نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Staphylococcus aureus is an important pathogen in humans and animals. This bacterium is important due to its great ability to gain resistance to a variety of antibiotics and cause severe diseases. Identifying acute infections caused by this bacterium using conventional methods such as culture is costly and time-consuming.In this study, the design and development of a new probe that specifically detects S. aureus by emitting a luminescence signal is carried out. The new recombinant probe, named Rluc-(ZpA963) 2, has the gene sequence encoding Renilla luciferase (Rluc) in fusion with the gene sequence encoding affibody (ZpA963)2. Protein expression was performed in Escherichia coli BL21 and protein purification was carried out by affinity chromatography. Kinetics studies show that Km of Rluc in the new probe is similar to recombinant Rluc; and are 1.07 µM and 1.22 µM, respectively. Therefore, the affinity for binding to cholentrazine does not change in Rluc-(ZpA963) 2. The binding of Rluc-(ZpA963)2 to S. aureus also show that the new probe is specifically capable of binding to bacteria at 4° C and 25 ° C. Moreover, the strongest signal is recorded in S. aureus growing in the Brain Heart broth. The present study may be used to develop commercial kits in the future.
کلیدواژهها English
طراحی و تولید کاوشگر بیولومینسانی جدید برای تشخیص مولکولی
استافیلوکوکوس اورئوس
یاسمن مزیدی1، رحمان امام زاده1*، محبوبه نظری2،3 و سیده شهربانو جعفری1
1 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوریهای زیستی، گروه زیست شناسی سلولی مولکولی و میکروبیولوژی
2 ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی ایران، مرکز تحقیقات غدد، انیستیتو غدد درون ریز و متابولیسم
3 ایران، تهران، ACECR، پژوهشکده ابن سینا، مرکز تحقیقات ریز فناوری زیستی،
تاریخ دریافت: 03/03/1401 تاریخ پذیرش: 07/10/1401
چکیده
باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل بیماریزای مهم در انسان و حیوان محسوب میشود. این باکتری به دلیل توانایی بسیار زیادش در کسب مقاومت نسبت به انواع آنتیبیوتیکها و در نهایت ایجاد بیماریهای شدید حائز اهمیت می باشد. شناسایی عفونتهای حاد ناشی از این باکتری با استفاده از روشهای متداولی مانند کشت، کاری هزینهبر و زمانبر میباشد. افی بادیها پلی پپتیدهای تک قلمرویی با وزن مولکولی حدود 5/6 کیلو دالتون هستند که در اتصال به طیف وسیعی از مولکولها اختصاصی هستند. در مطالعه حاضر کاوشکر نوترکیب جدید با نام Rluc- (ZpA963)2 با دو توالی ژنی کدکننده افی بادی (ZpA963)2 متصل به توالی ژنی کدکننده رنیلا لوسیفراز (Rluc) طراحی و سنتز شد. برای بیان پروتئین نوترکیب نیز از باکتری اشریشیاکلی استفاده شد و خالصسازی پروتئین نوترکیب نیز به روش کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. مطالعات سینتیک آنزیمی نشان داد که Km آنزیم Rluc در ساختار کاوشگر جدید مشابه با آنزیم Rluc نوترکیب و به ترتیب 07/1 و 22/1 میکرومولار میباشد و بیانگر این است که الحاق (ZpA963)2 به آنزیم Rluc، در تمایل اتصال به سوبسترای آن تداخلی ایجاد نکرده است. همچنین بررسی اتصال Rluc- (ZpA963)2 به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نشان داد که کاوشگر جدید قابلیت اتصال به باکتری را در دماهای 4 و 25 درجه سانتی گراد به طور اختصاصی دارد. علاوه براین بررسیها نشان داد بیشترین سیگنال لومینسانس مربوط به باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس کشت شده در محیط برین هارت براث میباشد. مطالعه حاضر ممکن است برای توسعه کیتهای تجاری جهت تشخیص و جداسازی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: افی بادی ZpA963، استافیلوکوکوس اورئوس، رنیلا لوسیفراز (Rluc )، لومینسانس
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: sci_rahman@yahoo.com
مقدمه
استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل بیماری زای مهم در انسان و حیوان محسوب میشود [27, 28]. این سویه از علل شایع عفونتهای پوستی و بیماریهای ناشی از مواد غذایی (FBD) در انسان، سپسیس در بیمارستانها و شیرخوارگاهها، ورم پستان در حیوانات شیرده و علاوه براین دلیل عفونتهای پوستی در احشام محسوب میشود [16, 35]. حیواناتی چون سگ، گربه و اسب میتوانند نقش مهمی در انتقال استافیلوکوکوس اورئوس به انسان داشته باشند [19, 33].
فاکتورهای بیماریزایی استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل ترشحی یا اتصالی به غشاء تشکیل شده است که باعث فرار از سیستم ایمنی، چسبندگی بافتی و لیز سلولی می شود [15]. عوامل دخیل در فرار از سیستم ایمنی شامل بتا-لاکتاماز و پروتئین A استافیلوکوکوس اورئوس (SpA) میباشد. پروتئینA ، پروتئین حفاظت شدهی است که نقش بسیار مهمی در پاتوژنز این باکتریها دارد [14, 19, 20]، بنابراین، این پروتئین میتواند به عنوان یک نشانگر تشخیصی برای این باکتریهای بیماری زا باشد [24]. SpA با وزن مولکولی حدود 42 کیلو دالتون، دارای پنج قلمرو همولوگ شامل قلمروهای E، D، A، B و C میباشد [25] و توسط انواعی از پروتئین ها از جمله آنتی بادی های ضد پروتئین A نشاندار شده [17]، آنتی بادی های تک قلمرویی و افی بادیها مورد هدف قرار میگیرد [30, 31].
افی بادیها پلی پپتیدهای تک قلمرویی با وزن مولکولی حدود 6.5 کیلو دالتون هستند که برای اتصال به طیف وسیعی از مولکول ها مانند گیرنده فاکتور رشد اپیدرم انسانی 2 [18]، انسولین [23]، گیرنده فاکتور نکروز تومور [34] و آلبومین سرم انسانی [26] اختصاصی هستند [32, 39, 40]. در مقایسه با آنتیبادی ها و آنتیبادیهای تک قلمرویی، که بهطور گسترده در فلوسیتومتری و روشهای ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) استفاده میشوند، مولکولهای افی بادی این مزیت را دارند که در شکل محلول در سلولهای میزبان مختلف بیان میشوند. اختصاصیت و میل ترکیبی زیاد، همراه با ثابت های تفکیک پایین، افی بادی ها را به ابزارهای مفیدی برای توسعه کاوشگرهای جدید تبدیل کرده است [38, 40]. اخیراً چندین افی بادی از جمله ZSPA-1، ZpA670، ZpA963 و ZpA964 برای اتصال به SpA گزارش شده است [15, 36]. در میان آنها، ZpA963 به دلیل اختصاصیت زیاد برای اتصال به SpA بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مطالعات نشان داده است که این مولکول قادر به اتصال به هر پنج قلمروی ساختاری SpA با میل ترکیبی مشابه میباشد [15]. اگرچه اتصال اختصاصی ZpA963 به SpA جذاب میباشد، ولی تاکنون این افی بادی به همراه پروتئین گزارشگر لوسیفراز برای تشخیص مستقیم SpA بر روی سطح سلول استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه نشده است.
لوسیفرازها پروتئین های گزارشگر هستند که به طور موفقیتآمیزی برای توسعه انواع مختلف کاوشگرهای مولکولی استفاده شدهاند [2, 8, 30, 34]. در سالهای اخیر نیز استفاده از این کاوشگرهای مبتنی بر لوسیفراز برای کاربردهای بالینی مورد توجه قرار گرفته است [10, 12]. بنابراین در این مطالعه از ویژگیهای جالب افی بادی ZpA963 در اتصال اختصاصی به SpA و همین طور ویژگیهای قابل توجه پروتئین گزارشگر رنیلا لوسیفراز، برای طراحی و ساخت یک کاوشگر جدید استفاده شده است. این کاوشگر مولکولی جدید به نام Rluc-(ZpA963)2 توسط اتصال قطعه کد کننده توالی Rluc به دو تکرار از توالی کد کننده افی بادی ZpA963، طراحی و ساخته شد و کاوشگر حاصل نیز برای تشخیص باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، توسط دستگاه لومینومتر استفاده شد.
مواد و روشها
همسانه سازی ناقل pCold I حاوی قطعه ژنی Rluc-(ZpA963)2
برای ساخت کاوشگر متصل شونده به پروتئین A باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به همراه پروتئین گزارشگر رنیلا لوسیفراز، از دو ناقل شامل ناقل اول، pCold I دارای قطعه ژنی (ZpA963)2 در کنار ژن EGFP که قبلا توسط شاکران و همکاران سنتز شده بود [9] و ناقل دوم، pCold I دارای قطعه ژنی کد کننده Rluc، استفاده شد. برای این منظور ابتدا باکتریهای دارای ناقل اول و دوم بطور جداگانه در محیط کشت مایع LB دارای آنتیبیوتیک در دمای ℃ 37 برای 16 ساعت کشت داده شدند. در ادامه پس از استخراج ناقل از این باکتری ها جهت ویرایش و هضم آنزیمی انجام شد
پس از تایید صحت استخراجها، جهت خارج کردن ژن EGFP از ناقل pCold I حاوی ژن (ZpA963)2، از آنزیمهای محدودکنندهی NdeI و XhoI استفاده شد. این دو آنزیم در جایگاه چندگانه همسانه سازی (Multiple Cloning Site) در ناقل pCold I، وجود دارند و در ابتدا و انتهای ژن EGFP قرار دارند [9]. ناقل دوم که pCold I دارای ژن Rluc واقعشده در بین دو جایگاه برشی مشابه میباشد، نیز توسط آنزیمهای محدودکنندهی NdeI و XhoI تیمار شد تا امکان خروج قطعهی ژنی Rluc فراهم شد. الحاق قطعه ژنی Rluc به ناقل pCold I حاوی ژن (ZpA963)2، پس از واکنش هضم، توسط آنزیم T4 لیگاز صورت گرفت. ناقل نوترکیب با استفاده از انتقال شیمیایی به E. coli DH5a منتقل شد و مدت یک شب در محیط LB در دمای ˚C37 کشت شد [4]. سپس تایید همسانه سازی با انجام واکنش تعیین توالی تایید شدند.
بیان و خالص سازی Rluc-(ZpA963)2
به منظور بیان پروتئین نوترکیب، ناقل نوترکیب حاوی تواکی کد کننده Rluc-(ZpA963)2 به سلولهای بیانیBL21 E. coli منتقل شد و سپس این سلولها در 200 میلیلیتر محیط کشت LB تلقیح شدند و در دمای ˚C 37 انکوبه شد تا در طول موج 600 نانومتر به دانسیته نوری 0.9-0.8 برسند. سپس، سلول ها با افزودن IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactoside)، در غلظت نهایی 0.3 میلی مولار و در دمای ˚C15 و 150 دور در دقیقه برای یک شب تیمار شد. سلول ها در نهایت توسط سونیکاسیون لیز شد. پروتئین نوترکیب Rluc-(ZpA963)2 با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل سفاروز خالص شدند. پس از خالص سازی پروتئین، آنالیز PAGE-SDS برای تایید کیفیت خالص سازی انجام شد. همچنین، سنجش برادفورد برای تخمین غلظت پروتئین خالص شده انجام شد. همزمان بیان و خالص سازی Rluc مشابه با مطالعات قبلی انجام شد [9].
سنجش فعالیت رنیلا لوسیفراز
برای سنجش فعالیت آنزیم ، 100 میکرولیتر از معرف سنجش حاوی 100 میلیمولار NaCl در بافر Tris-HCl 50 میلیمولار (pH 7.8 و 25 درجه سانتیگراد) با غلظتهای مختلفی از کولنترازین (23/0 تا 30 میکرومولار) در یک لوله مخلوط شد. واکنش با افزودن آنزیم Rluc یا Rluc-ZpA963 در غلظت نهایی 3 نانومولار آغاز شد و نشر نور طی 5 ثانیه توسط لومینومتر (لومینومتر برتولد سیریوس) ثبت شد و اطلاعات حاصل با ساتفاده از نرم افزار گرفپد پیرامیز 6 تحلیل شد.
سنجش اتصال افی بادی
سنجشهای اتصال کاوشگر با تیمار کاوشگر لومینسانس Rluc- (ZpA963)2 در حضور استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 6538) انجام شد. باکتری های کشت شده در فاز رشد لگاریتمی در محیط کشت LB، در دمای ˚C37، به مدت 10 دقیقه با سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند. رسوب حاصل با بافر فسفات سالین (PBS، pH 7 4) شسته شد و سپس در PBS دارای عوامل بلاک کننده (2.5% آلبومین سرم گاوی (BSA) و 0.05% tween 20) مجدداً معلق شد. سپس سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس با کاوشگر و آنزیم رنیلا لوسیفراز بطور جداگانه (در غلظت نهایی 20 نانومول در لیتر) برای مدت زمان 5 و 15 دقیقه برچسب گذاری شدند. برای از بین بردن اتصالات غیراختصاصی، نمونهها متعاقباً با PBS شسته شدند و به مدت 10 دقیقه با سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند. سلول های استافیلوکوکوس اورئوس نشاندار شده با استفاده از لومینومتر مورد مطالعه قرار گرفتند.
به منظور بررسی اختصاصیت اتصال کاوشگر، سنجش اتصال کاوشگر به سلولهای اشریشیا کلی با دستور عمل مشابه با سلول های استافیلوکوکوس اورئوس انجام شد. همچنین به منظور بررسی اثر تعداد سلول بر سیگنال کاوشگر، ابتدا دامنه ای از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (cell / ml 108 × 8/0 تا cell / ml 108 × 2 ) آماده شد و در PBS تحت تاثیر عوامل بلاک کننده (2.5% آلبومین سرم گاوی (BSA) و 0.05% tween 20) تیمار شد. پس از شتشوی سلولها با PBS، هر یک از نمونه ها با غلظت ثابت از کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 ( 20 نانومولار) به مدت 5 دقیقه تیمار شد. کاوشگرهای متصل نشده با اضافه کردن بافر PBS و انجام سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه با سرعت g 5000 حذف و در نهایت با اضافه کردن محلول کولنترازین (غلظت نهایی 10 میکرومولار) به نمونه های سیگنال هر یک از نمونه ها در دستگاه لومینومتر سنجیده شد. نتایج با استفاده از نرم افزار اکسل 2020 تحلیل شد.
کارایی اتصال کاوشگر به سلول های استافیلوکوکوس اورئوس رشد کرده در سه محیط کشت لوریا-برتانی نوتریانت و برین هارت براث نیز مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور پس از کشت شبانه در هریک از محیط های کشت به صورت جداگانه، تعداد cell / ml 108 × 6/1 از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس آماده و پس از انجام تیمار با عوامل بلاک کننده (2.5% آلبومین سرم گاوی (BSA) و 0.05% tween 20) و کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 ( 20 نانومولار) و حذف کاوشگرهای متصل نشده با انجام سانتریفیوژ (g 5000 به مدت 10 دقیقه) سنجش اتصال با اضافه کردن محلول کولنترازین (غلظت نهایی 10 میکرومولار) در دستگاه لومینومتر انجام شد.
نتایج
در مطالعه حاضر یک کاوشکر نوترکیب دارای توالی ژنی کد کننده افی بادی (ZpA963)2 در الحاق با توالی ژنی کد کننده Rluc طراحی و ساخته شد و سینتیک آنزیمی و کارایی اتصالی آن نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که کاوشگر نوترکیب با نام EGFP- (ZpA963)2 توانایی اتصال اختصاصی به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس دارد.
شکل 1: شماتیکی از کاوشکر نوترکیب Rluc- (ZpA963)2، دارای توالی ژنی کد کننده افی بادی ،(ZpA963)2 (fA2) در الحاق با توالی ژنی کد کننده Rluc طراحی و ساخته شده برای شناسایی سلول استافیلوکوکوس اورئوس
طراحی، بیان و تخلیص کاوشگر نوترکیب Rluc- (ZpA963)2
واکنش الحاق ناقل pCold I حاوی توالی کد کننده افی بادی (ZpA963)2 و قطعهی ژنی Rluc در جایگاه های محدود اثر NdeI و XhoI، در حضور آنزیم T4 DNA Ligase و در دمای ˚C22 انجام شد و ناقل نوترکیب با نام (ZpA963)2 pCold I RLuc ایجاد شد (شکل 2، الف). ناقل نوترکیب به باکتری های اشریشیا کلی مستعد به روش شیمیایی ترنسفورم شد. با هدف غربالگری اولیه تعدادی از کلنیهای رشد یافته انتخاب و فعالیت آنزیم رنیلا لوسیفراز در انها با اضافه کردن محلول سوبسترای کولنترازین توسط دستگاه لومینومتر بررسی شد. سپس با استخراج پلاسمید از دو کلنی، مرحله همسانه سازی با انجام واکنش تعیین توالی تایید شد. توالی کامل کاوشگر در پایگاه داده NCBI تحت شماره دسترسی GenBank MH2572398 ثبت شد.
به منظور بیان پروتئین، پس از تهیه کشت تازه با دانسته نوری برابر با 0.8 از تعدادی از کلنی های حاوی (ZpA963)2 pCold I RLuc، فرایند القای بیان توسط IPTG انجام شد. سلول های باکتریایی حاصل توسط سانتریفیوژ جمع آوری و توسط فرآیند سونیکاسیون لیز شد. پس از انجام سانتریفیوژ خالصسازی پروتئین نوترکیب از محلول رویی، توسط کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA انجام شد. کیفیت Rluc- (ZpA963)2 توسط SDS-PAGE بررسی شد. مطالعه SDS-PAGE نشان دهند یک نوار پروتئینی در محدودهی 45 تا 2/66 کیلودالتون میباشد که میتواند با وزن محاسبه شده برای پروتئین نوترکیب (84/53 کیلودالتون) تطابق داشته باشد (شکل 2، ب).
شکل 2: الف) کاوشکر نوترکیب Rluc- (ZpA963)2، دارای توالی ژنی کد کننده افی بادی (ZpA963)2 در الحاق با توالی ژنی کد کننده Rluc طراحی و ساخته شده، ب)نتایج الکتروفورز کاوشگر نوترکیب Rluc-(ZpA963)2 که به ترتیب در چاهک شمارهی یک، 5 مایکرو لیتر اندازه نمای پروتئین، شمارهی دو پروتئین نوترکیب به میزان 1 مایکرو لیتر و در چاهک سوم به میزان 3 مایکرو لیتر بارگذاری شدهاند.
تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد نشان داد که غلظت پروتئین خالص شده 5/0 میلی گرم در میلی لیتر است. پروتئین های نوترکیب خالص شده برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گرفت. با توجه به این که کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 دارای یک قلمرو متصل شونده به پروتئین A و یک قلمرو گزارشگر لوسیفرازی میباشد، ارزیابی کارایی هر یک از قلمروها بهطور جداگانه انجام شد.
مطالعات سینتیکی Rluc- (ZpA963)2
به منظور بررسی خصوصیتهای سینتیکی آنزیم Rluc متصل به کاوشگر، Km Rluc- (ZpA963)2 محاسبه و با Kmانزیم Rluc مقایسه شد. به این منظور غلظتهای مختلفی از سوبسترای کولنترازین در دامنهی از چند غلظت کمتر و بیشتر از Km آنزیم در بافر Tris-NaCl تهیه شد و فعالیت آنزیمها در غلظتهای مختلف سوبسترا و در دستگاه لومینومتر سنجیده شد. با استفاده از نرمافزار گرفپد پیرامیز 6 نیز نمودار مکائیلیس- منتن برای هر دو نمونه رسم شد (شکل 3).
مقدار Km برای آنزیم Rluc 22/1 میکرومولار و برای کاوشگر آنزیمی Rluc- (ZpA963)2 در حدود 07/1 میکرومولار میباشد. مقایسهی Km ها نشان میدهد الحاق توالی (ZpA963)2 با لوسیفراز در تمایل اتصال آنزیم به سوبسترا تاثیر قابل توجهی ندارد.
نتایج سنجش اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2
به منظور ارزیابی کارایی پروتئین نوترکیب حاصل، عملکرد Rluc-(ZpA963)2 در شناسایی و اتصال به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، تحت تاثیر فاکتورهای مختلفی مانند مدت زمان تیمار، تعداد سلولهای باکتریایی، دما و محیط کشت باکتری، بررسی شد.
شکل 3: الف) نمودار میکائیلیس-منتن آنزیم Rluc و ب) کاوشگر Rluc- (ZpA963)2، محور افقی غلظت کولنترازین (µM) و محور عمودی فعالیت آنزیم (RLUC/S) را نشان میدهد.
سنجش اتصال کاوشگر با تیمار Rluc- (ZpA963)2 با سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 6538) در دو زمان 5 و 15 دقیقه انجام شد.
به طور مشابه به منظور بررسی هرگونه میانکنش غیر اختصاصی بین آنزیم لوسیفراز و سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس، میانکنش Rluc نوترکیب با سلول های انجام شد. هریک از سلولها تیمار شده با بافر PBS شستشوی شد و سیگنال حاصل از آنزیم رنیلا لوسیفراز با اضافه کردن محلول کولنترازین ( 10 میکرمولار) در دستگاه لومینومتر ثبت شد. همچنین به منظور بررسی اختصاصیت اتصال کاوشگر به سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس، مطالعه اتصال Rluc- (ZpA963)2 و Rluc به سلولهای اشریشیا کلی، تحت شرایط مشابه انجام شد ( شکل 4).
شکل 4: نمودار سنجش اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 و آنزیم Rluc در مدت زمان 5 و 15 دقیقه بعد از انکوباسیون با سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی
نتایج مقایسه سنجش اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 و آنزیم Rluc در مدت زمان 5 و 15 دقیقه بعد از انکوباسیون با سلولها نشان می دهد که کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 بطور اختصاص به سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس متصل می شود و علاوه براین مقایسه مدت زمان انکوباسیون کاوشگر نشان میدهد که مدت زمان تیمار 5 و 15 دقیقه اثر مشابهی در سنجش اتصال کاوشگر به سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس دارند. همچنین تیمار اشریشیا کلی در زمان های 5 و 15 دقیقه با کاوشگر نوترکیب یا آنزیم نوترکیب سیگنال قابل ملاحظه ای ایجاد نمی کند در نتیجه اتصال Rluc- (ZpA963)2 به طور اختصاصی به سلول های استافیلوکوکوس اورئوس و از طریق قلمروی (ZpA963)2 انجام می شود.
تحلیل اتصال کاوشگر نوترکیب به تعداد متفاوت از استافیلوکوکوس اورئوس
برای بررسی اثر تعداد سلول در اتصال به کاوشگر Rluc-
(ZpA963)2، تعداد مختلفیاز باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (cell / ml 108 × 8/0 تا cell / ml 108 × 2 ) با غلظت ثابت از کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 ( 20 نانومولار) تیمار و سیگنال اتصال در حضور کولنترازین ( 10 میکرمولار) در دستگاه لومینومتر ثبت شد (شکل 5). نتایج نشان می دهد همزمان با افزایش تعداد سلولها میزان نشر نور لومینسانس ناشی از اتصال کاوشگر افزایش می یابد که بیانگر افزایش تعداد کاوشگرهای متصل به سلول می باشد. همچنین نتایج نشان می دهد با افزایش تعداد سلول از cell / ml 108 × 6/1 تا cell / ml 108 × 2 افزایش قابل ملاحظه ای در نشر نور ناشی از اتصال کاوشگر به سلول ایجاد نمی شود و به نظر میرسد در این حالت اتصالات کاوشگر به سلول به حالت اشباع رسیده است. افزایش سیگنال لوسیفراز و حالت اشباع پس از آن نشان می دهد اتصال استافیلوکوکوس اورئوس و Rluc- (ZpA963)2 اختصاصی است.
شکل 5: نمودار مربوط به اثر تعداد سلولهای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بر اتصال کاوشگر
اثر دما در سنجش اتصال کاوشگر
بررسی اثر دو دمای 4 سانتی گراد و 25 سانتی گراد در کارایی اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه شد. به این منظور باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (cell / ml 108 × 6/1 ) و کاوشگر ( 20 نانومولار) به مدت 15 دقیقه در دماهای 4 سانتی گراد و 25 سانتی گراد تیمار و سنجش فعالیت لوسیفرازی با افزودن کولنترازین در دستگاه لومینونتر انجام شد (شکل 6). نتایج نشان می دهد تیمار در هر دو دمای 4 سانتی گراد و 25 سانتی گراد سیگنال قابل اندازه گیری ایجاد می کند. با این حال، فعالیت کاوشگر متأثر از دما باشد و دمای 4 سانتی گراد در مقایسه با 25 سانتی گراد، میزان سیگنال سنجش شده تا حدود 2 بیشتر برابر می باشد.
شکل 6: نمودار مربوط به اثر دما بر روی میزان اتصال کاوشگر
اثر محیط کشت در سنجش اتصال کاوشگر
بررسی اثر رشد باکتری در محیط های مختلف اثر سه محیط کشت لوریا-برتانی، نوتریانت و برین هارت براث بر کارایی اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه شد. به این منظور باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (cell / ml 108 × 6/1 ) رشد یافته در سه محیط کشت مختلف لوریا-برتانی، نوتریانت و برین هارت براث با غلظت ثابت از کاوشگر ( 20 نانومولار) به مدت 15 دقیقه تیمار و سنجش فعالیت لوسیفرازی با افزودن کولنترازین در دستگاه لومینونتر انجام شد (شکل 7).
نتایج بیان می کند سیگنال قابل اندازه گیری در باکتری رشد کرده در سه محیط کشت لوریا-برتانی، نوتریانت و برین هارت براث ایجاد می شود با این حال، سیگنال کاوشگر به طور معنی داری در باکتری رشد کرده در محیط کشت برین هارت در مقایسه با دو محیط کشت دیگر بیشتر است.
بحث
باکتری استافیلوکوکوکوس اورئوس یکی از مهمترین عوامل بیماری زایی است که باعث مسمومیت غذایی و تأثیرات بالینی حاد و مزمن میشود و هرساله گزارشهای متعددی از ابتلا بــه ایــن بیماریها منتشر میشود [19, 33]. پروتئین A استافیلوکوکوس اورئوس (SpA) پروتئین حفاظت شدهی است که نقش مهمی در پاتوژنز این باکتری دارد [19, 20]، بنابراین، این پروتئین میتواند به عنوان یک شاخص تشخیصی برای این باکتری بیماری زا باشد. SpA با وزن مولکولی حدود 42 کیلو دالتون، دارای پنج دمین همولوگ شامل دمین های E، D، A، B و C میباشد و توسط انواعی از پروتئین ها از جمله آنتی بادی های ضد پروتئین A [17]، آنتی بادی های تک دمینی و افی بادیها مورد هدف قرار گرفته است [21, 31].
ZpA963 یک افی بادی ضد پروتئین A است و به دلیل اختصاصیت بالای برای اتصال به SpA مورد توجه بوده است. مطالعات نشان داده است که این مولکول قادر به اتصال به هر پنج قلمروی ساختاری SpA با میل ترکیبی مشابه است [21]. اخیرا شاکران و همکاران از ZpA963 در الحاق با EGFP کاوشگر لومینسانسی برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس توسعه دادند. با وجود کارآمدی کاوشگر EGFP-ZpA963 در شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس، سنجش مبتنی بر EGFP نیازمند دستگاههای به نسبت گران قیمت فلوسایتومتری میباشد. همچنین EGFP برای برانگیختگی نیاز به منبع نور خارجی دارد که ایجاد سیگنال پسزمینه و کاهش نسبت سیگنال به تداخل در کاوشگر میشود.
لوسیفرازها آنزیم های هستند که نشر نور سریع، تشخیص آسان، حساسیت زیاد دارند [7، 37]. بعلاوه بعلت عدم وجود سیگنال پسزمینه در سنجشها و استفاده از دستگاههای به نسبت ارزانقیمت لومینومتری حین درسنجش مورد توجه قرار گرفته اند [13, 22, 29]. تاکنون کاوشگر های مولکولی موفقی بر اساس رنیلا لوسیفراز برای شناسایی مرگ برنامه ریزی شده سلولی، تشخیص سلول های سرطانی و شناسایی گیرنده های فاکتور رشد اپیدرمی توسعه یافته است [6]. در این مطالعه یک کاوشگر مولکولی جدید به نام Rluc-(ZpA963)2 با الحاق Rluc با دو تکرار از افیبادی متصل شونده به پروتئین A با نام ZpA963، ساخته شد و کارایی کاوشگر حاصل برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس به روش لومینومتری نشان داده شده است.
الحاق پروتئین های نوترکیب ممکن است در عملکرد هر قلمرو تداخل ایجاد کند. گزارش شده است که جایگاه فعال آنزیم رنیلا لوسیفراز شامل اسیدها امینه آسپارتیک اسید 120، گلوتامیک اسید 144 و هیستیدین 285 در زیر واحد بزرگ پروتئین قرار دارند و نسبت به تغییرات کانفورماسیونی حساس هستند [3]. به منظور بررسی اثر قلمروی افی بادی بر روی فعالیت قلمروی رنیلا لوسیفراز در کاوشگر Rluc-(ZpA963)2، Km آنزیم Rluc در ساختار کاوشگر و Km آنزیم Rluc نوترکیب محاسبه شد. در نتیجه مطالعه نشان داد که مقادیر Km تقریبا مشابه با هم دیگر هستند و الحاق (ZpA963)2به Rluc تغییرات کانفورماسیونی معنی داری که منجر به تغییر در تمایل آنزیم به سوبسترای شده است ایجاد نکرده است. در مطالعه حاضر الحاق دو پروتئین Rluc و (ZpA963)2 در ساختار کاوشگر به واسطه لوپ انعطاف پذیر G4S انجام شده است. در نتیجه نتایج نشان می دهد که این لوپ فاصله کافی برای جلوگیری از ممانعت فضایی زیر واحد (ZpA963)2 بر روی Rluc در ساختار کاوشگر ایجاد می کند. مطالعات حاصل همچنین با نتایج غفوری و همکاران مطابقت دارد [34] و تایید میکند که فعالیت آنزیم رنیلا لوسیفراز در الحاق با سایر پروتئین های کوچک احتمالا در حضور لینکر انعطاف پذیر G4S تا حدود زیادی حفظ می شود.
گزارش شده است که (ZpA963) و نیز EGFP-(ZpA963)2 تمایل قابل ملاحظه ای به پروتئین A سطح استافیلوکوکوس اورئوس دارند [9, 38, 39]. مقایسه نتایج سنجش اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 و آنزیم Rluc با سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس نشان داد که قلمرو (ZpA963)2 در الحاق با Rluc قابلیت اتصال به سطح استافیلوکوکوس اورئوس را دارد و سیگنال قابل اندازه گیری در دستگاه لومینومتر ایجاد می کند. این اتصال به طور اختصاصی از طریق قلمروی (ZpA963)2 انجام می شود و آنزیم Rluc نوترکیب فاقد افی بادی سیگنال موثر ایجاد نمی کند. بعلاوه مطالعات نشان می دهد که اتصال کاوشگر Rluc- (ZpA963)2 به استافیلوکوکوس اورئوس در دامنه cell/ml 108 × 6/1 تا cell/ml 108 × 2 سلول با الگوی هایپربولیک انجام می شود و با افزایش تعداد سلول به اشباع می رسد. همچنین کاوشگر یا آنزیم رنیلا لوسیفراز نوترکیب قابلیت اتصال به سطح سلول های اشریشیاکلی را ندارند. در نتیجه اتصال Rluc- (ZpA963)2 به سلولهای استافیلوکوکوس اورئوس به طور اختصاصی انجام شده است.
بررسی تأثیر تغییر شرایط محیطی بر اتصال کاوشگر به سلول استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه شد. با وجود اینکه مدت زمان تیمار سلول ها با کاوشگر در دو زمان 5 و 15 دقیقه تاثیری روی افزایش سیگنال کاوشگر نداشت، دما و محیط کشت میتواند باعث اتصال مطلوب کاوشگر به باکتری شود. در مقایسه با دمای 25 درجه سانتی گراد، انکوبه کردن کاوشگر در دمای 4 درجه سانتی گراد سیگنال مناسبتری در زمان 5 دقیقه ایجاد می کند. گزارش شده است که آنزیم رنیلا لوسیفراز یک آنزیم ناپایدار به لحاظ سینتیکی است و فعالیت آن در درجه حرارت های بالا به سرعت کاهش می یابد [5]. در نتیجه کاهش سیگنال کاوشگر در درجه حرارت 25 درجه سانتی گراد ممکن است به علت اثرات نامطلوب دما بر قلمروی Rluc باشد. با اینحال صرفنظر از سیگنال مناسب تر در دمای 4 درجه سانتی گراد، کاوشگر جدید توانایی ایجاد سیگنال در هر دو دمای 4 درجه سانتی گراد و درجه سانتی گراد 25 را دارد و می تواند برای سنجش های معمول در دمای اتاق نیز انجام شود.
تاثیر محیط کشت بر روی سیگنال حاصل از کاوشگر قابل ملاحظه است و استافیلوکوکوس اورئوس رشد کرده در محیط برین هارت براث با پس از تیمار با کاوشگر، سیگنال بیشتری در مقایسه با سلول های رشد کرده در محیط های کشت لوریا-برتانی و نوتریانت ایجاد می کنند. این موضوع با مطالعات پیشین مطابقت دارد. گزارش شده است که محیطهایی همانند لوریا براث، نوترینت براث و برین-هارت براث تأثیر معنی داری در میزان بیان پروتئین A توسط باکتری دارند. با این حال گزارش شده است که [11] میزان قابلتوجهی از پروتئین A توسط 99% از سویهها در زمانی که در محیط برین-هارت کشت داده میشوند تولید میشود؛ در نتیجه افزایش سیگنال در باکتری های رشد کرده در محیط برین-هارت براث ممکن است بعلت افزایش بیان پروتئین A در این سلول ها در مقایسه با سلول های رشد کرده در محیط های لوریا براث و نوترینت براث باشد.
نتیجه گیری
بطور کلی نتایج نشان داد که کاوشگر جدید Rluc- (ZpA963)2 دارای دو قلمروی (ZpA963)2 و Rluc میباشد. در حالی که به واسطه قلمروی افی بادی (ZpA963)2به سلول های استافیلوکوکوس اورئوس متصل می شود، به واسطه قلمروی Rluc سیگنال قابل اندازه گیری ایجاد می کند. سنجش این سیگنال توسط روش های به نسبت ارزانقیمت لومینومتری انجام می شود و در مقایسه با کاوشگرهای پیشین مبتنی بر EGFP که سنجش آنها توسط فرایند به نسبت زمان بر و گرانقیمت وابسته به دستگاه فلوسایتومتری است، سنجش سیگنال Rluc سریع و با روش های دستگاهی ارزانقیمت تر انجام می شود. همچنین برای انجام آن نیاز به تکنسین های آزمایشگاهی دوره دیده که یک عامل محدود کننده در استفاده از روش های فلوسایتومتری است، نمی باشد. گزارشگر فعلی در کنار سایر روش ها موجود می تواند سنجش استافیلوکوکوس اورئوس را امکانپذیر نماید و ممکن است در آینده در توسعه کیتهای تشخیصی برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مورد استفاده قرار بگیرد.
تضاد منافع:
نویسندگان اعلام می کنند که هیچ تضاد منافعی ندارند.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از حمایت مالی صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور (Iran National Science Foundation (INSF)) از این رساله قدردانی مینمایند. نویسندگان از حمایت دانشگاه اصفهان برای اجرای پژوهش حاصل در قالب پایان نامه کارشناسی ارشد در آزمایشگاه مهندسی پروتئین دانشگاه اصفهان قدردانی مینمایند.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)