). QTL analysis of horticultural traits differentiating the cultivated tomato from the closely related species Lycopersicon pimpinellifolium. Theoretical and Applied Genetics. 92: 935–951.
24- Hatami Maleki, H., Karimzadeh, G., Darvishzadeh, R. and Sarrafi, A. (2011). Correlation and sequential path analysis of some agronomic traits in tobacco (Nicotiana tabacum L.) to improve dry leaf yield. Australian Journal of Crop Science. 5: 1644-1648.
25- Hatami Maleki, H., Karimzadeh, G., Darvishzadeh, R. Naghavi, M.R. and Sarrafi, A. (2013). Identification of QTLs associated with low chloride accumulation in oriental tobacco. Genetika. 45: 855-864.
26- Jarillo, A.J., del Olmo, I., Gómez-Zambrano, A., Lázaro, A., López-González, L., Miguel, E., Narro-Diego, L., Sáez, D. and Piñeiro. M. (2008). Review. Photoperiodic control of flowering time. Spanish Journal of Agricultural Research. 6: 221-244.
27- Jimenez-Gomez, J.M., Alonso-Blanco, C., Borja, A., Anastasio, G., Angosto, T., Lozano, R. and Martinez-Zapater, J.M. (2007). Quantitative genetic analysis of flowering time in tomato. Genome. 50: 303–315.
28- Julio, E., Denoyes-Rothan, B., Verrier, J.L. and Dorlhac de borne, F. (2006).   Detection of QTLs linked to leaf  and smoke properties in Nicotiana tabacum based on a study of 114 recombinant inbred lines.  Molecular Breeding. 18: 69–91. 
29- Kikuchi, R. and Handa, H. (2009). Photoperiodic control of flowering in barley. Breeding Science. 59: 546–552.
30- Lander, E.S. and Botstein, D. (1989). Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics. 121: 185–199.
31- Lindhout, P., van Heusden, S., Pet, G., van Ooijen, J.W., Sandbrink, H., Verkerk, R., Vrielink, R. and Zabel, P. (1994). Perspectives of molecular marker assisted breeding for earliness in tomato. Euphytica. 79: 279–286.
32- Semagn K., Bjørnstad Å. and Ndjiondjop M. N. (2006). Principles, requirements and prospects of genetic mapping in plants. African Journal of Biotechnology 5(25): 2569-2587.
33- Sumugat, M.R., Mayumi, M., Kyoko, A. and Sugiyama, N. (2010). Quantitative trait loci controlling flowerring properties in tomato. ISSAAS Journal. 16: 1-9.
34- Tong, Z., Jiao, T., Wang, F., Li, M., Leng, X., Gao, Y., Li, Y., Xiao, B. and Wu, W. (2012). Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum  L.). Plant Breeding. 131: 335–339.
35- White, F.H., Pandeya, R.S. and Dirks, V.A. (1979). Correlation studies among and between agronomic, chemical, physical and smoke characteristics in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum L.). Canadian Journal of Plant Science. 59: 111-120.
36- Yang, B.C., Xiao, B.G., Chen, X.J. and Shi, C.H. (2007). Assessing the genetic diversity of tobacco germplasm using inter simple sequence repeat and inter-retrotransposon amplification polymorphism markers. Annals of Applied Biology. 150: 393–401.
37- Zeng, Z.B. (1993). Theoretical basis of separation of multiple linked gene effects on mapping quantitative trait loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90: 10972–10976.
38- Zeng, Z.B. (1994). Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics. 136: 1457-1468. 
39- Zhang, D., Cheng, H., Hu, Z., wang, H., Kan, G. and Liu, C. (2013). Fine mapping of a major flowering time QTL on soybean chromosome 6 combining linkage and association analysis. Euphytica. 191: 23-33.
  • تاریخ دریافت: 25 بهمن 1392
  • تاریخ بازنگری: 03 اسفند 1393
  • تاریخ پذیرش: 23 اسفند 1393