نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه اصفهان
2 عضو هیئت علمی/ دانشگاه اصفهان
3 هیات علمی
4 هیات علمی دانشگاه اصفهان
5 هیات علمی دانشگاه شهید بهشتی
چکیده
پروتئینهای غیراختصاصی ناقل لیپید 2(nsLTP2) یکی از اعضای خانواده پرولامینها هستند که به دلیل ساختار ویژه خود توانایی انتقال ترکیبات لیپوفیل مختلفی را دارند. با وجود مزیتهای نسبی پروتئین LTP2 در انتقال دارو، خاصیت آلرژنی این پروتئینها نیز گزارش شده است. هدف مطالعه حاضر بررسی توالی و ساختار پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و نیز بهبود برخی از ویژگی های آن برای استفاده در سیستمهای تحویل دارو، توسط ابزارهای بیوانفورماتیک است. مقایسه توالی پروتئین های nsLTP2 انواع برنج، حداقل 51% شباهت بین گونههای مختلف را نشان میدهد. بر اساس ارزیابی های فیلوژنی مشخص شد که بیشترین شباهت بین توالی ژن این پروتئین با گونه ژاپنی (Accession NO. NP 0011048723.1) وجود دارد. موتیفها و جایگاههای مختلف nsLTP2 برنج ایرانی با کمک آنالیز توالی به دست آمد. همچنین مطالعات بیوانفورماتیکی نشان دهنده 4 جایگاه با خاصیت شبهآنتیژنی است که 3 عدد آن بعد از تغییرات پس از ترجمه باقی میماند و حضور آنها میتواند خاصیت آلرژنی این پروتئینها را توجیه کند. همچنین، بررسی توالی دو گونه ژاپنی و ایرانی موید این است که اسیدهای آمینه شرکت کننده در جایگاه فعال، به-طورکامل حفاظت شده است. بهمنظور مطالعه تاثیر حذف توالیهای آلرژن بر تمایل به لیگاندهای هیدروفوب، از روش مدلسازی در راستای تعیین ساختار، استفاده گردید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در صورت اعمال تغییراتی در توالی و حذف بخشهای آلرژن nsLTP2، احتمالا میتوان بازده پروتئین را در سیستمهای تحویل دارو افزایش داد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Sequence Analyses, Antigenic Characteristic and Three-Dimensional Structure of Rice nonspecific Lipid Transfer Protein 2: a Bioinformatics Study
نویسندگان [English]
2 university of isfahan
چکیده [English]
Nonspecific lipid transfer protein 2 (nsLTP2) is among prolamin super family, capable of transferring various lipophilic molecules such as sterols. Despite advantages of the protein in drug delivery systems, there are some reports on its allergenic properties. Comparative sequence analysis displayed at least 51% homology in different species of rice-nsLTP2. The aim of the current study was to evaluate gene sequence and protein structure analysis of Iranian rice-nsLTP2, by means of bioinformatics tools, to improve its potential capability for drug delivery systems. Gene sequence homology assessment revealed resemblance mostly with Japonica species (Accession NO. NP-0011048723.1). The presence of various specific sites and motifs in the structure of nsLTP2 were determined by sequence analysis. Preliminary studies demonstrated four antigenic determinants in the primary sequence of the protein, which three of them retain after post translational modification. Moreover, sequence assessment revealed that those residues contributing in the protein cavity are conserved totally among Japonica and Iranian species. Modeling approaches were used to determine the influence of deletion of allergenic sites on protein affinity toward hydrophobic ligands. The obtained results revealed the efficacy of nsLTP2, as a drug carrier protein, could be improve by appropriate swap at specific residues and elision of allergenic sites.
کلیدواژهها [English]
مطالعه توالی، خاصیت آنتیژنی و ساختار سه بعدی پروتئینهای غیراختصاصی ناقل لیپید2 در برنج ایرانی: مطالعه بیوانفورماتیکی
فاطمه زهرا درویشی1، مهران میراولیائی1*، رحمان امام زاده1، مجید متولی باشی2 و محبوبه نظری3
1 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش سلولی و مولکولی
2 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش ژنتیک
3 تهران، پژوهشکده فناوریهای نوین علوم پزشکی جهاد دانشگاهی ابن سینا، مرکز تحقیقات ریزفناوری زیستی
تاریخ دریافت: 14/11/92 تاریخ پذیرش: 8/9/93
چکیده
پروتئینهای غیراختصاصی ناقل لیپید 2(non specific Lipid Transfer Protein 2: nsLTP2) یکی از اعضای خانواده پرولامینها هستند که به دلیل ساختار ویژه خود توانایی انتقال ترکیبات لیپوفیل مختلفی را دارند. با وجود مزیتهای نسبی پروتئین nsLTP2 در انتقال دارو، خاصیت آلرژنی این پروتئینها نیز گزارش شده است. هدف مطالعه حاضر بررسی توالی و ساختار پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و نیز بهبود برخی از ویژگیهای آن برای استفاده در سیستمهای تحویل دارو، توسط ابزارهای بیوانفورماتیک است. مقایسه توالی پروتئینهای nsLTP2 انواع برنج، حداقل 51 درصد شباهت بین گونههای مختلف را نشان میدهد. بر اساس ارزیابیهای فیلوژنی مشخص شد که بیشترین شباهت بین توالی ژن این پروتئین با گونه ژاپنی (Accession NO. NP 0011048723.1 ) وجود دارد. موتیفها و جایگاههای مختلف nsLTP2 برنج ایرانی با کمک آنالیز توالی به دست آمدند. همچنین مطالعات بیوانفورماتیکی نشان دهنده 4 جایگاه با خاصیت شبهآنتیژنی است که 3 عدد آن بعد از تغییرات پس از ترجمه باقی میماند و حضور آنها احتمالاً میتواند خاصیت آلرژنی این پروتئینها را توجیه کند. همچنین، بررسی توالی دو گونه ژاپنی و ایرانی مؤید این است که اسیدهای آمینه شرکت کننده در جایگاه فعال، بهطورکامل حفاظت شده است. بهمنظور مطالعه تاثیر حذف توالیهای آلرژن بر تمایل به لیگاندهای هیدروفوب، از روش مدلسازی در راستای تعیین ساختار، استفاده گردید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در صورت اعمال تغییراتی در توالی و حذف بخشهای آلرژن nsLTP2، احتمالا میتوان بازده پروتئین را در سیستمهای تحویل دارو افزایش داد.
واژه های کلیدی: nsLTP2، مدلسازی براساس تشابه، دارورسانی، آلرژن
* نویسنده مسئول، تلفن:03137932475 پست الکترونیکی: MMiroliaei@yahoo.com
مقدمه
پروتئینهای انتقال دهنده لیپید در همه ردههای جانوران شامل باکتریها، مخمرها، گیاهان و جانوران وجود دارند. این پروتئینها جزء رایجترین و فراوانترین پروتئینهای محلول در گیاهان هستند (8 و 9) و به دلیل توانایی ویژه آنها در انتقال لیگاندهای مختلف مانند گلیکولیپیدها، اسیدهای چرب و استروئیدها بین غشاهای زیستی، با نام عمومی non-specific lipid transfer proteins (nsLTP) شناخته میشوند (12 و 35). آنها را براساس وزن مولکولی، به دو دسته nsLTP1 و nsLTP2 تقسیم میکنند (26). اسکلت پلیپپتیدی پروتئینهای nsLTP متشکل از چهار مارپیچ راستگرد است که توسط لوپهای انعطافپذیری به هم متصلشده و توسط چهار پیوند دیسولفیدی پایدار شدهاست (25). خاصیت اتصال و انتقال مولکولهای مختلف لیپیدی توسط این پروتئینها، به واسطه وجود یک حفره هیدروفوب داخل مولکولی تسهیل میشود (30). یکی از مهمترین کاربردهای این پروتئینها استفاده در سیستمهای انتقال دارو است. این ناقلها از یک سو با تمایل زیاد به داروها متصل و از اکسیداسیون و تخریب آنها جلوگیری میکنند. ازسوی دیگر با نگهداری داروها در فضای بسته خود سبب کاهش اثر سمی آنها بر سلولهای غیرهدف میشوند (9 و 33). همچنین، خواص آلرژنی پروتئینهایی مثل nsLTPها (13، 16 و 39) که غنی از آلفاهلیکس و اسیدآمینههای قطبی مانند سیستئین و اسیدآمینههای بارداری مانند لیزین و آرژینین میباشند، به اثبات رسیده است (5، 6، 7، 15، 22، 23، 32 و 38). پروتئینهای nsLTP2 بهدلیل ساختار کوچکتر خود نسبت به nsLTP1ها، با کاهش خاصیت آنتیژنی و افزایش سرعت انتقال و آزادکردن لیگاندها و توانایی اتصال به لیگاندهای متعدد (42)، برای استفاده در سیستمهای تحویل دارویی مناسبتر میباشند (9). ویژگیهای nsLTP2ها مانند نحوه اتصال به لیگاند و بررسی اتصال انواع لیگاند کمتر از nsLTP1ها شناخته شده است. تاکنون پروتئین nsLTP2 از تعدادی از گونه ها (9، 28، 39 و 47) و از جمله گونه ایرانی برنج با نام علمی Oryza sativa به دست آمده است (26) و توالی کدکننده پروتئین آن کلون شده است. بهعلاوه بررسیها نشان داده که nsLTP2 نوع ایرانی از انواع ژاپنی آن کوچکتر است که میتواند سبب افزایش سرعت انتقال و آزادکردن لیگاند توسط آن شود. به همین دلیل تمرکز مطالعه حاضر روی nsLTP2 برنج ایرانی است. در مطالعهای که در سال 2004 توسط Cheng انجام گرفت پتانسیل ذاتی زیستی این پروتئین به منظور استفاده در سیستم تحویل دارویی با ایجاد جهش نقطهای فلورسانس افزایش یافت (9). با کمک روشSite-direct mutagenesis و نرمافزارهای داکینگ نقش واحدهای آمینواسیدی هیدروفوب در ساختار، پایداری اتصال به لیگاند و فعالیت انتقال به لیپیدnsLTP2 برنج نوع ژاپنی مشخص شده است (10). به دلیل هدفمندکردن تحقیقات آزمایشگاهی، در این مطالعه با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی، توالی ژنnsLTP2 برنج ایرانی، ساختار پروتئینی و نواحی دارای خاصیت آنتیژنی آن بررسی شده است. به علاوه با هدف کاهش خاصیت آنتی ژنیسیته و همزمان افزایش کارآیی پروتئین فوق در اتصال به لیپید، ابتدا با روش تشابه، ساختار آن مدل سازی شد و در ادامه، تأثیر تغییرات اسیدآمینهای که منجر به کاهش خاصیت آنتیژنی و افزایش کارآمدی این پروتئین میشوند، پیشبینی شد. دستاوردهای پژوهش حاضر احتمالا میتواند بهمنظور دستورزی ژن این پروتئین و در راستای ارتقا کارآمدی آن، برای تولید ناقلهای دارورسان نوین با خاصیت زیست سازگاری بیشتر مفید باشد.
مواد و روشها
جمعآوری و انطباق توالی پروتئینهای nsLTP2 برنج: توالیهای مورد استفاده در این مطالعه از بانک ژن (www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank/) به دست آمد. به علاوه توالی نوکلئوتیدی nsLTP2 گونه هندی
(Accession No. A2XBN5.2)، از پایگاه داده SWISS-PROT به دست آمد. دستورزی، بررسی و ترجمه هر یک از توالیهای نوکلئوتیدی کدکننده پروتئین به وسیله پایگاه داده مولکولی Expassy (www.expasy.ch)، انجام شد (46). مطالعات ردیف سازی چندتایی (Multiple sequence alignments) با استفاده از BLAST موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov.blast) و CLUSTAL W موجود در پایگاه اطلاعاتی Expassy (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) انجام شد (24).
مطالعه فیلوژنیک، بررسی توالی پروتئینی و خاصیت آنتیژنیستی ns-LTP2 برنج ایرانی: مطالعات فیلوژنی توالی پروتئین nsLTP2 گونه ایرانی و یازده پروتئین مشابه با استفاده از پایگاهGeneBee (www.genebee.msu.su) به اجرا درآمد (15، 17و20).
محاسبه تئوری pI و وزن مولکولی پروتئین با استفاده از ابزارهای موجود در پایگاه داده Expassy (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html) انجام شد. موتیفهای موجود بر روی ساختار nsLTP2 مورد بررسی قرار گرفتند (www.expasy.ch/ motif scan). خاصیت آنتیژنسیتی ns-LTP2 برنج ایرانی با کمک پایگاه داده دانشگاه مادرید با آدرس http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl بررسی شد. این پایگاه با استفاده از روشKolaskar and Tongaonkar و بر اساس نتایج تجربی اپیتوپهای شناخته شده موجود عمل میکند (21، 27 و 45). به دلیل ارتباطی که بین nsLTP های گیاهی و آلرژیهای انسانی گزارش شده است (4 و 38)، برای مثال قابلیت اتصال nsLTPهای ذرت به IgE مشخص شده است که حتی پس از حرارت دیدن هم این ویژگی در پروتئین فوق حفظ می شود، میانکنش بین nsLTP2 برنج ایرانی با MHC-II نیز بررسی شد (2، 20، 23، 32 و 38).
مدلسازی پروتئینnsLTP2 برنج ایرانی: مدل سه بعدی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی، ابتدا با استفاده از پایگاه M4T (http://manaslu.aecom.yu.edu/M4T/) و به روش مدلسازی براساس تشابه(Homology modeling) به دست آمد (18 و 40). بمنظور پیدا کردن مدل مناسب، در این مرحله توالی nsLTP2 برنج ایرانی با توالی ساختارهای شناخته شده BLAST شد و توالیهای Nonspecific Lipid Transfer Protein (شماره دستیابیl6h1)، Nonspecific lipid transfer protein 2G (شماره دستیابیtuk1)، lipid transfer protein (شماره دستیابیn891)، Nonspecific lipid transfer protein (شماره دستیابیuvc1) و Nonspecific lipid transfer protein 2G (شماره دستیابیrzl1) همسانی 97 تا 35 درصد با توالی nsLTP2 ایرانی نشاد دادند. در نتیجه توالیهای Nonspecific Lipid Transfer Protein (شماره دستیابیl6h1) با بیشترین همسانی برای مدل سازی به روش تشابه (Homology modeling) استفاده شد. در ادامه بهینهسازی مدل با استفاده از سرور YASARA و با استفاده از میدان نیروی GROMOS 96 انجام شد (18 و 37) و Q-mean score (http://swissmodel.expasy.org/qmean) و Z-score آن محاسبه شد (1، 3، 13، 28 و 44).
Molecular Docking: مطالعات Docking با استفاده از نرمافزار Molegro (Molegro Virtual Docker (MVD)) و براساس یک الگوریتم هیبرید با نام تکامل افتراقی هدایت شده انجام گرفت. به این منظور، لیگاند مورد استفاده LysPC14 از Pubchem به دست آمده است. کمپلکسهای لیگاند- پروتئینی بر اساس MolDock Score امتیازدهی شدهاند (43 و 50).
نتایج
در مطالعه بیوانفورماتیک حاضر، پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی در سطح توالی و ساختار بررسی و موتیفهای آنتیژن آن مشخص شده است. دستاوردهای مطالعه حاضر قابلیت استفاده در دستورزیهای پروتئینی آینده را بر روی nsLTP2 دارد.
مطالعه توالی و خاصیت آنتیژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی: nsLTP2 شامل 96 اسید آمینه است، که سیگنال پپتید 26 اسیدآمینهای انتهای آمینی آن میتواند از پپتید جدا شده و پروتئین بالغ در مسیر ترشحی به خارج از سلول، هدایت شود (20 و 39). pI و وزن مولکولی این پروتئین با کمک ابزارهای پایگاه Expasy به ترتیب 33/9 وkDa 65/7 محاسبه شد. موتیفهای موجود در ساختار nsLTP2 نیز مورد بررسی قرار گرفت (جدول1). به طور جالب توجه nsLTP2 دارای شباهت با مهارکننده پروتئازی Tryp_alpha_amyl است. اخیراً مطالعات نشان دادهاند که اغلب پروتئینهای آلرژن موجود در برنج دارای موتیفهای مشابه این نوع از مهارکنندها هستند و با وجود شباهت ساختاری در اعضای این خانواده از پروتئینهای آلرژن، همه آنها الزاماً فعالیت مهارکنندگی بر روی سرین پروتئاز تریپسین ندارند و درنتیجه تاکنون نقش این پروتئینها در گیاهان مشخص نشده است (48). براین اساس، احتمال دارد این پروتئین نقشهای دیگری را هم در سیستمهای زیستی ایفاء کند که تاکنون شناخته نشده است.
جدول1- موتیفها و مکان قرارگیری گروههای مختلف nsLTP2 برنج ایرانی .
Amino acid position Motif information
1-31 Prokaryotic membrane
Lipoprotein lipid attachment
Site profile
21-26 N-myristoylation sites
28-33
41-46
56-58 Phosphorylation site
31-96 Tryp_alpha_amyl Proteases
Inhibitor
Seed storage
شکل 1- درخت فیلوژنی Rice-nsLTP2. فیلوگرام حاضر توسط Clustal-W alignment توالیهای پروتئینی شناخته شده این ژن و با استفاده از نرم افزار TreeTop program (www.genebee.msu.su/genebee.html) به دست آمده است. طول شاخهها در محور X نشاندهنده فاصله بین توالیهای مورد استفادهاند که توسط BLOSUM62 substitution matrix محاسبه شده است.
جدول2- ماتریکس فاصله، فاصله هر گونه با خودش صفر میباشد.
مطالعه و بررسی توالی ژنی و پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی نشاندهنده شباهت زیاد توالی آن به نوع خاصی از گونه ژاپنی(Accession NO. NP 001048723.1) (98 درصد) و نوع هندی (97 درصد) است و کمترین شباهت آن با nsLTP2 ژاپنی دیگر (Accession No. NP_001056242.1) به میزان 51 درصد است. نتایج حاصل با مطالعات فیلوژنیکی همخوانی دارد، به طوری که nsLTP2 برنج ایرانی با گونه ژاپنی (Accession NO. NP_0010562421 ) یک گروه هموفیلیک تشکیل میدهد، در حالیکه با نمونه هندی در دو گروه هتروفیلیک قرار دارند (شکل1 و جدول2). بهعلاوه این نتایج نشاندهنده کاربرد توالیها و ژنهای جدید در تعیین روابط بین گونهای در گیاهان می باشد.
بررسیهای بیوانفورماتیکی پروتئین nsLTP2 گونه Oryza sativa ایرانی موید وجود 4 توالی آنتیژنی در ساختار آن است که بزرگترین آن در قسمت سیگنال پپتید قرار دارد. طول، محل شروع و خاتمه توالیهای آنتیژنی پروتئین ns-LTP2 برنج ایرانی در جدول 3 قابل مشاهده است.
جدول 3- بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی توالی nsLTP2 ایرانی. (http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)
بررسیهای ایمونوژنیسیتی دقیقتر با سرور دوم ذکرشده در بخش روشها، بهصورت اختصاصی آمینواسیدهای اصلی درگیر در میانکنش بین سلولهای T و پپتید موردنظر را نشان میدهد ( جدول4).
جدول 4- نواحی آنتیژنی موجود در nsLTP2که با MHC-II برهمکنش میدهند.
End Position |
Sequence |
Start Position |
n |
15 |
VLVLAVAMVA |
6 |
1 |
28 |
VVGVAGASC |
20 |
2 |
62 |
LRAQQGCFC |
54 |
3 |
شکل 2- سمت چپ تصویر مدل اولیه پروتئین با میزان انرژیkJ/mol 2/6111- و در سمت راست مدل نهایی با مولکولهای آب در اطراف آن و میزان انرژیkJ/mol 6/25607-.
شکل3- نمودار راما چاندران nsLTP2 برنج نوع ایرانی و نوع هندی .(NIH MBI Laboratory for Structural Genomics and Proteomics)
این پروتئین دارای 3 مارپیچ آلفای غالب و یک مارپیچ کوچک است که انتهای C پروتئین شامل 40 واحد اسیدآمینه است. الگوی پیوندهای دی سولفیدی در نوع ژاپنی به صورت Cys 3_Cys 35/Cys 11_ Cys 25/Cys37_ Cys61/ Cys28_ Cys68 است (27) و به نظر میرسد توالی نوع هندی و ایرانی نیز از همین الگو پیروی کند (شکل 4 قسمت الف). با مطالعه توالی و ساختار پروتئینی rice-nsLTP2 نوع ایرانی با نوع ژاپنی مشخص گردید که آمینواسیدهای درگیر در تشکیل حفره هیدروفوب این پروتئینها مشابه یکدیگر هستند (شکل 4 قسمت ب).
ب |
الف |
شکل4- ساختار فضایی، رزیدوهای شرکت کننده در حفره هیدروفوب و الگوی باندهای دی سولفیدی درnsLTP2 نوع ایرانی (Chimera 1.7rc and M4T Server) ، الف) رزیدوهای شرکت کننده در تشکیل باندهای دی سولفیدی، ب) رزیدوهای شرکت کننده در تشکیل حفره هیدروفوب.
جهشزایی پروتئین nsLTP2 برنج ایرانی و Molecular Docking : جستجو به منظور یافتن حفره آب گریز در ساختار سه بعدی nsLTP2 بر مبنای هیدروفوبیسیته سطحی با نرمافزار MVD نشان داد، یک حفره آب گریز با حجم 53/22 آنگستروم مکعب با منفذ ورودی در مرکز این پروتئین وجود دارد که این حفره توسط ساختارهای آلفاهلیکسی پروتئین احاطه شده و ناحیه اتصال و استقرار مولکولهای هیدروفوب است. مطالعات جهشزایی که روی nsLTP2 برنج ژاپنی انجام شده است، اثر اسیدهای آمینه حفاظت شده آروماتیکی مانند: Y45, F39, F36 وY48 ، آمینواسیدهای هیدروفوبی مانند Il15, L8 و V49 روی ساختار پروتئین، پایداری، اتصال به لیگاند و فعالیت انتقال لیپید را نشان دادهاست (10).
به منظور کاهش خاصیت آنتیژنی پروتئین nsLTP2، تعدادی از این اسیدآمینههای باردار یا قطبی موجود، در بین توالی آلرژن پروتئین جهش داده شد. انجام مطالعات بیوانفورماتیکی نشان داد (14) که تغییر در تعدادی از توالیهای آلرژن و با جایگزینی آمینواسیدهای L28 و F39 و نیز تغییر در هر دو موقعیت به آلانین، باعث بهبود در خاصیت آنتی ژنی nsLTP2 میشود. تغییر این اسیدآمینه عموماً در محل تشکیلTurn های پروتئین انجام گرفت، تا کمترین تأثیر بر روی ساختار پروتئین ایجاد شود.
توالیهای تغییر یافته بار دیگر با استفاده از مدلسازی به روش تشابه(Homology modeling) ، مدلسازی شده و در مطالعات داکینگ در حضور لیپید LysPC14 مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج برهم کنشهای انواع جهشیافته از لحاظ توانایی اتصال به مولکولهای هیدروفوب در جدول 5 آورده شده است. به طور جالب توجه، جایگزینی آمینواسیدهای L28 و F39 به آلانین و یا تغییر در هر دو موقعیت، نه تنها باعث بهبود در خاصیت آنتی ژنی nsLTP2 میشود، بلکه خاصیت اتصال به لیپید را در پروتئین حاضر بهبود می دهد. بر این اساس پیشنهاد میشود دستورزی در این مکانها باعث افزایش هیدروفوبیسیته جایگاه اتصال و بهبود خاصیت انتقال دارو در پروتئین nsLTP2 شود.
جدول5- نتایج حاصل از جهشزایی پروتئین nsLTP2.
H Bond (kcal/mol) |
MolDock Score (kcal/mol) |
حجم حفره |
پروتئین |
-5.75 |
-80.28 |
22.53 |
نوع وحشی |
-11.15 |
-85.88 |
19.46 |
(L28A) نوع جهشیافته |
-10.01 |
-100.1 |
29.67 |
(F39A) نوع جهشیافته |
-2.14 |
-110.04 |
22.53 |
جهشیافته نوع (L28A and F39A) |
بحث
nsLTPs ، پروتئینهای قلیایی کوچک با قابلیت اتصال و انتقال انواع لیپیدها هستند، و با توجه به جایگاه هیدروفوب سطحی در آنها، موضوع کاربرد این پروتئینها در انتقال داروها مطرح شده است (31 و 35). در مطالعه حاضر توالی و ساختار nsLTP2 برنج ایرانی مورد بررسی قرار گرفت. توالی nsLTP2 های گونههای مختلف به شدت حفاظت شده است که احتمالاً نشان دهنده اهمیت توالی در عملکردهای سلولی پروتئین می باشد. بهعلاوه با توجه به رابطه فیلوژنی nsLTP2 برنج ایرانی با گونه هندی، به نظر میرسد این دو گونه دارای منشاء یکسان باشند (جدول 2). با این حال تفاوتهای موجود بین این دو گونه میتواند، سبب تغیرات اندک در توالی اسیدآمینهها و ساختار فضایی جایگاه اتصال شود. احتمال دارد چنین تفاوتهای بر روی خاصیت اتصال به لیپید و تمایل پروتئین به اتصال دارو اثرگذار باشد.
پروتئینهای غنی از آلفا هلیکس معمولاً بهعنوان آلرژن برای سیستم ایمنی بدن شناخته میشوند. پروتئینهای غنی از اسیدآمینههای قطبی باردار، دارای خاصیت آنتیژنی هستند و حداقل 8 اسیدآمینه از این نوع باید درکنارهم قرار بگیرند تا برای سیستم ایمنی بدن محرک باشند. مطالعات ایمونولوژیکی، خواص آلرژنی پروتئینهایی مثل nsLTPها که غنی از آلفاهلیکس و اسیدآمینههای قطبی مانند سیستئین و اسیدآمینههای بارداری مانند لیزین و آرژنین هستند، را مشخص کردهاند (11، 21، 46 و 49). بررسی ساختار اول نشان دهنده وجود چهار توالی آنتی ژن بر روی توالی nsLTP2 ایرانی می باشد. با این وجود، دو توالی آنتیژن در پروتئین nsLTP2 در ناحیه پپتید نشانه قرار دارند (جدول 3)، در نتیجه پیشبینی می شود با حذف این بخش خاصیت آنتیژنی آن کاهش یابد.
مطالعه توالیهای تغییر یافته نشان میدهند که هیچیک از تغییرات ایجاد شده در موتیفهای پس از ترجمه nsLTP2 ایرانی قرار ندارند. در نتیجه به نظر نمیرسد تغییر در توالی به طور مستقیم فرآیندهای همزمان با ترجمه و یا پس از ترجمه را با تغییرات شدید همراه کند. با این حال مطالعه حاضر نشان میدهد که جهش F39A در این پروتئین (جدول5)، با برهم زدن توالی آنتیژنی پروتئین سبب کاهش خاصیت آنتیژنی آن میشود. به علاوه افزایش سطح حفره هیدروفوب، افزایش خاصیت انتقال مولکولهای هیدروفوب را به همراه دارد. بررسیهای مشابه بر روی پروتئین nsLTP2 نوع ژاپنی نشان داده است که تغییر F39A اثری بر ساختار پروتئین ندارد (10). به دلیل شباهت زیاد nsLTP2 برنج نوع ژاپنی با نوع ایرانی، استنباط میشود جایگزینی F39 با آلانین تغییر شدیدی در ساختار nsLTP2 ایرانی ایجاد نکند. به علاوه به نظر می رسد تغییر L28 در محل انعطافپذیر ساختار پروتئین، کمترین تاثیر برروی ساختار سه بعدی nsLTP2 ایرانی داشته باشد. باوجود پیشبینی انجام شده، احتمال دارد تعداد زیادی از پپتیدهای کوچک که دارای توالیهای هیدروفوب در ساختار خود هستند، تمایل بیشتری برای تودهای شدن و تشکیل فیبریلهای آمیلوئیدی داشته باشند (19). مکان حفره هیدروفوب پروتئین nsLTP2 در درون ساختار است. همچنین ایجاد جهش F39A تغییری در ساختار پروتئین نوع ژاپنی ایجاد نکرده است، به همین دلایل احتمال می رود که جهش فوق اثر ناچیزی برروی تاخوردگی پروتئین داشته باشند. همچنین برای حذف این اثر میتوان از ناقلهایی با دنبالههای پروتئینی محلول و بهینهسازی شرایط بیان استفاده کرد (29، 34 و 36). مطالعات داکینگ نشان داد که تغییر در هر یک از موقعیتها و یا تغییر همزمان آنها، نه تنها خاصیت آنتیژنی پروتئین را کاهش میدهد، بلکه قابلیت اتصال به لیپید و احتمالا داروهای هیدروفوب را نیز بهبود میدهد (41).
در نهایت باوجود پیش بینیهای بیوانفورماتیکی در جهت بهبود احتمالی عملکرد nsLTP2 ایرانی، اثر نهایی تغییرات ایجاد شده در توالی پروتئینی بر روی ساختار و فعالیت nsLTP2 ایرانی غیر قطعی میباشد. این موضوع به خصوص به علت کوچک بودن توالی و نیز حفاظت شدگی شدید آن به صورت چالش باقی مانده است و مطالعات آینده میتواند در پاسخ به آن مفید باشد. درمجموع نتایج مطالعه حاضر میتواند در دستورزیهای پروتئینی هدفمند بر روی nsLTP2، بهمنظور افزایش کارآیی پروتئین حاضر در اتصال لیگاند و بهویژه در سیستمهای تحویل دارو مورد استفاده قرار بگیرد.