پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
مخمر پیکیا پاستوریس: ابزار آزمایشگاهی مناسب برای تولید پروتئین های نوترکیب
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 پژوهشگاه رویان
2 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرکان
3 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک
چکیده
سیستم بیانی باکتری توانایی تولید مقادیر بالایی از پروتئین های نوترکیب را داراست، اما ممکن است پروتئین های تولید شده تاشدگی ساختاری مناسبی نداشته و فاقد اصلاحات پس از ترجمه ای باشند. از طرف دیگر سلول های پستانداران اگرچه انتخاب مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب محسوب می شوند اما هزینه های بالای تولید و میزان کم محصول نوترکیب در این سیستم ها، محققان را به سمت مطالعه بر روی سیستم بیانی مخمری سوق داده است. مخمرها به دلیل داشتن ویژگی های بیشمار ازجمله دستکاری ژنتیکی آسان، میزان بالای بیان پروتئین های برون سلولی و درون سلولی، و توانایی انجام اصلاحات پس از ترجمه ای متناسب با سلول های یوکاریوتی، برای بیان پروتئین های خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیا پاستوریس برای تولید پروتئین های نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. ترشح مقادیر کمی از پروتئین های درونی مخمر در محیط کشت، باعث خالص سازی آسان پروتئین های نوترکیب از آن می شود. به هرحال، سویه های گلایکوسویچ مخمر پیکیا پاستوریس با قابلیت انجام اصلاحات پس ترجمه ای یکسان با سیستم بیانی یوکاریوتی، تنها نقص سیستم های بیانی مخمر را رفع کرده است. بر این اساس، پیکیا پاستوریس نسبت به سایر میزبان ها، سیستم ترشحی مناسبی برای دستیابی به مقادیر بالاتری از پروتئین های نوترکیب با ساختار درست بشمار می رود.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Pichia pastoris yeast: an appropriate experimental tool for recombinant proteins production
نویسندگان [English]
- Zahra Elyasi Gorji 1
- Amir Amiri Yekta 1
- Saeed Hassani 2
- mohammad hossein Sanati 3
چکیده [English]
The bacterial expression system has the ability to produce high amounts of recombinant proteins, but the produced proteins might not have suitable structure folding and post-translational modifications. In the other hand, the mammalian cell expression system also provides the suitable form for protein production; however the higher costs and generally low production yielding for this expression system made the researchers to have tendency to study on the yeast expression system. Yeasts are particularly suited to expression of foreign proteins for numerous features, including easy genetic manipulation, high levels of intracellularly or extracellularly protein expression, and the ability to carry out higher eukaryotic protein modifications. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been developed for the production of various recombinant proteins and growth into high cell densities in an inexpensive medium. Secretion of low amounts of yeast endogenous proteins in cell culture media makes the simple purification of expressed recombinant proteins. However, the Pichia pastoris Glyco-switch strains with the ability to produce eukaryotic glycoproteins with the same post-translational modifications fixed the only deficiency in yeast expression system. Accordingly, Pichia pastoris is an appropriate secretory system for obtaining larger quantities of correct products, in compare to other host cells.
کلیدواژه‌ها [English]
- Pichia pastoris
- Recombinant protein
- Genetic engineering
مخمر پیکیاپاستوریس: ابزار آزمایشگاهی مناسب برای تولید پروتئینهای نوترکیب
زهرا الیاسی گرجی1،2، امیر امیری یکتا1، سعید حسنی2، محمدحسین صنعتی1،3*
1 تهران، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و علوم پزشکی تولید مثل جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه ژنتیک
2 گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده علوم دامی
3 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فنآوری، پژوهشکده زیست فنآوری پزشکی، گروه ژنتیک پزشکی
تاریخ دریافت: 17/11/92 تاریخ پذیرش: 26/9/93
چکیده
سیستم بیانی باکتری توانایی تولید مقادیر بالایی از پروتئینهای نوترکیب را داراست، اما ممکن است پروتئینهای تولید شده تاشدگی ساختاری مناسبی نداشته و فاقد اصلاحات پس از ترجمهای باشند. از طرف دیگر سلولهای پستانداران اگرچه انتخاب مناسبی برای تولید پروتئین نوترکیب محسوب میشوند اما هزینههای بالای تولید و میزان کم محصول نوترکیب در این سیستمها، محققان را به سمت مطالعه بر روی سیستم بیانی مخمری سوق داده است. مخمرها به دلیل داشتن ویژگیهای بیشمار از جمله دستکاری ژنتیکی آسان، میزان بالای بیان پروتئینهای برون سلولی و درون سلولی، و توانایی انجام اصلاحات پس از ترجمهای متناسب با سلولهای یوکاریوتی، برای بیان پروتئینهای خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیاپاستوریس برای تولید پروتئینهای نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. ترشح مقادیر کمی از پروتئینهای درونی مخمر در محیط کشت، باعث خالص سازی آسان پروتئینهای نوترکیب از آن میشود. به هر حال، سویههای گلایکوسویچ مخمر پیکیاپاستوریس با قابلیت انجام اصلاحات پس ترجمهای یکسان با سیستم بیانی یوکاریوتی، تنها نقص سیستمهای بیانی مخمر را رفع کرده است. بر این اساس، پیکیاپاستوریس نسبت به سایر میزبانها، سیستم ترشحی مناسبی برای دستیابی به مقادیر بالاتری از پروتئینهای نوترکیب با ساختار درست بشمار میرود.
واژه های کلیدی: پیکیاپاستوریس، پروتئین نوترکیب، مهندسی ژنتیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 23562720-021، پست الکترونیکی: m-sanati@nigeb.ac.ir
مقدمه
تاریخچه کاربرد مخمر در عرصه زیست فنآوری: در اوایل سال 1960 انسولین انسانی به عنوان اولین داروی نوترکیب در باکتری تولید شد به طوری که امروزه این فرآورده نوترکیب برای بسیاری از بیمارانی که از دیابت رنج میبرند استفاده میشود. پس از آن چندین پروتئین دیگر و بخصوص هورمون رشد انسانی نیز در باکتری نوترکیب تولید شدهاست (48). بیان موفق پروتئین نوترکیب در باکتری، به ساختارهای اول، دوم، سوم و خصوصیات عملکردی پروتئین موردنظر وابسته است و از آنجایی که باکتری یک موجود پروکاریوت است، بیان پروتئینهای یوکاریوتی در آن با محدودیتهایی روبروست (22). همچنین بسیاری از پروتئینهای نوترکیب تولید شده در سلولهای حشرات در زمان استفاده در بدن پستانداران غیرفعال عمل میکنند که علت آن حذف سریع این نوع پروتئینها در چرخش خون بدن پستاندار است (55). بنابراین، امروزه گرایش زیادی برای یافتن سیستمهای تولیدی جایگزین وجود دارد.
از اوایل سال 1980 تا به امروز به دلیل شناخت ساختارهای ژنتیکی، زیستشیمیایی، فیزیولوژیکی و فنآوری تخمیر در مخمر ساکارومایسزسرویسیه، سازمان غذا و دارو آمریکا (FDA) این میکروارگانیزم را به عنوان یک موجود تکسلولی بیخطر به رسمیت شناخته است. در طی سال 1980، پروتئینهای نوترکیب در مخمر ساکارومایسزسرویسیه بیان شدند؛ اما چندی بعد مشخص شد که این موجود برای تولید تمام پروتئینهای موردنیاز مناسب نیست (21، 45 و 73). از نیمه سال 1980، جستجو برای میزبانهای جایگزین در میان گونههای مخمری آغاز شد (65). کلیورومایسزلاکتیس اولین گونه بعد از ساکارومایسزسرویسیه بود که برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شد و هماکنون برای تولید رنین در فرآیند پنیرسازی کاربرد بسیاری دارد (91).
امروزه مخمرهای پیکیاپاستوریس اصلاح ژنتیکی شده، تحت عنوان سویههای گلایکوسویچ، به طور جالب توجه دارای ژنهای کدکننده آنزیمهای مسئول اصلاحات پسترجمهای بوده و قادر به ترشح مقادیر بالایی از پروتئینهای نوترکیب با ساختارهای طبیعی و گلیکوزیلاسیون صحیح هستند که این امر مشکلات استفاده از پروتئینهای نوترکیب تولید شده در مخمر پیکیاپاستوریس را برای انسان حل کردهاست. با توجه به این موارد در سالهای اخیر این مخمر توانسته سیستم مناسبی برای تولید پروتئینهای دارویی بهحساب آید (42 و 47). به طوری که هم اکنون سویههای گلایکوسویچ مخمر پیکیاپاستوریس، برای تولید پروتئینهای نوترکیب با اصلاحات N-گلیکوزیلاسیون مختص پروتئینهای انسانی، در دسترس هستند (74).
به طور کلی مخمرها براساس مصرف متانول به دو گروه عمده تقسیم میشوند که مثالهایی از هر یک از این دو گروه در جدول 1ذکر شده است (65). این دو گروه عبارت است از:
1) میزبانهای متانول دوست.
2) میزبانهای غیرمتانول دوست.
مخمرهای متانول دوست، از متانول به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده میکنند. در ابتدا این گروه از مخمرها برای تولید پروتئین خوراکی مورد استفاده قرار گرفتند و اولین پروتئین خوراکی تولید شده در آنها جهت مصرف خوراک دام بوده است (64). پس از چندی به دلیل وجود دو ویژگی، به عنوان سیستم مناسب برای تولید پروتئین نوترکیب دارویی مورد توجه قرار گرفتند (64 و 65) که این دو ویژگی عبارتند از: 1) توانایی رشد در غلظتهای سلولی بالا (21 و 65) و 2) وجود پروموترهای قوی که تنظیم تولید آنزیمهای اکسیدکننده متانول را در این مخمر بر عهده دارند (21، 28، 64، 65 و 99 ).
جدول 1-تقسیمبندی مخمر براساس مصرف متانول (65).
|
مخمرهای متانولدوست
|
هانسنولاپلیمورفا (Hansenula polymorpha)، پیکیاپاستوریس، پیکیا متانولیکا (Pichia methanolica)، کاندیدابویدینی (Candida boidini)، اوگاتامینوتا (Ogataea minuta)، ساکارومایسزسرویسیه، کلی ورومایسزلاکتیس، |
|
مخمرهای غیرمتانولدوست
|
یارویالیپولیتیکا (Yarrowia lipolytica)، زایگوساکارومایسزروکسی (Zygosaccharomyces rouxi)، زایگوساکارومایسزبایلی (Zygosaccharomyces bailii)، سارکوسیفااکسیدنتالیس (Sarcoscypha occidetalis) |
به طور کلی دو سویه از مخمرهای متانول دوست برای بیان پروتئینهای خارجی استفاده میشوند:
1) پیکیاپاستوریس (18 و 64)
2) هانسنولاپلیمورفا (36 و 86).
مخمر پیکیاپاستوریس: امروزه، دانشمندان به طور پیوسته در حال دستکاری ژنتیکی مخمرها بهمنظور بیان پروتئینهای یوکاریوتی خارجی هستند (29). در طول 20 سال گذشته سیستمهای بیانی مخمرها که مشهورترین آنها پیکیاپاستوریس است، برای تولید پروتئینهای نوترکیب مورد توجه بسیار قرار گرفتهاند (10 و 23). اهمیت ویژه این مخمر، توانایی ترشح پروتئین خارجی در محیط کشت است. محصول ترشحشده میتواند بیش از 80 درصد پروتئینهای محیط کشت را شامل شود (60). با توجه به قابلیت این سیستم بیانی، تاکنون بیش از 1000 پروتئین در سیستم بیانی فوق کلون و بیان شدهاند (10، 71 و 96).
پیکیاپاستوریس یک سیستم بیانی مفید با بازدهی مؤثر و یک ابزار تجربی-کاربردی در مهندسی پروتئین به شمار میرود (18، 60، 73 و 99). در سال 1980، پیکیاپاستوریس برای بیان پروتئینهای خارجی توسعه یافت (10، 17، 61 و 99) و در سال 2009 اولین پروتئین نوترکیب دارویی (آنزیم بازدارنده کالیکرین) در آن تولید شد (65).
ویژگیهای سیستم بیانی مخمر پیکیاپاستوریس: سیستم بیانی پیکیاپاستوریس نسبت به دیگر سیستمهای بیانی مزایا و معایب مختص به خود را دارد (60)؛ که برخی از این ویژگیها را میتوان از مقالات مختلف استخراج نمود و در قالب جدول 2 تقسیم بندی کرد.
جدول 2- مزایا و معایب سیستم بیانی پیکیاپاستوریس.
|
مزایای مخمر پیکیاپاستوریس |
قادر به ادغام یک ژن خارجی در ژنوم خود و تولید پروتئین خارجی است (22). |
|
دارای پروموتر قوی به نام AOX در ژنوم خود است (79). |
|
|
از منبع کربن ارزان نظیر متانول برای تحریک پروموتر AOX استفاده میکند (41). |
|
|
نرخ رشد بالا و سریع به همراه تخمیر آسان و ارزان در غلظت سلولی بالا را دارا است (60). |
|
|
میزان قابلملاحظهای از پروتئین نوترکیب را در محیط کشت ترشح میسازد (60 و 97). |
|
|
میزان کمی از پروتئین خود را در محیط کشت ترشح میسازد (23، 27 و 63). |
|
|
آلودگیهای آندوتوکسین و باکتریوفاژ در این مخمر دیده نمیشود (60). |
|
|
دستکاری ژنتیکی آن آسان است (22 و 60). |
|
|
توانایی انجام اصلاحات پسترجمهای گوناگون شامل تشکیل ساختار پلیپپتیدی، تشکیل پیوند دیسولفیدی و گلیکوزیلاسیون را دارد (23 و 52). |
|
|
سطوح پروتئین نوترکیب تولید شده در این مخمر یک تا دو برابر بیشتر از مخمر ساکارومایسزسرویسیه گزارش شدهاست (2). |
|
|
دسترسی به این سیستم بیانی به صورت تجاری امکانپذیر است (10). |
|
|
معایب مخمر پیکیاپاستوریس |
این مخمر در مقایسه با سیستم بیانی پستانداران، قادر به اصلاح گلیکوپروتئینها به طور یکسان با الیگوساکاریدهای انسانی نیست (52). تمام پروتئینهای نوترکیب نمیتوانند با موفقیت در این مخمر ترشح شوند و حفظ بیان بالای پروتئین در شبکه آندوپلاسمی هنوز یک مشکل محسوب میشود (23). به طور کلی چرخه زیستی و بیوشیمیایی پیچیدهای دارند (65). خصوصیات ساختاری و عملکردی آن در مقایسه با میزبان باکتریایی ناشناختهتر است (22). |
|
قادر به سنتز آنتی بادیهای مونوکلونال در الگویی مناسب نیستند (47). در برخی موارد قندهایی را به پروتئینهای انسانی اضافه میکنند. که این قندها در این نوع پروتئینها به طور طبیعی یافت نمیشود (47). |
ژنوتیپهای مختلف در مخمر پیکیاپاستوریس: تمام سویههای تجاری مخمر پیکیاپاستوریس از سویه اولیه و طبیعی NRRL-Y 11430 منشاء گرفتهاند. سویههای تغییر یافتهای که تنها در یک جایگاه ژنی نسبت به سویه اصلی دچار دستکاری شدهاند شامل GS115، GS190، و JC254، سویههایی که در دو جایگاه ژنی دچار تغییر و دستکاری شدهاند شامل GS200 وJC227 ، سویههایی که در سه جایگاه ژنی دچار تغییر شدهاند شامل JC300 و در نهایت سویههایی که در چهار جایگاه ژنی دچار دستکاری و تغییر شدهاند شاملJC308 هستند. این تغییرات در این سویهها میتواند به عنوان نشانگر انتخاب در طی فرآیند نوترکیبی استفاده شود (34). در حال حاضر سویههای متعددی از پیکیاپاستوریس با طیف گستردهای از ژنوتیپ در دسترس هستند. انتخاب یک سویه خاص با توجه به کاربرد آن تعیین میشود. هر سویه ویژگی منحصر به فرد خود را دارا است و محققان طبق نیاز و صلاحدید سویه موردنظر خود را انتخاب میکنند. تا کنون گزارش مستندی مبنی بر برتری و رجحان مشخص یک سویه بر سویه دیگر در تولید یک محصول خاص گزارش نشده است چرا که الگوی بیان یک پروتئین بر اساس یک ویژگی خاص بررسی و تفسیر نمیشود بلکه وابسته به عوامل متعدد و پیچیدهای است. براساس نوع پروتئین و میزان اصلاحات مورد نیاز پس از بیان، هر یک از سویهها که مناسبتر باشند انتخاب خواهند شد (22). لازم به ذکر است که اولین سویهای که برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شد سویه GS115 بوده است (25). نکته مهم در ویژگی اکثر این سویهها، وجود پروتئازهای واکوئلی است. پروتئازهای واکوئلی فاکتور بسیار مهمی در تجزیه پروتئین به حساب میآیند. به طور مثال برخی از پروتئینها در محیط کشت پیکیاپاستوریس به طور ناپایدار تولید میشوند زیرا این گونه از پروتئینها به حضور پروتئازها حساس بوده و به سرعت توسط آنها تجزیه میشوند. به خصوص اینکه در شرایط کشت در مقیاس انبوه به علت تراکم بالای سلولی این آنزیمها به شکل فراوان در محیط کشت یافت میشود. چندین سویه عاری از پروتئاز از جمله سویههای SMD1163، SMD1165، SMB1168 (5 و 80) و SMD1168H (95) فاقد آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین هستند که به عنوان سویههای موفق در کاهش تجزیه برخی از پروتئینهای خارجی گزارش شدند (60). سویههای دارای این خصوصیت میتوانند در غلظت سلولی بالا و با تجزیه درصد کمی از سلولها رشد کنند اما نرخ رشد آهسته دارند (10). سویههای GS115 و SMD1168 فاقد ژن هیستیدین دهیدرژناژ (HIS4) هستند؛ در نتیجه برای بیان یک ژن خارجی در ژنوم آنها نیاز به حضور هیستیدین در محیط کشت است. سویههای SMD1168 و GS115 دارای ژن الکل اکسیداز-1 هستند که این ژن با کدکردن آنزیم الکل اکسیداز-1 مسئولیت مصرف تقریباً 85 درصد از متانول موجود در محیط کشت را بر عهده دارند (50). سویهKM71 ، اگرچه فاقد پروموتر الکل اکسیداز-1 است اما با استفاده از پروموتر دیگری به نام الکل اکسیداز-2، آنزیم الکل اکسیداز-2 را فعال میسازد که این پروموتر نسبت به پروموتر الکل اکسیداز-1 ضعیفتر است. (6، 21 و 50). MC100-3 سویه دیگری است که در آن هر دو پروموتر الکل اکسیداز حذف شدهاست (10).
فنوتیپهای موجود در مخمر پیکیاپاستوریس: مطالعات فیزیولوژیکی سلول میزبان برای تولید پروتئینهای نوترکیب ضروری است (65). براساس ژنوتیپ، سه نوع فنوتیپ متفاوت از مخمر پیکیاپاستوریس وجود دارد (64 و 65):
فنوتیپ : Mut+این گروه فنوتیپ طبیعی و اصلی مخمر پیکیاپاستوریس هستند. سویههای حاوی این نوع فنوتیپ هر دو ژن رمزکنندهی پروموترهای الکل اکسیداز-1 و الکل اکسیداز-2 را دارند. در این گروه متانول به میزان بالا و سریع استفاده میشود (33 و 77) و با حضور متانول به عنوان منبع کربن، بیان پروتئین در سطح بالا انجام خواهد شد (20). سویههای Mut+ بدلیل مصرف سریع متانول توانایی تحمل غلظت بالاتری از متانول را دارا هستند و با احتمال کمتری دچار مسمومیت متانولی میشوند، اما به همان نسبت به میزان بیشتری نیازمند اکسیژن بوده و بیشتر از سایر سویهها با کمبود اکسیژن مواجه میشوند (10، 22 و 53). رایجترین میزبان بیانی مورد استفاده در مخمر پیکیاپاستوریس، سویه GS115، دارای فنوتیپ +Mut است (60).
فنوتیپ : Muts در این گروه پروموتر AOX1 حذف شده است، اما پروموتر AOX2 دست نخورده باقی میماند. تعداد کمی از مخمرهای متانول دوست در این دسته جای دارند. این گروه به آرامی از منابع متانول استفاده میکنند (20، 62، 64 و 65). سویههای Muts با مقادیر کمتری از متانول نسبت به سویههای Mut+ القاء میشوند (20 و 33). پروتئینهایی که دارای فرآیند شکلگیری آهسته هستند بهتر است توسط این نوع فنوتیپ تولید شوند زیرا نرخ القای پروتئین در آنها آهستهتر و در نتیجه در بیشتر موارد تولید محصول نوترکیب صحیحتر است (2، 22، 67 و 70). به عبارت دیگر وقتی رشد و تولید پروتئین در این فنوتیپ آهستهتر انجام شود پروتئینهای حاوی فولدینگ پیچیده که نیاز به زمان بیشتری برای تشکیل ساختارهای سوم خود دارند، این فرصت را خواهند داشت تا قبل از ترشح، به ساختار صحیح خود دست یابند. از سویی دیگر با یک نگاه مقایسهای مشخص میشود که در حضور میزان کم متانول در محیط کشت سویههای Muts نسبت به سویههای Mut+، میزان تولید آنزیم کربوکسی پپتیداز-A2 (مسئول کد کردن پروتئین)در این سویهها بیشتر است؛ لذا مقدار محصول تولیدی نیز در این شرایط در سویه Mutsبیشتراز سویه Mut+ خواهد بود (22). لازم به ذکر است که نرخ افزودن متانول در محیط کشت این سویهها نسبت به سویههای Mut+ سه برابر آرامتر است تا غلظت متانول در محیط به میزان موردنظر یعنی بین g/l 8-2 باقی بماند زیرا مصرف متانول آهسته صورت میگیرید و غلظت بالای متانول در محیط کشت برای این سویهها سمّ محسوب میشود (91). این سویهها در مقایسه با سویههای Mut+ به اکسیژن کمتری نیازمند هستند (21). در سویههای Muts، به دلیل سوخت و ساز پایین، زمان مورد نیاز برای رسیدن به پروتئین تولیدی طولانی هستند و عمدتاً بین 150 تا 200 ساعت بعد از مصرف متانول بطول میانجامد (43؛ 48 و 49)؛ درحالیکه این زمان برای سویههای طبیعی حاوی ژن الکل اکسیداز-1، 50 ساعت و یا حتی کمتراست (40 و 50).
تا به امروز اکثر آزمایشات در مخمر پیکیاپاستوریس در سویهی +Mut انجام شدهاست زیرا این سویهها در حضور متانول سرعت رشد بالاتر و در نتیجه درصد تولید محصول نوترکیب بیشتری دارند، اما با این وجود چندین مطالعه نشان دادهاست که سویههای Muts از نظر تولید پروتئین نوترکیب ارجحیت دارند. به طور مثال آنزیم HRP در دو سویه از دو نوع فنوتیپ +Mut و Muts تولید شد. نتایج به دست آمده نشان داد که نرخ رشد در سویه +Mut نسبت به سویه Muts به میزان یک و نیم برابر بیشتر بودهاست اما نرخ بهرهدهی محصول در سویه +Mut نسبت به سویه Muts سه برابر کمتر بوده است (57). KM71 سویهای است که بر روی محیط کشت حاوی متانول با نرخ ضعیفی رشد میکند و دارای فنوتیپ Muts است (12 و 60).
3) فنوتیپ Mut- :تعدادی از سویههای مخمر پیکیاپاستوریس از متانول به عنوان منبع کربن استفاده نمیکنند زیرا هر دو پروموتر در این گروه حذف شده است (19، 64 و 65). در نتیجه این گروه عمدتاً از گلیسرول، سوربیتول یا مانیتول به عنوان منبع کربن استفاده میکنند؛ همچنین ممکن است کشت آنها در زمان القاح با دستورالعمل تغذیهای مخلوط همراه باشد؛ به این صورت که از مقدار کنترلشدهای از متانول به عنوان محرک القایی بیان پروتئین نوترکیب و از مقدار محدودی گلیسرول، سوربیتول یا مانیتول به عنوان منبع کربن و رشد استفاده کنند (22، 57 و 65).این شرایط در زمانی است که اگر تمام سویهها حتی فنوتیپهای Mut- پروموتر AOX1 در آنها قرار گیرد، به توانمندی القای بیان در سطوح بالا خواهند رسید (60). مثلا MC100-3 سویهای است که قادر به استفاده از متانول نیست؛ به عبارت دیگر دارای فنوتیپ –Mut است (12 و 60). این فنوتیپ به طور معمول قادر به رشد در متانول نیست. برای این سویه تنها زمانی از متانول استفاده میشود که از پروموتر AOX1 برای بیان پروتئین نوترکیب در وکتور وارد شده به ژنوم این مخمر استفاده شود (34).
وکتورهای مورد استفاده در مخمر پیکیاپاستوریس: تمام وکتورهای بیانی پیکیاپاستوریس به عنوان شاتل وکتور پیکیاپاستوریس/ اشریشیاکلی طراحی میشوند؛ زیرا عمل واردسازی یک توالی خارجی به درون وکتور بیانی پیکیاپاستوریس معمولاً در باکتری سویه اشریشیاکلی انجام میگیرد. به این صورت که وکتور حاوی ژن مورد نظر ابتدا وارد باکتری اشریشیاکلی شده چرا که این باکتری سیستم تکثیری سریع و سادهتری نسبت به مخمر پیکیاپاستوریس دارد، لذا پس از کشت این میکروارگانیزم از حضور پایدار وکتور نوترکیب در یک سیستم میزبان مطمئن شده و بدون صرف هزینه و وقت، توالی نوکلئوتیدی سازه مربوطه از لحاظ هرگونه تغییر و جهش بررسی میشود و در صورت عدم مشاهده هرگونه تغییر، وکتور مربوطه آماده انتقال به ژنوم مخمر است (1 و 60).
آنچه که در یک وکتور بیانی پیکیاپاستوریس باید طراحی شود شامل موارد زیر است (60):
1) توالی 5'AOX1 در بالا دست ژن
2) توالی پیام ترشحی
3) جایگاه کلونینگ چندگانه
4) جایگاه پایان رونویسی
5) جایگاه نشانگر انتخابی
6) جایگاه ژن مقاومت به آنتیبیوتیک
7) توالی 3'AOX1 در پایین دست ژن
اولین اقدام در انتخاب یک وکتور بیانی در پیکیاپاستوریس تعیین این موضوع است که ترشح یک پروتئین در محیط خارج سلولی صورت بگیرد یا به صورت درون سلولی باشد (91).
چندین وکتور تجاری برای بیان ژن خارجی در مخمر، وجود دارد. در شکل 1، PHIL-D2 و pPIC9 به عنوان دو نمونه از وکتورهای مورداستفاده در مخمر پیکیاپاستوریس برای تولید پروتئین نوترکیب نشان داده شدهاست (22).
از دیگر وکتورهای این گونه مخمری میتوان pPIC9K و pPICZa را نام برد که هر یک ویژگی منحصربه فرد خود را دارند (22).
شکل 1- نمونه‌هایی از وکتورهای رایج در پیکیاپاستوریس (22).
بهعنوان دستآورد جدید در سیستم ترشحی مخمر پیکیاپاستوریس، وکتورهای گلایکوسوییچ طوری طراحی گردیدند که قادر به بیان پروتئینهای نوترکیب انسانی با اصلاحات پس ترجمهای صحیح در این مخمر هستند. از این دسته میتوان به وکتورهای تجاری شامل pGlycoSwitchM8، pGlycoSwitchM5، pGlycoSwitchGnT-I، pGlycoSwitchGalT/1، pGlycoSwitchGalT/2،pGlycoSwitchMan-II/1 ، pGlycoSwitchMan-II/2 و pGlycoSwitchGnT-II اشاره نمود (51).
پروموترهای مورد استفاده در مخمر پیکیاپاستوریس: یکی از معیارهای کلیدی برای تولید پروتئینهای خارجی، افزایش بازدهی رونویسی (بیان) ژن مورد نظر با استفاده از پروموتر مناسب است (64). پروموترهای AOX1 و AOX2 در مخمر پیکیاپاستوریس به عنوان پروموترهای طبیعی و اصلی شناسایی گردیدند که در پی آنها سه فنوتیپ برای پیکیاپاستوریس به وجود میآورد. مشخص شده است که موفقیت سیستم بیانی پیکیاپاستوریس به میزان زیادی بدلیل وجود پروموتر AOX است (10). پروموتر AOX به شدت توسط متانول تحریک و توسط منابع کربنی دیگر نظیر گلیسرول و گلوکز متوقف میشود (22 و 99)، به طوری که در محیط کشت حاوی متانول به عنوان منبع کربن، mRNA آنزیم AOX بیش از پنج درصد از ذخیره RNA را شامل میشود (22). به عبارت دیگر فراوانی آنزیم الکل اکسیداز-1 زمانی که در محیط کشت حاوی متانول بهعنوان منبع کربن رشد میکند، میتواند به 30 درصد غلظت پروتئینهای سلولی برسد (22، 43 و 64) که این نشاندهنده قدرت برجسته پروموتر الکل اکسیداز-1 است. این پروموتر 85 درصد از فعالیت الکل اکسیداز را به خود اختصاص میدهد (19، 32، 90 و 100). در مقابل آن، آنزیم الکل اکسیداز-2 توسط پروموتر ضعیفتری به نام پروموتر الکل اکسیداز-2 کنترل میشود و 15 درصد از فعالیت الکل اکسیداز را در سلول به خود اختصاص می دهد (19 و 76). علاوهبر این، پروموترهای جدیدی برای بیان ژنهای خارجی جداسازی و بکار گرفته شدهاند که شامل پروموترهای گلیسرآلدئید تری فسفات دهیدروژناز (GAP) (10، 21، 91، 94 و 99)، فرمالدئید دهیدروژناز(FLD) (21، 71 و 99)، و دی هیدروکسی استون سنتتاز (DHAS) (56) در مخمر پیکیاپاستوریس هستند (94).
مسیر پروموتر AOX در متابولیسم متانول در مخمر پیکیاپاستوریس: مطالعات بیوشیمیایی نشان داد که استفاده از متانول نیازمند یک مسیر متابولیکی خاص به همراه چندین آنزیم مشخص است (93).
بر اساس شکل 2، مخمرهای متانولدوست دارای یک مسیر عمومی و مشابه برای استفاده از متانول هستند (74). این گروه میتوانند با استفاده از پروموتر الکل اکسیداز از متانول به عنوان منبع کربن استفاده نمایند؛ بدین صورت که پس از ورود متانول به محیط کشت مخمر، پروموتر الکل اکسیداز فعال شده و در پی آن ژن الکل اکسیداز بیان میشود. در ادامه آنزیم الکل اکسیداز توسط مخمر در محیط ترشح میشود (43). در حضور آنزیم الکل اکسیداز و اکسیژن در محیط پراکسیزوم، متانول به فرمالدئید اکسیده میشود و محصول جانبی این واکنش پراکسید هیدروژن است (10 و 35). پراکسید هیدرژن، یک محصول جانبی در مسیر مصرف متانول بشمار میرود و منجر به استرس سلولی و تحریک مرگ سلولی میشود (56). مقداری از فرمالدئید وارد سیتوزول شده و با حضور آن مجموعهای از فرآیندها انجام میشود. در این مسیر ابتدا فرمالدئید دهیدروژناز، فرمالدئید را به فرمات تبدیل ساخته و سپس فرمات دهیدروژناز، فرمات را به دی اکسیدکربن تبدیل میکند (35، 37 و 43). در مسیر دیگر فرمالدئید باقیمانده در پراکسیزوم با زایلولوز 5-فسفات واکنش میدهد و به وسیله آنزیم دیهیدروکسی استون سنتتاز دو ماده سه کربنه یعنی دیهیدروکسی استون و گلیسرآلدئید تری فسفات تولید میشود (35 و 43). این اجزا طی واکنشهایی در سیتوزول، بار دیگر زایلولوز 5-فسفات را تولید خواهند کرد. تنظیم متابولیسم متانول در مخمر یک فرآیند پیچیده است (93). سنتز آنزیمهای متابولیز کننده متانول با حضور متانول، فرمالدئید و فرمات تحریک و با حضور گلوکز و اتانول متوقف میشود (30، 77 و 93). تبدیل متانول به فرمالدئید، مرحله محدودکننده چرخه مصرف متانول در سلول محسوب میشود و زمانی که مقدار فرمالدئید و متانول به طور همزمان افزایش یابد، رشد سلول متوقف خواهد شد (22). فرمالدئید دهیدروژناز، فرمات دهیدروژناز و دی هیدروکسی استون سنتتاز آنزیمهای کلیدی در این واکنش بهحساب میآیند (57).
شکل 2- مسیر استفاده از متانول در پیکیاپاستوریس (74).
AOX1: الکل اکسیداز؛ :FLD2 فرمالدئید دهیدروژناز؛ FGH3: s- فرمیل گلوتاتیون هیدرولاز؛ FDH4: فرمات دهیدروژناز؛ CAT5: کاتالاز؛ DAS6: دی هیدروکسی استون سنتتاز؛ DAK7: دی هیدروکسی استون کیناز؛ TPI8: تریوفسفات ایزومراز؛ FBA9: فروکتوز-1و6- بیس فسفات آلدولاز؛ FBP10: فروکتوز-1و6 بیس فسفاتاز؛ DHA: دی هیدروکسی استون؛ GAP: گلیسرآلدئید سه فسفات؛ DHAP: دی هیدروکسی استون فسفات؛ F1,6BP: فروکتوز-1 و -6 بیس فسفاتاز؛ F6P: فروکتوز-6-فسفات؛ Pi: فسفات؛ Xu5P: زایلولوز-5-فسفات؛ GSH: گلوتاتیون.
توالی پیام ترشحی در مخمر پیکیاپاستوریس: بسیاری از پروتئینها بخصوص پروتئینهای ترشحی دارای یک منطقه پروپپتید هستند که برای شکلگیری صحیح پروتئین لازم است (73). این منطقه پیشین، شامل یک توالی کوچک متشکل از 15-6 اسیدآمینه است که پروتئینها را به سیستم ترشحی منتقل میسازد (68 و 73). اگرچه منطقه پروپپتید پروتئین، در هنگام آزادسازی پروتئین بالغ حذف میشود اما حضور آن در mRNA بالغ برای پایداری بیان و جلوگیری از تجزیهشدن پروتئین ضروری است (73)؛ همچنین عدم حضور آن در هنگام بیان پروتئین میتواند منجر به خارجسازی آرامتر پروتئینها از شبکه آندوپلاسمی و در برخی موارد از دستدادن ساختار پروتئینی شود (46، 66 و 75). پروتئینهای اولیه پس از خروج از شبکه آندوپلاسمی، به جسم گلژی منتقل میشوند تا منطقه پروپپتید حذف شود (24، 73 و 82). در مخمر، دسترسی به پیام ترشحی منجر به خارجسازی پروتئین از سلول میشود (9، 13 و 92). ژنهای خارجی میتوانند با توالی پیام طبیعی خود و یا توالی پیام مخمری ترشح شوند (68). ساکارومایسزسرویسیه و پیکیاپاستوریس توالیهای پیام اختصاصی کمی دارند، اما به طور موفقیتآمیزی بسیاری از پروتئینهای نوترکیب تولیدشده در مخمر پیکیاپاستوریس، قادر به استفاده از توالی پیام طبیعی خود هستند و مشاهده گردیده محصولات ترشحیافته با توالی پیام طبیعی زیست فعالتر هستند (22، 68، 73 و 81).
جایگاه توالی پیام ترشحی در وکتورهای مخمری و نیز دیگر یوکاریوتها، پس از شروع توالی پروموتر است (13، 58 و 68).
توالیهای پیام ترشحی مخمری که به طور موفقیتآمیزی برای بیان پروتئینهای نوترکیب در پیکیاپاستوریس استفاده شدند شامل توالی پیام ترشحی آلفا فاکتور (a-MF) و توالی پیام ترشحی اسید فسفاتاز (PHO1)هستند (14، 22، 58، 64 و 85).
توالی پیام ترشحی MF-a به عنوان پرکاربردترین توالی پیام ترشحی برای بیان پروتئین خارجی در پیکیاپاستوریس معرفی شده است (10، 14 و 92).
نشانگرهای انتخاب در مخمر پیکیاپاستوریس: تعدادی از ژنها به عنوان نشانگرهای انتخاب در فرآیند دستکاری ژنتیکی در پیکیاپاستوریس استفاده میشوند. این نشانگرهای انتخاب در سویههای مخمری نظیر پیکیاپاستوریس در اثر جهشهایی در برخی از نواحی ژنی به دست میآیند. به طور مثال برخی از نشانگرهای انتخاب نظیر HIS1، HIS2، HIS4، HIS5، و HIS6 مربوط به مسیر بیوسنتز هیستیدین هستند برخی دیگر نظیر ARG1 ، ARG2، ARG3 وARG4 مربوط به مسیر بیوسنتز آرژنین هستند. نشانگرهای دیگری نظیر ADE1، MET2، URA3 و FLD1 نیز تا کنون گزارش شدهاند (34). به طور مثال سویههای دارای نشانگر انتخابی HIS4 ناشی از جهش در ژن هیستیدینول دهیدروژناز خود هستند که قادر به سنتز هیستیدین نیستند به طوری که حضور هیسیتیدن در محیط کشت برای ادامه رشد آنها ضروری است؛ لذا میتوان از این ویژگی برای غربالگری کلنیهای نوترکیب استفاده نمود (10، 15، 17 و 44). پایفر و همکارانش (1992) بیان داشتند که گزینش نشانگرها و انتخاب پروموترهای صحیح برای دستیابی میزان بالایی از محصول نوترکیب ضروری است. انتخاب این دو ویژگی برای هر پروتئین متفاوت بوده که نشان دهنده تنظیم گسترده آن برای بهینهسازی فرآیند تولید پروتئین است (68). از طرف دیگر، به طور مثال با اینکه استفاده از نشانگر URA3 در مخمر پیکیاپاستوریس گسترش یافت اما استفاده از این نشانگر به دلیل آنکه رشد سویه مورد نظر را کند و زمانبر میسازد منجر به مشکلاتی میشود که در نهایت دانشمندان برای حل این مشکل نشانگرهای دیگری را معرفی نمودند. این نشانگرها بخشی از توالیهای ژنی مختص ژنوم مخمر هستند که با استفاده از تکنیک واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) شناسایی شدند و با وجود این توالیها دیگر نیازی به واردسازی یک نشانگر با استفاده از وکتور نیست (69).
انتقال سازه ژنی به ژنوم مخمر پیکیاپاستوریس: به دلیل آنکه هیچ وکتور خارج کروموزومی پایدار برای پیکیاپاستوریس وجود ندارند، وکتورهای بیانی معمولا به درون ژنوم مخمری وارد میشوند تا سویههای بیانی و پروتئینهای خارجی پایدار به دست آید (21 و 60).
اولین مرحله واردسازی وکتورهای نوترکیب خطیشده به ژنوم مخمر، هضم وکتور در یک جایگاه خاص با استفاده از آنزیم محدودالاثر و سپس انتقال وکتور خطی به درون سلول مخمر است (10 و 60). معمولاً پس از آمادهسازی نهایی وکتور نوترکیب در باکتری اشریشاکلی و خطی نمودن آن توسط آنزیمهای محدودالاثر، وکتور آماده درج درون ژنوم مخمر پیکیاپاستوریس است. توالی DNA موجود در انتهای وکتور خطیشده ورود DNA نوترکیب را به جایگاه ژنومی مخمر تحریک میسازد و در نتیجه وکتور به ژنوم مخمر ملحق میشود (91). در شکل 3 مراحل انتقال سازه نوترکیب به ژنوم مخمر و در نهایت ترشح پروتئین نشان داده شده است (1).
|
سازه نوترکیب |
|
انتقال سازه نوترکیب به ژنوم مخمر |
|
اصلاحات پس ترجمهای در شبکه آندوپلاسمی |
|
ترشح پروتئین از جسم گلژی |
شکل 3- نمای شماتیکی از وارد شدن یک سازه نوترکیب به سیستم بیانی مخمر پیکیاپاستوریس. هر سازه نوترکیب پس از طراحی و آمادهسازی، به ژنوم مخمر وارد میشود؛ توالی نوکلئوتیدی کدکننده پروتئین نوترکیب پس از بیان و ترجمه جهت انجام اصلاحات پس ترجمهای به شبکه آندوپلاسمی و جسم گلژی وارد میشود و در نهایت بر اساس نوع پروتئین به خارج از سلول یا درون سیتوپلاسم منتقل میگردد (1).
روشهای مورداستفاده برای انتقال DNA در مخمر پیکیاپاستوریس مشابه با مخمر ساکارومایسزسرویسیه است و نتایج مشابهی را نیز بههمراه دارد (15). انتقال سازه ژنی به ژنوم مخمر با استفاده از چهار روش متفاوت انجام میگیرد که شامل الکتروپوریشن، اسفروپلاست، استفاده از لیتیم کلراید و پلیاتیلن گلیکول هستند (16، 17، 22، 62، 91 و 94). در روش اسفروپلاست به دلیل انجام مراحل زیاد، احتمال آلودگی افزایش مییابد و علاوه بر آن فرآیندهای هضم سلولی ممکن است زندهمانی سلول را کاهش دهد (4 و 38). الکتروپوریشن آسان ترین و سریع ترین روش انتقال ژن در ژنوم پیکیاپاستوریس است (89). این روش رایجترین روش بوده (22 و 91) زیرا به مراحل کمتری نیازمند است و احتمال آلودگی در آن کمتر است (3).
در صورتی که جایگاه ژنی یکسانی در سازه ژنی وکتور نوترکیب و ژنوم مخمر وجود داشته باشد ادغام یک ژن به درون ژنوم مخمر، نوترکیبی همسان نامیده میشود. با واردسازی سازه بیانی در جایگاههای خاصی از کروموزوم پیکیاپاستوریس، این مخمر به میزبان نوترکیب تبدیل می شود. اندازه وکتور نوترکیب ممکن است بر روی پایداری ژنوم میزبان تأثیرگذار باشد. بنابراین، توسعه سویههای بیانی پایدار از نظر ژنتیکی که نرخ از دست دادن وکتور در آنها کمتر از یک درصد در هر نسل است بسیار مورد توجه است (73 و 88).
مسیر شکل گیری پروتئین در مخمر پیکیاپاستوریس: شکلگیری پروتئینها، اغلب با تشکیل ساختارهای دوم پروتئین آغاز میشود (22). پروتئینهای آماده برای ترشح به شبکه آندوپلاسمی هدایت شده و در آنجا دستخوش اصلاحات پس از ترجمهای میشوند. در ادامه، تنها پروتئینهای دارای ساختار صحیح، شبکه آندوپلاسمی را ترک خواهند کرد (40 و 46) و در نهایت پروتئینهای بالغ به صورت بستههایی به سطح سلول منتقل میشوند (73).
اصلاحات پسترجمهای پروتئین در مخمر پیکیاپاستوریس: یکی از مزایای عمده استفاده از پیکیاپاستوریس توانایی اصلاحات پسترجمهای پروتئینهای نوترکیب است. دسترسی به سویههای مهندسیشده گلایکوسویچ در پیکیاپاستوریس، آنها را به سیستم بیانی مفیدی برای تولید و ترشح پروتئینهای نوترکیب تبدیل ساخته است (23). به طور کلی، اصلاحاتی که باید پس از ترجمه پروتئین انجام گیرد شامل تشکیل باندهای دیسولفیدی، خارج کردن توالی پیام ترشحی از توالی اصلی پروتئین و گلیکوزیلاسیون پپتید بالغ است (59). پروتئولیزاسیون و گلیکوزیلاسیون از جمله مشکلات پس ترجمهای در پیکیاپاستوریس هستند که بر کیفیت پروتئین نوترکیب ترشح شده تأثیر میگذارد. پروتئینهای مختلف دارای وزن مولکولی مختص به خود هستند. بر اساس این خصوصیت میتوان تولید محصول نوترکیب مورد نظر را ارزیابی نمود. اگر اندازه محصول نوترکیب تولیدی کوچکتر از وزن مولکولی طبیعی مورد انتظارش به دست آید، این فرآیند حاصل پروتئولیزاسیون خواهد بود. به این معنا که پروتئین نوترکیب تولیدی در معرض آنزیمهایی قرار گرفته است که منجر به تجزیه آن شده است (91). یکی از مؤثرترین راهکارهای جلوگیری از فرآیند پروتئولیزاسیون، استفاده از سویههای عاری از آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین است (60) همان طور که قبلاً اشاره گردید این سویهها میتوانند در غلظت سلولی بالا و با تجزیه درصد کمی از پروتئینها رشد کنند (10). اگر اندازه محصول نوترکیب تولیدی بیشتر از میزان واقعی آن باشد، این مشکل در اثر گلیکوزیلاسیون پدید میآید یعنی پیوندهای بین رشتهای و تاشدگیهای ساختاری در این محصول منجر به اتصال و ادغام چندین رشته از پروتئین شده و سبب تشکیل پروتئین با اندازه چند برابر میشود (91). محققان اعلام نمودند که اصلاح مسیر N-گلیکوزیلاسیون در سویههای گلایکوسویچ، فیزیولوژی مخمر را تحت تأثیر قرار نمیدهد و چنین سویههای مهندسی شده، کاملاً قادر به تولید میزان بالایی از گلیکوپروتئینهای پستانداران با الگوی N-گلیکوزیلاسیون مورد انتظار هستند (52).
شبکه آندوپلاسمی محیط منحصربه فرد و بهینهای برای انجام اصلاحات پس از ترجمه پروتئینها، نظیر تاشدگی، سرهم بندی و تشکیل باندهای دیسولفیدی ایجاد میکند (91). ژآنگ و همکارانش (53) به همراه اینان و همکارانش (50)، در سال 2006 به این نتیجه رسیدند که بهبود توانایی تکمیل ساختار پروتئینی و اصلاحات پسترجمهای در شبکه آندوپلاسمی منجربه افزایش ترشح پروتئینهای نوترکیب در پیکیاپاستوریس میشود (23)؛ زیرا هرچه ساختار پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان به ساختار طبیعی آن پروتئین نزدیکتر باشد پایداری و نیمه عمر پروتئین مورد نظر بیشتر خواهد شد؛ لذا نرخ ترشح پروتئین در محیط کشت و در پی آن درصد شناسایی آن افزایش مییابد.
الگوی گلیکوزیلاسیون در مخمر پیکیاپاستوریس: تقریباً نیم تا یک درصد از پروتئینهای ترجمهشده در سیستم یوکاریوتی، گلیکوپروتئین هستند (22). گلیکوزیلاسیون رایجترین نمونه از اصلاحات پسترجمهای گلیکوپروتئینها در فرآیند ترشح به شمار میآیند که در شبکه آندوپلاسمی و پس از ترجمه پروتئین اتفاق میافتد (39). در این فرآیند، الیگوساکاریدها به آسپارژینهای خاص موجود در یک توالی معین از اسیدآمینههای آسپارژین –X– سرین/ترئونین متصل میشوند (51). طول و نوع الیگوساکاریهای اضافه شده به گلیکوپروتئینها متفاوت است. این تفاوت تنها مربوط به ساختار پروتئین هدف نیست بلکه سیستم بیانی نیز به طور قابل ملاحظهای در آن دخیل است (22). در پستانداران الیگوساکاریدهای متصل به جایگاه گلیکوزیلاسیون موجود در توالی اسیدآمینهای اغلب از اسیدسیالیک، گالاکتوز و -N استیل گالاکتوزآمین و در مخمر پیکیاپاستوریس این توالی تنها از قند مانوز و مانوزیل فسفات تشکیل شده است (10). گلیکوپروتئینهای بیان شده در مخمر پیکیاپاستوریس تنها 8 تا 14 مانوز اضافی با خود حمل میکنند، درحالی که این تعداد در مخمر ساکارومایسزسرویسیه در حدود 50 الی 200 است (8، 10 و 89). در مخمر ساکارومایسزسرویسیه، الیگوساکاریدهای اضافه شده به پروتئینهای ترشحی، فعالیت آنتیژنی را افزایش خواهند داد و در نتیجه پروتئین مصرفی در خون، به سرعت توسط کبد پاکسازی میشود اما در مورد پیکیاپاستوریس این حالت دیده نشدهاست (10، 18 و 89).
بیان سیتوپلاسمی در مقایسه با بیان ترشحی در مخمر پیکیاپاستوریس: اولین مرحله در بیان پروتئینهای نوترکیب، تعیین نحوه بیان است یعنی مشخص شود هدف تولید داخل سلولی یا ترشح خارج سلولی پروتئین است. ترشح حالت ترجیحی تولید پروتئین است زیرا دسترسی و شناسایی محصول آسان است اما انتخاب نوع بیان بستگی به پروتئین موردنظر دارد. اگر یک پروتئین در میزبان طبیعیاش به صورت درون سلولی تولید میشود در میزبان نوترکیب هم باید این اصل رعایت شود، و اگر به صورت ترشحی بوده پس باید وکتور مورد استفاده در میزبان جدید نیز خاصیت ترشحی داشته باشد زیرا شرایط محیطهای درون سلولی و ترشحی متفاوت است و در صورت عدم توجه به این اصل ممکن است یک پروتئین به طور ناصحیح ساختاربندی شده و در نهایت به صورت غیرفعال تولید گردد (72).
بیان سیتوپلاسمی، اغلب منجربه بیان سطوح بالا میشود زیرا محدودیتهای بالقوه مسیرهای ترشحی را دارا نیست. اما این نوع بیان چندین جنبه منفی نیز دارد برای مثال در بسیاری از موارد به دلیل ساختاربندی و پردازش پروتئینها نظیر تشکیل باندهای دیسولفیدی، محدودیت شدیدی برای بیان سیتوپلاسمی وجود دارد. همچنین شکستن سلولها به منظور خارجسازی پروتئین نیازمند مراحل اضافی در طول پردازش محصول است زیرا دیواره سلولی مخمر بسیار محکم است. در ادامه فرآیند نیز مواد حاصل از تجزیه سلولی باید پاکسازی شوند و محصول نهایی تنها بخش جزئی از اجزای سلولی در دسترس است چرا که تنها یک درصد از پروتئینهای داخل سلولی را پروتئینهای هدف تشکیل میدهند (61، 72 و 98).
عوامل مؤثر بر بیان پروتئین در مخمر پیکیاپاستوریس: برای بیان یک ژن در پیکیاپاستوریس سه اصل مهم است (61 و 64):
1) وارد ساختن ژن مورد نظر به وکتور بیانی
2) انتقال وکتور بیانی به ژنوم سویه مورد نظر از مخمر پیکیاپاستوریس
3) بررسی بیان محصولات حاصل از ژن خارجی
بیان پروتئینهای خارجی تنها به تعداد کپیهای ژن واردشده به ژنوم بستگی ندارد (31 و 76)، بلکه به دیگر عوامل نظیر ورود سازه نوترکیب به درون کروموزوم، جایگاه ورود ژن در وکتور، نواحی '5 و'3 ترجمه نشده در mRNA(توالی پیام ترشحی)، درصد ترکیب A+T در cDNA، نوع و ماهیت پیام ترشحی، فعالیت آنزیمهای تجزیه کننده پروتئینها، فیزیولوژی سویههای میزبان، شرایط رشد و کشت و پارامترهای تخمیری وابسته است که همه این موارد باید در طراحی یک سیستم تولیدی بهینه ملاحظه شوند(84). در توضیح این مطلب میتوان به بررسی برخی از این موارد پرداخت. روش ترجیحی برای بیان یک ژن در مخمر پیکیا پاستوریس انتقال سازه نوترکیب به درون ژنوم مخمر با استفاده از وکتورهای بیانی است این روش مزایای منحصر به فردی دارد از جمله آنکه سازه نوترکیب پایدار شده و امکان حضور چندین نسخه از آن در ژنوم مخمر وجود دارد. بهترین جایگاه قرارگیری ژن در سازه نوترکیب بعد از پروموتر است تا حداکثر بازدهی و کیفیت بیان ژن مورد نظر به دست آید. در سویههایی که پروموتر AOX1 در آنها حذف شده است (یعنی فنوتیپهای Mut-) سرعت رشد سویهها بسیار پایینتر از سویههای Mut+ است که با حضور پروموتر AOX1 رشد طبیعی خود را دارند. برای بیان پروتئینهای درون سلولهای ترجیح داده میشود که از فنوتیپهای Mut- استفاده شود زیرا در این سویهها پروتیئنهای طبیعی خود سلول که وابسته به مسیر متابولیسم پروموتر AOX1 هستند تولید نمیشوند و در نتیجه خالص سازی پروتئین از حجم انبوهی از پروتئینهای درون سلولی راحتتر است. اما برای تولید پروتیئنهای ترشحی از هر دو نوع فنوتیپ میتوان استفاده نمود. بار و همکاران در سال 1992 پروتئین ترشحی آلبومین سرم انسانی (HSA)را در هر دو فنوتیپ تولید نموده اما تفاوت قابل ملاحظهای در ترشح این پروتئین در این دو نوع فنوتیپ مشاهده نکردند. شواهد بسیاری وجود دارد که اثبات میکند وجود یک کپی از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر برای بیان بهینه پروتئین مورد نظر کافی است و افزایش تعداد کپیهای یک ژن تأثیر آن چنانی در تولید محصول مورد نظر ندارد. اما با این وجود، مطالعات بسیار دیگری نشان دادند که حضور چند نسخه از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر برای افزایش سطح بیان ضروری است. همچنین تعداد شواهد اندکی نیز نشان داد که حضور چند نسخه از ژن مورد نظر در ژنوم مخمر میتواند تأثیرات منفی در بیان ژن مورد نظر داشته باشد. بنابراین تأثیر تعداد کپیهای یک ژن بر روی بیان آن ژن خاص غیر قابل پیش بینی است. طول ناحیه توالی UTR-ʹ5 یک ژن میتواند نقش تعیین کنندهای در تولید بهینه محصول موردنظر داشته باشد. برای سنتز بهینه یک پروتئین خارجی بهتر است طول توالی ناحیه UTR-ʹ5 با طول توالی mRNA-AOX یکسان باشد. اسریکریشنا و همکاران (1993) مشاهده نمودند که سطح بیان پروتئینHSA با تنظیم یکسان سازی طول توالی UTR-ʹ5 با طول توالی mRNA-AOX در حدود 50 برابر افزایش یافت(84). ژنهایی که دارای درصد باز A+T بالایی هستند قادر به ترجمه با بازدهی بالا نیستند یک مثال از این موارد که در نهایت منجر به بلوکه شدن فرآیند ترجمه در مخمر پیکیاپاستوریس شده است توالی ATTATTTTATAAAA موجود در ژن HIV-gp120 است. الگوی عمومی برای یک ژن طوری باید باشد که در حدود 55-30 درصد از توالی ژنی حاوی بازهای A+T باشد. همان طور که قبلاً بیان شد، ترشح یک پروتئین روش ترجیحی در تولید محصول نوترکیب است، به دلیل آنکه خالص سازی محصول نوترکیب راحتتر است. برای پروتئینی که به طور طبیعی به حالت ترشحی تولید نمیشود ترشح آن در سیستم میزبان بسیار سخت و یا حتی غیر ممکن است. همچنین برای پروتیئنهایی که به طور طبیعی ترشحی هستند نظیر HSA و یا هورمون رشد تولید آنها به صورت درون سلولی غیرممکن است. برای ترشح یک پروتئین نیاز به توالی پیام ترشحی است. انتخاب توالی پیام ترشحی برای یک پروتئین دلخواه است. در برخی پروتئینها نظیر HSA و لیزوزیم گاوی استفاده از توالی پیام ترشحی طبیعی خود پروتئین کافی است. اگر توالی پیام ترشحی یک پروتئین در دسترس نیست میتوان از توالیهای پیام ترشحی موجود در مخمر نظیر α-MFاستفاده نمود (79).
کشت مخمر پیکیاپاستوریس: کشت مخمر پیکیاپاستوریس طی دو مرحله انجام میگیرد. در مرحله اول، سلولها در محیط کشتی به نام Batch (حاوی یک منبع کربن غیرقابل تخمیر نظیر گلیسرول) رشد میکنند و در مرحله دوم از یک محیط کشت القایی برای تحریک پروموتر AOX و استفاده از منبع کربن قابل تخمیر(نظیر متانول) بمنظور بیان ژن و القای پروتئین نوترکیب استفاده میشود. این محیط کشت Fed- Batch نامیده میشود (8، 60 و 73). در طول رشد و تکثیر مخمر، منبع عمومی کربن که اغلب گلیسرول است فقط تا حدی که نیازمندیهای سلول را برطرف سازد مورد استفاده قرار میگیرد (60 و 94). رشد هر سه فنوتیپ پیکیاپاستوریس بر روی گلیسرول یکسان است. اما سویههای دارای فنوتیپهای مختلف در استفاده از متانول متفاوت عمل میکنند. حدود 4 تا 5 ساعت موردنیاز است تا سلولها پس از خروج از محیط گلیسرول و ورود به محیط متانول با آن تطبیق یابند (87). بریرلی و همکارانش مشاهده نمودند که سویههای Mut+ به تغییرات سطح متانول در محیط بسیار حساس هستند (6).
عوامل مؤثر بر کشت مخمر پیکیاپاستوریس: جهت تولید پروتئین نوترکیب با ساختار صحیح در مخمر پیکیاپاستوریس، فراهم نمودن شرایط کشت مناسب از مهمترین عوامل به شمار میرود (22)، که میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
ظرف کشت مخمر پیکیاپاستوریس: به طور کلی انتخاب ظرف کشت، اولین مرحله برای بیان بهینه پروتئین در مقیاس کم است. طی مطالعهای که توسط بار و همکارانش در سال 1992 انجام شد، نوع ظرف کشت با تأثیر بر میزان انتقال اکسیژن به داخل محیط کشت، بر روی بیان پروتئین بسیار تأثیرگذار بودهاست. در این مطالعه، براساس تصویر 4، پنج نوع ظرف کشت با اشکال مختلف استفاده شد. آنها مشاهده کردند ظرف کشت سوم بهطور مؤثر تولید را بهبود میبخشد (22). در توضیح این مطب میتوان اظهار داشت که ظروف شیشهای قابل استفاده برای کشت مخمر در مقیاس کم، دارای زوایای مشخصی در هر یک از گوشههای دیواره خود هستند که بر حسب نوع این زوایا میزان اکسیژن ورودی و خروجی به ظرف در هنگام کشت مخمر تغییر خواهد کرد. چرا که کشت مخمر در این ظروف با تکان دادن مداوم در طول کشت همراه است، لذا شکل ظرف در میزان انتقال اکسیژن تأثیر به سزایی دارد. به طور مثال در ظرف کشت اول زاویه شیشه در حدود 45 درجه است در حالی که در هر یک از ظروف دو، سه، چهار و پنج زوایای دیوارهها و در نهایت اشکال ظروف به طور متفاوت طراحی شده است، لذا میزان درصد اکسیژن ورودی و خروجی و در پی آن میزان بیان ژن تغییر خواهد کرد. به طوری که در ظرف دو زاویه دیواره نسبت به ظرف یک، از ناحیه سطح به میزان نیم سانتیمتر و از ناحیه بالا به میزان هشت سانتی متر به سمت داخل انحراف داشته و سپس این زوایا به یکدیگر متصل شده تا دیواره ظرف را تشکیل دهند. تشکیل دیوارههای هر یک از ظروف با زوایای مختلف طبق توضیح بالا در شکل 4 مشخص شده است.
شکل 4- انواع ظروف کشت مخمر. ظروف یک تا پنج به ترتیب نمایانگر اشکال مختلفی از ظرف کشت مخمر هستند که نرخ اکسیژن رسانی به سلولهای مخمری را با توجه به زوایای دیوارههای ظروف تغییر میدهند. در شکل یک زاویه دیواره 45 درجه است، در شکل دو، سه، چهار و پنج این زاویه با تغییر شکل دیواره شیشههای ظرف به فرمهای مختلف تغییر کرده است (22).
اجزای محیط کشت مخمر پیکیاپاستوریس: نظیر دیگر مخمرها، رشد پیکیاپاستوریس نیازمند منابع کربن و نیتروژن است. رایجترین منابع کربن، گلوکز و گلیسرول و رایجترین منابع نیتروژن، پپتون و عصاره مخمری است. اجزای سازنده محیطکشت با اثرگذاری بر روی رشد و تکثیر سلولها، بیان پروتئینهای خارجی را در مخمر تحت تأثیر قرار میدهند (11 و 54).
دمای محیط کشت مخمر پیکیاپاستوریس: درجه حرارت در طول مرحله القای پروتئین نه تنها بر روی میزان تجزیه پروتئین بلکه بر روی بیان پروتئین نیز تأثیر میگذارد (11). دمای بالاتر از حد طبیعی ممکن است منجربه تشکیل باندهای دیسولفیدی درون مولکولی شده و در نتیجه امکان تجمع پروتئین بیشتر شود. پروتئینهای تجمع یافته با از دستدادن ساختار خود نسبت به پروتئولیزاسیون درون سلولی حساستر میشوند. دمای پایینتر از حد طبیعی منجربه کاهش تجزیه پروتئولیزاسیون شده، در حالی که با کاهش سرعت تشکیل پروتئین، زمان تشکیل صحیح پلیپپتید در حال تولید را افزایش میدهد (84).
کنترل اسیدیته (pH) محیط کشت: بهینه سازی اسیدیته برای رشد سلول، تشکیل و پایداری پروتئین ضروری است؛ بنابراین، تخمیر با اسیدیته کنترلشده اغلب در سیستم بیانی پیکیاپاستوریس انجام میشود (83). تعیین اسیدیته بهینه به ویژگیهای منحصربه فرد هر پروتئین به خصوص پایداری آن پروتئین بستگی دارد (60). پیکیاپاستوریس، قادر به رشد در محیط با اسیدیتهای بین سه تا هفت است، لذا این امکان وجود دارد که اسیدیته محیط کشت مخمر بر اساس خصوصیات منحصر به فرد هر پروتئین تغییر کند (8).
کنترل اکسیژن محلول و القای متانول: اکسیژن محلول میتواند با میزان جریان هوا کنترل شود. در بیشتر تخمیرها پس از اتمام کامل گلیسرول و شروع مصرف متانول، میزان اکسیژن محلول به طور مداوم در نرخ 30 تا 35 درصد نگهداری میشود اما پروتئینهای متفاوت نیازمند سطوح مختلف اکسیژن هستند که تنها با تکرار آزمایش به دست میآید (60).
و) غلظت سلولی مخمر پیکیاپاستوریس: تولید پروتئینهای ترشحشده با افزایش غلظت سلولی افزایش مییابد اما متأسفانه در این راستا، تجمع دیگر مواد سلولی به خصوص آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین به همان نسبت افزایش خواهد یافت. در چنین محیطی برخی از پروتئینهای ترشح شده به طور کامل پایدارند درحالی که سایر پروتئینها به طور قابل ملاحظهای کاهش مییابند. سه رویکرد برای کاهش تأثیر آنزیمهای تجزیه کننده پروتئین برروی پروتئینهای خارجی ترشح شده در محیط کشت سلول پیکیاپاستوریس وجود دارد: 1)افزودن اسیدآمینههای مکمل نظیر پپتون و یا کاسامینواسید به محیط کشت که احتمال تجزیه محصول را کاهش میدهد، 2)تغییر اسیدیته محیط کشت به سمتی که حداقل میزان پروتئازها در محیط وارد شود و 3) استفاده از یک سویه میزبان که در آن ژنهای PEP4 و PRB1(کدکننده آنزیمهای تجزیهکننده پروتئین)، حذف شده باشد (8). برای مثال سویههایSMD1163 ، SMD1165،SMB1168 (5 و 80) وSMD1168H (95) فاقد این دو ژن هستند که این خصوصیت در کاهش تجزیه بعضی پروتئینهای خارجی مؤثر است. لازم به ذکر است ژن PEP4 آنزیم پروتئینازA- و ژن PRB1 آنزیم پروتئینازB- را کدگذاری میکند(60).
ز) غلظت متانول در محیط کشت مخمر پیکیاپاستوریس: براساس یافتههای بار و همکارانش در سال 1992، غلظت متانول مورد استفاده در میزان بیان پروتئین مؤثر است. به طور کلی غلظتهای بین نیم تا یک درصد از متانول در محیط کشت پیکیاپاستوریس استفاده میشود. تجمع متانول میتواند بر رشد سلول تأثیرات منفی به همراه داشته باشد و میزان بیان پروتئین را کم کند. بنابراین، دسترسی به سطوح بهینه متانول برای بیان هر پروتئین لازم است (22).
مدت زمان القاء: طول دوره القاء نیز بر روی پروتئولیزاسیون موثر است با گذشت زمان القاء، تعداد سلولهای زنده کم میشود در نتیجه میزان تجزیه سلولی افزایش مییابد (11).
ترشح پروتئین در مخمر پیکیاپاستوریس: به طور کلی مخمر در مقایسه با قارچهای رشتهای میزان کمی از پروتئینهای طبیعی خود را در محیط کشت ترشح میکند. این خصوصیت، مخمر را به یک میزبان جذاب برای تولید پروتئینهای ترشحی تبدیل میسازد زیرا در نهایت، خالص سازی محصول آسان و تجزیه محصول پروتئینی کمتر خواهد شد (83). بنابراین، پروتئین نوترکیب درصد زیادی از پروتئینهای کل محیط بیانی را تشکیل میدهد (7). به هرحال به دلیل وجود شرایط و نیازمندیهای خاص نظیر پایداری و تاشدگی پروتئین، ترشح پروتئین اغلب برای پروتئینهایی توصیه میشود که به طور طبیعی در میزبان اصلی خود ترشحی هستند (19).
شناسایی محصول نوترکیب ترشح شده در محیط کشت مخمر پیکیاپاستوریس: تا به امروز سیستم بیانی مخمر در تولید مقادیر بالایی از بسیاری از پروتئینهای نوترکیب موفق بوده است. برای مثال میزان محصولات، بین g/l10-1 در محیط کشت سویههای پیکیاپاستوریس گزارش شدهاست. اما با این وجود تمام محصولات در این میزان در سطوح بالایی تولید نمیشوند و برای شناسایی تمام محصولات نباید انتظار داشت که همواره باندی در ژل پلی اکریلآمید که توسط روش کوماسی بلو رنگآمیزی میشود، مشاهده گردد. زیرا این روش یک روش اختصاصی نبوده و تنها بر اساس وزن مولکولی پروتئینها را جداسازی میکند و قادر به شناسایی پروتئینها با مقادیر کمتر از میکروگرم نیست. با توجه به اینکه میزان تولید هر پروتئین در مخمر متفاوت است احتمال عدم شناسایی محصول با این روش وجود دارد. بنابراین، لازم است برای بررسی بیان یک ژن در یک سویه از مخمر نوترکیب از یک یا چند آزمون حساس برای تشخیص پروتئین استفاده شود. آزمایشها میتواند بر مبنای فعالیت آنزیمی و یا استفاده از یک آنتی بادی علیه پروتئین یا محصول ژن موردنظر باشند (91). از جمله آزمونهای حساس میتوان به وسترن بلاتینگ، الایزا و فلوسایتومتری اشاره نمود.
محصولات تجاری تولید شده در پیکیاپاستوریس: بر طبق گزارشات حاصل از سایت شرکت Pichia، در حال حاضر شمار زیادی از محصولات پروتئینی تولید شده در پیکیاپاستوریس، برای کاربردهای صنعتی و دارویی وارد بازار شده است. این میزان در حدود هفتاد محصول نوترکیب است که در جدول 3 به تعدادی از آنها اشاره شده است (49).
همچنین در جدول 4، تعدادی از آنزیمهایی که به طور گسترده در صنایع کاغذ و خمیر کاغذ، منسوجات، صنایع مواد شوینده، و صنایع مواد غذایی و شیمیایی کاربرد دارند و در سطوح آزمایشگاهی در پیکیاپاستوریس تولید شده، نشان داده شده است (34).
جدول 3- فهرست محصولات نوترکیب تجاری تولید شده در مخمر پیکیاپاستوریس (49).
|
نام محصول نوترکیب |
شرکت سازنده |
کاربرد |
|
Kalbitor® (DX-88 ecallantide, a recombinant kallikrein inhibitor protein) |
Dyax (Cambridge, MA) |
درمان آنژیوادم ارثی |
|
Insugen® (recombinant human insulin) |
Biocon (India) |
درمان دیابت |
|
Medway (recombinant human serum albumin) |
Mitsubishi Tanabe |
افزایش حجم خون |
|
Shanvac ™ (recombinant hepatitis B vaccine) |
Shantha/Sanofi (India) |
پیشگیری از هپاتیت B |
|
Shanferon™ (recombinant interferon-alpha 2b) |
Shantha/Sanofi (India) |
درمان هپاتیت C و سرطان |
|
Ocriplasmin (recombinant microplasmin) |
ThromboGenics (Belgium) |
درمان چسبندگی زجاجیه(VMA) |
|
Nanobody® ALX-0061 (recombinant anti-IL6 receptor single domain antibody fragment) |
Ablynx (Belgium) |
درمان ورم مفاصل روماتیسمی |
|
Nanobody® ALX00171 (recombinant anti-RSV single domain antibody fragment) |
Ablynx (Belgium) |
درمان عفونت ویروسی سینسیشال تنفسی(RSV) |
|
Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) |
Trillium (Canada) |
درمان التهاب درون شبکهای مثانه/ درمان سندرم درد مثانه (IC/BPS) |
|
Purifine (recombinant phospholipase C) |
Verenium/DSM (San Diego, CA/Netherlands) |
صمغ زدایی از روغنهای حاوی میزان فسفر زیاد |
|
Recombinant trypsin |
Roche Applied Science (Germany) |
هضم پروتئینها |
|
Recombinant collagen |
Fibrogen (San Francisco, CA) |
واکنشگرهای تحقیقات پزشکی/ پرکنندههای غشایی |
|
AQUAVAC IPN (recombinant infectious pancreatic necrosis virus capsid proteins) |
Merck/Schering Plough Animal Health (Summit, NJ) |
واکسن نکروز پانکراس عفونی در ماهی قزل آلا |
|
Recombinant phytase |
Phytex, LLC (Sheridan, IN) |
افزودنی خوراک دام |
|
Superior Stock recombinant nitrate reductase |
The Nitrate Elimination Co. (Lake Linden, MI) |
محصولات مبتنی بر آنزیم، جهت آزمایش و تصفیه آب |
|
Recombinant human cystatin C |
Scipac (United Kingdom) |
واکنشگر تحقیقاتی |
جدول 4- برخی از آنزیمهای نوترکیب تولید شده در پیکیاپاستوریس (34).
|
آنزیم |
پروموتر |
توالی پیام ترشحی |
میزان تولید محصول |
|
زایلاناز |
|
|
|
|
Endo-β-1,4-xylanase |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-160 |
|
Thermostable endoβ-1,4-xylanase |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-1148 |
|
Acidophilic endo-1,4-β-xylanase |
pAOX1 |
native |
mgl-1178 |
|
سلولاز |
|
|
|
|
Carboxy methyl cellulase |
pAOX1 |
HAS |
___ |
|
Endo- β-1,4-glucanase |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-165 |
|
پروتئاز |
|
|
|
|
Aspartic protease |
pAOX1 |
SUC2 |
___ |
|
Aspergillus oryzae |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-1513 |
|
Thermo monosporafusca |
pGAP |
α-MF |
Ul-1135 |
|
لیپاز |
|
|
|
|
Lipase Lip2p |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-1630 |
|
Lipase |
pGAP |
α-MF |
184 Ul-1 |
|
Lipase B |
pGAP |
α-MF |
mgl-188 |
|
آمیلاز |
|
|
|
|
Salivary α-amylase |
pAOX1 |
GKL |
mgl-10.24 |
|
α-Amylase |
pAOX1 |
PHO1 |
mgl-150 |
|
α-Amylase |
pGAP |
α-MF |
500 Ul-1 |
|
فسفاتاز |
|
|
|
|
Alkaline phosphatase |
pAOX1 |
PHO1 |
mgl-12 |
|
Phosphatase |
pAOX1 |
α-MF |
mgl-110 |
مقایسه سیستم بیانی مخمر با دیگر سیستمهای تولیدی: در جدول 5 سیستمهای تولیدی متفاوت که تاکنون مطالعه شدند و یا برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده شدند به طور خلاصه گنجاندهشدهاند. مزایا و معایب هر سیستم در این جدول مشخص شدهاست (47).
جدول 5- مقایسه سیستمهای مختلف برای تولید پروتئینهای نوترکیب (47).
|
موارد مورد ارزیابی |
سیستمهای تولیدی |
|||||
|
باکتری |
مخمر |
سلولهای حشرات + باکلوویروس |
سلولهای حیوانی(سلول CHO) |
گیاهان ترانسژن |
حیوانات ترانسژن |
|
|
میزان تولید از نظر تئوری |
+++++ |
+++++ |
+++ |
+ |
+++++ |
+++++ |
|
میزان تولید از نظر تجربی |
++(+) |
++(+) |
+ |
+ |
++ |
++++ |
|
هزینه سرمایه گذاری |
+++++ |
+++++ |
++ |
+ |
++++ |
+++ |
|
هزینه تولید |
+++++ |
+++++ |
++ |
++ |
+++++ |
++++ |
|
انعطافپذیری سیستم |
+++++ |
+++++ |
++ |
+ |
+++++ |
++++ |
|
پایداری سیستم بیانی |
+++++ |
+++++ |
++++ |
+++ |
+++++ |
+++++ |
|
اصلاحات پسترجمهای |
+ |
++ |
+++ |
++++ |
+++ |
++++ |
|
پایداری محصول نوترکیب تولیدشده |
+++++ |
+++++ |
+++ |
+++ |
++++ |
++++ |
|
خالص سازی محصول |
+++ |
+++ |
+++ |
++++ |
+++ |
+++ |
|
آلودگی سیستم تولیدی با پاتوژنها |
+++++ |
+++++ |
+++++ |
+++ |
+++++ |
+++ |
|
میزان محصولات تولیدی در بازار |
++++ |
+++ |
+++ |
+++++ |
+ |
+++ |
بحث و نتیجه گیری
تولید یک محصول نوترکیب با انتخاب یک میزبان مناسب آغاز میشود. در این راستا مهمترین معیارهای موردنظر شامل: کیفیت، کمیت و میزان محصول است که ارتباط مستقیمی با کاربرد نهایی آن محصول دارد. کلید موفقیت برای افزایش تولید محصول، شناسایی تمام محدودیتهایی است که در مراحل ساخت آن نقش دارند. در حدود 20 درصد از پروتئینهای نوترکیب دارویی در میزبانهای مخمری، 30 درصد از آنها در باکتری اشریشیاکلی و 50 درصد در سلولهای یوکاریوتی تولید میشوند. علی رغم این واقعیت، امروزه گرایش فراوانی برای جایگزینی میزبانهای میکروبی اصلاح شده نظیر مخمر و باکتری با سلولهای یوکاریوتی وجود دارد (65). از سویی دیگر، میزبانهای باکتریایی فاقد توانایی تغییرات پس از ترجمه پروتئینها هستند و بیشتر پروتئینهای تولیدشده در آنها به مرور زمان فعالیت خود را از دست میدهند. به همین دلیل کاربرد باکتری برای تولید پروتئینهای پیچیده و نیازمند اصلاحات پس از ترجمه، در عمل حذف شده است (47 و 65). در میان میزبانهای میکروبی، مخمرها از جمله میکروارگانیسمهای مناسب برای تولید پروتئینهای نوترکیب به شمار میروند (36، 47 و 88)؛ به دلیل آنکه این گونهها قابلیت دستکاری ژنتیکی آسان داشته، لذا رشد سریع بر روی محیط کشت ارزان قیمت با غلظت سلولی بالا و توانایی اصلاحات پسترجمهای پیچیده را دارند (23، 29، 36 و 65). علاوه بر این، محصولات نوترکیب تولیدشده در آنها عاری از سم و آلودگی به DNA ویروسی است (100). در طول 20 سال گذشته سیستمهای بیانی مخمر به طور موفقیت آمیزی در تحقیقات پایه و صنعت زیستفناوری برای تولید و ترشح پروتئینهای نوترکیب با منشاء انسانی، حیوانی، گیاهی، قارچی، باکتریای و ویروسی استفاده شدهاند (26).
با توجه به مطالعات انجام گرفته میتوان اظهار داشت که مخمر پیکیاپاستوریس شرایط لازم برای تولید پروتئینهای نوترکیب را دارد (10) زیرا این مخمر توانایی ترشح پروتئین نوترکیب انسانی و غیر انسانی با خصوصیات زیستی مورد انتظار را نشان داده است (23). با نگاهی به مطالعات لی و همکارانش در سال 2007 میتوان بیان داشت که وجه مشترک در میان تمام سیستمهای تولیدی مخمر پیکیاپاستوریس، فقدان تشابه در جزئیات کار در فرآیند تولید است؛ که در نهایت مقایسه این سیستم تولیدی را در تحقیقات مختلف مشکل ساخته است (60). با وجود اینکه دستورالعملهای عمومی تخمیر پیکیاپاستوریس به وسیله شرکت Invitrogen فراهم گردید اما بسیاری از مطالعات نشان میدهد که بهینه سازی تولید پروتئینهای نوترکیب در پیکیاپاستوریس باید بر مبنای تجربیات فردی انجام شود. همچنین علیرغم کاربرد موفقیت آمیز پیکیاپاستوریس در تحقیقات انجام شده، هنوز مطالعات بیشتری نیاز است تا درک عمیقتری از پیامهای ترشحی، گلیکوزیلاسیون و آنزیمهای تجزیه کننده پروتئینها در پیکیاپاستوریس به دست آید تا با پیشرفتهای بیشتر، مشکلات ترشح پروتئینهای پستانداران در این موجود بهبود یابد؛ و در نهایت منجر به تولید دامنه وسیعتری از پروتئینهای خارجی در این سیستم شود.
تشکر و قدردانی
مطالعه حاضر با حمایت علمی و مالی پژوهشگاه رویان تهران انجام شده است.
', './data/cell/coversheet/651451988851.jpg'))
دوره 28، شماره 2 - شماره پیاپی 2
شهریور 1394صفحه 154-177
- تاریخ دریافت: 17 بهمن 1392
- تاریخ بازنگری: 26 آذر 1393
- تاریخ پذیرش: 26 آذر 1393