پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

بررسی اثرات سلولی آنتی باکتریهای سولفاتیازول و سولفاستامید بر روی سلولهای سرطان سینه (رده‏ سلولی T-47D)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

26412

چکیده

داروهای ضد باکتریایی اولیه موسوم به داروهای سولفونامیدی دارای اثرات زیستی بسیاری است که موجب کاربرد گسترده‏ بالینی آن شده است. با توجه به گزارشهایی مبنی بر اثرات ضد سرطانی بعضی از اعضای این خانواده‏ دارویی، در این پژوهش اثرات سلولی سولفاتیازول و سولفاستامید، دو آنتی باکتریال از این خانواده بر رده‏ سلولی سرطان سینه T-47D بررسی گردید. علائم ریخت شناسیِ ویژه‏ آپوپتوز توسط میکروسکوپ فلوئورسنت پس از رنگ آمیزی با Annexin-PI، و نیز نتایج حاصل از مطالعات فلوسیتومتری نشان داد که درصد سلولهای آپوپتوز شده در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید در قیاس با شاهد منفی بسیار اندک می‏باشد. این موضوع علی رغم افزایش معنی‌دار میزان فعالیت آنزیم کاسپاز-3 در سلولهای تیمار شده با دارو مشاهده می گردید. بررسیهای صورت گرفته به روی نمودارهای فلوسیتومتری رسم شده با استفاده از ردیاب DAPI مؤیّد آن بود که این داروها قادر به توقف سلولها در فازهای مختلف چرخه‏ سلولی نیز نمی‏باشند. در اینجا از اثر داروی دوکسوروبیسین به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. به دنبال این یافته‏ها نشان داده شد که سدیم سولفاتیازول با کاهش سطح بیان ژنهای Akt1، Akt2 و mTOR و نیز افزایش سطح بیان PTEN ، بقای سلولی را کاهش می‏دهد اما این مکانیسم برای سدیم سولفاستامید قابل مشاهده نمی‏باشد. سازوکار اثرات ضد سرطانی سدیم سولفاستامید با توجه به افزایش سطح بیان ژنهای Atg5، Akt1، Akt2 و mTOR و نیز کاهش سطح بیان PTEN می‏تواند از طریق راه اندازی مسیر اتوفاژی بقاء و کاهش سرعت تقسیم سلولی اعمال شده باشد. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cellular Effects of Antibacterial Drugs, Sulfathiazole and Sulfacetamide, on a Breast Cancer Cell line (T-47D)

چکیده [English]

Primary anti-bacterial drugs, called sulfonamide drugs, have several biological effects drived widespread use of these drugs in medicine. Here, with respect to some reports (confirming anti-cancerous activity of some sulfadrugs) cellular effects of two antibacterial sulfonamides (sulfathiazole and sulfacetamide) on T-47D cells was studied using several experimental methods. The fifty percent reduction in cell viability (LC50) was investigated after 48 h treatment of T-47D cells with sodium sulfathiazole and sodium sulfacetamide. Cells undergoing apoptosis were identified using fluorescent microscopy after double staining with Annexin-PI fluorochromes. Flow cytometric analysis, using Annexin-V-Flous kit, revealed lack of apoptosis amoung the treated cells. This notion was also exhibited by DNA laddering investigations while increasing in caspases-3 activity was registered. Cell cycle analysis after DAPI treatment indicated lack of cell cycle arrest amoung the treated cells. Here, doxorubicin was utilized as a positive control in all experiments. On the whole, regarding to the present study, it has been exhibited that in the presence of sodium sulfathiazole, decreased transcriptional expression level of Akt1, Akt2 and mTOR genes, in parallel with increased transcriptional level of PTEN gene, is being followed by reducing of cell viability. No similar mechanism was observed for sodium sulfacetamide. With respect to increased transcriptional expression level of Atg5, Akt1, Akt2 and mTOR genes, in parallel with decreased transcription level of PTEN gene, mechanism of action of sodium sulfacetamide should be exerted by cytoprotective autophagy causing decreasing of cell devision or growth rate.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Sulfathiazole
  • Sulfacetamide
  • Breast cancer
  • Apoptosis
  • Cell cycle arrest
  • Autophagy

بررسی اثرات سلولی آنتی باکتریهای سولفاتیازول و سولفاستامید بر روی سلولهای سرطان سینه (رده‏ سلولی T-47D)

راضیه محمدپور، شاهرخ صفریان*، سعید نوروزی و عاطفه رزازان 

تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، گروه سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 26/10/89             تاریخ پذیرش: 14/4/90

چکیده 

داروهای ضد باکتریایی اولیه موسوم به داروهای سولفونامیدی دارای اثرات زیستی بسیاری است که موجب کاربرد گسترده‏ بالینی آن شده است. با توجه به گزارشهایی مبنی بر اثرات ضد سرطانی بعضی از اعضای این خانواده‏ دارویی، در این پژوهش اثرات سلولی سولفاتیازول و سولفاستامید، دو آنتی باکتریال از این خانواده بر رده‏ سلولی سرطان سینه T-47D بررسی گردید. علائم ریخت شناسیِ ویژه‏ آپوپتوز توسط میکروسکوپ فلوئورسنت پس از رنگ آمیزی با Annexin-PI، و نیز نتایج حاصل از مطالعات فلوسیتومتری نشان داد که درصد سلولهای آپوپتوز شده در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید در قیاس با شاهد منفی بسیار اندک می‏باشد. این موضوع علی رغم افزایش معنی‌دار میزان فعالیت آنزیم کاسپاز-3 در سلولهای تیمار شده با دارو مشاهده می گردید. بررسیهای صورت گرفته به روی نمودارهای فلوسیتومتری رسم شده با استفاده از ردیاب DAPI مؤیّد آن بود که این داروها قادر به توقف سلولها در فازهای مختلف چرخه‏ سلولی نیز نمی‏باشند. در اینجا از اثر داروی دوکسوروبیسین به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. به دنبال این یافته‏ها نشان داده شد که سدیم سولفاتیازول با کاهش سطح بیان ژنهای Akt1، Akt2 و mTOR و نیز افزایش سطح بیان PTEN ، بقای سلولی را کاهش می‏دهد اما این مکانیسم برای سدیم سولفاستامید قابل مشاهده نمی‏باشد. سازوکار اثرات ضد سرطانی سدیم سولفاستامید با توجه به افزایش سطح بیان ژنهای Atg5، Akt1، Akt2 و mTOR و نیز کاهش سطح بیان PTEN می‏تواند از طریق راه اندازی مسیر اتوفاژی بقاء و کاهش سرعت تقسیم سلولی اعمال شده باشد.

واژه‏های کلیدی: سولفاتیازول، سولفاستامید، سرطان سینه، آپوپتوز، توقف چرخه‏ی سلولی، اتوفاژی

* نویسنده مسئول،  تلفن: 61113312  ، پست الکترونیکی: safarian@ibb.ut.ac.ir

مقدمه

 

ترکیب پاراآمینوبنزوئیک اسید که امروزه "سولفونیلامید" نامیده می‏شود در سال 1908 برای اوّلین بار ساخته شد، اما ارزش درمانی آن سالها پس از آن مشخص گردید (12). در سال 1932 یک مؤسسه‏ تجاری آلمانی ترکیب قرمز رنگی به نام 4-( َ4- سولفامیل‏فنیلازو)- ام- فنیلنِدیامین را  تولید کرد که در سال 1935 اثرات درمانی آن گزارش و به نام  "پرونتوسیل" نام گذاری گردید (24، 12). در همین سالها یک گروه محقق فرانسوی کشف کرد که خاصیت ضد باکتریایی این ترکیب در بخش پاراآمینوبنزن سولفونامیدی این مولکول نهفته است. در سال 1937 سولفاپیریدین ساخته شد که اولین سولفونامید موفق در درمان ذات الریه محسوب می‏گردید. پس از آن سایر سولفونامیدها نیز نظیر سولفاتیازول، سولفادیازین ساخته شدند (12). تا کنون بیشتر از 3300 سولفونامید ساخته شده است اما فقط تعداد کمی از آنها در مصارف دارویی استفاده و در بسیاری از موارد به عنوان ماده‏ای باکتریواستاتیک استفاده می‏شوند (12). داروهای سولفا (Sulfa Drugs) رشد و تکثیر برخی از باکتریها را با دخالت در فرآیند ساخت فولیک اسید مهار می‏کنند اما آنها را نمی‏کشند (32، 16). از بین سولفونامیدهای ساخته شده ترکیبات متعددی وجود دارد که فعالیتهای مهاری را در مقابل پروتئازهای مختلفی مانند متالوپروتئازها، سرین پروتئازها، سیستئین پروتئازها و آسپارتات پروتئازهای به دست آمده از پستانداران و یا ویروسها نشان می‏دهند و به همین علت فعالیتهای ضد ویروسی ،ضد توموری و ضد التهابی را از خود ظاهر می‏سازند (33). بعضی از مشتقات سولفونامیدی با خاصیت ضد سرطانی گزارش شده‏اند که از جمله می‏توان به E7070، و E7010 به عنوان مهار کننده‏های تجمع میکروتوبول‏ها اشاره نمود که از این طریق باعث توقف چرخه‏ سلولی می‏شوند (11، 28،29). ایندول سولفونامیدها با مختل کردن تجمع دینامیکی میکروتوبول‏های دوک میتوزی تکثیر سلولی را مهار می‏کنند و با القاء آپوپتوز در طی مسیر وابسته به Bcl-2 سلولهای سرطانی را می‏کشند (25).

از جمله داروهای سولفا، می‏توان سولفاتیازول و سولفاستامید را نام برد. سولفاتیازول در اواسط 1930 کشف و در ابتدا برای مقابله با توبرکلوزیس استفاده شد (35). سولفاتیازول ویژگی ضد باکتریایی و ضد میکروبی دارد و فرمول شیمیایی آن C9H9N3O2S2 می‏باشد. نام شیمیایی این دارو 4- آمینو-N - (1و3-تیازول-2- ئیل) بنزن سولفونامید است. این دارو به عنوان ادرار آور، مهار کننده‏ آنزیم کربونیک انیدراز و یا ضد تشنج کاربرد دارد و از جمله موارد استعمال آن می‏توان به درمان مکمل در برخی از بیماریهای ویروسی و باکتریایی مانند عفونتهای پنومونی و یا سایر عفونتهای ریه و عفونتهای مجاری ادراری اشاره نمود (21). سولفاستامید دارای نام علمی N-(4-آمینوفنیل) سولفونیل استامید و فرمول مولکولی C8H10N2O3S می‏باشد. کاربرد بالینی متداول این دارو در ترکیب با دو داروی سولفونامیدی دیگر به نام سولفاتیازول و سولفابنزامید در ساختار پماد موضعی برای درمان عفونتهای خاص واژینال می‏باشد. استفاده از این داروها می‏تواند با بروز یک سری از عوارض جانبی مانند تهوع، سردرد، واکنشهای حساسیتی شدید و واکنشهای آلرژیک و ایجادکننده‏ راشهای پوستی عمیق همراه باشد (17).

دوکسوروبیسین یک آنتی بیوتیک آنتراسایکلین است که به عنوان یکی از مؤثّرترین و پرمصرف‏ترین عوامل شیمی درمانی در درمان لوکمیا ، لمفوما و انواع تومورهای جامد به کار می‏رود (22). اگرچه اثرات کاردیوتوکسیک این دارو، پتانسیل بالینی آن را تا حدی محدود می‏کند (31). دوکسوروبیسین در سطح سلولی بین دو باز آلی در DNA ی دو رشته‏ای وارد می‏شود و از این طریق باعث مهار RNA و DNA  پلیمراز وابسته به DNA و در نتیجه مهار سنتز RNA و DNA و در نهایت آسیب به سازوکارهای تعمیر DNA می‏گردد. از طرفی این دارو با مهار کارکرد آنزیم توپوایزومراز II ساخت DNA را دستخوش اختلال می‏کند (22).  این دارو با اتصال به لیپیدهای غشای پلاسمایی، بسیاری از کارکردهای سلولی را تحت تأثیر قرار می‏دهد. از آن جمله می‏توان به تشکیل رادیکالهای آزاد مانندOH¯  اشاره نمود. سلولهای تیمار شده با دوکسوروبیسین ویژگیهای فعال شدن مسیر آپوپتوز و نیز توقف چرخه‏ سلولی را از خود نشان می‏دهد که به همین علت به عنوان یک داروی مؤثر در شیمی درمانی سرطان کاربرد دارد (3، 7،30) .

در این پژوهش، تلاش بر این بود که نحوه اثر گذاری دو عضو از اعضای خانواده دارویی سولفونامیدها (سولفاستامید و سولفاتیازول) را از لحاظ کاهش تکثیر و بقاء سلولی به روی سلولهای سرطانی T-47D مورد بررسی قرار داده تا از این طریق بتوان در طراحی مشتقات جدید سولفونامیدی و یا سایر داروهای غیر سولفونامیدی که محل اثر آن‌ها در محلی مشابه داروهای سولفونامیدی است گام‏های مؤثرتری را برداشت.

 

مواد و روشها

مواد و دستگاه‏ها: محیط کشت سلولRoswell Park Memorial Institute (RPMI)1640  و سرم جنین گاوی از شرکت Gibco (انگلستان) و محلول پنسیلین-استرپتومایسین از شرکت Roche (آلمان) خریداری گردید. محلول  3-[5،4- دی متیل تیازول-2-ئیل]-5،2-در فنیل تترازولیوم برومید (MTT) و محلول تریپسین-EDTA  از شرکت سیگما (انگلستان) خریداری شد. کیتهای رنگ آمیزیAnnexin-V-FLOUS ، کیت رنگ آمیزی پروپیدیوم یدید (PI)، کیت سنجش فعالیت کاسپاز-3، کیت DNA Lddering و کیت '4،6-دی آمیدینو-2- فنیل ایندول (DAPI) همگی از شرکت Roche (آلمان) خریداری گردید. کیت استخراج RNA و کیت QuantiFast™ SYBR Green Real time RT-PCR master mix از شرکت کیاژن (آمریکا) تهیه شد. آنزیم رونوشت بردار معکوس (RevertAidTM  M-MuLV reverse transcriptase)  و پرایمر رندوم هگزامر از شرکت Fermentas (آلمان) خریداری گردید. خریداری دارو‏ی دوکسوروبیسین از شرکت Ebewe-Pharma )اتریش( و سولفاستامید و سولفاتیازول از شرکت سینا دارو صورت گرفت. دستگاه ثبت اِلایزا ساخت شرکت Rayto (چین)؛ میکروسکوپ فلوئورسانس ساخت شرکت Axisplan2 Zeiss (آلمان)؛ طیف نور سنج فلوئورسانس مدل MPF-4A ساخت شرکت HITACHI (ژاپن)؛ طیف نورسنج Nanodrop ساخت شرکت Thermsientific (آمریکا) بوده‌اند و دستگاه فلوسیتومتر ساخت شرکت Partec (آمریکا) مجهز به نرم افزار  FloMax بوده است.  

رده‏ سلولی، شرایط کشت سلولی و تیمار سلولی: T-47D رده‏ سلولهای چسبنده با منشأ اپیتلیالی مجاری شیری از بانک سلولی ایران (با کد ATCC HTB-133) تهیه گردید. RPMI-1640 غنی شده با سرم جنین گاو (10 درصد حجم/حجم) و محلول پنیسیلین/استرپتومایسین (1 درصد حجم/حجم) به منظور فراهم کردن محیط مناسب برای رشد بهینه‏ سلولها انتخاب و استفاده گردید. سلولها تحت شرایط کنترل شده‏ دما (37 درجه سانتی گراد) و اتمسفر مرطوب حاوی CO2 (5 درصد حجم/حجم) کشت داده شد. با توجه به نتایج حاصل از سنجش MTT میزان LC50 برای داروهای سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و  دوکسوروبیسین بعد از 48 ساعت به ترتیب  mM5/6 ، mM  41 و  mM 3-10 × 337/0 به دست آمد. محلولهای دارویی با غلظتهای مورد نظر پس از حل کردن مقدار گرم لازم از داروها در محیط کشت ساخته شد و با بهره گیری از فیلترهای μm 22/0 استریل گردید. در شرایط استریل، تعویض محیط کشت سلول (فلاسکهای سلولی با پراکنش سلولی 80 درصد) با محلولهای دارویی از پیش ساخته شده (با غلظتهای مورد نظر از دارو) انجام شد و پس از گذشت 48 ساعت برداشت سلولی صورت گرفت. در زمان برداشت سلولی، بعد از تخلیه‏ محیط کشت حاوی دارو، سلولها تریپسینه و پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد (حدود 3 تا 5 دقیقه) ازکف فلاسک جدا شدند و با استفاده از بافر فسفات-سالین، سه بار در دمای 4 درجه سانتی گراد و در دور rpm2500 مورد شستشو قرار گرفتند و سپس به فریزر 70- درجه سانتی گراد انتقال یافتند.

آزمون MTT: بر اساس این آزمون، در هر یک از چاهکهای یک پلیت 96 خانه‏ای، 104 سلول انتقال و کشت داده شد. پس از رسیدن به تراکم 80 درصد، محیط کشتِ حاوی غلظتهای مختلف دارو با محیط قبلی جایگزین و سلولهای کشت داده شده در سه پلیت مجزا برای زمانهای انکوباسیون  24، 48 و 72  ساعت در شرایط کشت نگهداری شد. هر غلظت از دارو در سه چاهک تکرار شده و از سوی دیگر آزمایش در حداقل سه تکرار مجزا برای هر زمان انکوباسیون صورت گرفت به نحوی که برای هر غلظت دارو حداقل نه تکرار موجود باشد. بعد از گذشت زمان‏های مورد نظر، به هر چاهک ml25 از محلول ذخیره‏ی MTT با غلظت mg/ml4  یا µg/well  100 افزوده و پس از گذشت زمان سه ساعت، با افزودن  μl100 حلال دی متیل سولفوکساید (DMSO) میزان محصول فورمازان تولید شده توسط دستگاه الایزا در طول موج 570 نانومتر تعیین گردید. توان زیستی سلولهای تیمار شده با دارو (در هر غلظت از دارو)  به شکل نسبت درصد جذب نوری فورمازان تولیدی در نمونه در قیاس با میزان جذب نوری فورمازان تولیدی در شاهد منفی (سلولهای بدون تیمار دارویی) تعیین و در یک منحنی دوبعدی (درصد توان زیستی یا بقاء سلولها در مقابل غلظت دارو) نشان داده شد. با استفاده از این منحنی می‏توان LC50 را برای داروهای مورد نظر محاسبه و تعیین نمود.

بررسی ریخت شناسی سلولها با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسانس: بررسی حضور فسفاتیدیل سرین در نیم غشاء خارجی سلولها به عنوان یک ویژگی مهم در سلولهای آپوپتوزی، به همراه نفوذ پروپیدیوم یدید به داخل هسته‏ سلولهای آپوپتوزی پیر و یا سلولهای نکروزی با بهره گیری از کیت رنگ آمیزی Annexin-V-FLOUS  و میکروسکوپ فلوئورسانس صورت گرفت (10). در این روش سلولها به روی لاملهای پوشانده شده با پلی ال- لیزین 1 درصد در پتری دیشهای با قطر cm 3 کشت داده شد و پس از 24 ساعت با تخلیه‏ محیط کشت رویی، محیط کشت حاوی غلظت LC50 دارو (سدیم سولفاتیارول، سدیم سولفاستامید) افزوده گردید. پس از طی شدن زمان انکوباسیون مورد نظر (48 ساعت) محلول رنگی  Annexin V-FITC ( µg/ml 20) و پروپیدیوم یدید ( µg/ml 20) به مدت 15-10 دقیقه و در دمای 25-15 درجه در تاریکی در مجاورت سلولها قرار گرفت. سپس با برگرداندن لامل به روی یک لام شیشه‏ای تمیز تصاویر سلولی در درشت نمایی‏های مختلف در زیر میکروسکوپ فلوئورسانس (طول موج تحریکی nm 500-450 و طول موج ثبتی nm 565-515) در حداقل زمان ممکن و به دور از نورِ محیطی مورد رؤیت قرار گرفت. برای جلوگیری از خشک شدن لامل و افزایش وضوح تصویر ml 5-3 Mounting Media   در فاصله لام و لامل قرار داده شد.

سنجش آپوپتوز و نکروز و بررسی چرخه‏ی تقسیم سلولی با بهره گیری از روش فلوسیتومتری: به منظور تعیین تعداد سلولهای آپوپتوزی و نکروزی در یک جمعیت سلولی تیمار شده با هر دارو و قیاس آن با جمعیت سلولی در شاهد منفی، رنگ آمیزی سلولها با دو رنگ  Annexin-FITC و پروپیدیوم یدید ( PI ) طبق دستور کار کیت انجام گرفت. تجزیه وتحلیل داده‏ها با استفاده از نرم افزار دستگاه و در پی تقسیم بندی در منحنی دوبعدی Annexin-FITC علیه PI به چهار ناحیه Q1 تا Q4 صورت گرفت. در این تقسیم بندی، ناحیه Q1 نمایانگر سلولهای نکروزی با ویژگی ¯Annexin-FITC و PI+؛ ناحیه‏ی Q2 نمایانگر سلولهای آپوپتوز شده پیر با ویژگی +Annexin-FITC و PI+ ؛ ناحیه‏ Q3 نمایانگر سلولهای سالم با ویژگی ¯Annexin-FITC و ¯PI و ناحیه‏ Q4  نمایانگر سلولهای آپوپتوزی جوان با ویژگی Annexin-FITC+ و ¯PI می‏باشد (13 و 20). همچنین برای اندازه گیری محتوای DNA در سلولهای یک جمعیت سلولی، به منظور مقایسه‏ی نحوه‏ توزیع سلولها در فازهای مختلف چرخه‏ سلولی در نمونه‏های تیمار شده با دارو و نمونه‏ کنترل منفی، از نشانگر  DAPI  استفاده شد. در این روش، تعداد 105 ×5  سلول در دمای 4 درجه سانتی گراد برای مدت 30 دقیقه در تاریکی با محلول DAPI در بافر PBS با غلظت µg/ml 10 حاوی 6 درصد TritonX-100 انکوبه گردید. سپس نشر فلوئورسانس نشانگرِ به کار رفته پس از برانگیختگی در طول موج nm 359  ثبت گردید. ثبت فوتونهای نشری در طول موج nm 461 و تجزیه و تحلیل داده‏ها به روی منحنی دوبعدی تعداد سلولها در برابر سطح زیر پیک  (Area) با استفاده از نرم افزار FloMax انجام شد.

سنجش میزان فعالیت آنزیم کاسپاز-3 : به منظور کمّی نمودن میزان فعّالیّت کاسپاز-3 در عصاره‏ سلولهای تیمار شده با دارو در مقایسه‏ با نمونه‏ کنترل منفی، از کیت سنجش فعالیت کاسپاز-3 استفاده شد. در این کیت از AC-DEVD-AFC به عنوان سوبسترای آنزیم کاسپاز-3 استفاده گردید. آبکافت آنزیمی ِپیوند AFC- سوبسترا موجب رهاسازی AFC در آن و افزایش نشر در طول موج  nm 505 می‏گردد. میزان رنگِ فلوئورسنتِ ایجاد شده بر اثر شکست پروتئولیتیکِ سوبسترای کاسپاز، میزان فعالیت کاسپاز-3 را در عصاره سلولی استخراج شده را نشان می‏دهد. در اینجا پس از شستشوی سلولهای برداشت شده از فلاسکهای سلولی، فروپاشی سلولها به منظور تهیه عصاره‏ سلولی انجام شد. سپس با استفاده پلیت چندخانه‏ مخصوص کیت، به چاهکهای مورد نظر ml 100 از محلول آنتی کاسپاز- 3 اضافه و پس از انکوبه کردن به مدّت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد با ml 200 بافرblocking  جهت مسدود کردن نقاط اتصال غیر اختصاصی چاهکها جایگزین شد. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای محیط، بافر مسدود کننده خارج و چاهکها سه بار با بافر انکوباسیون مورد شستشو قرار گرفت. به هریک از چاهک­ها ml 100 از عصاره‏ی سلولی تهیّه شده اضافه و پس از یک ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد، عصاره سلولی خارج و چاهکها سه بار با بافر انکوباسیون شسته شد. سپس ml 100 از محلول سوبسترای تازه‏ تهیّه شده (AC-DEVD-AFC) به چاهک افزوده و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. مایع رویی حاوی مقادیر مشخصی از سوبسترای برش خورده و AFC آزاد شده است و در نتیجه میزان فلوئورسانس آن، معرف فعّالیّت آنزیم در عصاره سلولی می­باشد. میزان فلوئورسانس AFC آزاد شده توسط دستگاه فلوئورواسپکتروفوتومتر، با تهییج نمونه در طول موج تحریکی 400 نانومتر و طول موج نشری 505  نانومتر مورد سنجش قرار گرفت.

بررسی الگوی شکست نردبانی  DNA : پس از اثردهی دارو بر سلولها و گذشت زمان انکوباسیون 48 ساعت، استخراج و تخلیص DNA به منظور بررسی الگوی نردبانی آن با استفاده از کیت Apoptotic DNA Ladder Kit انجام گرفت. اساس کارکرد این کیت بر اتصال اختصاصی مولکولهای DNA به glass fiber fleece در حضور نمک کائوتروپیک و گوانیدین هیدروکلراید استوار گشته است. روش انجام کار بر اساس دستور کار کیت به صورت زیر می‏باشد: تعداد 106×2 از سلولهای تیمار شده با دارو توسط  بافر فروپاشاننده و اتصال یابنده به DNA، فروپاشانده و عصاره‏ حاصل از فیبرهای شیشه‌ای مستقر در لوله سانتریفیوژ عبور داده شد. این بافر حاوی گوانیدین هیدروکلراید M6، اوره mM10، تریس هیدروکلراید mM10، Triton X-100  (20 درصد حجم / حجم) با pH نهایی 4/4 می‏باشد. جداسازی اجزای سلولی از DNA متصل شده به فیبرها با انجام سانتریفیوژ در rpm8000 به مدت یک دقیقه صورت گرفت و پس از شستشوی لوله‏ سانتریفیوژ، DNA به کمک محلول نمکی ضعیف (تریسmM 10با 5/8pH ) استخراج و جمع آوری گردید. غلظت DNA با روش جذب خوانی تعیین شد و معادلmM   3-1 از آن به روی ژل آگارز 1 درصد در بافر TBE انتقال یافت تا الکتروفورز آن به مدت 5/1 ساعت تحت ولتاژ 75 ولت صورت پذیرد. در اینجا از عصاره‏ سلولهای U937 تیمار شده با غلظت µg/ml 4 ازداروی کمپتوتسین (Camptothecin) به عنوان نمونه‏ کنترل مثبت استفاده شد. تیمار سلولها با این دارو موجب القاء آپوپتوز درحدود 30 درصد می‏گردد که الگوی نردبانی DNAی آن به روی ژل آگارز قابل مشاهده می‏باشد.

Real time RT-PCR : RNA با استفاده از کیت RNeasy Plus Mini Kit بر اساس دستورالعمل کیت استخراج شد. cDNA با استفاده از آنزیم رونوشت بردار معکوس (RevertAidTM  M-MuLV) و پرایمرهای رندوم هگزامر ساخته شد. Real Time Quantitative RT-PCR با استفاده از کیت QuantiFast™ SYBR Green PCR Master Mix طبق دستورالعمل کیت و بر اساس برنامه‏ی واسرشتگی اولیه در 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 ثانیه و به دنبال آن 40 سیکل مشتمل بر 95 درجه سانتی گراد برای 10 ثانیه، توقف در دمای اتصال اختصاصی پرایمر برای مدت 25 ثانیه و تامین زمان لازم برای عملکرد آنزیم در 72 درجه سانتی گراد برای 30 ثانیه با استفاده از دستگاه Corbett Rotor-Gene 6000 انجام شد. آنالیز داده‌ها با کمک نرم افزار Corbett Rotor-Gene 6000 و به روش ΔΔCT انجام شد. لیست و توالی پرایمرهای مورد استفاده که توسط شرکت TAG Copenhagen (دانمارک) تهیه شده در جدول 1 آمده است.

 

جدول1- توالی پرایمرها

ژن

توالی پرایمر

Akt1

پرایمر پیشرو: 5'-CCAGATGGAAAGACGTTTTTGTG-3'

پرایمر پسرو: : 5'-GAGAACAAACTGGATGAAATAAA-3'

Akt2*

پرایمر پیشرو: : 5'-CTGCGGAAGGAAGTCATCATTGC-3'

پرایمر پسرو: : 5'-CGGTCGTGGGTCTGGAAGGCATAC-3'

GAPDH

پرایمر پیشرو: CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAG-3': 5'-

پرایمر پسرو: : 5'-AGGGTCTCTCTCTTCTTCCTCTTGTGCTCT-3'

mTOR

پرایمر پیشرو: 5'-TTTCCCCAAAACTTCTGATGTGCC-3'

پرایمر پسرو: 5'-CGGTGCTATGGACTGAATGCGAATG-3'

PTEN

پرایمر پیشرو: : 5'-TGGCTAAGTGAAGATGACAATCATG-3'

پرایمر پسرو: GCACATATCATTACACCAGTTCGT-3': 5'-

Atg5

پرایمر پیشرو: 5'-GTGAGATATGGTTTGAATATGAAGGC-3'

پرایمر پسرو: 5'-CTCTTAAAATGTACTGTGATGTTCCAA-3'

*با توجه به اینکه در سلول­های T-47D واریانت Akt3 بیان نمی­شود، لذا در اینجا بیان دو واریانت 1 و 2 بررسی شده است.


نرم افزارهای رایانه ای و تجزیه و تحلیلهای آماری: پردازش داده‏های فلوسیتومتری با استفاده از نرم افزار FloMax انجام و تجزیه و تحلیلهای آماری به منظور انجام آزمون آماری ANOVA  یک طرفه (با توجه به توزیع نرمال داده‏ها) در سطح 05/0p< با استفاده از نرم افزارهای SPSS16  و 2007 Excel صورت گرفت. پردازش داده‏های Real time RT PCR با استفاده از نرم افزار Rotor Gene 6000 به روش ΔΔCT و آنالیز آماری آن با استفاده از نرم افزار SPSS16 به روش t- test در سطح معناداری 05/0p< انجام شد.

نتایج

کاهش توان زیستی سلولهای T-47D در حضور سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و دوکسوروبیسین : به منظور تعیین رابطه‏ اثر دارو با زمان، نمونه‏ها بعد از گذشت زمان 24، 48 و 72 ساعت در محدوده‏ غلظتی تعیین شده و میزان توان زیستی سلولها پس از تیمار دارویی در قیاس با نمونه‏ شاهد منفی محاسبه گردید. نمودار جذب نوری محلول فورمازان در حلال DMSO، که بر اساس غلظتهای افزاینده‏ دوکسوروبیسین  و سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید رسم شده است (شکل1). نشان دهنده‏ اثرات بازدارندگی وابسته به غلظت دارو در رشد و تکثیر سلولها در محدوده‏ غلظتی صفر تا mM 4-10×6 برای دوکسوروبیسین و محدوده‏ غلظتی صفر تا mM 50 برای سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید می‏باشد. در شکل 1 ارتباط میزان توان زیستی سلول‌ها با افزایش غلظت دارو نشان داده شده است. با استفاده از این نمودار غلظت مؤثر دارو برای کاهش 50 درصدی رشد و تکثیر سلولها (LC50) در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت محاسبه و در 48 ساعت برای دوکسوروبیسین، سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید به ترتیب  برابر با µM 33/0، mM 5/6 و  mM 41 مشخص شده و در تمامی مطالعات انجام شده در این مقاله جهت تشخیص نوع اثر بازدارندگی دارو مورد استفاده قرار گرفته است.

 

 

 

 

 

ج بازدارندگی 50 درصدی (LC50) دارو 

شکل 1- منحنی توان زیستی سلولهای T-47D بر‏حسب افزایش غلظت دوکسوروبیسین،  سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید. درصد توان زیستی سلولها در مقایسه با نمونه کنترل منفی پس از تیمار با غلظتهای مختلف داروها به مدّت 24، 48  و 72 برای سدیم سولفاستامید و سدیم سولفاتیازول و 24 و 48 ساعت برای دوکسوروبیسین محاسبه گردیده است. منحنی حاصل نشان دهنده‏ اثر بازدارندگی دوکسوروبیسین، سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید بر روی توان زیستی سلولها به صورت تابعی از غلظت و زمان می‏باشد. هریک از نقاط، میانگین نتایج حاصل از حداقل سه آزمون مستقل ± خطای معیار می‏باشد.


عدم مشاهده‏ آپوپتوز یا نکروز در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و دوکسوروبیسین در بررسی میکروسکوپ فلوئورسنت و فلوسیتومتری: پس از تیمار دارویی سلولها با سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید (به مدت 48 ساعت در غلظت LC50) و رنگ‌آمیزی با  Annexin-PI، در یک جمعیت سلولی استقرار یافته در سطح لام، پیدایش علائم آپوپتوزی تنها در مورد تعداد بسیار کمی از سلولها در میکروسکوپ فلوئورسنت مشاهده شد.

 

 

(a1)

 

(a2)

 

 

 

 

  

(b1)

 

(b2)

 

 

 

c

شکل2- مشاهده ریخت شناسی سلولهای آپوپتوزی و نکروزی توسط میکروسکوپ فلوئورسنت. همان طور که در شکل مشاهده  می‌شود پس از رنگ آمیزی همزمان سلولهای تیمار شده باPI  و Annexin-FITC ، سلولهای نکروزی با جذب PI، سلولهای آپوپتوزی جوان با Annexin-FITC و سلولهای آپوپتوزی پیر با هر دو مادۀ PI و  Annexin-FITC رنگ می‌گیرند. تعداد سلولهای رنگ گرفته نسبت به مساحت میدان دید و در تکرارهای متعدد بسیار کم بوده است که علاوه بر تایید صحت کارکردی کیت Annexin-V-FlTC  در روش فلوسیتومتری (شکل 3)، نشان دهنده‏ درصد بسیار ناچیز بروز آپوپتوز در سلولهای تیمار شده با داروهای سدیم سولفاتیازول (a1,a2) سدیم سولفاستامید (b1, b2) می‏باشد. میدان دید میکروسکوپی برای نمونه‏ شاهد منفی نیز در تصویر (c) نشان داده شده است.

 

در طی آپوپتوز، سلولهای آپوپتوزی به علت سست شدن اتصالات بین سلولی با ماده‏ زمینه‏ای، به شکل کروی مشاهده می‏شوند که به علت تظاهر فسفاتیدیل سرین‏های غشائی به روی سطح خارجی غشاء و رنگ‏آمیزی آن‌ها با Annexin-FITC به رنگ سبز درخشان درمی‏آیند (شکل2). در سلولهایی که در مراحل انتهایی آپوپتوز قرار دارند و یا نکروزه شده‏اند،  نفوذ پذیری غشاء افزایش نشان می‏دهد و در نتیجه خصوصیت رنگ پذیری هسته با  PI به علت تجمع رنگ قرمز در هسته تظاهر می‏یابد (شکل 2).

از جمله تفاوتهای مهم بین سلولهای آپوپتوزی پیر با سلولهای نکروزی عدم رنگ پذیری غشاء پلاسمایی در سلولهای نکروزی با رنگ Annexin-FITC است (شکل a-b2). بدیهی است که سلولهای زنده در میدان دید میکروسکوپ فلوئورسنت به علت عدم رنگ پذیری با رنگهای فلوئورسنت قابل تشخیص نمی‏باشند و تنها با استفاده از امکانات فاز کنتراست قابل رؤیت هستند (شکل c2).

به منظور دستیابی به مقادیر عددی القاء آپوپتوز و نکروز، آزمون فلوسیتومتری با نشانگرهای PI و Annexin-FITC انجام گرفت. سلولهای وارد شده به دستگاه فلوسیتومتر بر اساس اختلاف در میزان نشر رنگهای فلوئورسین ایزوتیوسیانات (FITC) و پروپیدیوم یدید ( PI ) که جذب سلول شده‏اند مورد تفکیک قرار گرفتند. در ابتدا در یک جمعیت سلولی فاقد رنگ، تعیین حدود اصلی سلولها (ناحیه R1) و حذف نقاط نامناسب با استفاده از منحنی دوبعدی (FSC) در برابر (SSC) صورت گرفت. در نمودار دوبعدی Annexin-FITC در برابر PI  محاسبات مورد نظر با توجه به حدود اصلی جمعیت سلولی به روی چهار ناحیه‏ی اصلی Q1 تا Q4 انجام پذیرفت و درصد سلولهای سالم، آپوپتوزی و نکروزی مشخص گردید (شکل 3). در اینجا با توجه به نوع نتیجه‏گیری موجود در اغلب منابع، مجموع درصد سلولهای قرار گرفته در نواحی Q2 و Q4 به عنوان درصد کل وقوع آپوپتوز (سلولهای آپوپتوز شده‏ پیر و جوان) در نظر گرفته شد (جدول2) (8،14،34). در این حالت سلولهای قرار گرفته در نواحی Q1 و Q3 به ترتیب، معرف سلولهای نکروزی و سالم می‏باشد. در جدول2 به مجموع اعداد نواحی Q1 و Q2  نیز اشاره گردیده که در برخی از منابع به عنوان درصد کل وقوع نکروز مورد استناد قرار گرفته است (6).  بدیهی است که در چنین حالتی ناحیه‏ Q4 به تنهایی درصد کل سلولهای آپوپتوزی را نشان خواهد داد. اشاره به هر دو روش محاسبه‏ای فوق از آنجا صورت گرفته است تا مشخص گردد محاسبه‏ وقوع آپوپتوز و نکروز با توجه به هرکدام از دو روش فوق که صورت گیرد در حصول این نتیجه که درصد کل وقوع آپوپتوز و نکروز در زمان تیمار دارویی بسیار کم بوده است تأثیری را نخواهد داشت.

بررسی فلوسیتومتری نحوه‏ تغییر توزیع فازهای چرخه سلولی در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و دوکسوروبیسین : همان­طور که در شکل 4 و 5 مشاهده می‏شود در نتیجه‏ تیمارسلولها با دوکسوروبیسین تغییرات مشخصی در جابجایی پراکنش سلولها در مراحل مختلف چرخه‏ سلولی مشاهده می‏شود که جابجایی سلولها از مرحله‏ G1 به مرحله‏ S (و به میزان کمتر به مرحله ی G2/M) می‏باشد. در حضور داروهای سدیم سولفاستامید و سدیم سولفاتیازول پراکنش سلولها به نسبت نمونه‏ی شاهد تغییرات محسوسی را ندارد و از این جهت نمی‏تواند کاهش 50 درصدی رشد و تکثیر سلولی در زمان تیمار با این داروها را توجیه نماید. اما در مقابل، توقف چرخه‏ی سلولی در مرحله S ( انتقال از G1 به S به میزان 24 درصد) و G2 (انتقال از G1 به G2 به میزان 12 درصد) در سلولهای تیمار شده با دوکسوروبیسن می‏تواند دلیل قانع کننده‏ای را در مورد سازوکار اثر این دارو در ممانعت از تکثیر سلولی ارائه نماید.

 

 

 

 

شکل 3-الف) نمودار دوبعدی Annexin-FITC علیه PI مربوط به یکی از تکرارهای آزمون فلوسیتومتری. نمودارهای دو بعدی حاصل از مطالعات فلوسیتومتری نشان می‏دهد که درصد سلولهای آپوپتوزی و نکروزی تفاوت فاحشی را با نمونه کنترل منفی (سلولهای تیمار نشده) ندارد. محدوده اندازه‏ی سلولهای مورد بررسی، روی نمودار FSC/SSC در نمونه‏ سلولهای سالم فاقد رنگ و بر اساس اندازه‏ی طبیعی سلولها تعیین گردیده است.


افزایش فعالیت کاسپاز-3 در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و دوکسوروبیسین در مقایسه با کنترل منفی: کاسپاز-3 یک آنزیم کلیدی است که در تمام مسیر‏های فرآیند آپوپتوز فعالیّت دارد و مسئول فعّال و یا غیرفعّال کردن طیف گسترده‏ای از زیست مولکولها و ایجاد خصوصیات ویژه‏ این فرآیند در سلول است. بررسی تغییر فعالیت کاسپاز-3 می‏تواند به عنوان نشانگر مهمّی برای ورود سلولها به مسیر مرگ برنامه ریزی شده‏ سلولی تلقی گردد و در آزمونهای سلولی  جهت   بررسی   کمّی  اثر  فعّال  کننده‏ها  و  مهار

کننده‏های مرگ سلولی استفاده گردد (2،27).  


 

 

جدول2 - نتایج عددی آزمون فلوسیتومتری. نتایج مربوط به انواع سلولهای آپوپتوزی، نکروزی و سالم برای حداقل دو تکرار آزمایش به شکل درصد میانگین سلولها ± خطای معیار گزارش شده است. نواحی Q1، Q2، Q3 و Q4 و نیز Q1+Q2 و Q2+Q4 به ترتیب نشان دهنده‏ نواحی (PI+/Anx¯) ، (PI+/Anx+)، (PI¯/Anx¯)، (PI¯/Anx+) و (PI+) و (Anx+) می‏باشند.

 

 

 

G1

 

G1

 

G1

 

G2

 

S

 

G2

 

S

G1

 

S

 

 S

 

G2

 

G2

 

 S

 

G2

 

G1

شکل4 - بافت نگار دوبعدی چرخه سلولی  در سلولهای T47-D با بهره گیری از روش فلوسیتومتری و رنگ آمیزی با DAPI. در این نمودار FL4-A نمایانگر سطح زیر منحنی علائم ثبت شده برای هر سلول رنگ شده باDAPI ، در زمان عبور از مقابل پرتو لیزر می‏باشد. همان طور که در شکل

 مشاهده می‏شود، نواحی زنگوله‏ای مشخص شده از چپ به راست معرف درصد سلولهای موجود در فاز G1 ، S و  G2/M می‏باشد.


 

 

*

 

*

 

*

شکل 5- بافت نگار ستونی درصد سلولها علیه فازهای چرخه‏ سلولی. درصد سلولهای موجود در سه فاز چرخه‏ سلولی  G1، S، G2/M در چهار نمونه‏ کنترل منفی،دوکسوروبیسین، سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید نشان داده شده است. خطای معیار برای نمونه های ذکر شده نیز در روی شکل مشخص شده است. تفاوت معنادار در 05/0> p نسبت به کنترل منفی با * مشخص شده است.

 

مقایسه‏ میانگین میزان نشر فلوئورسانس حاصل از سه بار تکرار در سلولهای تیمار شده با دوکسوروبیسین، سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید در قیاس با نمونه‏ شاهد منفی به ترتیب نمایانگر افزایش 8/2، 2/2 و 5/1 برابری فعالیت کاسپاز-3 می‏باشد (شکل 6). این افزایش نشر نمونه‏های تیمار شده با دارو به خودی خود نشان دهنده‏ افزایش فعّالیّت آنزیم کاسپاز-3 در زمان مجاورت سلولها با داروها می‏باشد.

 

 

شکل6- بافت نگار مربوط به فعالیت کاسپاز-3. فعالیت آنزیمی در دمای 27 درجه سانتی گراد در عصاره‌ سلولی استخراج شده از تعداد 106×2  سلول و بر اساس دستورالعمل کیت سنجیده شده و میزان نشر  AFC آزاد شده توسط طیف نورسنج فلوئورسانس اندازه گیری شده است. سطح معناداری تست آماری به کار رفته  05/0 > p می‏باشد.


عدم مشاهده‏ قطعه قطعه شدن DNA در سلولهای T-47D تیمار شده با سدیم‏سولفاتیازول، سدیم‏سولفاستامید و دوکسوروبیسین در مقایسه با شاهد منفی و کنترل مثبت کیت: قطعه قطعه شدنDNA  کروماتینی یکی از نشانه‏های وقوع مرگ سلولی است. در مرگ ناگهانی سلول (نکروزی) DNA بدون نظم مشخص و به صورت اتّفاقی از نقاط مختلف شکسته می‏شود در حالی که در مراحل انتهایی فرآیند آپوپتوزی، بر اثر فعّال شدن آنزیمهای اندونوکلئاز درونی به وسیله کاسپازها، DNA کروموزومی از نواحی بین نوکلئوزومی بریده و قطعات یک و یا چند نوکلئوزومی ایجاد می‏گردد. در شکل (7) از راست به چپ تصویر کنترل مثبت فراهم شده توسط کیت (از عصاره سلولهای U937 تیمار شده با غلظت µg/ml 4 از داروی کمپتوتسین که موجب القای آپوپتوز به میزان 30 درصد می‏گردد)، کنترل منفی (سلولهای تیمار نشده)، سلولهای تیمارشده با دوکسوروبیسین، نمونه‏ نردبان وزن‌های مولکولی، سلولهای تیمار شده با سدیم سولفاستامید و سدیم سولفاتیازول نشان داده شده است. همان‌طور که مشاهده می‏شود به جز نمونه‏ کنترل مثبت در سایر نمونه‏ها، الگوی شکست نردبانی DNA مشخص نمی‏باشد.

 

شکل7- الگوی شکست نردبانی DNA در سلولهای تیمار شده با سدیم سولفاستامید، سدیم سولفاتیازول و دوکسوروبیسین در مقایسه با شاهد منفی و کنترل مثبت کیت. از سمت راست به چپ تصویر الگوی سلولهای کنترل مثبت فراهم شده توسط کیت ( از عصاره‏ سلول­های U937 تیمار شده با غلظت µg/ml 4 ازداروی کمپتوتسین)، کنترل

منفی (سلولهای تیمار نشده)، سلولهای تیمارشده با دوکسوروبیسین، نمونه نردبان وزن‌های مولکولی، سلولهای تیمار شده با سدیم سولفاستامید و سلولهای تیمار شده با سدیم سولفاتیازول مشاهده می‏شود. عدم ظهور الگوی نردبانی در نمونه تیمار شده با داروهای سولفونامیدی و در نمونه‏ی تیمار شده با دوکسوروبیسین حاکی از عدم وقوع و یا وقوع کم آپوپتوز می‏باشد. مشاهده‏ الگوی نردبانی در نمونه‏ کنترل مثبتِ کیت، صحت کارکرد کیت را نشان می‏دهد.

مطالعه‌ی مسیر بقاء سلولی در سلولهای T-47D در حضور سولفاتیازول و سولفاستامید: همان‌طور که در نمودار1 و جدول3 نشان داده شده است نتایج حاصل از Real time RT-PCR نشان دهنده‏ افزایش بیان ژن PTEN و کاهش بیان ژن‌های Akt1 ، Akt2 و mTOR در حضور سولفاتیازول می‏باشد. بدیهی است که افزایش بیان PTEN به عنوان فسفاتاز مهار کننده‌ مسیر Akt می‏تواند باعث کاهش توان زیستی سلولها در حضور دارو گردد (15). کاهش ارسال علائم بقاء سلولی از کاهش سطح بیان ژنهای Akt1، Akt2 و mTOR نیز قابل پیش بینی می‏باشد. از سوی دیگر با توجه به اشکال و اعداد آورده شده در نمودار1 و جدول3 مشخص می‏گردد که مسیر Akt  با توجه به کاهش بیان PTEN  و افزایش رونویسی Akt1 ، Akt2 و mTOR در حضور سولفاستامید تقویت شده است که از این منظر با کاهش مشخص توان زیستی سلولها در حضور این دارو مغایرت دارد. این موضوع در قسمت بحث با استناد بر راه اندازی مسیر اتوفاژی بقاء (cytoprotective autophagy) توضیح داده خواهد شد. استناد  ما بر راه افتادن مسیر اتوفاژی از طریق بررسی سطح بیان ژن Atg5 به عنوان یکی از مهم‌ترین ژنهای دخیل در شکل گیری اتوفاگوزوم‌ها (36) صورت گرفته و در نمودار1 و جدول3 نشان داده شده است.

بحث 

طیف وسیع اثرات دارویی خانواده‌ سولفونامیدها و گزارش‏های ضد و نقیضی که در مورد سازوکار اثرگذاری این داروها ارائه شده بود، در کنار نتایج به دست آمده از پژوهشهای قبلیِ مؤلفین در رابطه با نحوه‏ اثر‏گذاری داروهای استازولامید و سولفابنزامید که سازوکار اثرگذاری این دو دارو را از طریق مسیرهای ناشناخته‏ای به غیر از آپوپتوز و توقف چرخه‏ سلولی مشخص نموده بود (1،23) تصمیم بر آن شد تا به بررسی قابلیّت مهارکنندگی دو عضو دیگر از اعضای این خانواد‏ه‏ دارویی (سدیم سولفاتیازول و سدیم سولفاستامید) بر روی رده‏ سلولی سرطان سینه (T-47D) پرداخته شود تا شاید از این طریق بتوان به سازوکار دقیق این گروه از داروها پی برد.

 

 

نمودار1- نتایج Real time RT PCR. تغییرات بیان ژنهای دخیل در فرآیند بقای سلولی با تکنیک Real time RT PCR بررسی گردید و داده‌ها به صورت میانگین عددی(-∆∆CT2) حاصل از تکرارهای مختلف آزمایش به همراه خطای معیار نشان داده شده است. سطح معناداری تست آماری به کار رفته  05/0 > p می‏باشد که نمونه‏های دارای اختلاف معنادار نسبت به کنترل منفی با علامت * در نمودار ستونی نشان داده شده است. بررسی بیان ژن Atg5 فقط برای سلول‌های تیمار شده با سولفاستامید انجام شده است.

 

جدول3- نتایج عددی Real time RT PCR

میانگین -∆∆CT2 

± خطای معیار 

ژن 

سولفاستامید

سولفاتیازول

 

42/0± 99/2

03/0±15/0

Akt1

19/0±85/1

02/0±12/0

Akt2

14/0±61/0

8/0±73/2

PTEN 

44/0±11/3

09/0±49/0

mTOR

68/0± 66/3

---

Atg5

این تحقیق با توجه به آزمون MTT شاهد کاهش 50 درصدی تعداد سلولها بعد از تیمار دارویی 48 ساعته گردید (شکل1). اولین حدس در این خصوص، القاء آپوپتوز به عنوان عامل اصلی مرگ سلولی در زمان تیمار دارویی و کاهش درصد سلولها در حضور سدیم سولفاتیازول، سدیم سولفاستامید و دوکسوروبیسین بود. تصاویر حاصل از میکروسکوپ فلوئورسنت نشان داد که این دو دارو به میزان کمی سبب شکل‏گیری سلولهای آپوپتوزی و یا نکروزی شده‏اند به شکلی که تنها جستجو در میدانهای دید مختلف در میکروسکوپ فلوئورسنت می‏توانست تصاویر مناسبی را از سلولهای آپوپتوزی و یا نکروزی مشخص نماید (شکل 2). به منظور دستیابی به مقادیر عددی القاء آپوپتوز و نکروز در نمونه‏های شاهد منفی (سلولهای تیمار نشده با دارو)، سلولهای تیمار شده با دوکسوروبیسین و دو داروی سولفونامیدی، آزمون فلوسیتومتری با نشانگرهای PI و AnnexinV-FITC انجام شد. نمودارهای دو بعدی حاصل از مطالعات فلوسیتومتری نشان داد که درصد سلولهای آپوپتوزی و نکروزی تفاوت فاحشی را با نمونه‏ کنترل منفی (سلولهای تیمار نشده) ندارد (شکل3 و جدول2). عدم القاء آپوپتوز و یا نکروز حتی برای دارویی چون دوکسوروبیسین نیز مشاهده می‎گردید علی‏رغم آنکه با توجه به گزارشهای رسیده انتظار می‏رفت مقادیر بالایی از آپوپتوز در حضور این دارو راه‏اندازی شده باشد (9،19). توانایی القاء آپوپتوز در سلولهای سرطانی T-47D را می‏توان از طریق سنجش میزان فعّالیّت آنزیم کاسپاز-3 نیز مورد بررسی قرار داد. مطالعات ما نشان می‏داد که افزایش مشخصی درسنجش میزان فعالیت کاسپاز-3 وجود داشته است که به ظاهر مؤیّد به راه افتادن مسیرهای آپوپتوزی در سلولهای سرطانی T-47D در حضور سولفاستامید، سولفاتیازول و یا دوکسوروبیسین می‏باشد (شکل6). اگرچه در اغلب موارد فعّال شدن کاسپازها و متعاقباً سوبستراهای پایین دست با شکسته شدن DNA ژنومی از نواحی بین نوکلئوزومی و شکل‏گیری الگوی نردبانی همراه است (26)، امّا این موضوع در بررسیهای این تحقیق مشاهده نشد (شکل7). در اینجا، الگوی نردبانی مشخص حاصل از نمونه‏ کنترل مثبت کیت، صحّت انجام روش را در مورد سایر نمونه‌ها ثابت می‏کرد و از این لحاظ بدون هیچ گونه شبهه‏ای عدم بروز شکست نردبانی DNA ژنومی را علی‏رغم افزایش فعالیت کاسپاز-3 مورد تایید قرار می‌داد. در این راستا، افزایش مشاهده شده‏ی فعالیت آنزیمی کاسپاز-3 را (شکل 6) می‏توان با توجه به وجود نقص در فرآیندهای مولکولی پایین دست کاسپاز-3  ازجمله عدم کارکرد درست DFF40  توضیح داد. این بدان معناست که علی‏رغم ثبت فعالیت آنزیمی کاسپاز-3 در شرایط آزمایشگاهی (که در زمان مجاورت با سوبسترای مصنوعی و نه DFF40 ثبت شده است)، در شرایط طبیعی سلول که این آنزیم می‎بایست به روی سوبستراهای طبیعی خود (مانند DFF40) اثرگذار باشد این اثرگذاری احتمالاً با توجه به وجود نقص در ساختار سوبسترا(ها)ی طبیعی (مانند DFF40) در سلول مشاهده نمی‏گردد و لذا بواسطه‏ عدم فعال سازی DFF40 تجزیه‏ی DNA و ظهور الگوی شکست نردبانی نیز مشاهده نمی‏گردد (شکل 7).

نتایج حاصل از فلوسیتومتری و آزمون DNA laddering هم راستا با نتایج میکروسکوپ فلوئورسنت نشان داد که آپوپتوز در زمان تیمار دارویی به میزان قابل توجهی القاء نشده است (شکل های 7 ،3، 2).  لذا در اینجا، به منظور توضیحِ کاهش 50 درصدی تعداد سلولهای تیمار شده با داروهای سولفونامیدی و دوکسوروبیسین فرآیند توقف سلولها در یکی از فازهای چرخه‏ سلولی مورد بررسی قرار گرفت. بررسیهای فلوسیتومتری با استفاده از نشانگر نشر‏زای DAPI نشان داد که تیمار سلولی با داروهای سولفونامیدی تغییر محسوسی را در پراکنش سلولها در فازهای مختلف چرخه‏ سلولی در مقایسه با شاهد منفی به همراه ندارد (شکل 4 و 5). این در حالی بود که تیمار سلولها با دوکسوروبیسین جابه جایی مشخصی از سلولها را از مرحله G1 به مراحل S (معادل با 24 درصد) و G2 (معادل با 12 درصد) مجموعاً به میزان 36 درصد نشان می‏داد. همان طور که در مقدمه ذکر شد دوکسوروبیسین در DNA دورشته ای نفوذ می‏کند و باعث مهار RNA و  DNA پلیمراز وابسته به DNA می‏شود و در نتیجه مهار ساختِ RNA و DNA را در پی دارد (22). از طرفی این دارو با مهار کارکرد آنزیم توپوایزومراز II و باقی ماندن تنش توپولوژی DNA در زمان همانندسازی موجب مهار ساخت DNA و در نتیجه توقف در فاز S می‏گردد (22). مطالعات انجام شده در این تحقیق نیز توقف چرخه‏ سلولها در فاز S را در حضور دوکسوروبیسین تایید می‏نمود و به علاوه نشان می‏داد که دوکسوروبیسین توانایی آن را دارد که علاوه بر توقف در فاز S با اثرگذاری به روی عوامل مؤثر در کنترل چرخه‏ سلولی در فاز G2 مدت زمان استقرار سلولها را در فاز G2  و در نتیجه مدت زمان لازم برای تقسیم سلولی را افزایش دهد (شکل 4 و 5). این کار احتمالاً با از کار انداختن فسفاتازی چون Cdc25 به عنوان عامل اصلی برداشت فسفات مهاری از روی کمپلکس CyclinB/Cdc2 و در نتیجه مهار این کمپلکس روی می‏هد.

برخی از گزارشها وجود جهش را در برخی از سلولهای سرطان سینه گزارش و علت سرطانی شدن را به فعالیت لگام گسیخته محور Akt نسبت داده‏اند (4،18). بنابراین یکی از احتمالات در رابطه با نحوه‏ اثرگذاری داروهای انتخابی در این پژوهش می‏تواند تحریک رونویسی از ژن PTEN و یا مهار محور Akt از طریق کاهش سطح بیان ژنهای Akt1، Akt2 و mTOR قلمداد گردد. همان­طور که در نمودار1 و جدول3 نشان داده شده است در ارتباط با مسیر سلولی فعال شده در سلول­های تیمار شده با سولفاتیازول، کاهش سطح نسخه برداری از ژنهای Akt1، Akt2 و mTOR و افزایش نسخه برداری از ژن PTEN (فسفاتاز مهار کننده‌ مسیر Akt (15))  بیانگر کاهش ارسال علائم بقاء سلولی می‏باشد. بدیهی است که در چنین وضعیتی، توان زیستی سلولهای تیمار شده در حضور سولفاتیازول در مقایسه با سلولهای تیمار نشده (کنترل منفی) کاهش می‌یابد. لذا کاهش توان زیستی سلول‌ها در حضور سولفاتیازول و بروز اثرات ضد سرطانی آن نیازی به اثرگذاری به روی فرآیندهایی مانند آپوپتوز و یا توقف چرخه‏ سلولی را نخواهد داشت. جالب است که در ارتباط با سلولهای تیمار شده با سولفاستامید نتایج فوق مبنی بر مهار محور Akt حاصل نشد (جدول3). اما این دارو قادر است تا از طریق دیگری مانند افزایش زمان لازم برای طی شدن تمامی مراحل چرخه‌ سلولی (و نه یکی از مراحل خاص در چرخه‌ سلولی نظیر آنچه در شکل معمول توقّف چرخه‌ سلولی مشاهده می‏شود) باعث کاهش سرعت تقسیم سلولها گردد. این کار از طریق راه اندازی مسیر اتوفاژی امکان پذیر است که در آن با خورده شدن اندامکهایی نظیر میتوکندری و کاهش میزان تولید انرژی همه‌ فعالیتهای سلولی از جمله چرخه‏ سلولی دچار افت سرعت می‏گردند(5). اتوفاژی فرآیندی است که به طور طبیعی در زمان بروز یک تنش در محیط سلول (مانند تنش دارویی در اینجا) روی می‏دهد تا حیات سلول را از طریق کاهش سرعت انجام فرایندهای سلولی (از جمله تقسیم سلولی) و افزایش توان زیستی سلول‌ها (افزایش توان زیستی را در اینجا که به دلیل فعالیت مسیر Akt حاصل شده است را نباید با کاهش توان زیستی در آزمون MTT که به علت کاهش سرعت تقسیم سلولی ایجاد شده اشتباه گرفت) تضمین نماید. به این نوع اتوفاژی cytoprotective autophagy یا اتوفاژی بقاء اطلاق می‏گردد (5). به منظور اثبات به راه افتادن مسیر اتوفاژی در حضور سولفاستامید، میزان بیان ژن Atg5 با روش Real time RT-PCR مورد سنجش قرار گرفت و افزایش 5/3 برابری آن در قیاس با شاهد منفی دقیقاً افزایش فعالیت این مسیر سلولی را در زمان تیمار سلولها با داروی سولفاستامید نشان می‏دهد (نمودار1 و جدول3).

بنابراین در کل می‏توان گفت که سازوکار اثرگذاری داروی سولفاتیازول مهار مسیر Akt (کاهش توان زیستی سلولها) و سازوکار اثرگذاری داروی سولفاستامید راه اندازی مسیر اتوفاژی بقاء (کاهش سرعت تقسیم سولی) می‏باشد که هر دوی این سازوکارها در نهایت باعث کاهش تعداد سلولهای T-47D در زمان حضور دارو (در قیاس با جمعیت سلولی شاهد منفی) می‌شود.

تقدیر و تشکر

اعتبارات این کار توسط صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور (INSF) و حوزه‏ پژوهشی دانشگاه تهران فراهم شده است که بدین وسیله مراتب تشکر مؤلفین از این دو نهاد اعلام می‏گردد.

  1. Abdolmohammadi MH, Farahnak, S. Mohammadpour R, Safarian S. (2011) Study of the inhibitory effects of sodium sulfabenzamide on the growth and proliferation of T-47D cells with emphasis on apoptosis and cell cycle arrest. Journal of Qom University of Medical Sciences. 5(1): 61-74.
  2. Alnemri ES. (1997) Mammalian cell death proteases: A family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases. J. Cell Biochem. 64(1): 33-42.
  3. Bar-On, Ortal a; Shapira, Ma'anit a; Hershko, Dan D. a b.(2007) Differential effects of doxorubicin treatment on cell cycle arrest and Skp2 expression in breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs 18(10):1113-1121.
  4. Chau NM, Ashcroft M. (2004) Akt2: a role in breast cancer metastasis. Breast Cancer Res 6(1):55-57.

 
  1. Chen N, Debnath J. (2010) Autophagy and tumorigenesis. FEBS Lett.584(7):1427-35.
  2. Davis JW, Melendez K, Salas VM, Lauer FT, Burchiel SW. (2000) 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) inhibits growth factor withdrawal-induced apoptosis in the human mammary epithelial cell line, MCF-10A.  Carcinogenesis 21(5):881-886
  3. Dolak TM, Lever OW, Marsh D, Moran I, Sutton S. (1999) Ophthalmological preparation 18, p: 129.
  4. Dowejko A, Bauer RJ, Muller-Richter UDA, Reichert TE. (2009) The human homolog of the Drosophila headcase protein slows down cell division of head and neck cancer cells. Carcinogenesis 30(10):1678–1685.
  5. Eom YW, Kim MA, Park SS, Goo MJ, Kwon HJ, Sohn S, et al. (2005) Two distinct modes of cell death induced by doxorubicin: apoptosis and cell death through mitotic catastrophe accompanied by senescence-like phenotype. Oncogene 24(30):4765–4777.
  6. Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. (1992) Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol. 148(7):2207- 2216.
  7. Fukuoka K, Usuda J, Iwamoto Y, Fukumoto H, Nakamura T, Yoneda T, et al. (2001) Mechanisms of action of the novel sulfonamide anticancer agents E7070 on cell cycle progression in human non-small cell lung cancer cells.  Invest. New Drugs 19(3):219-227.
  8. Gennaro AR. (1990) Remigton's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. Mach Publishing Co., Eston, Pennsylvania, pp: 1174-1180.  
  9. Guichard C, Pedruzzi E, Fay M, Marie JC, Braut-Boucher F, Daniel F, et al. (2006) Dihydroxyphenylethanol induces apoptosis by activating serine/threonine protein phosphatase PP2A and promotes the endoplasmic reticulum stress response in human colon carcinoma cells. Carcinogenesis 27(9):1812–1827.
  10. Hsu CL, Yen GC. (2006) Induction of cell apoptosis in 3T3-L1 pre-adipocytes by flavonoids is associated with their antioxidant activity. Mol. Nutr. Food Res. 50(11):1072–1079.
  11. Jaclyn L, Gideon MB, Wendy BB, and Phillip ADS. (2008) Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway:    effective combinations and clinical considerations. Drug Resist. Updat.  11(1-2): 32–50.
  12. Javidannejad S, Hajibabaei M. (2001) Clinical information for Generic Drugs of Iran, 1st ed., University Sciences Publishing Co., Tehran, pp: 648-655.
  13. Javidannjad S, Hadjibabaei M. (2001) Medical Drugs Information: Generic Drugs of Iran. Tehran University Press, p. 648-655, [Text in Persian].
  14. Jhaveri MS, Rait AS, Chung KN, Trepel JB, Chang EH. (2004) Antisense oligonucleotides targeted to the human A folate receptor inhibit breast cancer cell growth and sensitize the cells to doxorubicin treatment. Mol. Cancer Ther. 3(12):1505-1512.
  15. Kim J, Freeman MR. (2003) JNK/SAPK mediates doxorubicin-induced differentiation and apoptosis in MCF-7 breast cancer cells. Breast Cancer Res. Treat. 79(3): 321–328.
  16. LaPensee EW, Schwemberger SJ, LaPensee CR, Bahassi E, Afton SE, Ben-Jonathan N. (2009) Prolactin confers resistance against cisplatin in breast cancer cells by activating glutathione-S-transferase. Carcinogenesis 30(8):1298–1304.
  17. Liao DC. (2003) Management of acne. J. Fam. Pract. 52(1):43-51
  18. Lown JW. (1993) Anthracycline and anthraquinone anticancer agents: current status and recent developments. Pharmacol. Ther. 60 (2): 185–214.
  19. Mohammadpour R, Safarian S, Abdolmohammadi MH. (2011) Study of the effects of acetazolamide in decreasing viability of the breast cancer cells in T-47D cell line. Journal of Science of University of Tehran 36(2):29-41.
  20. Mohammadzade N. (2001) Handbook of drugs and medicine for families, 2nd ed., Mazayer Publishing Co., Tehran, p: 92. 
  21. Mohan R, Banerjee M, Ray A, Manna T, Wilson L, Owa T, et al. (2006) Antimitotic sulfonamides Inhibit microtubule assembly dynamics and cancer cell proliferation. Biochemistry 45(17):5440-5449.
  22. Nagata S. (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res. 256(1):12-18.
  23. Nicholson DW, Thornberry NA. (1997) Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 22(8):299-306.
  24. Owa T, Yoshino H, Okauchi T, Yoshimatsu K, Ozawa Y, Sugi NH, et al. (1999) Discovery of novel antitumor sulfonamides targeting G1 phase of the cell cycle. J. Med. Chem. 42(19):3789-3799.
  25. Ozawa Y, Sugi NH, Nagasu T, Owa T, Watanabe T, Koyanagi N, et al. (2001) E7070, a novel sulfonamide agent with potent antitumor activity in vitro and in vivo. Eur. J. Cancer 37(17):2275-2282.
  26. Ruggy GH. (1946) Recent advances in pharmacology and materia medica. Ohio. J. Sci. 46(4) 208-210.
  27. Saltiel E, McGuire W. (1983) Doxorubicin (Adriamycin) Cardiomyopathy-A Critical Review. West J. Med. 139(3): 332–341. 
  28. Seydel JK. (1968)  Sulfonamides, structure-activity relationship, and mode of action. Structural problems of the antibacterial action of 4-aminobenzoic acid (PABA) antagonists. J. Pharm. Sci. 57(9):1455-1478.
  29. Supuran CT, Casini A, Scozzafava A. (2003) Protease inhibitors of the sulfonamide Type: Anticancer, Anti-inflammatory and Antiviral Agents. Med. Res. Rev. 23(5):535-558.
  30. Tyagi A, Singh RP, Agarwal C, Agarwal R. (2006) Silibinin activates p53-caspase 2 pathway and causes caspase-mediated cleavage of Cip1/p21 in apoptosis induction in bladder transitional-cell papilloma RT4 cells: evidence for a regulatory loop between p53 and caspase 2. Carcinogenesis 27(11):2269–2280.
  31. Van Hoogdalem EJ. (1998) Transdermal absorption of topical anti-acne agents in man; review of clinical pharmacokinetic data.  J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol 11(1):13-19.
  32. Yousefi S, Simon HU. (2009) Autophagy in cancer and chemotherapy. Results Probl. Cell Differ. 49:183-90.

 

 

پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 26، شماره 4 - شماره پیاپی 4
اسفند 1392
صفحه 532-549
  • تاریخ دریافت: 26 دی 1389
  • تاریخ بازنگری: 10 خرداد 1390
  • تاریخ پذیرش: 14 تیر 1390