نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Cyclomaltodextrinase (CDase) is belonging to a class of enzymes that are involved in carbohydrate degradation. It is one of the most important enzymes from the amylase family with highly important industrial applications. Recently, a variant of native CDase has characterized and reported (Accession number: AMB26774). Previous study on this enzyme and three representative mutants including A123V, C127Q and their respective double mutant, A123V/C127Q has shown that applying point mutations on the interface between the subunits has functional and structural consequences. In current work, complete set of experimental study and modelling procedures was performed to elucidate the thermodynamics behavior of the enzyme variants in chemical denaturation experiments using Guanidinium chloride (GdmCl) as chemical denaturant. It was shown that the wild-type protein with the maximum value of ∆G^(H_2 O) is the most stable variant, as compared with mutants. It appears that the replacement of residues at positions 123 and 127 leads to increasing the flexibility of the protein chains and that the feasibility of the GdmCl penetration and interaction with mutants as compared with the WT protein. We concluded that these positions are hot spot points that can be more manipulated to change the structural features of the enzyme toward thermal and chemical stability.
کلیدواژهها English
بررسی بیوترمودینامیکی آنزیم سیکلومالتودکستریناز بومی و برخی جهشیافتههای آن
جمشید مهروند1، نسیم حیاتی رودباری1، لیلا حسنی2، وهب جعفریان3* و خسرو خلیفه4*
1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد، واحد علوم و تحقیقات، گروه زیستشناسی
2 ایران، زنجان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی، گروه زیستشناسی
3 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
4 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 09/01/1401 تاریخ پذیرش: 05/05/1401
چکیده
آنزیم سیکلومالتودکستریناز (CDase) متعلق به رده آنزیمهای درگیر در تجزیه هیدراتهای کربن است و از مهمترین آنزیمهای خانواده آمیلازها با کاربردهای بسیار مهم صنعتی محسوب میشود. اخیراً یک گونه بومی از این آنزیم شناسایی و گزارش شده است (کد شناسایی: AMB26774). در مطالعه قبلی بر روی این آنزیم و سه جهشیافته از آن شامل A123V، C127Q و جهشیافته دوگانه مربوطه یعنی A123V/C127Q مشخص شد که اعمال جهش نقطهای در سطح بینابینی زیرواحدها اثرات ساختاری و عملکردی دارد. دراین مطالعه مجموعه کاملی از بررسیهای آزمایشگاهی و روشهای مدلسازی برای مشخص کردن رفتار ترمودینامیکی سویههای آنزیم در آزمایشهای واسرشتگی شیمیایی بااستفاده از گوانیدینیومکلراید (GdmCl) به عنوان ماده شیمیایی واسرشته کننده ساختار انجام شد. مشخص شد که پروتئین وحشی با بیشترین مقدار در مقایسه با جهشیافتهها پایدارترین سویه است. به نظر میرسد که جایگزینی باقیماندهها در سطح بینابینی رشتهها باعث انعطافپذیری بیشتر زنجیرهها نسبت به یکدیگر و سهولت نفوذ و میانکنش گوانیدینیومکلراید با آنزیمهای جهشیافته در مقایسه با نوع وحشی شده است. ما چنین نتیجهگیری کردیم که این مناطق نقاط حساسی هستند که میتوان با دستکاری بیشتر آنها باعث سوق دادن آنزیم به سمت پایداری دمایی و شیمیایی شد.
واژههای کلیدی: سیکلومالتودکستریناز، آمیلاز، پایداری دمایی، واسرشتگی، بیوترمودینامیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 02433052531 ، پست الکترونیکی: v.jafarian@znu.ac.ir, khalifeh@znu.ac.ir
مقدمه
آنزیمهای آمیلولیتیک (Amylolytic Enzymes) جزو مهمترین دسته آنزیمهای صنعتی و زیست فناوری به شمار میآیند و امروزه جداسازی این آنزیمها از میکروارگانیسمهای ترموفیل (Thermophile) بسیار مورد توجه قرارگرفته است. از طرف دیگر، آنزیمهای مقاوم به گرما دارای اهمیت بسیاری در صنعت می باشند، چرا که برای اهداف تجاری مختلف استفاده میشوند. دراین میان آنزیمهای خانواده آلفاآمیلاز (α-Amylase) یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی محسوب میشوند که در حدود 25 درصد از بازار آنزیمهای مورد استفاده در صنایعی مانند صنایع غذایی، نساجی، کاغذسازی، نانوایی و مهمتر از همه داروسازی و تولید پودرهای شستشو را به خود اختصاص دادهاند (4، 20،25 و29). انواع بسیار زیادی از آمیلازهای طبیعی، با خواص منحصر به فرد جداسازی شده و در صنعت نشاسته کاربردهای مختلفی را به خود اختصاص دادهاند. بسیاری از ویژگیهای ساختاری این پروتئینها مشترک هستند. بااین حال، آمیلازها را میتوان باتوجه به برش نشاسته، فعالیتهای ترانسگلیکوزاسیون یا حلقویسازی و سایر ویژگیهای ساختاری تقسیم بندی کرد (9، 11و 13). به دلیل تنوع بالا و شیوههای عملکرد مختلف، پایگاه اطلاعاتی تخصصی با عنوان CAZY (Carbohydrate degrading enzymes) حاوی اطلاعات ساختاری و عملکردی این آنزیمها بوده و براساس ویژگیهای ساختاری این آنزیمها را دستهبندی نموده است (6). براساس این تقسیمبندی، خانواده آلفا آمیلاز (خانواده گلیکوزید هیدرولاز 13) یکی از پنج ساختار خانواده تجزیهکننده هیدرولایتیکی نشاسته است و دربرگیرنده آنزیمهایی با فعالیت اختصاصی بر روی اتصالهای گلیکوزیدی α(1-4) و α(1-6)نشاسته است. اعضای خانواده گلیکوزید هیدرولاز 13، آنزیمهای چند دُمینی خمرهمانند (Barrel-like) هستند و با داشتن ساختاری بسیار متنوع، به تعدادی سوبستراهای اختصاصی نیز نیاز دارند (23). سیکلومالتودکستریناز (Cyclomaltodextrinase) با علامت اختصاری CDase (EC 3.2.1.54) هیدرولیز سیکلودکسترینها (CDs) را کاتالیز میکند. این ترکیب یک ساختار حلقه بسته متشکل از 6، 7 یا 8 باقیمانده گلوکز است که از طریق پیوندهای آلفا-(1و4) به هم متصل شدهاند (28). از خانواده گلیکوزید هیدرولاز13، سه گروه از آنزیمها با عنوانهای سیکلومالتودکستریناز، مالتوژنیک آمیلاز (EC3.2.1.133) و نئوپولولاناز (EC 3.2.1.135) موثر بر هیدرولیز سیکلومالتودکسترین شناسایی شدهاند. این سه آنزیم تقریباً از لحاظ خواص کاتالیتیکی و ساختار سه بعدی معادل هم هستند. در پایگاه دادههای عمومی، بیش از 20 نوع آنزیم مانند سیکلومالتودکستریناز، مالتوژنیک آمیلاز یا نئوپولولاناز با همسانی توالی در محدوده 40-86 درصد یافت میشود. این آنزیمها با داشتن یک دُمین اضافی در آمین انتهایی از آلفا آمیلازهای معمولی متمایز هستند و ترجیح سوبسترای سیکلومالتودکسترین بیش از نشاسته برای آنها مشخص شده است. در مقام مقایسه، این آنزیمها در هیدرولیز نشاسته و پلولان ناکارآمد میباشند (3، 15و 16). اعضای این خانواده قادر به هیدرولیز حداقل دو مورد از سه نوع سوبسترای نشاسته شامل سیکلودکسترین ها، پولولان و نشاسته هستند و با همین ویژگی از یک آلفا آمیلاز معمولی متمایز می شوند (15). سیکلومالتودکستریناز همچنین قادر به عمل بر روی سایر سوبستراهای مرتبط مانند نشاسته و پولولان (Pullalan) است، اما CDها اختصاصیترین سوبسترا نسبت به سایر سوبستراها هستند (21). باتوجه به ویژگیپذیری سوبسترایی CDase بر روی آمیلوز و آمیلوپکتین، CDase برای استفاده در صنایع غذایی و دارویی به ویژه تولید نشاسته بدون آمیلوز یا دارای مقادیر مختلف آمیلوز پیشنهاد شده است. نسبت آمیلوز به آمیلوپکتین در نشاسته برنج عمدتاً بر طعم برنج پخته تأثیر میگذارد. علاوه بر این، برنج کم آمیلوز، 5 تا 15 درصد آمیلوز، برای برنج پخته منجمد مناسب است (22). علاوه بر این، Auh و همکاران گزارش کردند که تیمار با CDase به طور قابل توجهی رتروگریداسیون برنج پخته شده را به تعویق میاندازد، زیرا مقدار قابل توجهی از آمیلوز توسط عمل آنزیم تجزیه میشود (7). این آنزیمها علاوه بر هیدرولیز، فعالیت سنتزی تحت عنوان ترانس گلیکوزاسیون را به منظور تشکیل مولکولهای قند با طولهای مختلف از خود نشان میدهند. بنابراین بواسطه شکل باریک و شکاف عمیق در جایگاه فعال ساختار دایمرها این آنزیمها، هدایت مولکولهای کوچکی مانند سیکلودکسترین نسبت به نشاسته به طرف این آنزیم بیشتر است. از سوی دیگر، فضای بزرگی در پایین شکاف جایگاه فعال کشف شده است که میتواند مولکولهای کوچک قند را برای واکنشهای ترانسگلیکوزاسیون جای دهد. در حال حاضر با توجه به این یافتهها، میتوان دریافت که چگونه دو نوع فعالیت کاتالیتیکی مختلف (به عنوان مثال، هیدرولیز و ترانس گلیگوزاسیون) در جایگاه فعال آنزیم رخ میدهد (3). ساختار مونومر سیکلومالتودکستریناز دارای یک دُمین انتهایی آمینی و یک دُمین کربوکسیل انتهایی، متصل به دُمین مرکزی خمره مانند با عنوان تخصصی ( /β)8 است. دُمین آمین انتهایی (رزیدوهای 1-123) و کربوکسیل انتهایی (رزیدوهای 505-583) ترکیببندی منحصر به فردی از رشتهها و صفحات بتا هستند (15). پژوهشگران از طریق تکنیکهای مختلف مهندسی پروتئین، پایداری و فعالیت آنزیمها را برای کاربردهای گوناگون بهبود دادهاند (10و 14). در حال حاضر یکی از روش معمول دستورزی آنزیم با در نظر گرفتن سوبسترا و واکنش انتخابی، طراحی و انجام جهشزایی هدفمند است. امروزه انواع مالتوژنیک آمیلازهای با کارایی کاتالیستی بالای هیدرولیزی، تغییر ویژگیپذیری سوبسترایی و بهبود ویژگی محصول با جهشزایی ساخته شده اند. همچنین با دستورزی آبگریزی جایگاه فعال از طریق مهندسی پروتئین، امکان تغییر فعالیت کاتالیتیکی ترانسگلیکوزاسیون آنزیم نسبت به فعالیت هیدرولیزی به صورت چشمگیری افزایش مییابد (3). پایداری کنفورماسیونی پروتئینهای کروی معمولا پایین بوده و به طور کلی در محدوده 5 تا 15 کیلوکالری بر مول است. در اکثر کاربردهای صنعتی، هدف ایجاد آنزیمهایی پایدارتر از حالت طبیعی است که بعد از دستورزی هم فعالیت آنزیمی مورد نظر را داشته باشند. چنین تغییر ساختاری ممکن است توسط جهش زایی هدفمند و با تغییر در توالی آمینواسیدی ایجاد شود یا با روشهای دیگری نظیر تغییر در ساختار یک زنجیره جانبی توسط تغییرات شیمیایی ایجاد گردد (26). روش جهشزایی هدفمند به وفور برای افزایش پایداری حرارتی آنزیمهای مختلف و از طریق مقایسه توالی همتایان ترموفیل و مزوفیل و یا مطالعه اطلاعات ساختار سه بعدی آنزیمها بکار برده میشود (24). در تحقیقات قبلی ویژگیهای آنزیمی این آنزیم و رابطه تکاملی آن با پروتئینهای مشابه گزارش شد (5). در ادامه تحقیقات بر روی این آنزیم، با در نظر گرفتن خواص فیزیکو-شیمیایی آمینواسیدها و موقعیت آنها در ساختار، اثر ساختاری و عملکردی جهشهای نقطهای در نزدیکی جایگاه فعال آنزیم مورد بررسی قرار گرفت (19). همچنین از طریق مقایسه توالی این آنزیم و توالی آنزیمهای همولوگ، و براساس مشاهده نواحی تغییرپذیر در موقعیتهای خاص توالی، جهشهای مورد نظر در بخش بینابینی زیرواحدها طراحی و ساخته شدند و تأثیر جهشها در پایداری دمایی پروتئین مورد بررسی قرار گرفت (18). در پژوهش اخیراً، پایداری پروتئین وحشی و جهشیافتههای مورد نظر در برابر گوانیدینیوم کلراید به عنوان ماده واسرشتهکننده شیمیایی (Chemical denaturant)، با استفاده از روشهای آزمایشگاهی و مدلسازی مبتنی بر قوانین بیوترمودینامیک مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
مواد مصرفی: سوبستراهای آلفا-سیکلودکسترین(α-CD) ، بتا-سیکلودکسترین (β-CD) و گاما-سیکلودکسترین (γ-CD)، سدیم پتاسیم تارتارات، CaCl2، ایزوپروپیلبتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، سدیم دودسیل سولفات(SDS)، محیط کشت (LB) و DpnI از شرکت Fermentas (آلمان) خریداری شدند. ستون آگارز Ni-NTA از QIAGEN (هیلدن، آلمان)، Pfu PCR Permix، کیت خالصسازی PCR و کیت استخراج پلاسمید از Bioneer (کره جنوبی) و کانامایسین از Madison (ایالات متحده) تهیه شده است.
زیستشناسی مولکولی: آنزیم سیکلومالتودکستریناز موردمطالعه دراین پژوهش با کد شناسایی آنزیمی 3.2.1.54 : ECاز سویه بومی Anoxybacillus flavithermus subsp. flavithermus strain ZNU.NGA جداسازی، بهصورت نوترکیب تولید و در بانک ژن با کد KT633577 ثبتشده است. کلونینگ ژن، ترانسفورماسیون به ایشرشیا کولی و بیان CDase و جهشها برای کلونینگ در پلاسمید pET28a و برای بیان ژن در BL21 شرکت Invitrogen انجام شده است. مراحل مولکولی مرتبط با طراحی پرایمرها و شیوه جهشزایی هدفمند و همچنین شیوه بیان پروتئینها و مشخصهبندی بیوشیمیایی آنزیمهای نوترکیب در مقاله قبلی شرح داده شده است (18).
مطالعات بیوانفورماتیک و طراحی جهش: توالی آنزیم مورد نظر در این مطالعه با کد شناسایی AMB26774.1 در پایگاه اطلاعاتی پروتئینها قرار داده شده است. توالیهای مشابه با این پروتئین از طریق اجرای برنامه BLAST استخراج و انتخاب شدند (6). همترازی چندگانه (Multiple Sequence Alignment (MSA)) این توالیها با استفاده از برنامه Omega Clustal انجام شد (17). ساختار سهبعدی آنزیم وحشی و جهشیافتهها با استفاده از برنامه MODELLER نسخه 10.2 (12) و با استفاده از فایل ساختاری مبتنی بر تفرق اشعه ایکس از واریانتی از آمیلاز با کد شناسایی 1SMA به صورت دیمر ساخته شدند (16). باتوجه به اینکه از هر توالی چندین ساختار بدست میآید، بهترین ساختار برای هر پروتئین از طریق تعیین نمره Z برای آمینواسیدهای موجود در ساختار و از طریق اجرای برنامه MODELLER صورت گرفت (27). ترسیم گرافیکی و بررسی ساختاری آنزیمها با استفاده از برنامه Chimera نسخه 1.16 انجام شد.
بررسی ترمودینامیکی واسرشتگی شیمیایی: هدف از انجام آزمایشهای بیوترمودینامیکی در این مطالعه، بررسی پایداری پروتئینها در برابر واسرشتهکننده شیمیایی گوانیدینیوم کلراید بود. بررسی تغییرات ساختاری ایجاد شده توسط ماده واسرشته کننده با استفاده از طیفسنجی فلوئورسانس صورت گرفت. دراین آزمایشها ابتدا نمونه خالص پروتئینهای تعویض بافر شده و با غلظت 1 میکرومولار در بافر دیالیز با pH برابر 0/7 آماده شدند. سپس محلول گوانیدین هیدروکلراید با غلظت 6 مولار در بافر دیالیز با pH مورد نظر تهیه گردید و با استفاده از رقیقسازی آن با حجمهای مختلف از بافر در همان pH، از غلظت 0 تا 6 مولار با فاصله غلظتی 5/0 با پروتئین وحشی و هریک از جهشیافتهها انکوباسیون شیمیایی در دمای معمولی صورت گرفت. زمان انکوباسیون 5 ساعت در نظر گرفته شد. سپس اندازهگیریهای شدت فلوئورسانس با برانگیختگی در طول موج 280 ثبت و شدت طیف نشر یافته در فاصله 300 تا 400 نانومتر انجام گردید. پهنای باند طول موج تحریکی و نشری هر دو بر روی 5 نانومتر و سرعت اسکن در 100 نانومتر بر دقیقه تنظیم گردید. با رسم تغییرات شدت فلوئورسانس بر حسب غلظت گوانیدینیوم کلراید منحنیهای واسرشتگی شیمیایی بدست آمد و در مرحله بعد با پیشفرضهای بیولوژیکی ذکر شده در قسمت نتایج و بحث با استفاده از نرمافزار کالیداگراف مدلسازی منحنیهای سیگموییدی واکنش واسرشتگی انجام شد.
نتایج و بحث
مطالعات بیوانفورماتیک و توصیف جهشها: آنزیمهای درگیر در متابولیسم هیدراتهای کربن از تنوع بالایی برخوردار بوده و هرنوع از این آنزیمها نیز از منابع مختلفی قابل استخراج و مشخصهبندی هستند (1و 2). آنزیم سیکلومالتودکستریناز موردمطالعه دراین تحقیق نیز در زمره آنزیمهای درگیر در متابولیسم ترکیبات هیدروکربنی بوده و از یک گونه بومی باکتریایی استخراج و کلون شده است. جهت طراحی جهش، ابتدا با استفاده از برنامه BLAST توالیهای مشابه با توالی پروتئین مورد نظر در این مطالعه (NCBI ID: AMB26774) استخراج شده و از بین آنها تعدادی توالی با درصد تشابه بالای 70درصد انتخاب شدند. مشاهده نتایج اجرای این برنامه نشان میدهد که همه پروتئینهای بدست آمده در خروجی برنامه متعلق به آنزیمهای درگیر در فرایندهای بیوشیمیایی مرتبط با کربوهیدراتها هستند. بنابراین بررسی دقیقتری بر روی این آنزیمها در پایگاه اطلاعاتی تخصصی آنزیمهای مرتبط با کربوهیدراتها(CAZy: http://www.cazy.org) نیز صورت گرفت تا اطلاعات ساختاری و عملکردی بهتری از این پروتئینها داشته باشیم. باتوجه به درصد بالای تشابه در توالی و همچنین شباهتهایی که در ساختار تاخورده عملکردی این آنزیمها دیده میشود، اعتقاد براین است که همگی این آنزیمها، متعلق به یک ابرخانواده بوده و لذا دارای یک توالی به عنوان جد مشترک هستند که در طول زمان از طریق جهشهای مختلف به توالیهای بعدی واگرا شده است. به همین دلیل آنزیم CDase مورد نظر نیز در مقایسه با آنزیمهای منتخب از این پایگاه اطلاعاتی مورد آنالیز قرارگرفت. توصیف کامل پروتئینهای انتخاب شده و همچنین رابطه تکاملی بین آنها در مقاله مربوطه قابل مشاهده است (18).
شکل1- بخشی از فایل همترازی چندگانه توالیها. توالیهای مورد نظر برای مقایسه از طریق اجرای برنامه BLAST و با استفاده از توالی پروتئین سیکلومالتودکستریناز با کد شناسایی AMB26774 به عنوان ورودی یافت شدند. همترازی توالیها توسط برنامه ClustalOmega صورت گرفت و خروجی این برنامه به عنوان ورودی در برنامه ESPript به کار گرفته شد تا ترسیم گرافیکی مناسبی بدست آید. محل انجام جهش در شکل با علامت فلش مشخص شده است.
دقت در شکل نمودار 1 که بخشی از توالی کامل آنزیمها را در بر میگیرد، نشان میدهد که در برخی موقعیتهای توالیهای مورد مقایسه، حفاظتشدگی بالایی دیده میشود، که بیانگر اهمیت بالای باقیماندههای حفاظتشده در ساختار و عملکرد آنزیمها میباشد. به عبارت دیگر جهشهای تصادفی ایجاد شده دراین موقعیتها برای موجود حاوی آنزیم، کشنده بوده و لذا اکنون شاهد حضور این تغییرات در توالی آنزیمهای موجود در طبیعت نیستیم. یکی از دلایل این وضعیت میتواند ناشی از عدم سازگاری این جهشها با شرایط زیست-محیطی حاکم بر موجودات در طول فرایند تکامل بوده است، به طوریکه اگر زمین شرایط زیست محیطی دیگری را تجربه میکرد این احتمال وجود داشت که در باقیماندههای آمینواسیدی مشاهده شده در فایل همترازی توالیها وضعیت دیگری را شاهد باشیم. بااین پیشفرض، اعتقاد بر این است که دستکاری نواحی با حفاظتشدگی بالا معقول نبوده و میتواند باعث تولید آنزیمی با ساختار غیرطبیعی و فاقد عملکرد باشد، مگر اینکه در شرایط مختلف از نظر پارامترهای بیوشیمی-فیزیکی بررسی شده و شرایط مناسب برای ایجاد ساختار تاخورده عملکردی آنها را پیدا کرد. به همین دلیل توجه ما در طراحی جهش بیشتر بر روی نقاطی متمرکز میشود که درجاتی از تغییرپذیری در طول تکامل را نشان دهند. نکته دیگری که در شکل نمودار 1 وجود دارد این است که در موقعیتهای دارای تغییرپذیری، باقیماندههای آمینواسیدی مشاهده شده در هر موقعیت ممکن است از نظر خواص بیوفیزیکی نظیر اندازه شاخه جانبی، فضای کنفورماسیونی، آبگریزی و یا قطبیت شاخه جانبی مشابه و یا متفاوت باشند که شیوه رنگبندی کاراکترهای آمینواسیدی بازتابی از این موضوع است. با در نظرگرفتن همه این موارد و همچنین بررسی ساختار آنزیم CDase، (که در قسمت بعد اشاره خواهد شد) موقعیتهای 123 و 127 در آنزیم CDase که به ترتیب توسط آمینواسیدهای آلانین و سیستئین اشغال شدهاند، برای انجام عمل جهشزایی هدفمند انتخاب شدند. با در نظر داشتن پیشفرضهای اشاره شده، در موقعیت 123 مجوز تبدیل الانین به یکی از آمینواسیدهای سرین، لیزین، ایزولوسین، والین و آسپارژین وجود دارد. آمینواسیدهای سرین، لیزین و آسپارژین در خط تکاملی مربوطه با رنگ متفاوت نشان داده شدهاند که نشان دهنده متفاوت بودن این آمینواسیدها نسبت به آلانین است. به همین دلیل آمینواسیدهای ایزولوسین و والین برای انتخاب نهایی باقی میمانند که با توجه به اختلاف سایز این دو آمینواسید، علیرغم خواص مشابه فیزیکو-شیمیایی دیگر، برای انتخاب نهایی باید موقعیت آنها را در ساختار پروتئین مشخص کنیم.
باتوجه به اینکه آنزیم CDase فاقد ساختار سهبعدی تعیینشده به روشهای آزمایشگاهی است، ساختار آن با استفاده از برنامه MODELLER مدلسازی شد. نمودار 2 تصویری از ساختار سهبعدی آنزیم است که در آن موقعیت 123 نیز مشخص شده است.
دقت در شکل 2 نشان میدهد که موقعیت 123 در آنزیم وحشی CDase که آمینواسید آلانین را شامل میشود، در حدفاصل دو زنجیره قرار داشته و تا حدی در معرض مولکولهای قطبی آب است. بنابراین به نظر میرسد که از بین دو گزینه والین و ایزولوسین (باتوجه به تحلیل نمودار 1)، والین شرایط مناسبتری برای جایگزینی دارد، چرا که زنجیره جانبی و آبگریز ایزولوسین نسبت به والین بزگتر بوده و از نظر ترمودینامیکی تماس آن با سطح قطبی پروتئین نامطلوبتر است. بنابراین، جهش A123V به عنوان اولین جهش معرفی شد.
شکل 2- ساختار سهبعدی آنزیم CDase با تاکید بر موقعیت جهشها. ساختار آنزیم CDase با استفاده از الگوی ساختار مبتنی بر بلورنگاری اشعه ایکس با کد ساختاری 1SMA و به صورت دیمر با دو زنجیره مشابه ساخته شده است. موقعیت باقیماندههای آمینواسیدی منتخب برای اعمال جهش یعنی جایگاههای 123 و 127 در هر زنجیره به ترتیب با رنگهای قرمز و آبی مشخص شدهاند. برای سهولت مشاهده موقعیتهای مورد نظر و میزان دسترسپذیری آنها، ساختار پروتئین به حالت فضاپرکن نشان داده شده است. ترسیم گرافیکی شکل پروتئین و شیوه نمایش ساختار با استفاده از برنامه Chimera صورت گرفته است.
در نزدیکی همین آمینواسید و در موقعیت 127 از فایل همترازی توالیها، (نمودار 1) در آنزیم CDase باقیمانده آمینواسیدی سیستئین وجود دارد و در موقعیت مشابه در آنزیمهای دیگر این ابرخانواده تنوعی از آمینواسیدها مشاهده میشود. باتوجه به قطبی بودن سیسئتین، از بین آمینواسیدهای باردار، آبگریز و قطبی موجود در این ستون تکاملی، به نظر میرسد که گلوتامین مناسبترین گزینه برای جایگزینی است، بنابراین جهش دوم با عنوان C127Q در این نقطه تعریف گردید. دراین طراحی، عدم درگیر بودن سیستئین در میانکنش دیسولفید نیز در نظر گرفته شد. جهش دوگانهای مشتمل بر اعمال همزمان هر دوی این جهشها (A123V/C127Q) نیز برای بررسی اثر همزمان دو جهش طراحی گردید.
مطالعات ترمودینامیک: در مطالعه ترمودینامیکی قبلی بر روی این آنزیم و جهشیافتههای آن، پایداری این واریانتهای آنزیمی در برابر پارامتر دما مورد بررسی قرارگرفت و با تحلیل نتایج مشخص شد که میانکنشهای مرتبط با موقعیتهای 123 و 127 در پایداری دمایی پروتئین نقش دارند. مطالعه ترمودینامیکی در این تحقیق شامل بررسی پایداری ساختاری آنزیم وحشی و جهشیافتههای CDase در برابر گوانیدینیوم کلرایدبه عنوان واسرشتهکننده شیمیایی ساختار است. در نمودار 3 طیفهای فلوئورسانس ذاتی آنزیم CDase نوع وحشی پس از انکوباسیون در غلظتهای مختلف گوانیدینیوم کلراید آورده شده است. همانطور که انتظار میرود توام با افزایش غلظت ماده شیمیایی غیرطبیعی کننده ساختار، شدت فلوئورسانس ذاتی کاهش پیدا کرده و این کاهش توام با جابجایی به سمت طول موجهای بزرگتر است.
شکل 3- منحنی فلوئورسانس ذاتی آنزیم وحشی CDase در غلظتهای مختلف گوانیدیوم هیدروکلراید. با افزایش تدریجی غلظت گوانیدینیوم کلراید و باز شدن ساختار پروتئین کاهش شدت فلوئورسانس ذاتی همراه با جابجایی به سمت طول موجهای بلندتر را مشاهده میکنیم. با رسم تغییرات شدت فلوئورسانس ذاتی بر حسب تغییرات غلظت گوانیدینکلراید منحنی واسرشتگی تعادلی بدست میآید. منحنی واسرشتگی تعادلی در داخل نمودار اصلی آورده شده است.
برای آنالیز نتایج خام این نوع آزمایش مطابق آنچه که در شکل 3 برای پروتئین وحشی آورده شده است، طول موج 330 نانومتر جهت مدلسازی دادهها انتخاب شده و منحنی تغییرات شدت فلوئورسانس در این طول موج بر بر حسب غلظت گوانیدینیوم کلرایدرسم شد. علت انتخاب این طول موج آن بود که در این نقطه، آنزیم رفتاری ریاضیاتی در قالب یک منحنی سیگمویید را از خود نشان میدهد. پس از انتخاب طول موج مناسب برای هر آنزیم و رسم تغییرات شدت فلوئورسانس منحنیهای نقطهای شکل 4 برای همه آنزیمها، شامل پروتئین وحشی و جهشیافتههای آن بدست آمد. در این شکل خطوط پیوسته در بین نقاط حاصل مدلسازی این دادههای آزمایشگاهی است که در زیر به جزییات بیان خواهد شد.
همانطور که در منحنیهای نمودار 4 دیده میشود توام با افزایش غلظت ماده غیرطبیعیکننده ساختار، شدت فلوئورسانس نشری نیز پایین میآید که نشان دهنده باز شدن ساختار پروتئین و دسترسپذیری کروموفورهای تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین نسبت به مولکولهای قطبی حلال است.
شکل4- منحنی تغییرات طول موج نشری فلوئورسانس ذاتی در 330 نانومتر برای آنزیم وحشی و جهشیافتههای آنزیم CDase. هر نقطه در این منحنیها حاصل طیفسنجی نشری پس از انکوباسیون پروتئین در غلظت مورد نظر از گوانیدینیوم کلراید است. نقاط موجود در نمودار نتایج مشاهدات آزمایشگاهی بوده و خطوط پیوسته حاصل مدلسازی این دادهها از طریق تطبیق با معادله سیگموییدی با استفاده از نزمافزار کالیداگراف است، بهطوریکه این معادله حاوی پارامترهای زیستی است.
از دیدگاه مبتنی بر مکانیک کوانتوم، کاهش شدت نشر بر حسب غلظت گوانیدینیوم کلرایدبازتابی از باز شدن تدریجی ساختار مولکولهای آنزیم است. با این حال از دیدگاه ترمودینامیک آماری، آنچه که تغییر میکند نسبت تعداد مولکولهای واسرشته به مولکولهای طبیعی در هر غلظت است که متحمل تغییر میشود. به بیان دیگر در دیدگاه مکانیک آماری فرض بر این است که مولکولهای پروتئین در یک فرایند دو حالته دچار تغییر ساختار میشوند و هر مولکول در هر لحظه یا ساختار طبیعی و یا ساختار واسرشته دارد، بنابراین در غلظت صفر ماده غیرطبیعیکننده تقریباً 100 درصد مولکولها ساختار طبیعی دارند و در غلظت 5.5 مولار به بالا میتوان گفت که 100 درصد پروتئینها دچار تبدیل ساختار از طبیعی به واسرشته شدهاند. در منطقه گذار پروتئین نیز این درصد دچار تغییر میشود. با همین پیشفرض دو حالته بودن فرایند واسرشتگی آنزیم، در منحنیهای واسرشتگی نمودار 4 را میتوان با رابطه زیر تطبیق داده و پارامترهای زیستی را پیشبینی کرد (28).
(1)
دراین رابطه و به ترتیب محل برخورد خطوط مبنای مماس بر بخشهای بالایی و پایینی منحنی سیگمویید هستند. پارامترهای و نیز به ترتیب شیب این خطوط میباشند. پارامتر تغییرات انرژی آزاد گیبس مرتبط با واسرشتگی پروتئین است که براساس مشاهدات آزمایشگاهی به غلظت صفر گوانیدینیوم کلراید تعمیم داده شده و به عنوان معیاری از پایداری پروتئینها در نظر گرفته میشود. به عبارت دیگر فرض دیگر مدلسازی این است که یک رابطه خطی بین غلظت گوانیدینیوم کلراید و غلظتهای مختلف گوانیدینیوم کلرایدطبق رابطه درجه اول زیر وجود دارد.
(2)
پس میتوان گفت که رابطه 2 به طور ضمنی در معادله 1 وارد شده است.
هراندازه عدد مثبت بزرگتری باشد به این معناست که جمعیت بیشتری از پروتئینهای موجود در محلولی که فاقد ماده غیرطبیعی کننده است، از ساختار طبیعی برخوردارند. پارامتر m نیز شیب خط راستی است که در معادله 2 تغییرات انرژی آزاد گیبس بر حسب غلظتهای مختلف اوره را نشان میدهد. دراین صورت هر اندازه این شیب بیشتر باشد به این مفهوم است که پروتئین مورد بررسی حساسیت بیشتری به گوانیدیوم کلراید دارد که از نظر مولکولی به مفهوم فشردهتر بودن ساختار پروتئین در حالت تاخورده و یا بازشدگی بیشتر در حالت واسرشته یعنی اختلاف سطح در دسترس بین دو حالت تاخورده و واسرشته است. نتایج حاصل از مدلسازی دادههای آزمایشگاهی از طریق تطبیق دادهها با منحنیهای سیگموییدی واسرشتگی در ستونهای اول و دوم جدول 1 آورده شده است. از طرف دیگر در نقطه میانی منطقه گذار در منحنیهای واسرشتگی نسبت جمعیت مولکولهای تاخورده پروتئین به مولکولهای واسرشته پروتئین برابر بوده و در نتیجه ثابت تعادل برابر با 1 خواهد بود. بنابراین بر طبق رابطه ترمودینامیکی تغییرات انرژی آزاد واکنش واسرشتگی دراین نقطه صفر است. در این صورت پارامتر در رابطه 2 برابر با صفر شده و از آنجا میتوان غلظتی از گوانیدینیوم کلراید که نیمی از مولکولها واسرشته شدهاند را محاسبه نمود. نتیجه حاصل از این محاسبه در ستون سوم جدول 1 آورده شده است.
جدول 1- مقادیر ترمودینامیکی مرتبط با واکنش واسرشتگی شیمایی آنزیم وحشی CDase و جهشیافتههای آن. دو ستون اول به طور مستقیم و از طریق تطبیق دادههای آزمایشگاهی (نمودار 3) با معادله 1 (نمودار 4) بدست آمدهاند. ستون سوم جدول نیز با استفاده از مقادیر تغییرات انرژی آزاد در آب خالص و شیب خط وابستگی انرژی آزاد به غلظت گوانیدینیوم کلراید محاسبه شده است.
|
(M) |
(Kcal.mole-2) |
(Kcal/mole) |
|
|
2.9±0.11 |
1.3±0.05 |
3.8±0.20 |
WT |
|
2.7±0.10 |
1.1±0.04 |
3.0±0.15 |
A123V |
|
2.8±0.10 |
1.0±0.04 |
2.8±0.13 |
C127Q |
|
2.3±0.09 |
0.8±0.03 |
1.8±0.08 |
Double |
دقت در دادههای جدول 1 نشان میدهد که اختلاف پایداری بین پایدارترین و ناپایدارترین واریانت آنزیمی (پروتئین وحشی و جهشیافته دوگانه) برابر با 2 کیلوکالری بر مول است که عدد قابل توجهی است و نشان دهنده این است که در شرایط استاندارد مورد نظر در مدلسازی جمعیت بیشتری از پروتئین وحشی ساختار تاخورده طبیعی دارند. نسبت بین تعداد مولکولهای واسرشته به طبیعی در مورد جهشیافتههای یگانه اگرچه از جهشیافته دوگانه وضعیت بهتری دارد، با این حال همین دو جهشیافته نیز نسبت به پروتئین وحشی از پایداری کمتری برخوردارند. دادههای ستون آخر جدول 1 نیز نشان میدهد که غلظت مورد نیاز از ماده غیرطبیعی کننده برای واسرشته کردن نیمی از مولکولهای پروتئین برای پروتئین وحشی بیشتر است که این داده نیز بازتابی از مقاومت بیشتر آنزیم وحشی در برابر گوانیدینیوم کلراید است براساس این داده، جهشیافته دوگانه در مقایسه با بقیه پروتئینهای نوترکیب، غلظت کمتری از گوانیدینیوم کلراید به نصف تلفات ساختاری میرسد. مقدار عددی Cm برای دو جهشیافته یگانه تقریباً برابر بوده و اختلاف مشاهده شده در محدوده خطای آزمایشگاهی است. دادههای مربوط به مقدار عددی m نشان میدهد که پروتئین وحشی به عنوان واریانت پایدارتر، از فشردگی ساختاری بیشتری در حالت تاخورده برخوردار است که این موضوع میتواند در نفوذپذیری نسبت به مولکولهای گوانیدینیوم کلراید تأثیر گذار بوده و مقاومت پروتئین را افزایش دهد. علاوه براین با توجه به اینکه جهشهای اعمال شده در سطح بینابینی زیرواحدها هستند، ناپایداری ایجاد شده را میتوان به تضعیف میانکنشهای بین مولکولی مرتبط با این دو نقطه نسبت داد، به طوریکه در مورد جهشبافته دوگانه اثر تضعیفشدگی همزمان ناشی از تغییر در دو موقعیت 123 و 127 باعث انعطافپذیری بیشتر زیرواحدها و امکان نفوذ موثرتر مولکولهای ماده شیمیایی غیرطبیعیکننده شده است. براساس این مشاهدات میتوان گفت که این دو موقعیت از نقاط حساس این آنزیم بوده و لذا با انجام جهشهای دیگر دراین نواحی میتوان به آنزیمی با خواص ساختاری و عملکردی بهبود یافته دست پیدا کرد.
نتیجهگیری
با در نظر گرفتن نتایج مطالعات قبلی در مورد این آنزیم و در مقایسه با مطالعه اخیر میتوان گفت که دستکاری سطح بینابینی زیرواحدها با جهشهای هدفمند، پایداری پروتئین را در برابر هر دو نوع واسرشتهکننده حرارتی و شیمیایی تحت تأثیر قرار میدهد و از آنجا که جابجایی زیرواحدها نسبت به هم، در کاتالیز آنزیمی نقش دارد، بنابراین میتوان گفت که با بررسی بیشتر این منطقه از ساختار آنزیم میتوان به طور همزمان پایداری ساختاری و بازدهی کاتالیتیکی آنزیم را بهبود بخشید.
تقدیر و تشکر
مراحل مولکولی این پژوهش در دانشگاه زنجان و طیفسنجی فلوئورسانس ذاتی در دانشگاه علوم پایه و تحصیلات تکمیلی زنجان صورت گرفته است.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)