نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه گلستان
چکیده
در حال حاضر روشهای in silico یکی از کم هزینهترین و سریعترین روشهای موجود جهت طراحی و کشف دارو در زمینه درمان محسوب می گردد. در این مطالعه ما علاقهمند شدیم تا با انجام طراحی محاسباتی دارو به روش داکینگ مولکولی ترکیباتی را معرفی کنیم که نقش موثری در مهار پلیمریزاسیون توبولینها به عنوان عوامل اصلی تقسیم سلولی در تومورهای سرطانی دارند. بدین منظور ترکیبات کرومنی که توسط محققین مختلف خواص ضد سرطانی آنها مورد آزمایش قرار گرفته بودند، جمع آوری، و بر اساس جایگاه اتصال آنها به توبولین، آنالوگهای جدیدی طراحی شدند. سپس، با استفاده از روش داکینگ مولکولی توسط نرم افزار آکادمیک AutoDock Vina ترکیبات قویتر شناسایی شدند و برهمکنشهای احتمالی این ترکیبات با جایگاه اتصال کلشیسین در توبولین آنالیز شد. با توجه به اینکه ترکیبات طراحی شده با مقدار انرژی پایینتری نسبت به کلشیسین به ساختار پروتئین داک شدند، میتوانند به عنوان ترکیبات بالقوه دارویی مورد ارزیابیهای بعدی قرار بگیرند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Designing new chromene compounds with anticancer activity and studying their interaction with tubulin by molecular docking method
نویسندگان [English]
Golestan University
چکیده [English]
Currently, in silico methods considered as one of the least expensive and fastest ways for drug design and discovery in the field of therapy. In the present study, we were interested to introduce compounds, which have an important role in inhibiting tubulins polymerization as the main factor of cell division in cancerous cells using computational drug design, especially molecular docking method. For this purpose, chromene compounds, which their anticancer properties had been tested by several researchers, were gathered and based on their binding site of tubulin, new analogs were designed. Then, by using AutoDock Vina software, stronger compounds which had the lowest affinity energy, were identified and their possible interaction with the colchinine binding site analyzed by LigPlot and UCSF Chimera. Given that newly designed compounds docked to the protein structure with lower affinity energy than colchicine as the control sample, they could be the subject of further assessment as the potential pharmaceutical compounds.
کلیدواژهها [English]
طراحی ترکیبات کرومنی جدید با فعالیت ضد سرطانی و بررسی چگونگی میانکنش آنها با توبولین به روش داکینگ مولکولی
مصطفی جواهری مقدم 1، حسن آریاپور1* و علیاکبر دهنوخلجی2
1 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
2 گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی
تاریخ دریافت: 21/9/92 تاریخ پذیرش: 11/5/93
چکیده
در حال حاضر روشهای in silico یکی از کم هزینهترین و سریع ترین روشهای موجود جهت طراحی و کشف دارو در زمینه درمان محسوب میگردد. این مطالعه بر آن است تا با انجام طراحی محاسباتی دارو به روش داکینگ مولکولی ترکیباتی را معرفی کند که نقش مؤثری در مهار پلیمریزاسیون توبولینها به عنوان عوامل اصلی تقسیم سلولی در تومورهای سرطانی دارند. بدین منظور ترکیبات کرومنی که توسط محققین مختلف خواص ضد سرطانی آنها مورد آزمایش قرار گرفته بودند، جمعآوری و بر اساس جایگاه اتصال آنها به توبولین، آنالوگهای جدیدی طراحی شدند. سپس، با استفاده از روش داکینگ مولکولی توسط نرم افزار آکادمیک AutoDock Vina ترکیبات قویتر شناسایی شدند و برهمکنشهای احتمالی این ترکیبات با جایگاه اتصال کلشیسین در توبولین آنالیز شد. با توجه به اینکه ترکیبات طراحی شده با مقدار انرژی پایینتری نسبت به کلشیسین به ساختار پروتئین داک شدند، میتوانند به عنوان ترکیبات بالقوه دارویی مورد ارزیابیهای بعدی قرار بگیرند.
واژه های کلیدی: توبولین، کرومن، داکینگ مولکولی، سرطان
* نویسنده مسئول، تلفن: 01714427173، پست الکترونیکی: aryapour@ibb.ut.ac.ir
مقدمه
سرطان یکی از پر چالشترین بیماریهای است که بشر تاکنون با آن روبرو بوده و هنوز به عوامل درمانی مؤثر زیادی نیاز است تا با رشد خارج از کنترل تومورهای بدخیم بتوان مقابله کرد. ثابت شده است که ترکیبات ضد سرطانی طبیعی در بین داروهای ضد سرطانی جزء دسته درمانی موفق بودهاند (28). عوامل متصل شونده به میکروتوبول به طور وسیعی در شیمی درمانی سرطان استفاده میشوند. این عوامل منجر به اختلال در ناپایداری دینامیک میکروتوبولها در طی فرآیند پلیمریزاسیون و دپلیمریزاسیون میگردند. احتمالاً مهمترین نقشی که میکروتوبولها در سلول ایفاء میکنند، شرکت در فرآیند میتوز و عملکرد صحیح دوکها میباشد. اختلال در فرآیند تجمع میکروتوبولها چه با مهار پلیمریزاسیون توبولینها و چه با مهار دپلیمریزاسیون، منجر به افزایش شمار سلولهایی میشود که در مرحله متافاز متوقف میشوند. بنابراین هدفگیری توبولینها به عنوان اجزاء اصلی میکروتوبولها راهکار مهمی در کنترل سرطان است. تا کنون مشخص شده است که ترکیبات مختلف زیادی به میکروتوبولها متصل میشوند. به لحاظ جایگاه اتصال این ترکیبات به چهار گروه تقسیم میگردند (شکل1) که عبارتند از: 1- لیگاندهایی که به جایگاه تاکسول (T) اتصال مییابند، 2- لیگاندهایی که به جایگاه وینبلاستین (V) اتصال مییابند، 3- لیگاندهایی که به جایگاه بنزایمیدازول (B) اتصال مییابند و 4- لیگاندهایی که به جایگاه کلشیسین (C) اتصال مییابند. این ترکیبات میکروتوبولها را ناپایدار میکنند و منجر به آپوپتوز سلولی میشوند (11).
آپوپتوز فرآیندی است که طی آن ارگانیسم می تواند تعداد سلولهایش را کنترل و سلولهایی را که غیرضروریند و تهدیدی احتمالی برای بقای آن به حساب می آید را محدود کند. تعادل مناسب بین آپوپتوز و مهار آپوپتوز در حفظ همئوستازی و مورفولوژی اندام اهمیت دارد. از آنجایی که خیلی از سلولهای سرطانی مهار غیرطبیعی آپوپتوز را نشان میدهند، این مسئله اهمیت ویژهای در جستجو و طراحی القاء کنندههای آپوپتوز به عنوان عوامل بالقوه ضد سرطانی پیدا میکند (23).
با در نظر گرفتن این مطلب که طراحی دارو کاری است چند بعدی، لذا روش قدیمی نشستن و خیره شدن به ساختارهای شیمیایی روی کاغذ برای سنتز و غربالگری طیف گستردهای از ترکیبات نا امید کننده است. همچنین مشکلات مربوط به مدیریت دادهها با حجیم تر شدن آنها افزایش مییابد. دارو علاوه بر فعالیت مناسب باید فراهمی زیستی خوراکی بالا، سمیت پایین، قابلیت ثبت علمی و نیمه عمر کافی در جریان خون داشته باشد. هزینه تولید یک ترکیب دارویی موضوع مهمی است، که برای داروهای انسانی کمتر، برای داروهای دامپزشکی بیشتر و برای ترکیبات شیمیایی کشاورزی بسیار اهمیت دارد. برنامههای رایانهای برای تحلیلهای چند بعدی، بهینهسازی و انتخاب ترکیبات پیشرو ایجاد شدهاند (41).
روش محاسباتی طراحی دارو بر اساس ساختار، که در آن مولکولهای کوچک درون ساختار ماکرومولکولهای هدف "داک" میشوند و به اتصال آنها در جایگاه مورد نظرامتیاز داده میشود به طور گستردهای در تعیین نحوه برخورد، یافتن و بهینه سازی ترکیبات رهبر کاربرد دارد. در واقع تاکنون توسعه شماری از داروها نظیر مهار کننده پروتئاز HIV به طور زیادی تحت تأثیر یا بر پایه طراحی براساس ساختار و استراتژیهای غربالگری بوده است (29).
شکل 1- نمایی از جایگاههای اتصال لیگاندهای مختلف بر روی هترودیمر αβ- توبولین (13).
کرومنها ترکیباتی هستند که در بسیاری از ارگانیسمهای دریایی نظیر شاخه کورنتراتا، ماهیها، اسفنجها، نیامداران و جلبکهای بزرگ با خواص بیولوژیکی متنوع یافت می شوند (19). ترکیبات کرومنی خواص سایتوتاکسیک شدید و همین طور توانایی مهار پلیمریزاسیون توبولینها را نشان میدهند. که مکانیسم اصلی عمل این دسته از ترکیبات القای آپوپتوز میباشد. این ترکیبات و همچنین مشتقات آن نمونههای بالینی بسیار خوبی برای درمان سرطان در انسانها هستند. به علاوه ثابت شده است که تعدادی از این ترکیبات را میتوان به عنوان پیش دارو در نظر گرفت، که جزء عوامل شیمی درمانی برای هدفگیری رگهای توموری هستند و فعالیت ضد رگزایی دارند. جایگاه اتصال آنها نزدیک به محل اتصال کلشیسین است، و در سلولهای مقاوم به دارو نسبت به عوامل ضد میتوزی دیگر مثل تاکسانها و وینکاها فعال باقی میمانند، بنابراین میتوانند در درمان سرطانهای مقاوم به دارو یک مزیت به حساب آیند (23 و 34).
تاکنون مشتقات زیادی از کرومنها استخراج یا طراحی و سنتز شدهاند ولی هیچ گونه مطالعه شبیهسازی مولکولی در ارتباط با میانکنش این ترکیبات با هترودیمر توبولین صورت نگرفته است بنابراین در این تحقیق تصمیم گرفته شد تا یک سری مطالعات داکینگ و شبیهسازی مولکولی بر روی تعدادی کرومن منتخب اجرا گردد با این هدف که فهم بهتری نسبت به چگونگی اتصال این دسته از ترکیبات درون توبولین به دست آید. نتایج به دست آمده میتواند در ادامه روند طراحی و سنتز ترکیبات مؤثرتر، مفید واقع شود.
مواد و روشها
آمادهسازی پروتئین: ساختار کریستالوگرافی شده توبولین به همراه کلشیسین با قدرت تفکیک 73/2 آنگستروم از بانک اطلاعات پروتئین دانلود گردید (PDB ID: 3UT5). دیمر α و β توبولین به همراه هترومولکولهای GDP، GTP و Mg از بقیه بخشهای اضافی استخراج شدند. لوپها و رزیدوهای از دست رفته در فایل کریستالوگرافی که شامل لوپهای 46-38 و 451-440 از زیرواحد α-توبولین و 455-442 از زیرواحد β-توبولین هستند، توسط برنامه Modeller9.11 (15) به روش چند الگویی بازسازی شدند، این نواحی از دست رفته پروتئین 3UT5 در الگوهای پروتئینی استفاده شده نظیر 1FFX، 2XRP و 4I4T دارای ساختار رندوم کویل بودند. در نهایت سکانس و ساختار سه بعدی پروتئین کریستالوگرافی شده با سکانس و ساختار سه بعدی پروتئین مدل سازی شده و همین طور شبیهسازی شده ، توسط برنامه UCSF Chimera (33) تطبیق داده شدند. کلشیسین و تمامی هترواتمها به غیر از کوآنزیمها و کوفاکتورها از دیمر توبولین حذف شدند سپس با استفاده از برنامه AutoDockTools (35)، بعد از معین کردن بار Gasteiger (17)، اتمهای هیدروژن قطبی، به توبولین اضافه شدند.
بهینهسازی پروتئین همولوژی شده به روش شبیهسازی دینامیک مولکولی: برای بهبود جهتگیری زنجیرههای جانبی، متعادلسازی پروتئین و همچنین آرایش صحیح اتمها، از شبیهسازی دینامیک مولکولی با به کارگیری میدان نیروی CHARMM27 (8) استفاده گردید. پارامترهای کوآنزیمها توسط سرور SwissParam (42) محاسبه شدند. کمپلکس پروتئین-کوآنزیم در جعبه مکعبی با حفظ شرایط PBC و فاصله nm1 با لبه جعبه در تمام جهات درون محلول آبی با فرمت TIP3P قرار گرفت. با جایگزینی یون Na+ بار کلی سیستم خنثی و نوع میانکنشهای الکترواستاتیک PME تعیین گردید. کمینهسازی اولیه انرژی برای عاری کردن سیستم از برهمکنشهای پرانرژی و برخوردهای حاصل از ممانعتهای فضایی تا رسیدن به مقدار انرژی kJ/mol1000 برای مدت زمان 50 پیکو ثانیه انجام شد. طول تمام پیوندها توسط الگوریتم LINCS (20) محدود شدند. سپس سیستم مورد نظر به ترتیب در دما ی ثابت 310 کلوین و فشار ثابت 1 بار به مدت 50 پیکو ثانیه به تعادل رسید. در نهایت محاسبات دینامیک مولکولی به مدت 5 نانو ثانیه به وسیله سرور تحت وب GROMACS که بخشی از تورین WeNMR میباشد، انجام گرفت (37 و 39). نتایج حاصل از شبیه سازی توسط برنامه Grace مورد ارزیابی قرار گرفت (3).
آمادهسازی لیگاند: ابتدا تمامی ساختارهای ترکیبات کرومنی از مقالاتی که تا سال 2011 منتشر شده بودند استخراج، با استفاده از برنامه کاربردی MarvinSketch ترسیم و همین طور با کمک برنامه کاربردی MolConverter از مجموعه ChemAxon (4) بهینهسازی و به ساختار سه بعدی تبدیل شدند،که مجموعاً حاوی 189 ترکیب شامل 125 ترکیب از کارهای Kemnitzer و همکاران(9, 22-27)، 8 ترکیب از کار Pinney و همکاران(34)، 9 ترکیب از کار Batista و همکاران(7)، 4 ترکیب از کار Endo و همکاران(14)، 4 ترکیب از کار Conti و همکاران(12)، 15 ترکیب از کار Mun و همکاران(31) و نهایتاً 24 ترکیب از کار Cheng و همکاران(10) میباشد. با در نظر گرفتن این ترکیبات و کانفورماسیون آمینو اسیدهای موجود در جایگاه کشیسین 100 آنالوگ جدید طراحی شدند و با استفاده از برنامه کاربردی Evaluator از مجموعه ChemAxon (4) بر اساس اصل پنجم لیپینسکی (30) آنالوگهای نامناسب از سایر آنالوگها طراحی شده، فیلتر شدند.
داکینگ مولکولی: فرآیند داکینگ لیگاندها به جایگاه اتصال کلشیسین در پروتئین توبولین با استفاده از نرمافزار AutoDock Vina انجام گرفت (36). تمامی محاسبات داکینگ با استفاده از الگوریتم بهینه کننده جستجوی محلی تکرار شونده با در نظر گرفتن پروتئین به صورت انعطافناپذیر و لیگاند به صورت انعطافپذیر انجام شد. جعبه گرید با ابعاد 29×29×29 نقطه ساخته و در محدوده جایگاه اتصال کلشیسین قرار داده شد. فاصله گرید Å 1000 و سایر پارامترها به صورت پیشفرض در نظر گرفته شدند. پس از انجام داکینگ بهترین کانفورماسیون با پایینترین میزان انرژی اتصال، به عنوان نتیجه انتخاب شد. در نهایت مؤثرترین ترکیبات انتخاب و میانکنشهای هیدروژنی و هیدروفوبی کمپلکس توبولین-لیگاند و طول پیوندهای هیدروژنی به وسیله نرم افزار UCSF Chimera و LigPlot آنالیز گردید (38).
شکل2- انطباق سکانسهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده پروتئین 3UT5 که با استفاده از نرمافزار UCSF Chimera صورت گرفت. رنگ آمیزی سکانسها بر اساس ساختار دو بعدی پروتئین صورت گرفت. نواحی سبز مربوط به صفحات بتا، آبی مارپیچهای آلفا و قرمز مربوط به رندوم کویلها میباشد. نواحی که دارای رزیدوهای گمشدهاند به صورت نقطه چین به نمایش درآمدند.
نتایج
پروتئین: سکانسهای هر دو پروتئین کریستالوگرافی و مدل سازی شده نیز با کمک نرم افزار UCSF Chimera بر روی هم منطبق و بر مبنای ساختار دو بعدی رنگ آمیزی و شاخص یکسانی آنها سنجیده شد (شکل2)، میزان یکسانی برای زنجیرههای A برابر با 96 درصد و برای زنجیرههای B برابر با 97 درصد مشاهده شد. در این تطبیق رزیدوهای گمشده در کریستالوگرافی به صورت خط چین نشان داده شده است. همچنین فایل کریستالوگرافی شده 3UT5 نسبت به سکانس اصلی توبولین دارای رزیدوهای گمشده شامل یک لوپ در زنجیره آلفا و دو لوپ در C ترمینالهای هر دو زنجیره بود، که با کمک برنامه Modeller بازسازی و همولوژی شدند، سپس پروتئین مدل سازی شده توسط برنامه GROMACS به مدت 5 نانو ثانیه شبیهسازی دینامیک مولکولی شد. ساختار سه بعدی پروتئین کریستالوگرافی با ساختار پروتئین مدل سازی شده (شکل3.الف) و پروتئین شبیهسازی شده (شکل3.ب) مقایسه شد. مقدار RMSD حاصل از شبیهسازی 5/0آنگسترم میباشد. آنالیز نتایج حاصل از شبیه سازی دینامیک ملکولی پروتئین 3UT5 مدل سازی شده نشان داد که پروتئین مورد نظر بعد از حدود یک نانو ثانیه به تعادل رسیده است (شکل4).
داکینگ: تمام محاسبات داکینگ توسط برنامه Vina صورت گرفت که طی آن 100 ترکیب تازه طراحی شده همراه با کلشیسین به عنوان نمونه کنترل مثبت به درون ساختار پروتئین داک شدند. انرژی تمایل ترکیبات به پروتئین هدف به صورت kcal/mol محاسبه شد، هرچه مقدار انژری کمتر باشد تمایل لیگاند به جایگاه اتصال بیشتر میباشد و برعکس. این میزان برای کلشیسین برابر با (kcal/mol)6/7- برآورد شد. از بین ترکیبات طراحی شده نیز 5 ترکیب پایینترین میزان انرژی را از خود نشان دادند مقادیر انرژی تمایل این ترکیبات به پروتئین هدف در جدول1 ارائه شده است. ساختار این ترکیبات نیز در شکل 5 نشان داده شده است.
جهت معتبر سازی نتایج حاصل از داکینگ ترکیبات طراحی شده از مولکول کلشیسین موجود در ساختار کریستاله پروتئین 3UT5 استفاده گردید. صحت نتایج، از مقایسه حالت پیشبینی شده لیگاند کلشیسین نسبت به حالت کریستاله آن و اندازهگیری مقدار RMSD تأیید شد.
شکل3- الف- ساختار پروتئینهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده قبل از شبیهسازی که بر روی هم منطبق شده اند. ب- ساختار پروتئینهای کریستالوگرافی و مدل سازی شده بعد از شبیهسازی که بر روی هم منطبق شدهاند. ساختار کریستالوگرافی با رنگ قرمز و ساختار مدل سازی شده با رنگ آبی مشخص شدهاند.
برای این منظور کلشیسین مجددا به درون جایگاه خود داک گردید و RMSD آن با ساختار اولیه به کمک نرمافزارMolsoft ICM-Browser (5) برآورد شد (شکل6). مقدار RMSD کلشیسین داک شده و کریستاله 6/0 آنگسترم بود که نشان میدهد پارامترهای لحاظ شده در داکینگ، در مورد این قبیل لیگاندها و جایگاه مذکور دقت مناسبی دارند.
شکل4- RMSD حاصل از شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین مدل سازی شده در مدت زمان 5 پیکو ثانیه
شکل5- ساختار کلشیسین و ترکیبات منتخب حاصل از امتیازدهی داکینگ
شکل6- مقایسه ساختار پیشبینی شده و واقعی کلشیسین. ساختار داک شده با رنگ سبز و ساختار کریستاله با رنگ قرمز مشخص شده است.
جدول 1- مقادیر انرژی اتصال ترکیبات طراحی شده موثرتر از کلشیسین
شماره ترکیب |
انرژی اتصال (kcal/mol) |
358 304 505 457 266 کلشیسین* |
4/10- 7/9- 5/9- 5/9- 10- 6/7- |
* نمونه کنترل |
پس از داکینگ نحوه میانکنش 5 ترکیب مؤثرتر به همراه کلشیسین توسط برنامه UCSF Chimera و LigPlot مورد ارزیابی قرار گرفت. رزیدوهای کلیدی کاتالیتیک در واکنش با کلشیسین شامل 181Val درگیر در پیوند هیدروژنی و 352Lys، 258Asn، 255Leu، 254Lys، 318Ile، 259Met، 250Ala به همراه 10 رزیدوی دیگر درگیر در واکنشهای غیر پیوندی هستند (شکلهای 7 و 8). رزیدوهای کاتالیتیک درگیر با ترکیب 358 عبارتند از 11Gln با دو پیوند هیدروژنی به گروه نیترو و همچنین رزیدوهای 224Tyr، 259Met، 258Asn، 352Lys، 255Leu، 318Ile، 181Val با برهمکنشهای غیر پیوندی (شکلهای 7 و 8). برای ترکیب 304 برهمکنشهای 258Asn، 259Met، 352Lys با هسته کرومن و 249Asn، 254Lys، 178Ser، 255Leu، 318Ile با گروههای (trifluoromethyl)benzene و N-( pyridin-4-yl)acetamide مشاهده شد (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 505 برهمکنشهای غیر پیوندی رزیدوهای 254Lys ، 352Lys ، 258Asn ، 249Asn ، 181Val ، 255Leu ، 259Met ، 318Ile و پیوندهای هیدروژنی احتمالی رزیدوهای 350Asn و 315Val با OH متصل به حلقه کرومنی تشکیل شدند نرم افزار UCSF Chimera این پیوندهای هیدروژنی را تأیید نکرد (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 457 رزیدوهای 250Ala ، 258Asn ، 259Met ، 315Val ، 352Lys ، 180Ala ، 178Ser ، 183Glu ، 255Lue درگیر واکنشاند (شکلهای 7 و 8). در ترکیب 266 پیوندهای هیدروژنی احتمالی رزیدوهای 221Arg ، 178Ser ، 351Val تنها توسط نرم افزار LigPlot تأیید و همین طور برهمکنشهای غیر پیوندی رزیدوهای 224Tyr ، 353Thr ، 352Lys ، 175Pro ، 222Pro نیز تشخیص داده شدند (شکلهای 7 و 8). اتمهای درگیر در پیوند هیدروژنی لیگاندهای 266، 358 و 505 با آمینواسیدهای جایگاه اتصال در جدول 2 ارائه شده است.
شکل7- برهمکنشهای احتمالی ترکیبات با جایگاه اتصال کلشیسین در پروتئین توبولین توسط LigPlot: (الف) کلشیسین، (ب) ترکیب 358، (ج) ترکیب 304، (د) ترکیب 505 (و) ترکیب 457 (ز) ترکیب 266. در LigPlot پیوندهای هیدروژنی با رنگ سبز و رزیدوهای درگیر در برهمکنشهای غیر پیوندی با رنگ قرمز و همین طور اتمهای کربن با رنگ مشکی، اکسیژن با رنگ قرمز ، نیتروژن با رنگ آبی، و فلور با رنگ سبز به نمایش گذاشته شده است. برای نمایش دادن لیگاندها از مدل گوی و میله استفاده شد.
بحث
متابولیتهای طبیعی سهم عمدهای از داروهای ضد سرطانی را به خود اختصاص دادهاند، این ترکیبات عرصه مناسبی برای کشف و توسعه داروها محسوب میشوند. مطالعات بر روی پکتین سیب نشان داد که این ترکیب قادر به القای آپوپتوز در رده سلولی سرطان پروستات Du145 میباشد (2). همچنین طبق مطالعات پارساسرشت و همکاران تیمار متابولیتهای حاصل از باکتریLactobacillus rhamnosus GG در غلظتهای 100، 200 و 300 میکرولیتر/ میلیلیتر بر روی رده سلولهای سرطانی CacoII به ترتیب موجب مهار 8/60، 5/72 و 1/82 درصدی این سلولها شد (1).
با این وجود طراحی و توسعه داروها فرآیندی بسیار پرهزینه، زمان بر و همچنین نیازمند ارزیابیهای آزمایشگاهی فراوانی برای رسیدن دارو به بازار میباشد، از این رو گسترش روشهایی که بتوان طی آن میلیونها ترکیب را در بازه زمانی کوتاهتر و با هزینه کمتر غربال نمود از اهمیت ویژهای برخوردار است. امروزه روشهای in silico به عنوان یکی از کم هزینهترین و سریع ترین راهکارها برای رسیدن به ترکیبات رهبر و یا دارو مورد استفاده قرار میگیرند (6).
مطالعات in silico توسط Bai و همکاران منجر به شناسایی 306 مهار کننده از میان 50000 ترکیب برای غیر فعال کردن سم ریسین شد. ارزیابیهای بیوشیمیایی و سلولی بر روی ترکیبات غربال شده نشان داد که دو مهارکننده دارای اثر محافظتی قوی بر روی سلولهای Vero در برابر سم ریسین میباشند (6). اختلال در فعالیت پروتئین Tip60 به عنوان یکی از عوامل مهم در مسیرهای سیگنالینگ سلولی، باعث بروز بیماریهای نظیر سرطان و زوال مغزی میگردد. روش غربالگری مجازی که در این مطالعات به کار گرفته شده است باعث شناسایی چهار مهارکننده برای پروتئین Tip60 از میان ترکیبات گردآوری شده از پایگاه اطلاعاتی ChemBridge شد. ارزیابیهای بعدی صورت گرفته بر روی این مهارکنندهها در شرایط in vitro نتایج حاصل از in silico را تأیید کرد (40).
بنابر گزارش Endo و همکارانش، مشتقات 3-کربوکسیآمید کرومنها مهارکننده آلدو کتو ردوکتاز (AKR) هستند (14). از سوی دیگر نتایج حاصل از مطالعات Cheng و همکاران نشان داد که این ترکیبات مهار کننده فاکتور نکروز توموری آلفا (TNFα) نیز میباشند (10).
شکل8- برهمکنشهای احتمالی ترکیبات با جایگاه اتصال پروتئین توسط UCSF Chimera: (الف) کلشیسین (ب) ترکیب 358 (ج) ترکیب 304 (د) ترکیب 505 (و) ترکیب 457 (ز) ترکیب 266. در UCSF Chimera لیگاندها به صورت مدل گوی و میله و اتمهای کربن با رنگ خاکستری، نیتروژن آبی، اکسیژن قرمز، فلئور سبز ، ساختار پروتیئن با رنگ سفید و رزیدوهای در گیر در پیوند هیدورژنی سبز و مابقی رزیدوهای درگیر در برهمکنش با رنگ صورتی مشخص شدهاند، مابقی تنظیمات مربوط به رنگبندی همانند برنامه LigPlot صورت گرفته است.
اهمیت توبولینها در میتوز و تقسیم سلولی باعث شده است تا مهار پویایی توبولینها به عنوان هدفی در طراحی داروهای ضد سرطانی قرار بگیرد (21). ترکیباتی نظیر کرومنها و کامبریتاستاتینها که در جایگاه کلشیسین و یا نزدیک به آن داک میشوند باعث مهار فرآیند پلیمریزاسیون میکروتوبولها میشوند (23)، لذا توسعه و طراحی چنین ترکیباتی بعنوان ترکیباتی بالقوه ضدسرطانی مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته است.
جدول2- پیوند های هیدروژنی درگیر در کمپلکس ترکیبات با توبولین
لیگاند |
پیوند هیدروژنی |
اتم لیگاند |
آمینو اسید |
فاصله (Å) |
358 |
1 |
O2 |
:NE11Gln |
96/2 |
2 |
O3 |
:NE11Gln |
17/3 |
|
505 |
1 |
O3 |
:O315Val |
95/2 |
2 |
O3 |
:O350Asn |
35/3 |
|
266 |
1 |
O4 |
1:NH221Arg |
81/2 |
2 |
N2 |
:OG178SER |
88/2 |
|
3 |
N3 |
:OG178SER |
02/3 |
|
4 |
O1 |
:O351Val |
99/2 |
نتایج حاصل از مطالعات Furst و همکاران نشان داد که مشتقات سیکلوپروپیلی کمبریتاستاتین از طریق حلقه فنولی و آنیلین به ترتیب با آمینواسیدهای 179Thr و 178Ser درگیر پیوند هیدروژنی شده و موجب مهار پلیمریزاسیون توبولینها میشوند (16). در حالی که نتایج حاصل از مشاهدات این تحقیق نشان داد که اسیدآمینه 178Ser فقط با ترکیب 266 درگیر پیوند هیدروژنی می گردد و با ترکیبات 304، 358 و 457 درگیر برهمکنشهای غیرپیوندی میشود. علاوه بر این، برهمکنشهای غیرپیوندی بین اسیدآمینه 179Thr و ترکیبات 457 و کلشیسین مشاهده گردید.
همچنین مطالعات Blanch و همکاران بر روی آنالوگهای کمبریتاستاتین و مشتقات تریآزول نشان داد که اسیدآمینههای 181Val، 241Cys و 258Asn با این ترکیبات درگیر پیوند هیدروژنی میشوند (32). در صورتی که نتایج حاصل از داکینگ ترکیبات ارائه شده در این مطالعه، برهمکنشهای غیر پیوندی با اسیدآمینههای 181Val و 258Asn را نشان میدهد. همچنین پیوند هیدروژنی اسیدآمینه 181Val و برهمکنشهای غیر پیوندی اسیدآمینههای 241Cys و 258Asn با کلشیسین مشاهده شد.
پروتئین مدل سازی شده با Modeller توسط GROMACS شبیهسازی مولکولی شد. مقدار RMSD بین پروتئین کریستاله و شبیه سازی شده 5/0 آنگستروم میباشد که کمتر از دو میباشد و نشان دهنده مدل سازی و پارامترسازی صحیح فرآیند شبیهسازی میباشد. علاوه بر این معتبر سازی مطالعات داکینگ نیز با اندازهگیری RMSD کشیسین داک شده با کریستاله انجام شد که مقدار آن 6/0 آنگسترم به دست آمد. معمولاً میزان Å2 > RMSD برای گزارش تقارن بین دو مولکول مناسب است. این موضوع نشان میدهد فرآیند داکینگ به درستی جایگاه کلشیسین را پیشبینی کرده است. انرژی اتصال برای بهترین مد کلشیسین kcal/mol 6/9- به دست آمد.
مطالعات داکینگ توسط AutoDock Vina (یکی از پرکاربردترین نرمافزارهای داکینگ که در سال 2009 منتشر شد) صورت گرفت. Vina نسل جدیدی از AutoDock محسوب میشود، به خدمت گرفتن تابع امتیازدهی تجربی در مقابل تابع نیمه تجربی AutoDock و همین طور استفاده از الگورتیم بهینه کننده جستجوی محلی تکرار شونده در مقایسه با الگوریتم ژنتیکی لامارک باعث افزایش سرعت و دقت داکینگ شده است (18). هر چند که شارژ محاسبه شده با ADT براساس روش Gasteiger-Marsili (17) میباشد، اما باید توجه داشت که Vina برای محاسبات خود به هیچ شارژی نیاز ندارد و شارژ را بر اساس تابع درونی خود تغییر میدهد (36). ترکیبات طراحی شده به جایگاه کلشیسین توسط برنامه Vina داک و بر اساس انرژی اتصال رتبهبندی شدند. بهترین مد هر یک از چهار ترکیب ارائه شده در جدول 1 نسبت به بقیه ترکیبات و همین طور نسبت به کلشیسین دارای پایینترین میزان انرژی تمایل بودند. بنابراین تمایل آنها به این جایگاه بهتر بوده و نسبت به بقیه ترکیبات اختصاصیتر عمل میکنند.
برای درک بهتر جایگاه اتصال و همین طور نحوه اتصال لیگاندها به این جایگاه برهمکنشهای احتمالی میان ترکیبات و توبولین توسط نرم افزار LigPlot برآورد شد و به صورت دو بعدی به نمایش درآمد (شکل7). پیوند هیدروژنی در اتصال ترکیبات 266، 505 و 358 و برهمکنشهای غیر پیوندی در دو ترکیب 304 و 457 نقش مهمی ایفا میکند.
برای تأیید این گزارشها از نرمافزار Chimera استفاده و در ارزیابی این نرمافزار پیوند هیدروژنی فقط در مورد ترکیب 358 مشاهده شد، با توجه به میزان انرژی اتصال این لیگاند (جدول1) و میزان انرژی پیوند هیدروژنی که حدوداً معادل Kcal/mol3-1 میباشد، و همین طور در مقایسه با ترکیب 304 میتوان گفت پیوند هیدروژنی استخلاف NO2 در موقعیت 5 گروه (pyridin-2-ylamino)-methanone نقش مهمی در افزایش امتیاز این ترکیب داشته است. بررسی اطلاعات حاصل از نحوه برهمکنش ترکیبات توسط هر دو نرمافزار تأیید میکند که رزیدوی 352Lys واقع در زنجیره β در تمام برهمکنشهای غیر پیوندی حضور داشته است و میتواند به عنوان یک رزیدوی کلیدی در این جایگاه مورد ارزیابیهای بیشتر قرار گیرد.
براساس گزارش Kemnitzer و همکاران ترکیبات کرومنی به جایگاه کلشیسین متصل میشوند (23)، اما اتصال این ترکیبات به توبولین تا کنون شبیهسازی نشده و نحوه اتصال آنها برآورد نشده است. به نظر میرسد که ترکیبات طراحی شده بیشتر از طریق میانکنشهای هیدروژنی و هیدروفوبیک با رزیدوهای موجود در جایگاه اتصال ارتباط برقرار میکنند. آنالوگهای ارائه شده در این تحقیق میتوانند به عنوان ترکیبات رهبر در مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرند.