بررسی نقش هورمون GnRH در مراحل مختلف تکوین آزمایشگاهی رویان گاو

رحیم طایفه, آیدین; حیدری, فرید; قراگوزلو, فرامرز; میر شکرایی, پژمان; فرخی, ناصر; نیری فسایی, بهار; خضری, جعفر

بررسی نقش هورمون GnRH در مراحل مختلف تکوین آزمایشگاهی رویان گاو

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

¹ تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، مرکز ملی موش تراریخت

² تهران،پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری،گروه بیوتکنولوژی حیوانات

³ تهران،دانشگاه تهران،دانشکده دامپزشکی،گروه علوم بالینی

⁴ شهرکرد،دانشگاه شهرکرد،دانشکده دامپزشکی،گروه علوم بالینی

⁵ شاهرود،دانشگاه شاهرود،دانشکده کشاورزی،گروه زراعت واصلاح نباتات

⁶ تهران،دانشگاه تهران،دانشکده دامپزشکی،گروه میکروبیولوژی

چکیده

تاثیر هورمون GnRH در تنظیم و کنترل تولید مثل در حیوان ماده و نر در مطالعات کلینیکی بخوبی نشان داده شده است ولی با توجه به نقش بسیار مهم این هورمون در سیستم تناسلی حیوان، مطالعات اندکی در مورد اثر آن روی فرآیند فولیکولوژنز ، بلوغ تخمک ، لقاح تخمک و اسپرم و تکامل رویان صورت گرفته است. هدف از این تحقیق بررسی تاثیر مقادیر مختلف این هورمون در فرآیند لقاح و تکامل رویان بوده است. در این تحقیق تعداد 1091 عدد تخمک استحصال شده به روش آسپیراسیون ، به تفکیک داخل محیط های لقاح و کشت جنین حاوی غلظت های 800 ، 1000 و 1500 نانوگرم GnRH به ازای هر میلی لیتر محیط کشت قرار گرفته و با گروه شاهد مقایسه شدند. در آزمایش اول و دوم بر اساس آنالیز میکروسکوپی از نظر ظاهری افزایش میزان تقسیم و بلاستوسیست در گروه های تیمار(خصوصا در گروه های حاوی مقادیر 800 و 1000 نانوگرم GnRH به ازای هر میلی لیتر محیط کشت)نسبت به گروه شاهد مشاهده شد ولی از نظر آماری تفاوت معنی دار بین گروه های تیمار و شاهد مشاهده نشد و همچنین افزایش قابل ملاحظه در تعداد کل سلول ها و توده سلولی خارجی در گروه های تیمار نسبت به گروه شاهد مشاهده شد(0.05>p) .

کلیدواژه‌ها

20.1001.1.23832738.1393.27.2.6.6

عنوان مقاله [English]

Gonadotropin-Releasing Hormone efficacy on different developmental stages of embryo in bovine

نویسندگان [English]

Idin Rahim Tayefeh ¹
Farid Heidari ²
Faramarz Gharagozlo ³
Pejman Mirshokraei ⁴
Naser Farrokhi ⁵
Bahar Nayeri Fasaei ⁶
Jafar Khezri ²

¹ National Center of Transgenic Mice, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology(NIGEB), Tehran, I.R. of Iran

² National Center of Transgenic Mice, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology(NIGEB), Tehran, I.R. of Iran

³ Clinical Sciences Dept., Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, I.R. of Iran

⁴ Clinical Sciences Dept., School of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, I.R. of Iran

⁵ Agronomy and Plant Breeding Dept., Faculty of Agriculture, Shahrood University of Technology, Shahrood, I.R. of Iran

⁶ Microbiology Dept., Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, I.R. of Iran

چکیده [English]

In vitro embryo production(IVEP) has been used for both research and production purposes in cattle. Through analysis of IVEP, detailed mechanisms involved in natural embryo production can be revealed and further the embryo transfer techniques and transgenesis can be facilitated. Although Gonadotropin-Releasing Hormone effects in regulating and controlling the animal reproduction in clinical studies have been well-documented, studies considering the effects of topical process, folliculogenesis, oocyte maturation, fertilization and embryo development are almost lacking. In this study, The effects of different concentrations of Gonadotropin-Releasing Hormone on the process of fertilization and embryo development was evaluated.Collected oocytes (1091 cells) placed in in vitro fertilization media and in vitro culture media, supplemented by 0.8, 1 and 1.5 µg/ml of GnRH. Based on microscopic analysis, The cleavage rate and blastocyst rate increased in the in vitro fertilization media and in vitro culture media containing of Gonadotropin-Releasing Hormone but this increased was not statistically. Moreover, by incorporating of GnRH to in vitro culture media, the number of trophectoderm and total cells were increased (p<0.05) .

کلیدواژه‌ها [English]

GnRH
IVF
IVC
Cleavage rate
Blastocyst rate

اصل مقاله

بررسی نقش هورمون GnRH در مراحل مختلف تکوین آزمایشگاهی رویان گاو

آیدین رحیم طایفه¹، فرید حیدری^2*، فرامرز قراگزلو³، پژمان میرشکرایی ⁴، ناصر فرخی⁵، بهار نیری فسایی⁶ و جعفر خضری²

¹تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، مرکز ملی موش تراریخت

²تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی حیوانات

³تهران، دانشگاه تهران، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم بالینی

⁴مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، گروه علوم درمانگاهی

⁵شاهرود، دانشگاه شاهرود، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات

⁶تهران، دانشگاه تهران، دانشکده دامپزشکی، گروه میکروبیولوژی

تاریخ دریافت: 22/6/90 تاریخ پذیرش: 12/2/91

چکیده

تأثیر هورمون GnRH در تنظیم و کنترل تولید مثل در حیوان ماده و نر در مطالعات کلینیکی به خوبی نشان داده شده است ولی با توجه به نقش بسیار مهم این هورمون در سیستم تناسلی حیوان، مطالعات اندکی در مورد اثر آن روی فرآیند فولیکولوژنز ، بلوغ تخمک ، لقاح تخمک و اسپرم و تکامل رویان صورت گرفته است. هدف از این تحقیق بررسی تأثیر مقادیر مختلف این هورمون در فرآیند لقاح و تکامل رویان بوده است. در این تحقیق تعداد 1091 عدد تخمک استحصال شده به روش آسپیراسیون ، به تفکیک داخل محیطهای لقاح و کشت جنین حاوی غلظتهای 800 ، 1000 و 1500 نانوگرم GnRH به ازای هر میلی لیتر محیط کشت قرار گرفته و با گروه شاهد مقایسه شدند. در آزمایش اول و دوم بر اساس آنالیز میکروسکوپی از نظر ظاهری افزایش میزان تقسیم و بلاستوسیست در گروههای تیمار(خصوصاً در گروههای حاوی مقادیر 800 و 1000 نانوگرم GnRH به ازای هر میلی لیتر محیط کشت)نسبت به گروه شاهد مشاهده شد ولی از نظر آماری تفاوت معنی دار بین گروههای تیمار و شاهد مشاهده نشد و همچنین افزایش قابل ملاحظه در تعداد کل سلولها و توده سلولی خارجیدر گروههای تیمار نسبت به گروه شاهد مشاهده شد(05/0>p) .

واژه های کلیدی : هورمون GnRH ، لقاح آزمازشگاهی، کشت آزمایشگاهی، میزان تقسیم زیگوت، میزان بلاستوسیست.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144580314 ، پست الکترونیکی: heidari@nigeb.ac.ir

مقدمه

قابلیت تولید و نگهداری رویان در بسیاری از گونه های حیوانی از جمله اسب ، گاو ، گوسفند و بز مورد تحقیق و بررسی قرار گرفته است . با توجه به پیشرفتهای فراوانی که در این زمینه حاصل شده است به نظر می رسد در آینده از این تکنیک به منظور تولید کنترل شده و آسان رویانها، تسریع در بهبود ژنتیکی گله ها، ذخیره منابع ژنتیکی و ایجاد خلوص نژادی استفاده شود .

آزمایشگاههای کمی در جهان وجود دارند که قادر به تولید رویان جهت انتقال به حیوان باشند ولی با عنایت به مزایای فراوان تولید آزمایشگاهی رویان از جمله کاهش فاصله نسلها و استفاده بهینه از دامهای برتر، محققین زیادی جهت بهبود راندمان تولید، نگهداری و انتقال رویان در تلاشند (5 و 20). مطالعات اخیر نشان داده است که میزان آبستنی متعاقب انتقال رویانهای تولید شده داخل آزمایشگاه به رحم حیوان در مقایسه با رویانهای تولید شده در بدن حیوان کمتر است ، همچنین این رویانها نسبت به انجماد حساس ترند(12).

محققین نشان داده اند که تغییر در اجزای سیستم کشت می تواند باعث بهبود زنده مانی رویانهای منجمد شده و میزان آبستنی پس از انتقال به رحم حیوان شود. در این میان می توان به افزودن برخی مواد به محیط کشت از جمله فاکتور رشد اپیدرمی و فاکتور رشد شبه انسولین اشاره کرد(1 و 28).

هورمون GnRH دکاپپتیدی به وزن مولکولی 1183 دالتون ، حاوی 10 اسید آمینه و نیمه عمر 4 تا 7 دقیقه است و به عنوان مهم ترین هورمون تولید مثلی حیوان مطرح است (2). در ابتدا این هورمون به عنوان هورمون هیپوتالاموسی تحریک کننده هیپوفیز برای آزاد سازی هورمون LH شناسایی شد و به این دلیل نام هورمون LH-RH به آن داده شد، سپس با تشخیص خاصیت این هورمون در آزاد کردن هورمون FSH ، نام هورمون GnRH برای آن برگزیده شد (6).

هورمون GnRH علاوه بر عملکرد اصلی در تنظیم فعالیتهای تولید مثلی، روی فرآیندهای تولید رویان نیز به صورت موضعی نقش دارد (17) . در چندین گونه پستاندار مقادیری از هورمون GnRH فرا هیپوتالاموسی در بافتهایی نظیر تخمدان ، جفت ، اویداکت و بیضه شناسایی شده است که همانند هورمون GnRH هیپوتالاموسی است(13)، همچنین این هورمون در سایر بافتها به صورت اتوکرین و پاراکرین عمل کرده و فعالیتهای استروئیدوژنز را کنترل می کند و در مرگ سلولی نیز نقش دارد(2) .

هدف از این تحقیق با توجه به موارد ذکر شده ، بهبود راندمان تولید ، نگهداری و انتقال رویانها جهت افزایش میزان آبستنی متعاقب انتقال رویانهای تولید شده داخل آزمایشگاه به رحم حیوان بوده است. همچنین با توجه به نقش اساسی میزان موفقیت در تولید آزمایشگاهی رویان بر موفقیت روی سایر تکنیکهای تولید مثلی از جمله همانند سازی و تولید حیوانات تراریخت ، می توان نتایج حاصل از این تحقیق را در جهت بهبود راندمان این تکنیکها به کار برد.

مواد و روشها

جمع آوری و بلوغ تخمک: پس از کشتار حیوان، تخمدانها از بافتهای اضافی جدا و داخل فلاسک حاوی سرم فیزیولوژی استریل 30 درجه سانتی گراد و آنتی بیوتیک (پنی سیلین100 واحد در میلی لیتر و استرپتومایسین100 میلی گرم در میلی لیتر) به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از شستشوی تخمدانها (حداقل 4 بار با سرم فیزیولوژی استریل حاوی آنتی بیوتیک) ، تخمکها از فولیکولهای 2 تا 8 میلی متر استحصال و داخل تیوب 50 میلی لیتر حاوی محیط آسپیراسیون ریخته شدند. سپس رسوب ایجاد شده داخل تیوب ، داخل پلیت خط کشی شده ریخته شد و تخمک ها زیر استریو میکروسکوپ جمع آوری و داخل محیط شستشو (محیط آسپیراسیون فاقد هپارین)، تخمکهای با کیفیت انتخاب شدند (تخمکهای حاوی حداقل 4 لایه سلول کومولوس، سیتوپلاسم یکنواخت و رنگ قهوه ای تیره) و در دسته های 10تایی در قطرات 50 میکرو لیتر از محیط بلوغ منتقل شدند و به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور 37 درجه دارای 5 درصد دی اکسید کربن قرار گرفتند.

محیط آسپیراسیون: M199 HEPES (Gibco 12340030)+ BSA(Sigma A-7030) + 4 میلی گرم به ازای هر میلی لیتر Heparin(Sigma H-8514)+ 2 میکرو گرم به ازای هر میلی لیتر Gentamicine(Sigma G-1397) 1 میکرو گرم به ازای هر میلی لیتر

محیط بلوغ تخمک: M199 bicarbonate (Gibco 11043023) + FCS 10% (Sigma F-2442)+ Na -Pyruvate (Sigma P-3662)20 میکرو گرم به ازای هر میلی لیتر +E2(Sigma E-4389) 1 میکرو گرم به ازای هر میلی لیتر +EGF(Sigma E-4127) + 100 نانو گرم به ازای هر میلی لیتر Gentamicin(Sigma G-1397) 1 میکرو گرم به ازای هر میلی لیتر

لقاح: قبل از لقاح آزمایشگاهی پایوت اسپرم داخل آب 30 درجه قرار گرفت ، پس از گذشت 30 تا 60 ثانیه محتوای پایوت داخل تیوب حاوی 5 میلی لیتر محیط شستشوی اسپرم (Sperm TALP) ریخته و به مدت 10 دقیقه در rpm1000 سانتریفیوژ شد. پس از حذف قسمت بالایی رسوب ، به آرامی 2 میلی لیتر محیط شستشوی اسپرم روی رسوب ریخته شد و با زاویه 45 درجه داخل انکوباتور قرار گرفت و پس از گذشت 1 ساعت 1 میلی لیتر از سطح محیط به داخل میکروتیوب منتقل شد.

شمارش اسپرم: رقت 1/0 برای شمارش اسپرم تهیه شد و حدود 10 میکرو لیتر از آن بین لامل و لام هموسایتومتر قرار گرفت و سپس اسپرمها در 4 خانه کناری و خانه مرکزی از مربع مرکزی لام زیر میکروسکوپ شمرده شدند.

طبق فرمول زیر غلظت اسپرم محاسبه شد :

N^* x D^* x 50000 = تعداد اسپرم به ازای هر میلی لیتر

*N = تعداد اسپرم شمرده شده در 5 خانه

*D = فاکتور رقت (10)

رقت 4 میلیون اسپرم به ازای هر میلی لیتر محیط تهیه و5 میکرو لیتر از آن به محیط لقاح افزوده شد.

تخمکهای بالغ شده (شکل 1) پس از 3 بار شستشو داخل محیط شستشو (HEPES TALP) ، در دسته های 5 تایی داخل قطرات 50 میکرولیتر از محیط لقاح (Fert-TALP) منتقل شدند و به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور 39 درجه و دارای 5% دی اکسید کربن قرار گرفتند.

شکل1- تخمکهای بالغ شده پس از گذشت 24ساعت داخل محیط بلوغ

کشت رویان: زیگوتها به مدت 2 دقیقه داخل محیط شستشو (HEPES SOF) پیپتاژ شدند. پس از 4 بار شستشو، رویانها در دسته های 10 تا 30 تایی به محیط کشت رویان (SOF) منتقل شدند و داخل انکوباتور 37 درجه و دارای 5 درصد دی اکسید کربن قرار گرفتند. سپس محیط کشت رویانها 2بار با فاصله 72 ساعت تعویض شد.

آزمایش شماره 1 : در این آزمایش غلظتهای 800، 1000 و 1500 نانو گرم در میلی لیتر هورمون (Sigma L-9761) GnRH داخل محیط لقاح افزوده شدند و اثر آنها بر اساس آنالیز میکروسکوپی بعد از 6 تکرار روی میزان تقسیم زیگوت پس از گذشت 48 ساعت از لقاح (شکل2) بررسی شد.

شکل2- زیگوتهای تقسیم شده پس از گذشت 72 ساعت از لقاح داخل محیط کشت

آزمایش شماره 2 : در این آزمایش غلظتهای 800، 1000 و 1500 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH داخل محیط کشت رویان افزوده شدند و اثر آنها بر اساس آنالیز میکروسکوپی پس از 6 تکرار بر میزان بلاستوسیست (شکل3) و کیفیت رویانها (با استفاده از رنگ آمیزی افتراقی پروپیدیوم آیداید و هقس) بررسی شد.

شکل3- بلاستوسیست های تولید شده پس از گذشت 8 روز از لقاح داخل محیط کشت

رنگ آمیزی افتراقی توسط رنگهای پروپیدیوم آیداید و هقس: بلاستوسیست های تولید شده 20 ثانیه داخل محیط کشت حاوی 5/0 درصد تریتون و رنگ پروپیدیوم آیداید (50 میکروگرم در میلی لیتر محیط کشت)قرار گرفتند. سپس داخل اتانول 100 درصد حاوی رنگ هقس(25 میکرو گرم در میلی لیتر محیط کشت) روی یخ منتقل شدند. پس از 30 دقیقه بلاستوسیست ها روی لام ثابت و با میکروسکوپ فلورسنت ارزیابی شدند (رنگ صورتی معرف توده سلولی خارجی و رنگ آبی معرف توده سلولی داخلی ) (شکل4) (9).

شکل4- بلاستوسیست رنگ آمیزی شده توسط رنگ پروپیدیوم آیداید و هقس(سلولهای TE صورتی رنگ و ICM آبی رنگ)

طراحی آزمایش و آنالیز آماری: داده های حاصل از نتایج آزمایش با نرم افزار SPSS( ver.14) آنالیز شدند. در مورد شمارش سلولی ابتدا آزمون Normality انجام شد سپس جهت انجام آنالیز واریانس میانگین گروهها از آزمون One way ANOVA و از آزمون تکمیلی ( Post Hoc test) Fisher LSD جهت مقایسه بین دو گروه استفاده شد و در مورد بررسی تعداد رویانها از آزمون مربع کای استفاده شد (0.05>p).

نتایج

آزمایش اول : تعداد 548 عدد تخمک در 6 تکرار داخل محیط لقاح حاوی غلظتهای 0 ، 800 ، 1000 و 1500 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH قرار گرفت و بر اساس آنالیز میکروسکوپی تفاوت معنی داری بین گروهها حاصل نشد ولی به صورت مشاهده ای افزایش روی میزان تقسیم در گروههای 800 و 1000 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد (جدول 1).

جدول1- تأثیر غلظت های مختلف هورمون GnRH افزوده شده به محیط لقاح روی میزان تقسیم

غلظت هورمون GnRH	تعداد تخمک	تعداد زیگوت های تقسیم شده	میزان تقسیم
0 نانوگرم در میلی لیتر	134	84	62.4 %
800نانوگرم در میلی لیتر	140	97	^ns 68.1 %
1000نانوگرم در میلی لیتر	143	104	^ns 72.1 %
1500نانوگرم در میلی لیتر	131	86	^ns 65 %

* بین میانگین تیمارهای 800 ،1000 و 1500 نانوگرم در میلی لیتر هورمون GnRH با نمونه شاهد تفاوت معنی داری وجود ندارد(Non significance). * تمام آزمایشات برای گروههای آزمایشی در 6 تکرار انجام شده است.

آزمایش دوم : تعداد 543 عدد تخمک در 6 تکرار داخل محیط کشت حاوی غلظتهای 0 ، 800 ، 1000 و 1500 نانو گرم در میلی لیتر GnRH قرار گرفت و بر اساس آنالیز میکروسکوپی تفاوت معنی داری بین گروهها حاصل نشد ولی به صورت مشاهده ای افزایش روی میزان بلاستوسیست در گروههای 800 و 1000 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد(جدول 2).

جدول2- تأثیر غلظتهای مختلف هورمون GnRH افزوده شده به محیط کشت روی میزان بلاستوسیست

غلظت هورمون GnRH	تعداد تخمک	تعداد بلاستوسیست	میزان بلاستوسیست
0 نانوگرم در میلی لیتر	135	27	19.72%
800 نانوگرم در میلی لیتر	137	34	^ns 24.48%
1000 نانوگرم در میلی لیتر	131	33	^ns 24.71%
1500 نانوگرم در میلی لیتر	140	26	^ns 18.23%

* بین میانگین تیمارهای 800 ،1000 و 1500 نانوگرم در میلی لیتر هورمون GnRH با نمونه شاهد تفاوت معنی داری وجود ندارد(Non significance).

* تمام آزمایشات برای گروههای آزمایشی در 6 تکرار انجام شده است.

در مورد کیفیت رویانهای تولید شده در محیطهای کشت حاوی و فاقد غلظتهای مختلف هورمون GnRH تفاوت قابل ملاحظه ای در تعداد کل سلولها و توده سلولی خارجی بین گروههای تیمار و شاهد مشاهده شد(جدول 3).

جدول3-تأثیر غلظتهای مختلف هورمون GnRH افزوده شده به محیط کشت روی کیفیت رویانها

غلظت هورمون GnRH	تعداد بلاستوسیست	تعداد ICM±S.E	تعداد TE±S.E	تعداد کل سلولها±S.E	نسبت ICM به TE±S.E
0 نانوگرم در میلی لیتر	18	1.5 ±48.9	2.1±84.6	2.5±133.4	0.03±0.59
800 نانوگرم در میلی لیتر	27	1.1±46	^*1.5±99.1	^*1.8±145.1	0.01±0.47
1000 نانوگرم در میلی لیتر	21	1.6±45.5	^*1.2±97.2	^*2.2±142.7	0.01±0.47
1500 نانوگرم در میلی لیتر	19	1.3±46.1	^*1.5±96.7	^*1.9±142.7	0.02±0.48

* بین میانگین تیمارهای 800 ،1000 و 1500 نانوگرم در میلی لیتر هورمون GnRH با نونه شاهد در سطح 95 درصد تفاوت معنی داری از نظر تعداد توده سلولی خارجی و کل سلولها وجود دارد (0.05>p). * تمام آزمایشات برای گروههای آزمایشی در 6 تکرار انجام شده است.

بحث

ترکیبات مختلفی جهت افزایش میزان بلوغ تخمک و تکامل رویانهای حیوانات مختلف به محیطهای بلوغ، لقاح و کشت افزوده شده است. در این میان می توان به تأثیرEGF و VEGF روی بلوغ تخمک ، تقسیم و تکامل رویان (1 و 8)، PGE و PGF روی ظرفیت پذیری اسپرم و لقاح (4)،IGF-1 روی کیفیت و تکامل رویان (22)، PDGF-α و PDGF-β روی تکامل رویانها بعد از مرحله 8 سلولی (21)، EGF و FGF بصورت همیار روی تکامل رویان (16)اشاره کرد. همچنین BST از طریق کاهش آپوپتوز سلولی (از 14 درصد به 7/2 درصد)، افزایش گلوکز، اگزوسیتوز لیپیدها، تراکم میتوکندریها (14)، انسولین از طریق افزایش نفوذ گلوکز و اسیدهای آمینه به داخل سلول روی تکامل رویان مؤثر است(18).

در سال 1994 گیرنده های هورمون GnRHدر رحم موش شناسایی شدند و نویسنده معتقد بود که این هورمون به صورت پاراکرین در دینامیسم آندومتر و لانه گزینی نقش داشته است(3). در همین سال گیرنده های این هورمون روی توده سلولی داخلی و خارجی شناسایی شدند (26). در سال 1995 میزان mRNA رسپتورهای این هورمون در مراحل مختلف تکامل رویانهای موش توسط تکنیک real-time PCR بررسی شد که میزان آن در مرحله 2 سلولی افزایش ، 2 سلولی تا مورولا کاهش ، بعد از Early Blastocyst افزایش و درمرحله Expanded Blastocyst به حداکثر میزان خود رسید(10). در سال 1996 نیز رسپتورهای این هورمون در مراحل مختلف تکامل در موش شناسایی شد و این موضوع باعث تأیید ارتباط بین رویان و لوله تناسلی از طریق هورمون GnRH شد(25و27).

در سال 2005 تأثیر آنتاگونیست های هورمون GnRH روی تکامل رویانهای موش بررسی شد که باعث کاهش تکامل رویانها شد و نویسنده علت آن را شکستن ساختار میتوکندریها، کاهش فاکتورهای رشد ضد مرگ سلولی، کاهش فاکتور رشد اپیدرمی و کاهش فاکتور رشد شبه انسولین در بلاستوسیستها مطرح کرد(15).

در سال 2006 تأثیر آگونیست های هورمون GnRH روی تکامل رویانهای موش بررسی شد که روی تکامل رویانها در کشت انفرادی مؤثر و در کشت گروهی غیر مؤثر بود و نویسنده علت غیر مؤثر بودن آن را پوشانده شدن اثرات آگونیستی هورمون GnRH توسط فاکتورهای اندوژنوس ترشح شده توسط رویانها مطرح کرد(23).

در سال 1998 هورمون GnRH و رسپتورهایش ، در زمان لانه گزینی و مراحلی از فاز لوتئال در انسان شناسایی شد(7) و برخی از محققین معتقدند که نقش این هورمون روی تکامل رویانها به واسطه افزایش هورمون hCG است(26) .

در سال 2005 نیز هورمون GnRH باعث افزایش سلولهای تروفکتودرم رویانهای خوک شد (19).

لازم به ذکر است با توجه به نقش بسیار مهم هورمون GnRH در کنترل سیکل تناسلی گاو ، تحقیقات محدودی در زمینه تأثیر این هورمون روی لقاح و تکامل رویان صورت گرفته است. در سال 1995 غلظتهای 32 ،160 و 800 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH داخل محیط لقاح افزوده شد و میزان تقسیم در گروه حاوی 800 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH به طور قابل ملاحظه ای افزایش یافت و همچنین گیرنده های این هورمون در سطح سلولهای کومولوس شناسایی شدند(10). در سال 2000 آزمایش مشابه انجام شد و تفاوت قابل ملاحظه ای بین گروههای تیمار و شاهد مشاهده نشد و همچنین گیرنده ای در سطح سلولهای کومولوس و اسپرم شناسایی نشد(24). در این تحقیق انتخاب غلظتها بر مبنای تحقیقات مشابه در سالهای 1995 و 2000 بوده است و غلظتهای بالاتر از 800 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH (800 ، 1000 و 1500) داخل محیط لقاح و کشت مورد بررسی قرار گرفته است که در آزمایش اول تفاوت معنی داری بین گروهها حاصل نشد ولی به صورت مشاهده ای افزایش روی میزان تقسیم در گروههای 800 و 1000 نانو گرم در میلی لیتر هورمون GnRH در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد.

در آزمایش دوم از نظر آماری افزایش قابل ملاحظه تعداد کل سلولها و توده سلولی خارجی بین گروههای تیمار و شاهد مشاهده شد و همچنین به صورت مشاهده ای افزایش میزان بلاستوسیست در گروههای حاوی 800 و 1000 نانوگرم در میلی لیتر GnRH در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد ولی از نظر آماری معنی دار نبود و لازم به ذکر است که تاکنون تأثیر این هورمون روی رویانهای گاو بررسی نشده و تنها تحقیقات محدودی روی موش و خوک صورت گرفته است.

نتیجه گیری و پیشنهاد

در این مطالعه هورمون GnRH به طور قابل ملاحظه ای باعث افزایش تعداد کل سلولها و توده سلولی خارجی شد و آنالیز میکروسکوپی نشان دهنده تأثیر این هورمون روی تکامل رویانها می باشد.

با توجه به تأثیر احتمالی این هورمون بر مقاومت رویانها در مقابل انجماد ، لانه گزینی و زنده مانی آنها بعد از انتقال به حیوان گیرنده نیاز به تحقیقات بیشتری در این زمینه است.

تشکر و قدردانی: بدین وسیله نگارندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از همکاری صمیمانه آقایان دکتر مرتضی دلیری، دکترمهدی شمس آرا، دکتر مجتبی دشتی زاد، مهندس احسان هاشمی، دکتر سعید امین زاده اعضای محترم هیئت علمی گروه دام و آبزیان پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ابراز می دارند.

مراجع

1-Anas,M.K.I. and Terada,T. (1999) In vitro nuclear maturation and developmental potential of bovine oocytes cultured with EGF and wortmannin, Biology of Reproduction P:179.

2-Arthur,G.H., Pearson,H., Parkinson,T. (1996) Veterinary reproduction and obstetrics , 7th edition , WB Sanders Company Limited .

3-Asirvatham,A.L., Johnson,G.A., Belden,E.L., Van Kirk,E.A., Moss,G.E., Murdoch,W.J. (1994) Immunization of mice against a synthetic N-terminal extracellular domain gonadotropin-releasing hormone receptor peptide, Am Journal Reproduction Immunology 32:95–100.

4-Baptista,M.C., Marques,C.C., Pereira,R.M., Vasques,M.I. and Horta,A.E.M. (2000) Effects of prostaglandins onbovine sperm capacitation and fertilization in vitro, Theriogenology 53: 416.

5-Bousquet,D., Twagiramungu,H., Morin,N., Brisson,C., Carboneau,G., Durocher,J.( 1999) In vitro embryoproduction in the cow: An effective alternative to the conventional embryoproduction approach, Theriogenology 51: 59–70.

6-Brebion,P., Belloc,J.P., Brioison,M., Elite,L. (1990) Ewe pretreated with a GnRH antagonist yield more usable embryos following FSH , In sixth meeting European association for embryo transfer , Lyon p:12 .

7-Casan,E.M., Raga,F., Kruessel,J.S., Wen,Y., Nezhat,C., Polan,M.L. (1998) Immunoreactive gonadotropin-releasing hormone expression in cycling human endometrium of fertil patients, Fertilization Steril 70:102–106.

8-Einspanier,R., Muller,K., Bieser,B., Kosmann,M. and Schams,D. (1999) Differential expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in bovine ovarian follicles and first effects of VEGF applied during in vitro maturation of oocytes, Journalof Reproduction and Fertility, Abstract Series 23: 7.

9-Fischer-Brown,A., Block,J., Hansen,J. (1998) Differential staining of trophectoderm and inner cell mass in combination with tunnel analysis of bovine embryos, University of Florida, Theriogenology 54: 121-126 .

10-Funston,R.N., Seidel,G.E. (1995) Gonadotropin-releasing hormone increases cleavage rates of bovine oocytes fertilized in vitro , Biology Reproduction 53:541–545 .

11-Gordon,I. (1996) Laboratory Production of Cattle Embryos , CABI publishing .

12-Greve,T., Avery,B., Callesen,H.(1993) Viability of in-vivo and in-vitro produced bovine embryos, Department of Reproduction Royal Veterinary and Agricultural University Frederiksberg C, Denmark, Reproduction in Domestic Animals 28:164-169.

13-Hsueh, A.J.W., Jones, P.B.C. (1981) Extrapituitary actions of gonadotropin releasing hormone , Endocrinology 2:437–455.

14-Izadyar,F., Colenbrander,B. and Bevers,M.M. (1996c) In vitro maturation of bovine oocytes in the presence of growth hormone accelerates nuclear maturation and promotes subsequent embryonic development, Molecular Reproduction and Development 45:372–377.

15-Kawamura,K., Fukuda,J., Kumagal,J., Shimizu, Y., Kodawa, H., Nakamura,A., Tanaka,T. (2005) Gonadotropin-Releasing Hormone I Analog Acts as an Anti-apoptotic Factor in Mouse Blastocysts , Theriogenology 57: 142-157.

16-Lee,E.S. and Fukui,Y. (1995) Effect of various growth factors in a defined culture medium on in vitro development of bovine embryos matured and fertilized in vitro, Theriogenology 44: 71–83.

17-Lindner,G.M., Wright,R.W. (1983) Bovine embryo morphology and evaluation , Theriogenology 20: 407–416.

18-Matsui,M., Takahashi,Y., Hishinuma,M. and Kanagawa,H. (1995a) Stimulatory effects of insulin on the development of bovine embryos fertilized in vitro, Journalof Veterinary Medical Science 57:331–336.

19-Nam,D.H., Lee,S.H., Kim,H.S., Lee,G.S., Jeong,Y.W., Kim,S., Kim,J.H., Kang,S.K., Lee,B.C., Hwang,W.S. (2005) The role of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and its receptor in development of porcine preimplantation embryos derived from in vitro fertilization , Theriogenology 63:190-201 .

20- Peterson,A.J., Lee, R.S-F. (2003) Improving successful pregnancies after embryotransfer, Theriogenology 59: 687–697.

21-Poole,E.M., Richardson,M.E. and Baird,M.V. (1995) The effects of EGF, IGF-I and PDGF-alpha on the ability of the bovine embryo to circumvent the 8-cell developmental block in vitro, Journal of Animal Science 73: 221.

22-Prelle,K., Boxhammer,K., Stojkovic,M. and Wolf,E. (1999b) Effects of insulin-like growth factor-I and its analogues on IGF-I binding protein gene expression in preimplantation bovine embryos, Theriogenology 51: 189.

23-Raga,F., Casan,E.M., Kruessel,J., Wen,Y., Musoles,F.B. and Polan,M.L. (2006) The Role of Gonadotropin-Releasing Hormone in Murine Preimplantation Embryonic Development, Theriogenology 58: 132-151.

24-Rota,A., Penzo,N. and Vincenti,L. (2000a) Effect of gonadotropin-releasing hormone on cleavage rate and embryo development of bovine oocytes fertilized in vitro, In: Proceedings 16th Meeting European Embryo Transfer Association, Santander p: 198 .

25- Santos,M.J., Mercader,A., Frances,A., Portoles, E., Remohi,J., Pellicer,A., Simon,C. (1996) Role of endometrial factors in regulating secretion of components of the immunoreactive human embryonic interleukin-1 system during embryonic development, Biology Reproduction 54: 563–574.

26- Seshagiri,P.B., Terasawa,E., Hearn,J.P. (1994) The secretion of gonadotropinreleasing hormone by peri-implantation embryos of the rhesus monkey, comparison with the secretion of chorionic gonadotropin, Human Reproduction 9: 1300–1307.

27- Tazuke,S.I., Guidice,L.C. (1996) Growth factors and cytokines in endometrium, embryonic development and maternal: embryonic interactions, Semin Reproduction Endocrinology 14: 231–243.