بررسی اثر اکسیدکنندگی FeSO₄  و H₂O₂   بر خنثی­سازی اتیدیوم بروماید- یک ماده برای رنگ­آمیزی DNA ژنومی با قابلیت سرطان­زایی

مونا خلقی^1*، ، ناهید نوری²، جلال رستم زاده³ و علی جلیل سرقلعه¹ و فرید حیدری⁴

¹ ایران، کرج، دانشگاه تهران، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

² ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاه پزشکی

³ ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

⁴ ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده کشاورزی، گروه زیست فناوری دامی

تاریخ دریافت: 30/05/1396          تاریخ پذیرش: 13/04/1401

چکیده

پژوهشگران علوم بیولوژی جهت بررسی ساختار ماکرومولکول­های زیستی، پس از جداسازی و ازدیاد این مولکول­ها نیازمند تکنیک_­های برای آشکار سازی بر ژل­های آگارز می­باشد. که به منظور رنگ­آمیزی ژل­های آگارز اتیدیوم­بروماید به علت قیمت مناسب آن متاسفانه تا به امروز به عنوان یکی از اصلی­ترین مواد فلوروسانت در اکثر مراکز پژوهشی در دنیا استفاده می­شود. در سـال­های اخیر مصرف وسیع این ماده در آزمایشگاه­های بیولوژی و پزشکی به دلیل حلالیت در آب، سبب پایداری آن در محیط و ورود آن بـه اکوسیـستم­هـای آبـی شده­است. که این امر منجر به اختلال در سیستم گردش خون، فعالیت بافت­های مختلف بدن و تغییر در فرآیند ترجمه و رونویسی DNA در موجودات مختلف و بروز سرطان شده است. روش­های متفاوت فیزیکی و شیمیایی همچون الکترودBDD ، جذب کربن فعال و غیره جهت خنثی سازی اتیدیوم­بروماید، پیشنهاد شده است. که اکثر این روش­ها به دلیل گران یا پیچیده بودن روش مصرف مورد استقبال پژوهشگران قرار نگرفته است. یکی از راهکارهای مقرون به صرفه برای مقابله با حذف ترکیبات شیمایی نامطلوب استفاده از اﮐﺴﯿﺪاﺳﯿﻮن ﻓﻨﺘون­ها می­باشد ولیکن تاکنون نقش این مواد بر اتیدیوم بروماید سنجیده نشده است. لذا با توجه به کاربرد بالای اتیدیوم­بروماید در مطالعات آزمایشگاهی، هدف از این تحقیق بررسی اثر 6 تیمار مختلف دو ماده شیمیایی FeSO₄ و H₂O₂  به عنوان مواد اکسیدکننده قوی و ارزان قیمت بر خنثی­سازی اتیدیوم بروماید می­باشد. نتایج بیان کرد از بین تیمارهای مختلف تیمار حاوی 200 میلی گرم بر لیتر FeSO₄ به همراه 300  میلی گرم بر لیتر H₂O₂ دارای بالاترین پتانسیل برای اکسید کردن اتیدیوم­بروماید می­باشد.

واژه های کلیدی: اتیدیوم­بروماید، اکسیدکننده، FeSO₄، H₂O₂ و DNA ژنومیک

* نویسنده مسئول، تلفن:  02144787413  ، پست الکترونیکی: heidari@nigeb.ac.ir

مقدمه

اتیدیوم بروماید (Ethidium bromide) یا هومیدیوم بروماید (Homidium Bromide) ماده­ای از کریستال­های جامد غیر فرار، به طور متوسط محلول در آب، اتیل گلیکول مونو متیل اتر و تا حد کمی محلول در کلروفرم و اتانول شناخته شده است. این ماده دارای خاصیت فلورسنس و رنگ نارنجی مایل به قرمز می­باشد. اتیدیوم­بروماید توسط واتکینز در سال 1952، از 3 و 8 دی نیترو6 فنیل فنان تریدین با افزودن اتیل­تولوئن به دنبال کار با برومید آمونیوم بدست آمد(17). مشخصات فیزیکی و شیمیایی آن در جدول 1 آمده است.

جدول 1- خصوصیات و ساختار اتیدیوم بروماید

به دلیل کاربرد ساده و عمومی اتیدیوم­بروماید، این ماده در بسیاری از آزمایشگاه­های بیوشیمیایی، زیست­شناسی مولکولی، پزشکی، آنزیمولوژی و در تکنیک­های متفاوتی مانند الکتروفورز، فلورومتری، اسپکتوفتومتری، فلوسیتومتری مورد استفاده می­باشد. سرطان زا بودن این ماده در آزمون­های حیوانی به اثبات رسیده است که مقدار آسیب­دیدگی با طول مدت تماس ارتباط مستقیم دارد. تماس با چشم،  به قرنیه آسیب وارد کرده و یا منجر به کوری می­گردد. تماس طولانی و شدید با آن آسیب­های ریوی، آسیب بافتی، خفگی، بیهوشی، عوارض جانبی تولید­مثلی و نهایتاً مرگ را می­تواند در پی داشته باشد (14).نشان داده شده است که اضافه کردن اتیدیوم بروماید به محیط کشت لنفوسیت­های انسانی سبب ایجاد تغییر در ساختار کروموزومی آنها می­شود (10). اتیدیوم بروماید قادر است بخش NADH-Ubiquinone در زنجیره تنفسی را در میتوکندری مهار نماید (23). گزارش­هایی نیز از رسوب این ترکیب در بافت­های قلب، عضلات اسکلتی، تیروئید، آدرنال و روده وجود دارد (13). همچنین آلودگی شیمیایی آب با چنین موادی به عنوان یک تنش شیمیایی برای ماهی­ها و سایر آبزیان مطرح می باشد. سیـستم ایمنـی آبزیان تحت تاثیر مـواد آلاینـده منجر به بروز بیمـاری در آن­ها مـی­شود که در بلند مدت با کاهش گونه­هـای آبـزی و بـهم خوردن تعادل در اکوسیستم­های آبی همراه خواهد­بود (30). در این راستا پژوهشی در سال 1391 به منظور بررسی اثرات اتیدیوم بروماید بر تعدادی از شاخص­های هماتولوژیکی در ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio) انجام شد که نتایج این تحقیق بر سمیت این ماده بر موجودات آبزی تاکید می­کند. پاسخ های هماتولوژیکی ماهی کپور به سمیت اتیدیوم بروماید به صورت کاهش معنی­دار در تعداد گلبول­های قرمز، کاهش غلظت متوسط هموگلوبین گلبول قرمز نسبت به گروه کنترل می باشد(1). لذا با توجه به این امر که مواد زائد جامد همانند مواد مصرفی آزمایشگاه­ها، داروها و آنتی­بیوتیک­ها، رنگ­ها و مواد شیمیایی از آلاینده­های اصلی محیط زیست بوده، طی سال­های اخیر مطالعات زیادی در راستای مدیریت بهینه آنها انجام گرفته، تا از خطرات و خسارت­های زیست محیطی ناشی از آنها کاسته شود. که از جمله آن­ها می­توان به روش­های مختلفی همانند تجزیه نوری با استفاده از پرتو فرابنفش، استفاده از ترکیب فرآیند شبه فنتون(Fe/ H₂O₂) ، ترکیب فرآیند الکترولیز و فنتون (25، 27 و 29) و یا جذب که نوعی فرآیند تغییر فاز است (28) اشاره نمود. همچنین استفاده از دیاتومیت به عنوان جاذب در پژوهش­های متعددی مورد بررسی قرار گرفته است (2). دیاتومیت یک سنگ رسوبی سفیدرنگ، نرم و سبک است  که عمدتاً از میکروفسیل جلبک­های تک سلولی آبی تشکیل می­شود. ساختار ویژه آن سبب شده است تا به عنوان فیلتراسیون برای نوشیدنی­های مختلف و مواد شیمیایی آلی و غیرآلی و همچنین به عنوان جاذب درحذف لکه­های نفتی کاربرد داشته باشد (18). اما در بین انواع پسماندهای آزمایشگاهی، اتیدیوم­بروماید به عنوان یکی از مواد خطرناک مورد توجه بوده و مدیریت بهینه  پسماند آن بسیار ضروری می­باشد. اهمیت این موضوع تا آنجاست که در کشورهای توسعه یافته بازرسی به صورت سرزده به آزمایشگاه­های مولکولی انجام می­گیرد تا در صورت آلودگی بیش از حد سطوح، مسئول آزمایشگاه را توبیخ کنند. لذا به دلیل سرطان­زا بودن این ماده روش­های مختلفی به منظور دفع اتیدیوم بروماید ارائه شده است که از جمله آن­ها می­توان به موارد زیر اشاره نمود. روش­های تصفیه در محل مصرف اتیدیدم­بروماید، جهت آماده­سازی برای دفع آسانتر و راحتتر آن شامل روش جذب کربن فعال، روش جذب آمبولایت XAD-16، خنثی­سازی اسید هیپوفسفروس، سدیم نیترات، سدیم بیوکربنات، خنثی­سازی توسط پتاسیم پرمنگنات، هیدروکلریک اسید، سدیم هیدرواکساید، دسترویر، الکترود (BDD= Boron-Doped Diamond) و (TIO₂= Titanium Dioxide) است (15، 29 و 31). ولی با این حال ژل­های آلوده بدون خنثی­سازی در محیط زیست رها می­شوند که از مهمترین دلایل این امر پیچیدگی و سخت بودن مراحل کار و همچنین گران بودن اکثر تکنیک­های معرفی شده به عنوان پاک­کننده اتیدیوم بروماید است. به طور مثال استفاده از فیلترهای مختلفی همچون فیلترهای ذغالی (Charcoal filtration) و کیت­های قیف مانند (Funnel Kit) به عنوان آسان­ترین روش­هایی که تاکنون پیشنهاد شده است، علاوه بر تحمیل بار مالی اضافی بر آزمایشگاه­های مولکولی می­بایست در جعبه­های مخصوص مواد زائد خطرناک قرار داده شوند و سپس در کوره سوزانده شوند که همین موارد مانع از استفاده­ی این تکنیک­ها در آزمایشگاه­ها است. همچنین تخریب فوتوکاتالیستی این رنگ سمی توسط تکنیک TIO₂ به پارامترهای بسیار متنوعی از جمله شرایط آب و هوا، دما، pH، غلظت کاتالیزورهای مختلف و سوبستراها بستگی دارد (13) و یا ساخت BDD که یک الکترود آند دوپیه شده از الماس و بور می­باشد و نیاز به مهارت بسیار دارد که متاسفانه در حال حاضر در ایران ساخته نمی­شود و هزینه وارد کردن آن نیز بسیار بالا می­شود (31).  

یکی از راهکارهای مقرون به صرفه برای مقابله با حذف ترکیبات شیمایی نامطلوب استفاده از اﮐﺴﯿﺪاﺳﯿﻮن ﻓﻨﺘوﻦ­ها می­باشد ولیکن تاکنون نقش این مواد بر پاکسازی اتیدیوم بروماید سنجیده نشده است. لذا با توجه به قابل دسترس و ارزان بودن دو ماده FeSO₄  و H₂O₂  (با قابیلت اکسیداسیون بالا) ، هدف از این پژوهش بررسی اثر احتمالی FeSO₄  و H₂O₂  به عنوان  مواد اکسید کننده بر خنثی سازی اتیدیوم بروماید در حضور و عدم حضور نور فرابنفش و همچنین شناسایی بهترین ترکیب این دو ماده اکسیدکننده جهت حداکثرکردن اثر خنثی سازی بر ماده سرطان­زا می­باشد.

مواد و روشها

در این پژوهش به منظور بررسی اثر اکسیدکنندگی FeSO₄  و H₂O₂  بر اتیدیوم بروماید آزمایش زیر طراحی گردید. ابتدا 10 نمونه خون از گاو هلشتاین، با استفاده از ونوجکتهای mL 5 حاوی ماده ضد انعقاد EDTA از طریق سیاهرگ دمی خونگیری شده­است و استخراج DNA به روش نمکی (Salting out) انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از خون با روش نمکی توسط اسپکتروفتومتری و از طریق محاسبه‌ی نسبت جذب نور در طول موج 260 نانومتر به 280 نانومتر اندازه‌گیری شد که نسبت بدست آمده در محدوده‌ی مناسب 2- 8/1 قرار داشت. بعد از اطمینان یافتن از کیفیت DNA استخراج شده 5 میکرولیتر از نمونه DNA ‌به همراه 3 میکرولیتر بافر بارگذاری در هر چاهک تزریق گردید. سپس بعد از رنگ­آمیزی ژل­ها توسط اتیدیوم بروماید، کیفیت باندهای DNA موجود در ژل­ها مورد سنجش قرار گرفت که بعد از تایید کیفیت مطلوب مورد انتظار، در مرحله بعد تغییرات ژل­ها توسط FeSO₄  و H₂O₂   در 6 تیمار مختلف شامل غلظت­های  50، 100 و 200 میلی گرم بر لیتر  از FeSO₄ و غلظت­های 100،200 و 300 میلی گرم از H₂O₂ در حضور و عدم حضور اشعه فرابنفش مورد ارزیابی قرار گرفت.  (جدول 2).

جدول 2- مقادیر مختلف تیمارهای فتون جهت اکسایش اتیدیوم بروماید

نتایج و بحث

ترکیبات سمی می توانند هم بصورت مستقیم باعث آلودگی انسان شوند و هم از طریق مصرف مواد غذایی تولید شده در محیط­ها و خاک­های آلوده به بدن انسان وارد شوند و تاثیرات منفی خود را بر انسان و سایر موجودات زنده بروز دهند (4). ولیکن متاسفانه در بسیاری از فعالیت­های صنعتی، تحقیقاتی و آزمایشگاهی از مواد سمی متعدد استفاده می­شود. که رهاسازی بدون خنثی سازی می تواند عوارض جبران ناپذیری در محیط زیست و سایر جانداران از جمله انسان داشته باشد(3).

نتیجه‌ی الکتروفورز محصولات DNA بر روی ژل آگارز کیفیت مناسب روش استخراج DNA را تأیید می­کند (شکل1چپ). همچنین نتایج غلظت سنجی DNA با نانودارپ در شکل 1 (راست) نشان دهنده این است DNA  استخراج شده دارای کمیت و کیفیت مناسبی می­باشد.

شکل1- محصولات DNA بر روی ژل آگارز(چپ) و  نمودار نانودراپ DNA (راست)

نتایج این آزمایش نشان می­دهد که دو ماده اکسید کننده FeSO₄  و H₂O₂   دارای توان لازم جهت خنثی­سازی اثر اتیدیوم بروماید می­باشند بطوریکه که بین تیمارهای مختلف تیمار شش حاوی200 میلی گرم بر لیتر  از FeSO₄  به همراه300 میلی گرم بر لیتر از H₂O₂  به عنوان بهترین تیمار در اکسید نمودن اتیدیوم­بروماید بوده توانایی تغییر خواص فیزیکی و شیمیایی این ماده  را داشته و قادر به خنثی­سازی آن است(شکل2).

شکل 2- اثر سطوح مختلف FeSO₄  و H₂O₂  بر اتیدیوم بروماید موثر بر DNA ژنومیک

این امر محرز است که بهم پیوستن مولکول­ و یا از هم گسیختن آن­ها موجب تغییر ماهیت شیمیایی مواد می­گردد. اکسیداسیون پیشرفته برای اکسیداسیون ترکیبات آلی و غیر آلی کاربرد دارد. محققین این فرآیندها را به عنوان فرآیندهایی که همراه با تولید رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل می­باشد و پتانسیل بالایی برای اکسیداسیون ترکیبات آلی دارند، تعریف نمود (19 و 21). به خاطر ظرفیت اکسایش بالای رادیکال­های هیدروکسیل (8/2 ولت)، در اغلب فرآیندهای اکسایش پیشرفته، رادیکال OH با روش­های مختلف تولید می­شود که با تلفیق آن­ها می­توان علاوه بر افزایش تولید رادیکال هیدروکسیل، سرعت اکسیداسیون را بهبود بخشید (12-11 ). یکی از فرآیندهای اکسیداسیون شیمیایی که در تصفیه آب و فاضلاب کاربرد دارد، فرآیند فنتون است که در سالهای اخیر به دلیل تولید و مصرف آلاینده­های سمی و دیر تجزیه­پذیر کاربرد بیشتری پیدا کرده است (8). فنتون فرآیندهای اکسیداسیون شیمیایی است که در آن، یون آهن به عنوان کاتالیست در یک محیط اسیدی با اکسیداسیون وارد واکنش شده و تولید رادیکال هیدروکسیل می­نماید. این واکنش از نوع واکنش­های اکسایش-کاهش می­باشد به این ترتیب که یون فلزی، انتقال یک الکترون را می­پذیرد:

Fe²⁺ + H₂O₂                       Fe³⁺+ OH^-+ OH

همچنین کارایی این روش تحت تاثیر عوامل مختلفی از جمله pH، دما، غلظت آهن، پراکسید هیدروژن و زمان واکنش است (6 و 20). که برخی پژوهش­ها دلیل تاثیر افزایش pH بر میزان خنثی نمودن مواد زائد در محیط آبی را به دلیل افزایش جاذبه الکترواستاتیکی نسبت داده­اند (9).

 لذا به طور کلی موثرترین روش زدایش مواد آلی و غیرآلی اکسیداسیون شیمیایی است. توان استاندارد اکسیدکنندگی پراکسید هیدروژن در pHهای اسیدی و بازی به ترتیب 8/1 و 87/0 ولت می­باشد. این ماده شیمیایی برای تیمار پساب­های صنعتی حاوی مواد آلاینده معدنی و آلی کاربرد وسیعی دارد. بیشتر کاربرد آن در حذف مواد آلاینده شامل ترکیبات سولفیتی، هیدروکلریت­ها، نیتریت­ها، سیانید­ها و کلر می­باشد. همچنین از پراکسید هیدروژن در تصفیه گازهای حاوی اکسیدهای گوگرد دار و اکسید نیتروژن با تبدیل آن­ها به اسید استفاده می­شود همچنین این ماده در عملیات سفید کردن خمیر کاغذ و تولید ترکیبات آلی مورد استفاده قرار می­گیرد. با تجزیه پراکسید هیدروژن، آب و اکسیژن تولید می­شود و از این قابلیت به منظور تامین اکسیژن مورد نیاز میکروارگانیسم­ها در تصفیه زیستی و همچنین واحدهای پاکسازی زیستی (Bioremendiation) مواد آلاینده استفاده می­شود (7، 16، 20 و 26). بنابراین طبق بررسی­های انجام شده، از ترکیب فنتون­ها در پاکسازی مواد سمی متفاوتی در فاضلاب به منظور پاکسازی اکوسیستم انجام می­شود. از جمله پژوهش­های انجام شده در این راستا تحقیقی است که صیدمحمدی و موحدیان در سال 1389 به منظور بررسی اثر التراسونیک/فنتون بر اکسایش 4-کلروفنل است. ترکیبات فنلی در محیط زیست به دلیل خصوصیات خاص از جمله سمیت و تجزیه­ناپذیری منجر به مشکلات بسیاری می­شود. آن­ها نشان دادند که اکسیداسیون 4-کلروفنل با استفاده از فرآیند اکسیداسیون پیشرفته تلفیقی (امواج فراصوت و فنتون) بسیار فراتر از استفاده مجزا از هریک از روش­های مذکور است و سرعت تجزیه 4-کلروفنل به عوامل متعددی نظیر pH، غلظت پراکسیدهیدروژن به عنوان اکسیدکننده، زمان تماس، غلظت آهن و غلظت اولیه ماده آلی بستگی داشته­است. همچنین بهترین شرایط بهره­برداری سیستم در غلظت 05/0 مول بر لیتر ماده اکسیدکننده، 025/0 میلی مول در لیتر آهن و pH اسیدی بوده است(5). که از نظر کارایی استفاده از فنتون جهت اکسایش مواد سمی توسط FeSO₄  و H₂O₂   با تحقیق حاضر تشابه دارد (شکل 3).

شکل3- اثر سطوح مختلف FeSO₄  و H₂O₂  بر مایع اتیدیوم بروماید

همچنین در تحقیق دیگری که توسط کریمی و همکاران در سال 1392 در مورد بررسی فرآیند اکسیداسیون پیشرفته H₂O₂  UV/در حذف ماده سمی نفتالین (هیدروکربن چند حلقه­ا­یی) از محیط آب انجام شد نشان دادند که شرایط بهینه جهت پاکسازی 15 میلی­گرم در لیتر نفتالین با دوز 20 میلی­گرم بر لیتر   در3 pH= و شدت  فرا بنفش (254 نانومتر) با راندمان 73 درصد می­باشد (6). که نتایج آن­ها از نظر خاصیت اکسایش فنتون­ها بر پاکسازی مواد سمی با تحقیق حاظر مطابقت دارد ولی از نظر استفاده از نور فرابنفش متفاوت است. در پژوهشی دیگر که به منظور بررسی تصفیه­پذیری فاضلاب صنایع فرش با استفاده از فرآیند فنتون انجام گرفت نتایج این تحقیق  به منظور حذف رنگ­های شیمیایی سینتتیک تایید می­شود. آن­ها نشان دادند مصرف 5/5 گرم بر لیتر از FeSO₄ به همراه 385 گرم بر لیتر H₂O₂   منجر به حذف COD با راندمان 95 درصد می­شود (7). لذا نکته اساسی در پژوهش حاضر بحث تغییر ماهیت اتیدیوم بروماید و عدم خاصیت فلوروسانس بودن این ماده است که همانطور که نشان داده­شد، بعد از قرارگیری در معرض مواد پاک کننده منجر به خنثی کردن اتیدیوم بروماید می­شود. لازم به ذکر است بر طبق آزمایش­های انجام شده بهترین مقدار مواد مصرفی جهت پاکسازی برای FeSO₄  برابر با 200 میلی گرم بر لیتر و برای H₂O_2، 300 میلی گرم بر لیتر می­باشد و پارامترهایی همانند استفاده از نور فرابنفش، دما و pH  تاثیر چندانی بر فرآیند نداشته است. بنابراین متناسب با دسترسی آسان کاربران آزمایشگاه به مواد شیمیایی FeSO₄  و H₂O₂   و همچنین قیمت بسیار مناسب این مواد نسبت به سایر روش­ها استفاده آن به منظور پاکسازی اتیدیوم بروماید توصیه می­شود.

تقدیر و تشکر

نویسندگان برخود لازم می دانند که از همکاری مسئولین آزمایشگاه ژنتیک بخش اصلاح نژاد دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران و نیز مسئولین آزمایشگاه ژنتیک بخش اصلاح نژاد دانشکده کشاورزی دانشگاه کردستان تشکر نمایند.