جداسازی متابولیت­های ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass

سید محمود ضابطی¹، احمد اسماعیلی^1*، حسن مداح عارفی²، فرهاد نظریان فیروزآبادی¹ و فرزانه مجیری¹ 

¹ خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

² کرج، موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال

تاریخ دریافت: 25/9/91               تاریخ پذیرش: 5/3/92 

چکیده

استخراج DNA ژنومی با کیفیت و کمیت مطلوب از نیازهای بنیادی فنهای مولکولی زیستی مختلف است. در بعضی تحقیقات به دلایل مختلفی نمونه­های گیاهی مورد مطالعه از طبیعت جمع­آوری می­شود که این گیاهان معمولاً خشبی بوده و استخراج DNA از بافت گیاهی این نمونه­ها به علت وجود کربوهیدرات­ها، ترکیبات پلی­فنلی و پروتئینها با مشکلاتی روبرو است. به ویژه آنکه این ترکیبات به شکل کمپلکس با اسیدهای نوکلئیک ترکیب می­شوند و جداسازی آنها را با مشکل مواجه می­کند. در این تحقیق DNA ژنومی از برگ گیاه آویشن به گل رفته با چهار روش Doyle and Doyle، Dellaporta،Kang and Yang  و Khanuja استخراج گردید. نتایج به­دست آمده نشان داد که روش خانوجا با اندکی تغییرات از بقیه روشها بهتر بود. در این روش استخراج، رسوب چسبناک قهوه­ای رنگی در محلول حاوی DNA به­دست آمد که در روشهای دیگر دیده نشد. بر این اساس این رسوب توسط آنالیزهای GC-Mass، IR و طیف UV مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مشخص شد که این رسوب شامل تیمول، کارواکرول، نرولیدول و بورنئول بود. در طیف GC بیشترین میزان را ماده تیمول دارا بود (65 درصد). از این ­رو روش خانوجا بهینه شده توانست متابولیت­های ثانویه عمده آویشن را جداسازی کرده و می­توان پیشنهاد نمود که این روش جهت استخراج DNA  گیاهانی که به گل رفته­اند مناسب­تر از سایر روشها می­باشد. 

واژه‌های کلیدی: آویشن، استخراج DNA، متابولیت­های ثانویه، GC-Mass، IR

* نویسنده مسئول، تلفن: 06614200191 ، پست الکترونیکی:  ismaili.a@lu.ac.ir 

مقدمه 

داروهای شیمیایی با وجود کارآیی که دارند اما دارای اثرات نامطلوب فراوانی هم هستند، این موضوع باعث شده محققین به مواد طبیعی (که دارای اثرات نامطلوب کمتری هستند) بیشتر توجه نمایند. امروزه در اکثر کشورها از گیاهان دارویی در فرآیندهای درمانی استفاده­های مختلفی می­شود (12).

آویشن یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است که در طب سنتی و مدرن کاربرد فراوان دارد (20). جنس آویشن (Thymus)، یکی از جنسهای خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است که در زیرخانواده Nepetoideae قرار دارد (19). با توجه به اهمیت این گیاه در صنایع دارویی، محققان به دنبال آن می­باشند که با استفاده از فن­آوریهای زیستی علاوه بر مطالعات پایه (از قبیل شناسایی گونه­ها و تاکسونومی)، به کاربردهای زیستی تولید داروها و مهندسی متابولیک آن بپردازند.

همانند بسیاری از فن­آوریهای دیگر، زیست­فناوری دارای مزایای زیادی می­باشد و با توجه به نیاز فراوان به این رشته، هر روز شاهد ظهور فنون جدید آزمایشگاهی یا بهبود فنون قبلی در مطالعات و پژوهشهای این رشته می توان بود. یکی از مهم ترین تکنیکهای پایه در علوم DNA نوترکیب و مهندسی ژنتیکی و سایر مطالعات ژنتیکی، استخراج DNA است و شاید بتوان گفت استخراج اسیدهای نوکلئیک اولین گام در انجام این­گونه مطالعات است (1). از آنجایی که در اکثر فنون آزمایشگاهی از تکنیک واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) برای آنالیز DNA استخراج شده استفاده می­شود و با توجه به حساسیت زیاد این سیستم به یک الگو با کیفیت و کمیت مناسب (7) نیاز به بهینه­سازی روش استخراج احساس می­شود. وجود ترکیبات بازدارنده در محلول DNA استخراج شده باعث جلوگیری از فعالیت آنزیمهای تک پلیمراز در واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) و همچنین مانع عمل آنزیمهای برشگر می­شود (9). روشهایی که نیاز به تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی نداشته باشد و با هزینه کمتری بتوان DNA قابل استفاده از لحاظ کمی و کیفی به­دست آورد، بسیار مورد اهمیت است. با وجود اینکه ایده اصلی پشت استخراج DNA خیلی پیچیده نیست، دستورالعملهای مختلف استخراج DNA برای گونه­های خاصی پیشنهاد شده است و دستورالعملهای منتشر شده لزوماً قابل استفاده برای همه گونه­ها نیست (21). مشکلی که عمدتاً در طی استخراج رخ می­دهد این است که ترکیباتی از قبیل پلی­ساکاریدها و ترکیبات فنلی به شکل کمپلکس با اسیدهای نوکلئیک باند می­شوند (23)، که تغییر در pH و ترکیب بافر استخراج توانسته است در بهبود کمیت و کیفیت DNA استخراج شده تا حدودی موثر باشد (18).

تحقیقات متعددی جهت بهینه­سازی روش استخراج صورت گرفته است به­طور مثال شلفرد و همکارانش (2002) دستورالعملهای استخراج را در سه گونه مختلف با بافتهای تازه و فریز شده مقایسه نمودند و دریافتند که بافتهای فریز شده دارای غلظت DNA بیشتری هستند (22). امام جمعه و همکاران (2006)، چهار روش استخراج DNA ژنومی را در Agaricus bisporus با هم مقایسه کردند، این محققین هر چهار روش را مناسب دانستند و پیشنهاد دادند که هر پژوهشگر براساس امکانات آزمایشگاهی دردسترس، یکی از روشها را انتخاب نماید (14). در تحقیقی دیگر جهت بهینه­سازی استخراج DNA از گیاهان دارویی که در مناطق مختلف ترکیه رشد می­کنند چهار روش مورد آزمون قرار گرفت و نتیجه گرفته شد هنگامی که از گیاهان بالغ استفاده می شود هیچ­کدام از روشها نتیجه مطلوبی را به‌دست نمی‌دهد و این به علت وجود متابولیت­های ثانویه در این نوع گیاهان می­باشد (25).

در اکثر منابعی که مورد بررسی قرار گرفت مشخص شد که استخراج از بافتهای جوان به مراتب نتایج بهتری را نسبت به وقتی که بافت پیر بوده ارائه می­دهد (10، 17 و 26)؛ اما در مواقعی محقق براساس نوع تحقیق و یا به اجبار باید از سطح طبیعت و یا مزرعه­ نمونه­­برداری کند که در این حالت اکثر گیاهان به گل رفته و متابولیت­های ثانویه زیادی در گیاه تولید شده­اند. این موضوع سبب می­شود کیفیت مطلوبی در حین استخراج DNA مشاهده نشود. بنابراین در این تحقیق به بررسی و بهینه­سازی روشی مناسب و مطلوب برای گیاه بالغ آویشن پرداخته شد تا بتوان به یک روش مناسب جهت استخراج DNA آن دست یافت و آن را به دیگر گیاهان بالغ هم تعمیم داد. در این مطالعه از چهار روش مختلف استخراج استفاده گردید. همچنین رسوبهای به­دست آمده در روشهای مختلف جهت درک بهتر از ماهیت مواد موجود در آنها مورد آنالیز فیتوشیمیایی قرار گرفت.  

مواد و روشها

مواد گیاهی: نمونه­های مورد بررسی از مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور جمع­آوری شد. نمونه­ها همه از گیاهان بالغ و به­ گل رفته انتخاب گردید. برگهای گیاهان پس از شستشو با آب مقطر توسط ازت مایع پودر و به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان منتقل و درون میکروتیوپ در دمای 80- درجه سانتی­گراد تا زمان استخراج نگهداری شد.

استخراج DNA: در این تحقیق، روشهای مختلف استخراج شامل، دویل و دویل (13)، دلاپورتا (11)، کانگ و یانگ (15) و خانوجا (17) با توجه به کمیت و کیفیت DNA مورد مقایسه قرار گرفتند. در ادامه یک روش دیگر که مشابه روش خانوجا ولی با کمی تغییرات بود هم مورد آزمون قرار گرفت. در روش خانوجای تغییریافته، تعداد دورهای سانتریفیوژ متفاوت از دستورالعمل اصلی انتخاب گردید (مرحله اول 8000 دور، مرحله دوم 10000 دور)؛ همچنین اولین رسوب DNA به­دست آمده، با الکل 80 درصد همراه با سانتریفیوژ در 1000 دور در دقیقه به مدت 3 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد شستشو داده شد و بعد از خشک کردن رسوب به جای بافرTE  با نمک بالا، در آب مقطر دو بار استریل حل گردید. از آنجا که انجام مراحل بعدی پروتکل موجب تشکیل رسوب ژلاتینی DNA شد به­گونه­ای که پس از غلظت­سنجی نمونه­ها، مقدار DNA به­دست آمده کمتر و از کیفیت مطلوبی برخوردار نبود استخراج در این مرحله به پایان رسانده شد که این کار موجب کوتاه تر شدن مدت زمان استخراج گردید. با توجه به نقش NaCl در استخراج DNA خالص (3 و 26)، در این روش علاوه بر بافر استخراج که شامل NaCl غلیظ (5 مولار) بود، در مرحله افزودن ایزوپروپانول هم مجدداً از NaCl غلیظ (5 مولار) استفاده گردید.

بررسی کمیت و کفیت DNA استخراج شده: با استفاده از الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز 8/0 درصد و مقایسه تراکم نوارهای DNA هر نمونه با تراکم نوارهای نشانگر کیفیت باند DNA هر نمونه مشخص شد. برای هر نمونه 8 میکرولیتر DNA استخراج شده با 2 میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شد و در چاهکهای ژل آگارز در شرایط بافری TAE تخلیه گردید و با اعمال ولتاژ ثابت 90 ولت  به مدت 60 دقیقه الکتروفورز گردید 

به منظور بررسی کمیت DNA استخراج شده از دستگاه بیوفتومتر استفاده گردید. در ابتدا جهت بالا بردن دقت دستگاه غلظت DNA نمونه­ها کاهش داده شد. بدین منظور غلظت نمونه­ها با نسبت 5 به 195 آب مقطر استریل تنظیم گردید و بعد از بلانک دستگاه با آب مقطر استریل، نسبت جذب 260 به 280 و غلظت DNA بر اساس نانوگرم در میکرولیتر قرائت گردید. 

آنالیز فیتوشیمیایی: در روش خانوجای تغییریافته گیاهانی که بافت پودر شده آنها خشبی­تر بودند، بلافاصله بعد از افزودن نمک در مرحله انکوبه کردن با ایزوپروپانول، در ویال حاوی محلول DNA، رسوب چسبناک قهوه­ای رنگی تشکیل می­شد که در سایر روشها مشاهده نگردید. بنابراین، این رسوب مورد بررسی قرار گرفت، تا ترکیبات موجود در آن شناسایی شوند. 

به دلیل اینکه رسوبهای قهوه­ای رنگ به دست آمده از لحاظ رنگ و نمونه مورد بررسی با هم متفاوت بودند، هر رسوب به­طور جداگانه نگهداری گردید. در ابتدا 10 رسوب مختلف از لحاظ رنگ به طور تصادفی انتخاب گردید. تست حلالیت برای آنها به وسیله 10 حلال مختلف (متانول، اتانول، دی متیل فرم آمید، پروپانول، اتر، کلروفرم، اتیل استات، تترا هیدرو فوران، تولوئن و آب مقطر) انجام شد. با وجود اینکه تمام این حلالها تا حدودی توانستند رسوب را در خود حل کنند اما جهت بررسیهای بعدی از حلال آب مقطر استفاده شد که کار با آن ساده­تر بود. بنابراین نمونه­ها با آب مقطر به حجم 25 میلی­لیتر رسانده و طیف UV آنها با استفاده از دستگاه (SHIMADZU) UV-Visible گرفته شد. سپس برای تعیین کیفی و گروههای عاملی موجود در این رسوبها، طیف IR آنها با استفاده از دستگاه (SHIMADZU) IR به دست آمد. برای این منظور ابتدا 01/0 میلی­گرم از رسوب همراه با 02/0 میلی­گرم از ماده KBR در هاون به خوبی با هم مخلوط گردید، سپس توسط دستگاه پرس به صورت قرص درآورده و از قرص حاصل طیف گرفته شد. در انتها برای تعیین نوع مواد و میزان مواد موجود در رسوب از نمونه­ها طیف GC-Mass گرفته شد. برای این کار ابتدا 001/0 میلی­گرم از رسوب را در متانول حل کرده و به میزان 2 میکرولیتر از محلول توسط سرنگهای خاص به دستگاه تزریق گردید و طیف آن به دست آمد.

نتایج و بحث

از بین روشهای مورد آزمون روش خانوجا با اندکی تغییرات نتایج بهتری را نشان داد. کیفیت DNA استخراج شده در این روش از روش­های دیگر بالاتر بود (شکل 1). این روش بهینه شده به نوعی ترکیبی چند روش متداول می­باشد. استفاده از روشهای ترکیبی می­تواند نتایج بهتری را نسبت به روشهای متداول داشته باشد (5).

شکل1- DNA ژنومی استخراج شده از گیاه آویشن به کمک روشهای متفاوت (از چپ به راست): a) روش Dellporta b) روش CTAB c) روشKang and Yang  d)روش خانوجا e) روش خانوجای تغییر یافته  M) نشانگر اندازه 1kb.

مقدار OD بین 2-8/1 بود که نشان­دهنده آن است DNA استخراجی از کیفیت و خلوص بالایی برخوردار است (جدول 1). NaCl به کار رفته در استخراج با تشکیل یون Na⁺ و اتصال با فسفات موجود در ساختمان DNA سبب می­شود که مولکولهای DNA به دور هم جمع شوند. همان­طور که در جدول 1 دیده می شود، روش خانوجای تغییر یافته، به دلیل استفاده از غلظت بالای NaCl نتایج چشمگیری از نظر کیفیت پس از غلظت­سنجی DNA نشان داد که استفاده دو مرحله­ای از نمک در تحقیقات دیگر هم نتیجه مطلوبی را ارائه داده است (16). همچنین در تحقیقات دیگر کاربرد NaCl با غلظت بالا توانست کیفیت مطلوب­تری از DNA را به دست آورد (24).

در روشDoyle and Doyle  استفاده از استات آمونیوم باعث تشکیل رسوب ژلاتینی شد که پس از غلظت­سنجی نمونه­ها، مقدار DNA به­دست آمده کمتر و میزان آلودگی بیشتر بود(13). در روش دلاپورتا به علت عدم اتصال بهینه SDS بافر استخراج با پروتئینها در نتیجه نسبت _280/260 OD پس از غلظت­سنجی بالا گزارش شد(11). در روش Kang and Yang، حتی فنل هم نتوانست نتیجه قابل قبولی بدهد و مقدار DNA کمتر از روش خانوجای تغییریافته بود (15).

جدول 1- مقایسه کمی و کیفی پنج روش استخراج DNA مورد مطالعه در این تحقیق.

همان­گونه که در شکل2 دیده می­شود، تمامی 10 نمونه، الگوی منحنی یکسانی را نشان دادند؛ این امر مبین این موضوع است که تمام نمونه­های مورد آزمون دارای ترکیبات مشابه می­باشند و تنها غلظت­ آنها متفاوت است؛ دلیل متفاوت بودن رنگ رسوبها هم همین تفاوت در غلظت­ها می­باشد.

شکل2- طیف UV از 10 نمونه تصادفی. حروف a تا k نمایانگر نمونه­ها می­باشد.

با توجه به این موضوع، تمام رسوبهای حاصل با هم مخلوط شده و در آنالیزهای بعدی از مخلوط این رسوبها استفاده گردید. طیف IR تا حدودی نشان­دهنده گروههای عاملی موجود در ماده ناشناخته می­باشد. پیکهای ظاهر شده در 1400 تا 1550 مربوط به کربنهای (C-C) آروماتیک می­باشد و پیک 1649 مربوط به گروه کربونیل EDTA می­باشد که یکی از ترکیبات اولیه بافر استخراج است (شکل 3). همچنین پیک ناحیه 2300 تا 3600 مربوط به OH فنل می­باشد و پیک ناحیه 2900 مربوط به CHهای آروماتیک است. پیکهای 3000 تا 3200 مربوط به CHهای آلیفاتیک می­باشد. پیک ظاهر شده در 1290 مربوط به CO یگانه است که ممکن است مربوط به فنل و یا EDTA باشد. با توجه به این اطلاعات، نمونه مجهول شامل بخش عظیمی از ترکیبات آروماتیکی و آلیفاتیکی می باشد.

طیف GC مشخص کننده تعداد ترکیبات پایدار در نمونه مجهول می­باشد، که هرچه میزان جذب یک پیک بیشتر باشد نشان­دهنده آن است که، آن ترکیب در نمونه مجهول درصد بیشتری دارد. همچنین هرچه پیک در زمان بازداری طولانی­تری ظاهر شود، نشان­دهنده جرم مولکولی بیشتر آن ماده است. از روی طیف GC به دست آمده مشخص شد که پنج ماده پایدار در این رسوب وجود دارند و ترتیب ظهور آنها نیز در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل3- طیف IR، مربوط به رسوب حاصل از استخراج DNA

با توجه به طیف Mass مشخص شد که اولین طیف که در دقیقه 83/3 ظهور کرده متعلق به ماده مرکاپتواتانول است که از مواد اولیه بافر استخراج می­باشد؛ دومین طیف در دقیقه 8/5 مربوط به ماده بورنئول بوده و در چرخه بیوسنتز بعد از تیمول و کارواکرول تولید می­شود (4)؛ سومین طیف در دقیقه 16/6 ماده تیمول است که یکی از متابولیت­های ثانویه عمده آویشن بوده و تحقیقات نشان داده است که اثر آرام بخشی این گیاه تا حدود زیادی بستگی به وجود این متابولیت دارد (27)؛ طیف چهارم متعلق به ماده کارواکرول است که در دقیقه 38/6 ظهور کرده این ماده خاصیت آنتی اکسیدانی دارد (8) و آخرین طیف در دقیقه 43/9 ظهور کرد که مربوط به ماده نرولیدول بود  (شکل5).

همانطور که مشاهده می­شود یکسری از مهمترین متابولیت­های ثانویه در آویشن که می­توانند مواد مزاحم در استخراج DNA از گیاهان مسن باشند، توسط روش استخراج DNA خانوجا (با اندکی تغییرات) جداسازی شده­اند؛ که این مواد در گیاهان بالغ و مسن به­وفور یافت می­شوند.

شکل4- طیف GC، مربوط به رسوب حاصل از استخراج DNA

شکل5- طیف Mass حاصل از آنالیز پیکهای مهم نمونه های GC به ترتیب زمان ظهور پیک

روشهایی که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفتند بارها در مطالعات قبلی نتایج رضایت­بخشی را نشان دادند به طور مثال کاراکوسیس (2003) توانست با روشKang and Yang ، DNA خالص و مطلوبی را استخراج کند (16)؛ همچنین اعلائی و همکاران (1385) با استفاده از روش CTAB توانستند DNA ای با کمیت و کیفیت مناسب از گیاه سیکلامن جداسازی نمایند (1). باقرزاده و همکاران (1388) با استفاده از روش خانوجا موفق به استخراج DNA خالص از گیاه دارویی آویشن شدند(2)؛ معصومی اصل وهمکاران (1388) توانستد با روش دلاپورتا جهت آنالیز PCR نمونه های با کیفیتی را استخراج کنند(6).

جدول2- مراحل دستورالعمل روش استخراج بهینه شده

اما درخصوص گیاهان بالغ که دارای متابولیت­های ثانویه زیادی هستند این روش­ها چندان کارساز نیستند که این مطلب با نتایج به­دست آمده توسط ورال (2009) که بر روی گیاهان دارویی بالغ صورت گرفته بود، مطابقت داشت (25).

بنابراین روشی که در این مطالعه بهینه گردید (جدول2)، می­تواند به عنوان یک دستورالعمل پایه برای مطالعات مختلف بر روی گیاهان دارویی مسن که دارای متابولیت­های ثانویه زیادی (به ویژه با ترکیبات مشابه این گیاه) بوده، پیشنهاد گردد.