مطالعه فعالیت کمپلکس­های Nic-امگا 3 و Pic-امگا 3 روی تیروزیناز قارچ و ویژگی ضد سرطانی آن­ها روی سلول­های 375A- ملانوما

فرهاد سنگین آبادی¹، نعمت االله غیبی^2*، عادله دیوسالار³، علی اکبر صبوری⁴ و پریچهر یغمایی¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² ایران، قزوین، دانشگاه علوم پزشکی قزوین، مرکز تحقیقات سلولی مولکولی، گروه بیوتکنولوژی و بیوفیزیک

³ ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم سلولی مولکولی

⁴ ایران، تهران، دانشگاه تهران، مؤسسه بیوشیمی و بیوفیزیک

تاریخ دریافت: 29/10/1400          تاریخ پذیرش: 30/03/1401

چکیده

روش­های درمانی کم خطر و کارآمد موضوع اصلی بسیاری از تحقیقات اخیر در زمینه درمان سرطان ملانوما بوده است. بر همین اساس، هدف در اینجا بررسی تأثیر کمپلکس‌های نیکوتینیک-امگا 3 و پیکولینیک اسید-امگا 3 برروی تیروزیناز قارچ و ویژگیهای ضد تکثیری آنها روی رده سلولی ملانوما 375A- بود. در بررسی حاضر، سلول‌ها در معرض سطوح مختلف کمپلکس‌های نیکوتین-امگا 3 و پیکولینیک-امگا 3 قرار گرفتند. برای مشاهده تکثیر سلولی، از روش MTT و میکروسکوپ معکوس استفاده شد. تجزیه و تحلیل کنتیکی اثر این کمپلکس­ها بر آنزیم تیروزیناز نیز مورد بررسی قرار گرفت. کمپلکس‌های نیکوتین-امگا 3 و پیکولینیک-امگا 3 با دنبال نمودن رفتاری وابسته به غلظت و زمان توانستند رشد سلولی را به طور قابل توجهی کاهش دهند. اثر مهارکنندگی معنی‌دار برای پیکولینیک-امگا 3 در غلظت کمتر با افزایش زمان مشاهده شد. از سوی دیگر، نیکوتین-امگا 3 سطح مشابهی از بازدارندگی را نشان نداد، و در 24 ساعت تنها سطح 200 میکرومولار معنی‌دار بود و در 48 ساعت و 72 ساعت، بازدارندگی معنی­دار بین 150-200 میکرومولار مشاهده گردید.  بدین معنا که رشد و تکثیر سلول­های سرطانی مورد بررسی به میزان قابل توجهی در زمان و غلظت مورد نظر کاهش یافت. شیوه عمل این دو کمپلکس بر روی تیروزیناز قارچ به صورت بازدارندگی رقابتی بود و مقادیر Ki شامل 2/5 و 1/5 میلی مولار، به ترتیب برای نیکوتین-امگا 3 و پیکولینیک-امگا 3 بود. به نظر می­رسد کمپلکس های نیکوتین-امگا 3 و پیکولینیک-امگا 3 دارای پتانسیل ضد تکثیری قوی در برابر سلول­های ملانوما هستند، که دال بر پتانسیل کاربردی آنها در درمان ملانوما می­باشند.

واژه های کلیدی: بازدارندگی رقابتی، تیروزیناز قارچ، پیکولینیک اسید، امگا 3، آنالیز سینتیکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 028-22302634، پست الکترونیکی:ngheibi@qums.ac.ir

مقدمه

ملانوما اگرچه شایعترین نوع سرطان پوستی نبوده ولی خطرناکترین و کشنده­ترین نوع آن است که غالبا با ملانوسیت­ها آغاز می­گردد، و پرتوهای فرابنفش از جمله عوامل اصلی آن شناخته شده است. از  دیگر عوامل بنیانی آن  می­توان به عوامل تضعیف کننده سیستم ایمنی، تماس با ترکیبات سمی و خال­های چندگانه مادرزادی اشاره نمود. پیشرفت ملانوما و بقای آن وابسته به سلول­های سرطانی و قابلیت دستکاری مسیر مرگ سلولی، گریز از نظارت ایمنی و زنده مانی در شرایط محیطی غیر مطلوب می­باشد. از این جهت است که این سلول­ها قابلیت زنده مانی در هیپوکسی را داشته و استرس اکسیداتیو ایجاد می­نمایند (8 و 10). پیشرفت­های تحقیقاتی روی جزئیات و مکانیسم­های کنترلی سلول­های ملانوما در چند دهه اخیر باعث روشن­ نمودن بسیاری از مسائل مبهم گردیده و راه برای استفاده هدفمند از آنزیم­های دخیل باز کرده و موجب ایجاد راه­های عملی و کاربردی در مقابله با ملانوما گردیده. از این میان می­توان به تیروزیناز (E.C.1.14.18.1) اشاره نمود که تغییر در میزان فعالیت آن نقشی بسیار بنیانی در ایجاد اختلالاتی چون ملانوما، هایپرپیگمانتاسیون، آلبینیسم و پیبالدیسم دارد. این اختلالات غالبا در نتیجه هیدروکسیله شدن L-تیروزین به L‐DOPA در مرحله اول ملانوژنز و به دنبال آن اکسیداسیون کاتکول­آمین به O-quinine  می­باشد (1-4، 11، 19و22).

همانطور که پیشتر اشاره گردیده، کاهش فعالیت تیروزیناز عامل ایجاد اختلالات پوستی شناخته شده و هدف قرار دادن این آنزیم می­تواند برای جلوگیری و درمان ملانوما مفید باشد (14 و 34). تیروزیناز قارچ با منشاء  Agaricus bisporus  مدلی خوبی برای طراحی بازدارنده­ها و بررسی فعالیت این آنزیم کلیدی می­باشد. با توجه به دردسترس بودن آن و شباهت ساختاری بالای آن به تیروزیناز پستانداران مدل بسیار مناسبی برای انجام چنین بررسی­هایی می­باشد. از بازدارنده­های مختلف تیروزیناز از قبیل ریسورسینیل مویتی (Resorcinyl moiety)، حلقه تیازول (Thiazole ring) (28)، کوجیک اسید (kojic acid)، هیدروکوئینون (Hydroquinone)، آربوتین (Arbutin) (7 و 18)، گاما-توجاپلیسین (γ-thujaplicin) (35) و بنزویک اسید و مشتقات پیریدین (benzoic acid & pyridine derivatives) (16) اشاره نمود که از نظر بازدارندگی آن­ها روی بیش­تولید ملانین مورد بررسی قرار گرفته­اند.

اسیدهای چرب غیراشباع به دلیل فعالیت ضد اکسیدانی بالا واجد خاصیت ضد سرطانی هستند. این نوع اسیدها بر اساس باندهای دوگانه به دوسته اسیدهای چرب چند اشباع­نشده  polyunsaturated fatty acids (PUFAs)) و اسیدهای چرب تک اشباع نشده (monounsaturated fatty acids) هر دو گروه دارای ویژگی­های مهمی هستند که باعث جلوگیری از بدخیمی غدد سرطانی  می­گردد. PUFAs متشکل از خانواده­های  3-n (امگا 3) و 6-n (امگا 6) می­باشد که می­تواند فعالیت ضد سرطانی در حالت درون شیشه­ای و درون جانداری داشته باشد (26، 30 و 32).

پیکولینیک اسید (PA) محصول طبیعی تجزیه تریپتوفان است که کرومیوم پیکولینات به عنوان یک مکمل رژیم غذایی برای کاهش وزن تجویز می­گردد (14 و 19). PA عمدتا به­عنوان تشدید کننده پاسخ­های ایمنی شناخته می­شود (6، 8 و 10). اسید نیکوتینیک و آمید آن نیکوتین آمید رایج ترین اشکال ویتامین B نیاسین (ویتامین B3 ) که می­تواند سطح کلسیم درون سلولی را به صورتی وابسته به زمان و غلظت کنترل نماید. علاوه بر این، غلظت نسبتاً بالای نیکوتینیک اسید (NA)   به­­واسطه القای تخریب بتا توبولین باعث تجزیه اسکلت سلولی می­شود. از آنجا که اسکلت سلولی نقش حیاتی در مهاجرت سلولی ایفا می کند، این تجزیه اسکلت سلولی توسط نیکوتین اسید ممکن است روند متاستاز را مختل کند (3، 28 و 33).

با در نظر داشتن پتانسیل بالای NA و PA در درمانی­های بالینی به دلیل دخیل بودن آنها در روندها و مکانیسم­های بنیانی سلولی و ارائه دیدگاهی بهتر از نحوه عملکرد آن­ها در کنار اسید چرب امگا 3 روی کنترل آنزیم تیروزیناز در سلول­های سرطانی 375A- ملانوما  به شیوه­های مختلف در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند. همچنین اثر کمپلکس­های NA و PA با اسید چرب امگا 3 بر میزان زنده­مانی سلول­های سرطانی با آزمون MTT مورد بررسی قرارگرفت.

مواد و روشها

کشت سلول: رده سلولی A-375 ملانوما از مجموعه بانک سلولی انستیتو پاستور )تهران، ایران( خریداری شد. محیط DMEM حاوی  ٪10سرم جنینی غیرفعال شده با گرما و 100U/ml پنی سیلین/استرپتومایسین برای کشت سلولها استفاده شد. پلیتهای کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد تحت 5CO₂ ٪ نگهداری شدند.

بررسی میزان بقا و تکثیر سلولی به روش  MTT: برای تعیین میزان بقا و تکثیر سلولها از روش MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) بر اساس پروتوکل قبلی استفاده شد. به طور خلاصه، 2500 سلول از رده 375A- ملانوما در هر یک از چاهک­های پلیت­های  96 خانه کشت داده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، سلولها در معرض غلظتهای مورد نظر از نیکوتینیک اسید-امگا 3 و پیکولینیک اسید-امگا 3  قرار گرفتند. آزمایشات برای هر گروه در سه تکرار و با گروه کنترل تیمار نشده در سه زمان مختلف  24، 48 و 72 ساعت انجام شد. پس از گذشت زمان­های مورد نظر، محیط کشت قبلی حذف و محیط  μl200 DMEM %10، وFBS  %10 ( mg/mL5) MTT  (سیگما، ایالات متحده) اضافه شد. پس از انکوباسیون به مدت 4 ساعت دیگر، محصول فورمازون احیا یافته داخل سلولی با جایگزینی 100 میکرولیتر از محیط  DMEM-1640 با همان حجم دی متیل سولفوکساید (DMSO) حل شد. مقادیر جذب در 570 نانومتر با دستگاه میکروپلیتریدر ( (BioTek, ELX800, USAاندازه­ گیری شد. غلظت مهار کننده نصف حداکثر  (IC₅₀) از هر آزمایش محاسبه شد.

آنالیز تراکم سلولها توسط میکروسکوپ معکوس: سلولهای  375A- ملانوما به تعداد  4×104 درون پلیـت 24 خانه­ای کشـت داده شـدند. پـس از گذشـت  24،   48 و 72 سـاعت از تیمار با دوزهای مختلف کمپلکس­های نیکوتینیک اسید-امگا 3 و پیکولینیک اسید-امگا 3، سـلول هـای گـروه کنتـرل و گروه­های تحت تیماری مختلـف بـه دقـت در زیـر میکروسـکوپ معکوس (Leica, Germany) مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز سنتیکی بازدارندگی MT: سینتیک بازدارندگی با استفاده از غلظت‌های مختلف L-DOPA (10-2.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، P-ALA و N-ALA (0، 4، 8، 12، 16 میلی‌مولار) ارزیابی شد، غلظت تیروزیناز 40 واحد بود. حالت مهاری و پارامترهای جنبشی توسط معادله Line weaver-Burk در یک شکل متقابل دو برابر معادله (1) (27)، که در آن km ثابت Michaelis است. v و V max به ترتیب سرعت واکنش اولیه و حداکثر سرعت واکنش را مشخص می کنند، و  [S] غلظت سوبسترا را نشان می دهد:

                               (1)

ثابت اتصال برای آنزیم آزاد (K_ic) از طریق نمودار خطی دیکسون معادله به دست آمد. (2) 1/v در مقابل[I]، که در آن (I) نشان دهنده غلظت بازدارنده است:

                                    (2)

ثابت اتصال برای کمپلکس سوبسترا-آنزیم (Kiu) از طریق نمودار خطی Cornish-Bowden-Eisenthal معادله (3) (9) از (V/S) در مقابل [I] توصیف شد:

                      (3)

آنالیز آماری: کلیه نتایج حاصل از این مطالعه در رابطه با  MTT با استفاده از روشهای آماری one way مورد تجزیه و  two way ANOVA  و ANOVA در نرم­افزار SPSS 28 (IBM, Armonk, NY, USA) تحلیل قرار گرفته و نمودارها در هر دو مورد با استفاده از نرم افزار Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)، با سطح معنی داری 01/0 و 05/0p< گزارش شدند.

نتایج

در بررسی اثر غلظت­های مختلف (200-0 میکرومولار) کمپلکس­های پیکولینیک اسید-امگا 3  و نیکوتینیک اسید-امگا 3 تحت تیمارهای زمانی مختلف 24، 48 و 72 ساعت، شاهد اثر معنی­دار این کمپلکس­ها  بر کاهش تکثیر و رشد سلولی بودیم. سلول­های تحت تیمار 24 ساعت با غلظت­های مختلف پیکولینیک اسید-امگا-3، مهار رشد سلول­های سرطانی ملانوما با افزایش غلظت نشان دادند ولی این افزایش مهار تنها از سطح 150 میکرومولار به بعد مشاهده گردید و تفاوت معنی­داری را در سطح 01/0 >p حادث گردید (شکل 1). روند مشابهی در تیمار زمانی 48 مشاهده شد ولی با افزایش فاکتور زمان، سطح غلظت 125 میکرومولار نیز مهار معنی­دار (05/0 >p) رشد سلولی را نشان داد. بیشترین مهارکنندگی رشد سلولی تحت تیمار با کمپلکس­ پیکولینیک اسید-امگا 3 در شرایط زمانی 72 ساعت مشاهده گردید، چراکه غلظت 100 میکرومولار این کمپلکس توانست رشد سلول­های ملانوها A-375 را به شکل معنی­داری (05/0 >p) مهار نماید. دیگر سطح­ها، 200-125 میکرومولار نیز مشابه دو تیمار زمانی قبلی باعث مهار معنی­دار سلول­های سرطانی گردیدند (شکل 1).

شکل 1- آنالیز بقای سلولها پس از در معرض قرار گرفتن با غلظتهای مختلف کمپلکس پیکلولینیک اسید-امگا-3. به تیمارهای زمانی در شکل­ها اشاره گردیده. علامت ستاره اشاره به اختلاف معنی­دار در سطح 5 (*) و 1 (**) درصد دارد.

واکنش سلول­های سرطانی ملانوما به نیکوتینیک اسید- امگا 3 کمپلکس تحت تیمارهای زمانی نامبرده در بالا تا حدی متفاوت از کمپلکس پیکولینیک اسید-امگا 3 بود. در تیمار زمانی 24 ساعت، اثری وابسته به غلظت در توان مهارکنندگی کمپلکس نیکوتینیک اسید- امگا 3 مشاهده گردید (شکل 2)، همانند کمپلکس قبلی، ولی این روند کاهش در نیکوتینیک اسید- امگا 3 کم نوسان­تر بود و صرفا بیشترین غلظت به کاربرده شده (200 میکرومولار) توانست مهارکنندگی معنی­داری (05/0 >p) را نشان دهد. با افزایش زمانی به 48 ساعت، این کمپلکس توانست مهارکنندگی معنی­داری رو سلول­های سرطانی در غلظت­های پایین­تر 175 و 150 میکرومولار داشته باشد. روند مشابهی در تیمار 72 ساعت مشاهده گردید، دال بر اینکه افزایش زمان اثری بر افزایش توان مهارکنندگی غلظت­های پایین­تر کمپلکس نیکوتینیک اسید- امگا 3 ندارد (شکل 2). تغییرات در تراکم سلول­های A375 ملانوما  قبل و بعد از تیمار با غلظت­های مختلف کمپلکس­های نیکوتینیک اسید- امگا 3 و  پکلینیک اسید-امگا 3 نیز می تواند در تصاویر میکروسکوپی مشاهده گردد (شکل 3).

پارامتر سنتیکی کمپلکس­های نیکوتینیک اسید-امگا 3  و پیکولینیک اسید-امگا 3 روی تیروزیناز قارچ مورد بررسی قرار گرفته و ویژگی­های سنتیکی با استفاده از نمودار مقایسه­ای لینویور-برک به دست آمد. نتایج حاصل نشان می­دهد که افزایش بازدارنده موجب ایجاد خطوط مختلفی می­گردد که دارای شیب بوده و از محور Y می­گذرد (شکل A, B4). مقدار K_i   نمودار دوم لینویور-برک (شکل A, B4) و معادله 1 حاصل گردید. نوع بازدارندگی آنزیم به ترتیب در نیکوتینیک اسید-امگا 3، 134/0=Vmax و 19/0=Km، 2/5=K_i  و در پیکولینیک اسید-امگا 3، 14/0=Vmax و 19/0=Km، 1/5=K_i رقابتی بود.

شکل 2- آنالیز بقای سلولها پس از در معرض قرار گرفتن با غلظتهای مختلف کمپلکس نیکوتینیک اسید-امگا-3. به تیمارهای زمانی در شکل­ها اشاره گردیده. علامت ستاره اشاره به اختلاف معنی­دار در سطح 5 (*) و 1 (**) درصد دارد.

شکل 3- عکس­های میکروسکوپ نوری (احتمالاً) فاز-کنتراست تغییرات در تراکم سلول­های سرطانی رده 375A- ملانوما تحت تیمارهای 1) کنترل 2)  50 میکرومولار 3) 200 میکرومولار نیکوتینیک اسید- امگا3 و در تیمارهای زمانی 48 و 72 ساعت. عکس­های 5 و4 اثر غلظت­های 4) 50، 5) 200 میکرومولار، پیکولینیک اسید-امگا 3 به ترتیب در 48 و 72 ساعت نشان می­دهد.

شکل 4- نمودار مقایسه­ای لینویور-برک آزمون سنتیکی تیروزیناز قارچ روی کمپلکس­های نیکوتینیک اسید-امگا 3  و پکولینیک اسید-امگا 3. L‐DOPA به­عنوان سوبسترا در نظر گرفته شد. واکنش در 10 میلی­مولار PBS، 8/6  pH، در دمای ^oC 25 و 40 واحد آنزیم در حضور غلظت­های مختلف از کمپلکس نیکوتینیک اسید-امگا 3  (A): (نیلی) 0، (نارنجی) 4، (خاکستری) 8، (زرد) 12 و (آبی) 16 میلی­مولار؛ کمپلکس­ پیکولینیک اسید-امگا 3: (B): (نیلی) 0، (نارنجی) 4، (خاکستری) 8، (زرد) 12 و (آبی) 16 میلی­مولار. پلات­های ثانویه، شیب در مقابل غلظت­های مختلف بازدارنده، که ثابت بازدارنده (K_i)  را از نقاط طولی ارائه می­دهد.

بحث

اسیدهای چرب اشباع، تک غیراشباع و ترانس در صورت مصرف در مقادیر زیاد با به خطر انداختن ایمنی سلولی، خطر ابتلا به سرطان را افزایش می­دهند (12). در مقابل، PUFAهای امگا 3 عملکرد ایمنی سلولی را بهبود می­بخشد و بروز تومور را کاهش می­دهند و موجب افزایش بیان TNF-a می­گردد. همچنین سطح گونه­های فعال اکسیژن را سرکوب می­کنند و بر متابولیسم مواد مغذی در سلول­های سرطانی تأثیر می­گذارند (14 و 35). نیکوتینیک اسید از رگزایی از طریق بازسازی اسکلت سلولی جلوگیری
می­کند. که نشان می­دهد سنتز ALA به عنوان امگا 3 و اسید نیکوتینیک به عنوان یک مشتق جدید، ممکن است عوامل شیمیایی پیشگیری کننده و درمانی ایمن برای انواع خاصی از سرطان­ها باشند (21، 23 و 31). مطالعه قبلی ما بر روی سنتز مشتقات اسید چرب غیراشباع چندگانه و تأثیر مشتقات کریزین امگا-3 و -6 که مهارکننده­های آنزیم تیروزیناز هستند که در ملانوما بیش از حد بیان می­شوند، متمرکز بود. اسیدها و ترکیبات پیریدین به عنوان مهارکننده­های درمانی بالقوه بر روی آنزیم تیروزیناز و رده سلولی ملانوما 375-A تاثیرگذاری قابل توجهی را نشان دادند. غلظت‌هایی که در آن مهارکننده‌ها تراکم سلولی را تا 50 درصد کاهش دادند، (IC₅₀) به ترتیب در 61/2 و 42/2 میلی‌مولار برای اسیدهای نیکوتین و پیکولینیک به دست آمد (16).

ترکیب عوامل ضد سرطانی برای افزایش یا از بین بردن معایب ترکیبات مورد استفاده در فرایند درمان سرطان، یک رویکرد ثابت شده برای شیمی درمانی سرطان است (24). همانطور که در نتایج سنجش MTT در شکل 2 ذکر شد، IC₅₀ مشاهده شده برای نیکوتینیک اسید-امگا 3 در رده سلولی ملانوما 375-A برای سه تیمار زمانی 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب  5/161، 3/149 و 2/145μM و برای پیکولینیک اسید-امگا 3، 4/141، 8/132 و 9/123μM بود، که بر اثر ضد تکثیری بیشتر این مشتقات را در مقایسه با هر کدام از ترکیبات به تنهایی تاکید می­نماید. مالیخان و همکاران  نیز در بررسی اثر مشتقات نیکوتینیک اسید-امگا 3 روی سلول­های سرطانی ملانوما سطح IC₅₀ مشابهی را شامل 7/166، 2/144 و 1/146 μM در سه تیمار زمانی 24، 48 و 72 گزارش نمودند (28). به­طورکلی، در بررسی حاضر، مشتقات پیریدین (اسیدهای نیکوتین و پیکولینیک) به همراه  امگا 3  داری تاثیرگذاری قابل توجه و IC₅₀ پایین­تر نیز نسبت به مطالعات پیشین بودند، بدین معنا که در غلظت پایین­تری توانستند موجب کاهش 50% تراکم سلول­های سرطانی گردند. در مطالعه ای مشابه، هی و همکاران (19) با افزودن دو مولکول نیاسین مشتقی از کورکومین تولید کرد که فراهمی زیستی را بهبود بخشید و عملکرد ضد تکثیر قابل توجهی را در برابر رده­های سلولی سرطانی روده بزرگ (HCT116)، پستان (MCF-7) و نازوفارنکس (CNE2, 5- 8F  و 6-10B) نشان داد. علاوه بر این، القای آپوپتوز علاوه بر توقف چرخه سلولی در فاز G2/M با مکانیسم با واسطه p53 است که رویکرد اصلی این مشتق می­باشد در حالیکه گزینش پذیری بالایی را نیز حفظ می­نماید.

ما این مشتق از اسید نیکوتین را برای بهبود فراهمی زیستی و کارایی حمل و نقل آن سنتز کردیم. این اصلاح ساختاری مولکولی احتمالاً جذب روده ای آن را افزایش می دهد. نیکوتینیک اسید و نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید (NADC) دو پیش ساز نیاسین هستند. این دو ترکیب به‌عنوان بستری از آنزیم‌های تجزیه‌کننده NADC مانند پلی پلیمرازهای (ADP-ribose) (PARPs)، CD38 و سیرتوئین‌ها عمل می‌کنند. علاوه بر این، تجزیه  NADC توسط PARP1/2 به تولید PAR و ترمیم DNA اجازه می دهد و از طریق آسیب DNA، فعالیت PARP1/2 منجر به مرگ سلولی توسط آپوپتوز می شود، بنابراین نیاسین به عنوان یک عامل پیشگیری بالقوه از سرطان پوست می­تواند در فرایند درمان در نظر گرفته شود. برای فعالیت مونوفنولاز، اسید 2 آمینو بنزوئیک و اسید 4 آمینه بنزوئیک فعالیت آنزیم را به صورت غیر رقابتی مهار کردند، در حالی که اسید نیکوتینیک و اسید پیکولینیک به طور رقابتی فعالیت آنزیم را محدود کردند (3، 7 و 8).

نتایج مطالعه ما نشان داد که نیکوتینیک اسید-امگا 3­ و پیکولینیک اسید-امگا 3 باعث مهار فعالیت MT و بی ثباتی فیزیکوشیمیایی آن می­شوند. نمودارهای مقایسه­ای لینویور-برک الگوهای مختلفی از مهار رقابتی را برای هر دو کمپلکس نشان می­دهد. پیشتر گزارش گردیده که حالت مهاری مهارکننده‌های فلاونول معمولاً مهار رقابتی برای اکسیداسیون L-DOPA توسط تیروزیناز و پاره­مولکول 3-هیدروکسی-4-کتو فلاونول است و ساختار نقش کلیدی در شلاته کردن مس دارد. ارزیابی سنتیکی فعالیت آنزیم در حضور نیکوتینیک اسید-امگا 3­ و پیکولینیک اسید-امگا 3 یک شیوه رقابتی مهار را با ثابت مهاری (Ki)  به ترتیب 2/5 و 1/5 میلی‌مولار برای نیکوتینیک اسید-امگا 3­ و پیکولینیک اسید-امگا 3  القا نمود. در مطالعات قبلی، کمپلکس‌های Chyrsin به همراه امگا 3 و 6 یک اثر بازدارنده رقابتی بر MT با مقادیر Ki  45/0 و 29/0 میلی‌مولار نشان دادند و فعالیت اسید نیکوتنیک و پیکولینیک اسید به ترتیب دارای  Ki  4/2 و 93/2 میلی مولار و 93/2 میلی مولار بودند (16, 21). مهار فعالیت تیروزیناز ممکن است به گروه های هیدروکسیل روی ترکیبات فنلی فلاونوئیدها بستگی داشته باشد که با آنزیم پیوند هیدروژنی ایجاد نمایند و موجب القای بازدارندگی رقابتی و نهایتا منجر به کاهش فعالیت آنزیمی می­گردند (5 و 25). چندین مطالعه نشان داده است که اسیدهای چرب اشباع و غیر اشباع اثرات مهاری بر فعالیت تیروزیناز دارند. تغییرات در فعالیت با افزایش اسیدهای چرب غیر اشباع ممکن است تخریب تیروزیناز توسط کمپلکس پروتئازوم را افزایش دهد، در حالی که افزایش اسیدهای چرب اشباع شده اثر معکوس دارد (15, 16). جمالی و همکاران در مطالعه ای نشان دادند که اثر بازدارندگی ترکیبی اسیدهای چرب بهتر از حالت جداگانه آن­ها می­باشد (21). آنالیز سینتیکی کمپلکس‌های این مطالعه نشان داد که مهار آنزیم تیروزیناز رقابتی بود (شکل A,B4)، این یافته در موافقت با نتیجه گرفته شده توسط غیبی و همکاران بر روی نیکوتنیک و پیکولینیک اسید می­باشد (16).

نتیجه گیری

به طور کلی، کمپلکس­های تازه طراحی شده نیکوتینیک اسید-امگا 3­ و پیکولینیک اسید-امگا 3  اثرات ضد تکثیری بر رده سلولی 375-A ملانوما را به­صورتی وابسته به غلظت و زمان را نشان دادند. نیکوتینیک اسید IC₅₀ پایین­تری در مقایسه با اسید نیکوتین به تنهایی و همراه با  امگا 3 به همراه داشت. و این ویژگی مولکولی باعث بیشتر شدن فراهمی زیستی نیکوتینیک اسید-امگا 3­ در سلول­های تیمار شده گردیده و بر همین اساس این کمپلکس قابلیت بیشتری در کاهش تراکم سلول­های سرطانی را داشت. عکس­های میکروسکوپی نیز نشان داد سلول­های سرطانی تحت تیمارهای مختلف کاهش تراکم داشته­اند. در راستای تغییرات سینتیکی با استفاده از نمودار لینویور-برک، کمپلکس­ها موجب القای ناپایداری ترمودینامیکی و تغییرات ساختاری در MT شدند. این کمپلس­ها، می­تواند برای بررسی بیشتر پیشنهاد شودند و در  مطالعات پیشرو به عنوان یک مکمل شیمی­ درمانی پیشگیری کننده اختلالات  پوستی و  سرطان در نظر گرفته شوند.