طراحی حسگر زیستی اندازه گیری گلوکز با استفاده از الکترود اصلاح شده با نانو ذرات اکسید کادمیوم و آنزیم گلوکز اکسیداز

سعید رضایی زارچی¹ و مسعود نگهداری^2* 

¹ یزد،  دانشگاه پیام نور یزد، گروه زیست شناسی

² مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مرودشت، باشگاه پژوهشگران جوان 

تاریخ دریافت: 9/7/90                 تاریخ پذیرش: 3/2/91

چکیده

در این مطالعه به معرفی حسگر زیستی جدیدی برای اندازه گیری گلوکز با استفاده از آنزیم گلوکز اکسیداز، نانوذرات اکسید کادمیوم و الکترود خمیر کربن پرداخته شد. نانوذرات اکسید کادمیومی که در این تحقیق تهیه و مورد بررسی قرار گرفت، دارای اندازه 43 نانومتر بود. نتایج به دست آمده از این تحقیق بیانگر این است که الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات اکسید کادمیوم سنتزی، می تواند انتقال الکترون را در آنزیم گلوکز اکسیداز تثبیت شده روی سطح الکترود تسهیل نماید. همچنین فرم احیاء شده آنزیم گلوکز اکسیداز می تواند به وسیله اکسیژن محلول با انجام یک واکنش الکترو کاتالیتیکی اکسید شود، که این اکسایش، به علت واکنش بین فرم اکسید شده گلوکز اکسیداز و گلوکز، به وسیله گلوکز مهار می شود. بر اساس کاهش پاسخ الکتروکاتالیتیکی آنزیم گلوکز اکسیداز در محلول اشباع از اکسیژن در حضور گلوکز، یک حسگر جدید برای گلوکز طراحی شد. حسگر طراحی شده دارای حساسیت بالا و در محدوده خطی 20 تا 360 میکرومولار می تواند جهت تعیین گلوکز مورد استفاده قرار گیرد. همچنین این حسگر دارای پایداری بسیار خوبی می باشد.

واژه های کلیدی: حسگر زیستی، نانو ذرات اکسید کادمیوم، آنزیم گلوکز اکسیداز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09190072275، پست الکترونیکی: Masoud.negahdary@hotmail.com  

مقدمه

حسگرهای زیستی گروهی از سیستمهای اندازه گیری می باشند و طراحی آنها بر مبنای شناسایی انتخابی آنالیتها بر اساس اجزای بیولوژیک و آشکارسازهای فیزیکوشیمیایی صورت می پذیرد (2). اولین انگیزه برای پیشرفت فناوری حسگرها از قلمرو بهداشت و درمان سرچشمه می گیرد و مهم ترین کاربرد حسگرهای زیستی و حسگرهای شیمیایی نیز در همین موضوع می باشد، چرا که حسگرها ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکولهای زیستی به شمار می روند (1، 2، 4، 10، 12 و 14). در حقیقت حسگرهای زیستی ابزارهای تجزیه ای به شمار می روند که می توانند با بهره گیری از هوشمندی مواد بیولوژیک، ترکیب یا ترکیباتی را شناسایی نموده، و با آنها واکنش دهند و بدین ترتیب یک پیام شیمیایی، نوری و یا الکتریکی ایجاد نمایند. بیشترین کاربرد حسگرهای زیستی در تشخیصهای پزشکی و علوم آزمایشگاهی است. استفاده از حسگرهای زیستی به دلیل دقت و حساسیت روش ‌و همچنین در مواردی به دلیل عدم نیاز به وسایل پیشرفته و صرف زمان و هزینه زیاد برای تشخیص آنالیتها در مراکز کوچک و در مراکز با امکانات کم و حتی در منزل نیز کاربرد دارد. عملکرد انتخابی، مهم ترین مشخصه یک حسگر می باشد. به عبارتی دیگر این مشخصه توانایی تشخیص مواد مختلف را دارد (10، 12 و 14). حساسیت، پاسخ حسگر به واحد تغییرات غلظت آنالیت است. دامنه تغییرات، محدوده ایست که در آن حسگر از حساسیت خوبی برخوردار است. گاهی به آن، محدوده دینامیک یا خطی نیز می گویند. معمولاً لازم است که حسگر تا کمتر از یک میلی مولار و در موارد خاص تا ^15-10 کوادریلیوم مولار حساسیت داشته باشد (12). تکرارپذیری، دقت و صحت  خروجی حسگر را نشان می دهد. در واقع تکرار پذیری نشان دهنده توانایی یک حسگر در تشخیص یک آنالیت خاص می باشد. از دیگر موضوعات مهم در خصوص حسگرهای زیستی می توان موضوع پایداری و تأثیر عوامل تداخل گر را مطرح کرد. پایداری را بر مبنای درصد بیان می کنند، حسگرهای زیستی که قبلاً طراحی شده، معمولاً پایداری بین دامنه 60 تا 97 درصد را دارا می باشند و این نشان دهنده این است که در دوره های زمانی مشخص که معمولاً 14 روز می باشد بین 3 تا 40 درصد از فعالیت کلی حسگر کاسته می شود. پس با توجه به هزینه های طراحی و تجاری سازی حسگرهایی با پایداری پایین مقرون به صرفه نمی باشند. این موضوع نیز قابل ذکر است که بازار اصلی مصرف حسگرهای زیستی در جایی است که آزمایش و بررسی سریع مورد نیاز باشد، و در این رابطه  اگر هزینه های تعمیر و نگهداری تجهیزات آزمایشگاهی در نظر گرفته شود، حسگرهای زیستی ارزان قیمت را می توان در تمامی موارد از خانه تا بیمارستان به کار گرفت (8). در میان مبدلهای مورد استفاده، مبدلهای الکتروشیمیایی بیشترین کاربرد را دارند که شامل تکنیکهای ولتامتری و آمپرومتری می باشند. نقش حسگر ایجاد یک بستر مناسب برای تسهیل تشکیل کمپلکس پروب-هدف (تشکیل این کمپلکس در موارد پزشکی و صنعتی خیلی وسیع است و پروب عامل جستجوگری هست که به دنبال هدف خاص خود می باشد و اگر این کمپلکس به طور موفقیت آمیز تشکیل شود، سبب ایجاد پیام تشخیص در حسگر می شود، (به عنوان مثال این کمپلکس در دارورسانیهای خاص کاربرد دارد). در واقع تشکیل این کمپلکس، سیگنالی برای شناسایی محسوب می شود (8 و 14). آنزیم احیاء کننده به عنوان یک الکتروکاتالیزور عمل می کند که سبب تسهیل شدن انتقال الکترون بین الکترود و مولکول سوبسترا، بدون وجود هیچ واسطه ای می شود (9). این نوع از حسگرهای زیستی معمولاً انتخاب پذیری و حساسیت بیشتری دارند، چرا که محدوده پتانسیل مورد استفاده، پتانسیل احیای آنزیم است. سطوح برهنۀ الکترود در بررسی الکتروشیمی پروتئینها مناسب  نیست و باید روی سطح الکترود گروههای لازم برقراری ارتباط فعال با درشت مولکولها (Macromolecules) را فراهم آورد. این گروهها نقش اساسی تسریع فرآیند انتقال الکترون را ایفاء می کنند و از انواع این گروهها می توان سیستئین، گوگرد، آلدهید، هیدروکسید و نانوذرات را نام برد. این گروهها از لحاظ پیوند هیدروژنی یا پلهای نمکی، مکمل درشت مولکولها هستند که مولکولهای تأمین کنندۀ گروههای مذکور را تسهیل کننده می گویند(3). در این تحقیق از نانوذرات اکسید کادمیوم به عنوان تسهیل کننده استفاده گردید. تعیین غلظت گلوکز در نمونه های بالینی، بیولوژیکی و شیمیایی همچنین در تولید مواد غذایی و تخمیر بسیار مهم است (18 و 19). یکی از مباحث مهم و کلیدی در طراحی حسگرهای زیستی، فرآیندهای الکتروشیمیایی دخیل در آن است. الکترودها از اجزای اصلی در هر سلول الکتروشیمیایی به حساب می آیند و سیستمهای الکتروشیمیایی سه الکترودی می باشند که از الکترودهای نقره-نقره کلرید یا کالومل اشباع شده به عنوان الکترود مرجع استفاده می شود. از یک سیم پلاتینی به عنوان الکترود شمارنده استفاده می شود و مهم ترین الکترود، الکترود کار نام دارد و در ابتدا در ساخت این نوع الکترود معمولاً از فلز طلا استفاده می شد اما در حال حاضر الکترودهای گرافیت، کربن شیشه -ای و خمیر کربن، عموماً به عنوان الکترود کار به کار می روند. در این تحقیق از الکترود خمیر کربن استفاده شده که دارای مزیتهای ویژه ای نسبت به انواع دیگر است: روش تهیه الکترود خمیر کربن بسیار ساده و در تهیه آن از پودر گرافیت و پارافین استفاده می شود؛ همچنین الکترود خمیر کربن نقش مؤثرتری نسبت به دیگر الکترودها در فرآیند انتقال الکترون و پدیده اکسایش و کاهش ایفاء می کند و از لحاظ جدید بودن واقعاً الکترود کارآمدی محسوب می شود و این ویژگیها باعث می شود که پایداری و بازده یک حسگر زیستی شدیداً افزایش یابد. با توجه به نانو ذره انتخاب شده، الکترود مذکور و ساختار پروتئینی آنزیم گلوکز اکسیداز که برای اولین بار به طور همزمان در  طراحی این بیوسنسور اندازه گیری گلوکز به کار می رود، هدف از این تحقیق صرفاً طراحی بیوسنسوری کارآمدتر، پایدارتر، با دقت تشخیص بالاتر و در صورت تجاری سازی با قیمتی ارزان تر است.

مواد و روشها

دستگاهها و تجهیزات: آزمایشهای ولتامتری چرخه ای با یک الکترو آنالیزور مدل  slemilink system) EA-201 ) مجهز شده به یک کامپیوتر شخصی انجام شد. یک سلول الکتروشیمیایی سه قطبی در سراسر آزمایشها به کارگرفته شد. از الکترود خمیرکربن خالص یا خمیرکربن اصلاح شده با نانو ذرات اکسید کادمیوم (قطر 1 میلی متر) به عنوان الکترود کار، یک الکترود اشباع شده کالومل به عنوان الکترود مرجع و یک الکترود پلاتینی به عنوان الکترود شمارشگر استفاده شد. از دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل (Shimadzu UV160)  برای انجام آزمایشهای طیف (مرئی-فرابنفش) استفاده گردید.

مواد شیمیایی و محلولها: سولفات کادمیوم، هیدروکسیدسدیم، پودر گرافیت، استیک اسید (99.955 درصد)، اتانول (99.5 درصد)، اسیدهیدروکلریک، ستیل تری متیل آمونیوم بروماید از شرکت مرک تهیه شده است. آنزیم گلوکز اکسیداز  و بتا-د-گلوکز از شرکت سیگما خریداری شد. نمونه استاندارد سرم طبق دستورالعمل آماده شد. همه مواد شیمیایی استفاده شده دارای خلوص شیمیایی بوده و بدون خالص سازی مجدد استفاده شدند. محلولهای بافر فسفات 1/0 مولار با  pHهای مختلف با مخلوط کردن محلولهای استاندارد ذخیره K₂HPO₄)  و   (KH₂PO₄ و تنظیم کردن  pH با H₃PO₄ یا NaOH تهیه شدند.  

آماده سازی نانو ذرات اکسیدکادمیوم: در یک آزمایش محلول اول با استفاده از اسید استیک 06/0 مولار، سولفات کادمیوم 03/0 مولار و 40 میلی گرم ستیل تری متیل آمونیوم بروماید به عنوان سورفکتانت در یک لیتر آب دو بار تقطیر تهیه شد. محلول دوم با دانه های سود 9/0 مولار و 25 میلی لیتر اتانول 70 درصد در یک لیتر آب مقطر دو بار تقطیر تهیه شد. سپس محلول اول به محلول دوم همراه با هم زدن مداوم اضافه شد و رسوب به دست آمده با استفاده از کاغذ فیلتر واتمن، فیلتر و سپس در 80 درجه سانتی گراد در کوره هوای داغ حدود یک ساعت خشک شد. رسوب خشک شده به بوته سیلیسی (41 درجه) انتقال داده شد و در 400 درجه سانتی گراد حدود 2 ساعت سوزانده و سپس پودر به دست آمده برای از بین بردن ناخالصیهای موجود در ذرات، 3 تا 4 بار با اتانول شستشو شد (13). خصوصیات نانو ذرات حاصل با استفاده از تفرق اشعه ایکس، جذب طیف سنجی (مرئی- فرابنفش) بررسی شده و برای ساخت الکترود خمیرکربن اصلاح شده مورد استفاده قرار گرفت. برای بررسی خصوصیات نانوذرات با استفاده از تفرق اشعه ایکس از معادله شرر استفاده شد، که در این معادله قله های برجسته برای تخمین اندازه دانه های نمونه به کار گرفته شدند. معادله 1، معادله شرر می باشد  که  K ثابت است و برابر (9/0) می باشد(5). λ طول موج است و β تمام پهنای نیمه ماکزیمم خط است و θ زاویه پراش است.

(معادله 1)          D=Kλ/ (βcosθ)

توصیف صفات اختصاصی: نانو ذرات به دست آمده بالا سپس با دستگاه بروکر مدل  (D/MAX 2500)با تفرق اشعه ایکس با تابش  λ =1/540 Å ، جریان250 mA  و ولتاﮋ عملkV  40آزمایش شدند. نمونه ها پس از پخش در محلول تولوئن با استفاده از طیف سنج نوری  دو پرتویی (مرئی- فرابنفش) اندازه گیری و ثبت شدند.

آماده سازی الکترود: در تهیه الکترود خمیر کربن ابتدا پودر گرافیت در دمای700 درجه سانتی گراد به مدت 30  ثانیه در یک کوره استردار قرار گرفت و سپس در درجه حرارت اتاق در یک دسیکاتور در حضور ژل سیلیکای فعال شده، سرد شد؛ و در مرحله بعد خمیر کربن به وسیله مخلوط کردن پودر گرافیت کربن تولید شده توسط روش بالا با روغن پارافین به نسبت 1میلی گرم پودر گرافیت کربن در مقابل 36/ . میلی لیتر روغن پارافین تهیه شد. خمیر کربن تولید شده در این مرحله مربوط به الکترود خام خمیر کربن است. در مرحله بعد برای تولید خمیر کربن اصلاح شده با نانوذرات اکسید کادمیوم ابتدا صد میلی گرم از پودر گرافیت کربن تولید شده در بالا را به صورت کامل با 300 میکرو لیتر محلول نانو ذرات سنتز شده مخلوط و سپس بعد از تبخیر آب در دسیکاتور در مدت زمان 3 ساعت، 36 میکرولیتر روغن پارافین به ترکیب اضافه گردید. یک بخش از خمیرهای فرآوری شده در سرنگهای لوله ای پلاستیکی با قطر 5/0 تا 52/0 میلی متر برای تولید الکترود خام خمیر کربن و بخش دیگر برای تولید الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو ذرات گذاشته شد. تماس الکتریکی با خمیر به وسیله الحاق یک سیم مسی از سوی پایین لوله سرنگ پلاستیکی و به سوی پشت مخلوط برقرار شد. گروههای (نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز) و (الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز) به وسیله قطره قطره ریختن 10 میکرولیتر گلوکز اکسیداز در محلول بافر فسفات 1/0 مولار دارای PH برابر 7 به ترتیب به (نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن) و (الکترود خمیر کربن) تهیه شد، و در نهایت نوک الکترودها به صورت دستی با کاغذ تمیز صاف گردید و آماده استفاده شد. در طول آزمایش، همه الکترودها در محلول بافر فسفات و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری می شدند.

سنجشهای الکتروشیمیایی: اندازه گیریهای الکتروشیمیایی به وسیله دستگاه پتانسیواستات گالوانو استات انجام شد. سیستم سه الکترودی در برگیرنده یک الکترود کار آماده شده، یک سیم پلاتینی به عنوان الکترود شمارنده  و یک الکترود کالومل اشباع شده به عنوان مرجع برای همه آزمایشات الکتروشیمیایی به کار گرفته  شد. همه آزمایشات در محلول بافر فسفات 1/0 مولار به عنوان الکترولیت پشتیبانی کننده و درجه حرارت اتاق (16تا20 درجه سانتی گراد) انجام شدند. آزمایشها برای تعیین گلوکز و مطالعات الکتروکاتالیتیکی در محلولهای اشباع شده از هوا انجام گرفت، سایر آزمایشات در محلولهایی انجام شدند که به مدت 15 دقیقه در معرض نیتروژن خالص قرار گرفته و به طور کامل بدون اکسیژن شدند و در تمام آزمایشات این حالت حفظ شد. و انجام این فعالیت به این علت است که حضور اکسیژن باعث ایجاد اختلال در سیستم الکتروشیمیایی می شود.

نتایج و بحث

پراش پرتو X برای نانو ذرات اکسیدکادمیوم: شکل 1 منحنی پراش پرتو  Xبرای نانو ذرات اکسیدکادمیوم را نشان می دهد. قله های پراش در مقدار  θ2 جذب شده اند. اندازه دانه برای نانو ذرات اکسید کادمیوم مقدار 43 نانومتر تخمین زده شد و افزایش در تیزی قله های پراش پرتو  Xنشان می دهد که ذرات در ماهیت بلورین هستند. پراشهای (111) (200) (220) (311) و (222) به وضوح دیده می شوند و به طور نزدیک با الگوهای مرجع اکسید کادمیوم مطابقت می کند. فایل مرجع برای مطابقت در ( کمیته مشترک مطالعات پراش پودر) در فایل شماره 0640-05 موجود می باشد. همان طور که در شکل 3-1 مشخص است این محاسبه در محور عمودی برحسب شدت نیرو سنجیده شده است که در مقیاس SI و واحد سنجش آن وات/ مترمربع می باشد. در محور افقی زاویه پراش با θ2 نشان داده شده و واحد سنجش آن درجه می باشد (17). اجزای فرمول شرر و اندازه محاسبه شده برای نانوذرات اکسید کادمیوم پس از بررسی با پراش پرتو X در جدول 1 آورده شده است:

جدول 1- اجزای فرمول شرر و اندازه محاسبه شده برای نانوذرات اکسید کادمیوم

شکل 1-  منحنی پراش پرتو ایکس برای نانو ذرات اکسید کادمیوم؛ افزایش در تیزی قله های پراش پرتو  Xثابت می کند که نانوذرات اکسید کادمیوم در ماهیت بلورین هستند.

طیفهای جذبی مرئی- فرابنفش نانو ذرات اکسیدکادمیوم: طیف جذبی مرئی- فرابنفش نانو ذرات اکسید کادمیوم در شکل 2 نشان داده شده است. اگرچه طول موج طیف سنج با منبع نور محدود می شود اما گروه جذبی نانو ذرات یک تغییر مکان واضح را در منطقه آبی رنگ( طول موج 400 نانومتر) طیف مرئی نشان می دهند که ناشی از مقدار محدود نمونه نانوذرات در مقایسه با توده ذرات کادمیوم اکسید است. این پدیده نمایان می سازد که تشکیل این نانو ذرات به سورفکتانت و حلال آلی بستگی دارد. چون سورفکتانت ستیل تری متیل آمونیوم بروماید به سطح نانو ذرات سنتز شده می چسبد. بنابراین در اثر این عمل، سورفکتانت تثبیت کننده نانو ذرات بوده و در تشکیل یا رشد هسته ذرات برای دستیابی به درجه بالایی از یکنواختی کمک می کند و این موضوع به این علت است که این سورفکتانت دارای بار منفی می باشد و نانوذرات را نیز دارای بار منفی می کند و ذرات با بارهای همنام به یکدیگر جذب نمی شوند و بین آنها نیروی دافعه به وجود می آید (6 و 16). در شکل 3 قسمتهای مختلف طیف مرئی با رنگهای ویژه هر ناحیه نشان داده شده است. طیف مرئی بین طول موجهای 400 تا 700 نانومتر را پوشش می دهد و با توجه به شکل 2 نواحی که در طول موج کمتر از 400 نانومتر قرار دارند مربوط به ناحیه فرابنفش می باشد.

شکل 2- طیف جذبی مرئی- فرابنفش برای نانو ذرات اکسید کادمیوم

شکل 3- قسمتهای مختلف طیف مرئی به همراه طول موج آنها و رنگهای ویژه هر ناحیه

بهینه سازی برای تدارک الکترود آنزیمی: همان طور که در شکل 4 منحنی b نشان داده شده یک جفت قله احیاء با ثبات و واضح برای انتقال مستقیم الکترون از آنزیم گلوکز اکسیداز  بر روی ولتاموگرام چرخه ای الکترود (نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز) در محلول بافر فسفات 1/0 مولار با  pH برابر 7، مشاهده می شود. پتانسیلهای قله های اکسید و احیاء به ترتیب در 310- و  365- میلی ولت در 50 میلی ولت برثانیه بودند. هیچ قله  قابل مشاهده ای در الکترود ( الکترود خمیر کربن/ آنزیم گلوکز اکسیداز) نبود (شکل4 منحنی a). سپس از پتانسیلهای اکسید و احیاء، پتانسیل معادل فرآیند احیای محاسبه شده که در اینجا برای آنزیم گلوکز اکسیداز برابر با 337- میلی ولت می باشد. طریقه محاسبه بدین صورت است که از پتانسیلهای مذکور میانگین گرفته می شود. پتانسیل مشاهده شده در الکترود برهنه ( اصلاح نشده با نانوذرات) هیچ نوع قله کاتدی و آندی را نشان نداد (شکل4 منحنی a). این موضوع بیانگر این واقعیت است که نانوذرات اکسید کادمیوم به عنوان تسهیل کننده انتقال الکترون از گونه احیاء به سطح الکترود و برعکس عمل می کند. این نتایج با کارهای قبلی که نقش نانو ذرات را برای تسهیل الکترون نشان دادند، مطابقت دارد (7). در شکل 4 (b) نشان داده شده است که ذرات اکسید کادمیوم در سطح نانو می تواند یک نقش کلیدی را در مشاهده پاسخ ولتاموگرام چرخه ای آنزیم گلوکزاکسیداز نشان دهد. در نانوذرات نسبت سطح به حجم خیلی زیاد است و این موضوع واکنش پذیری نانوذرات را افزایش می دهد. دراین تحقیق نیز نانو ذرات اکسید کادمیوم به علت داشتن خواص ویژه در سطح نانو،  اثر بزرگی را در تبادل الکترون بین گلوکزاکسیداز و الکترود خمیر کربن بازی می کند (15).

شکل 4- ولتاموگرامهای چرخه ای a ( الکترود خمیر کربن-نانوذرات کادمیوم  b ) الکترود خمیر کربن-نانوذرات اکسید کادمیوم-آنزیم گلوکز اکسیداز در محلول بافر فسفات 1/0 مولار ، PH برابر 7 و سرعت روبش 50 میلی ولت برثانیه می باشد.

الکتروشیمی جذب سطحی گلوکز اکسیداز  بر روی الکترود اصلاح شده با نانو ذرات اکسید کادمیوم: در مطالعه بعدی خصوصیات انتقال الکترون آنزیم گلوکز اکسیداز روی الکترود خمیر کربن اصلاح شده با نانو اکسید کادمیوم بررسی گردید و اثر سرعتهای روبشی روی ولتاموگرامهای چرخه ای این آنزیم مطالعه شد. در شکل5 (b & a) یک وابستگی خطی بین جریانهای قله کاتدی و آندی آنزیم گلوکز اکسیداز با سرعت روبش مشاهده می شود و جریانهای قله احیاء به طور خطی با سرعت روبش افزایش می یابد. ضریب همبستگی برای پیک کاتدی برابر با 998/0 و برای پیک آندی برابر با 993/0 می باشد. این پدیده به این مطلب اشاره دارد که فرآیند احیاء تحت کنترل جذب گونه احیاء روی سطح الکترود می باشد و مبین تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز به طور پایدار روی سطح الکترود می باشد. در شکل 5 (a) با توجه به عدد صفر در محور عمودی، قله هایی که در نواحی بیشتر از صفر قرار دارند، قله های اکسایشی هستند و قله هایی که در نواحی کمتر از صفر قرار دارند، قله های کاهشی می باشند( البته این گفته فقط مختص این شکل می باشد). و این قله ها در سرعتهای روبش مختلف رسم شده است. کم ارتفاع ترین قله در کمترین سرعت روبش و پر ارتفاع ترین قله در بیشترین سرعت روبش ثبت شده است. در شکل 5 قسمت (b) نمودار خطی اکسایش و احیاء مشخص شده است.

در محدوده سرعت روبش کمتر از 100 میلی ولت بر ثانیه سینتیک انتقال مستقیم الکترون با استفاده از مدل لاویرون (1979) تشریح شد. نمودار پتانسیل پیک کاتدی در مقابل لگاریتم سرعت روبش ضریب انتقال بار الکتریکی α برابر 68/0 را می دهد. تفکیک قله به قله در سرعتهای 10،20، 40، 70 و100 میلی ولت بر ثانیه به ترتیب 70، 75، 82، 88 و 95 میلی ولت بود. ملاحظه مقدار شاخص α و تفکیک قله به قله کمتر از100 میلی ولت، ثابت سرعت انتقال الکترون(k_s) طبق فرمول k_s= mnFv/RT در جایی که m یک پارامتری وابسته به تفکیک قله به قله است، برابر(9/38) برثانیه برآورد شد.

شکل 5- قسمت(a) ولتاموگرامهای چرخه ای(نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز)در سرعتهای روبش 50، 100، 200، 300، 400، 600، 800 و 1000 میلی ولت برثانیه (از کم ارتفاع ترین قله تا پر ارتفاع ترین قله)، و قسمت (b) نمودارهای رسم شده با استفاده از نرم افزار اکسل و بر اساس قسمت(a) می باشد. این آزمایش در محلول بافر فسفات1/0 مولار و PH برابر 7 انجام شد.

وابستگی انتقال الکترون مستقیم گلوکز اکسیداز به  pH محلول: در مطالعه بعدی مشاهده شد که تغییرات به وجود آمده در پتانسیلهای قله ولتاموگرام چرخه ای و جریانها به وسیله pH، در محدوده  pHبین 5 تا 7 برگشت پذیر بودند، یعنی اگر الکترود از یک محلول با مقادیر مختلف pH، به محلول اولیه منتقل شود ولتاموگرام چرخه ای یکسان به دست می آید. افزایش در  pHمحلول باعث تغییر مکان در پتانسیلهای قله های کاتدی و آندی گردید. نمودار پتانسیل معادل در مقابل pH (از 4 تا 11) یک خط به وجود می آورد با شیبی برابر 44- میلی ولت بر  pHکه این هم نزدیک به مقدار مورد انتظار 58- میلی ولت برpH بود، که حکایت از این موضوع دارد که 2 پروتون و 2 الکترون در فرآیند انتقال الکترون حضور داشتند. کاهش برگشت ناپذیر در جریان پیک در 4pH=   ناشی از دناتوره شدن پروتئین است که این موضوع هم ناشی از جدایی گروه FAD  در این محدوده ازpH  می باشد، در ضمن لازم به توضیح است که FAD یک کوفاکتور احیاء می باشد و در واکنشهای مهمی در متابولیسم نقش دارد (11). نمودار وقایع مذکور در شکل 6 نمایش داده شده است.  

الکتروکاتالیز اکسیژن حل شده در جهت انتقال الکترون گلوکز اکسیداز جذب شده در سطح: در شکل 7 ولتاموگرام چرخه ای برای انتقال مستقیم الکترون از آنزیم گلوکز اکسیداز  در حضور اکسیژن محلول به صورت چشمگیر تغییر می کند و یک افزایش جریان قله احیاء و کاهش جریان قله اکسایش (منحنی b) مشاهده می شود و به طور کلی یک پاسخ جریان بزرگ در پتانسیل  5/0 - ولت رخ می دهد.

شکل 6- وابستگی پتانسیل معادل و pH محلول برای الکترود اصلاح شده در محلول بافر فسفات ( سرعت روبش 100 میلی ولت بر ثانیه)

تفاوت در منحنی a و منحنی b نشان دهنده این است که گلوکز اکسیداز جذب شده بر روی الکترود، احیای اکسیژن محلول را کاتالیز کرده و باعث یک افزایش چشمگیر در جریان قله احیاء می شود. در فرمولهای 1 و 2 به ترتیب واکنش احیاء و اکسایش رخ داده است. 

شکل 7- ولتاموگرامهای چرخه ای ازGOD/Au/CPE  در محلول بافر فسفات 1/0 مولار و در PH  برابر 7 در غیاب (a) و در حضور اکسیژن محلول (b) در سرعت روبش 50 میلی ولت بر ثانیه

واکنش اول برای آنزیم گلوکز اکسیداز و فلاوین آدنین دی نوکلئوتید احیاء است چون واکنش دهنده ها، الکترون و هیدروژن جذب کرده اند و واکنش دوم برای آنزیم گلوکز اکسیداز و فلاوین آدنین دی نوکلئوتید اکسایش است، چون واکنش دهنده ها اکسیژن جذب کرده و هیدروژن را از دست داده اند.

GOD (FAD) + 2e^- + 2H⁺↔ GOD (FADH₂)                                           (1)

GOD (FADH₂) + O₂→ GOD (FAD) + H₂O₂                                                               (2)

اثر گلوکز بر روی فرایند الکترو کاتالیتیک گلوکز در محلول اشباع از اکسیژن و تعیین غلظت آن: به محض اضافه کردن بتا-د(+)گلوکز به محلول بافر فسفات اشباع شده از هوا، پاسخ جریان احیای (نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز) کاهش یافت (شکل8). این کاهش با اضافه کردن مجدد بتا-د(+)گلوکز افزایش یافت. با توجه به اینکه بتا-د(+)گلوکز سوبسترای گلوکز اکسیداز است و حضور آن باعث انجام یک واکنش آنزیمی برطبق معادله 3 خواهد شد و غلظت شکل اکسید شده گلوکز اکسیداز بر روی سطح الکترود را کاهش می دهد.  

 (3)    (FADH₂)           گلوکز اکسیداز +گلوکونولاکتون  (FAD)→گلوکز اکسیداز+گلوکز  

بنابراین اضافه کردن گلوکز انجام واکنش الکترو کاتالیتیک را مهار کرده و منجر به کاهش جریان احیا می شود. ولتاموگرامهای چرخه ای (نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز) با افزودن متوالی بتا-د(+)گلوکز به محلول بافر فسفات 1/0 مولار اشباع شده از هوا و کاهش یافتن جریان احیاء ( از بالا (a) به پایین(f) کاهش یافته) در شکل 8 (a) نشان داده شده اند. قسمت (b) شکل 8 منحنی شیب خطی مربوط به   محدوده پاسخ خطی حسگر به غلظت بتا-د(+) گلوکز می باشد که از 20 تا 360 میکرومولار با ضریب هبستگی برابر 994/ 0 محاسبه شده و حد آشکار سازی در حالتی که نسبت سیگنال واقعی به سیگنال ناخواسته 3 بود، 10 میکرومولار اندازه گیری شد.

پایداری حسگر  گلوکز اکسیداز: برای تعیین پایداری حسگر طراحی شده، الکترود آنزیمی در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 10 روز قرار داده شد، و پس از این مدت زمان، حسگر 96 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. همچنین این حسگر  توانست یک جریان دائمی را وقتی که 150 چرخه پی در پی در حضور گلوکز طی شود، حفظ کند. این حسگر در صورت قطره قطره ریختن دوباره محلول گلوکز اکسیداز  به سطح آن، بعد از اینکه نوک الکترود با ملایمت روی یک کاغذ تمیز و سپس در یک سطح شیشه ای صاف برای تولید یک سطح یکنواخت و مسطح مالیده شود، قابل تولید مجدد است. پاسخ جریان سطح جدید درغلظت 2/0 میلی مولار بتا-د(+)-گلوکز مورد آزمایش قرار گرفت. انحراف معیار نسبی برای هفت بار متوالی تجدید کردن 9/5 درصد بود. بنابراین این روش سریع، آسان، خیلی با اهمیت و تکرار- پذیر برای حذف سطح جدا شده از غشای گلوکز اکسیداز  محسوب می شود. در ضمن این حسگر، قابلیت ساخت مجدد شش الکترود، ساخت مجزا و تکرار پذیری قابل قبول با انحراف معیارهای 5/6 درصد برای جریان تعیین شده در غلظت 2/0 میلی مولار بتا-د(+)-گلوکز را نشان داد.

تعیین گلوکز در نمونه سرم و اثر تداخل: تعیین گلوکز در نمونه سرم با استفاده از روش اضافه کردن نمونه استاندارد بر روی حسگر انجام شد. بعد از اینکه پاسخ جریان در 5 میلی لیتر از محلول بافر فسفات 1/0 مولار  با 7pH=  که محتوی 40 میکرو لیتر نمونه سرم بوده تعیین شد، چهار تا محلول10 میکرو لیتری بتا-د(+)-گلوکز 20 میلی مولار برای تعیین، پی در پی به سیستم اضافه شد. تمام غلظتهای گلوکز در محلولهای آشکار سازی در یک محدوده خطی از پاسخ بودند. سطح گلوکز 66/8 میلی مولار یعنی نزدیک به مقدار 74/8 میلی مولار که به وسیله دستگاه اسپکترومتری به دست آمده بود، تعیین شد.

شکل 8 (a)- ولتاموگرامهای چرخه ای(نانوذرات اکسید کادمیوم/ الکترود خمیر کربن/آنزیم گلوکز اکسیداز)در  محلول بافر فسفات 1/0 مولار  با PH: 7  محتوی اکسیژن محلول و غلظتهای 0، 20، 80، 160، 240 و 340 میکرو مولار گلوکز (ازبالابه پائین) در سرعت روبش 50 میلی ولت بر ثانیه. (b)  منحنی شیب خطی مربوط به  محدوده پاسخ خطی حسگر

اثرات تداخل به وسیله آزمایش پاسخهای 1/0 میلی مولار گلوکز در حضور اسید اوریک و اسیدآسکوربیک با افزایش تدریجی غلظت مورد تحقیق قرار گرفتند. 16/0 میلی مولار اسیداوریک و 36/0 میلی مولار اسیدآسکوربیک باعث افزایش به ترتیب 3/3 درصد و 1/5 درصد در جریان احیاء شدند. بنابراین این مواد به سختی باعث ایجاد مقدار کمی تداخل در پاسخ این حسگر زیستی شدند که بیانگر پایداری و کارآیی بالای حسگر طراحی شده می باشد.

نتیجه گیری

حسگر زیستی طراحی شده برای اندازه گیری غلظت گلوکز در محدوده خطی از 20 تا 360 میکرومولار ارائه شده است. در طراحی این حسگر از الکترود خمیرکربن، نانوذرات اکسید کادمیوم و آنزیم گلوکز اکسیداز استفاده شد. داده های به دست آمده از مطالعه پراش اشعه ایکس نشان داد که اندازه نانوذرات تهیه شده اکسید کادمیوم 43 نانومتر بود. نقش مؤثر نانوذرات در طراحی حسگرهای زیستی، افزایش سرعت انتقال الکترون بین گونه احیاء و اکسایش می باشد. در نهایت باید ذکر کرد که حسگر طراحی شده پایداری بسیار بالا و مقاومت زیاد در مقابل عوامل تداخلگر را در محیط آزمایشگاهی نشان داد. و در صورت تجاری سازی می تواند کاربردهای پزشکی و صنعتی زیادی داشته باشد.