شناسایی و بررسی بیان ریز RNA‌های حفاظت‌شده مرتبط با تنش شوری در عدس (Lens culinaris L.)

شناسایی و تحلیل بیان ریز RNA‌های حفاظت‌شده مرتبط با تنش شوری

در عدس (Lens culinaris L.)

مهدی گودرزی، احمد اسماعیلی^*، سید سجاد سهرابی، فرهاد نظریان فیروزآبادی و حمید رضا عیسوند

ایران، خرم‌آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

تاریخ دریافت: 08/07/1400                        تاریخ پذیرش: 23/03/1401

چکیده

میکرو RNAها (miRNAs)، خانواده‌ای از ریز RNAها (sRNA) هستند که بیان ژن‌ها را در سطح پس از رونویسی با تخریب mRNA یا ممانعت از ترجمه تنظیم می‌کنند. گرچه تاکنون هزاران میرنا در گونه‌های مختلف گیاهی شناسایی‌شده است با این حال، اطلاعاتی از وجود میرناهای حفاظت‌شده مرتبط با تنش شوری در عدس (Lens culinaris L.) که یکی از مهم‌ترین و پرمصرف‌ترین محصولات زراعی در ایران و کشورهای در حال توسعه به‌شمار می‌رود، گزارش نشده است. مطالعه حاضر به‌منظور شناسایی میرناهای محافظت‌شده بالقوه و ژن‌های هدف آن‌ها در ترنسکریپتوم گیاه عدس تحت تنش شوری انجام شد. در این مطالعه، 55892 یونی ژنی که از فرآیند سرهم‌بندی نوپدید، مجموع خوانش‌های کوتاه مشتق شده از توالی‌یابیRNA  عدس تحت دو شرایط کنترل و تنش شوری صورت گرفته بود برای پیش‌بینی miRNAهای حفاظت‌شده و ژن‌های هدف آن‌ها استفاده شد. در نهایت از بین توالی‌های کاندید شش میرنای محافظت‌شده با پتانسیل بسیار بالا (lcu-miR156، lcu-miR167، lcu-miR169، lcu-miR171،lcu-miR396 و lcu-miR390) پس از اعمال فیلترهای سخت‌گیرانه شناسایی شدند. میرناهای شناسایی‌شده دارای بیان متفاوتی در تنش‌ شوری بودند. نتایج نشان داد که ژن‌های هدف میرناهای شناسایی شده در اغلب فرآیندهای زیستی همچون تمایز، رشد و نمو، انتقال پیام و پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی، نقش مهمی ایفا می‌کنند. علاوه‎بر این نتایج نشان داد که برخی از عوامل رونویسی متعلق به خانواده‌های SBP، C2H2، GRAS، M-type_MADS و MYB به‌طور وسیعی تحت تاثیر فرآیند تنظیمی میرناهای شناسایی شده قرار می‌گیرند. مجموعه میرناها و ژن‌های هدف شناسایی شده در مطالعه حاضرمی‌تواند به‌عنوان پایه‌ای مفید برای پژوهش‌های عمیق‌تر و دقیق‌تر در مورد نقش میرناها در پاسخ به تنش شوری عدس محسوب ‌شوند.

واژه‌های کلیدی: ترنسکریپتوم، تنش ‌شوری، میرنا، عدس

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: ismaili.a@lu.ac.ir

مقدمه

بسیاری از صفات با ارزش اقتصادی بالا در گیاهان، از طریق شبکه‌های برهمکنش ژنی پیچیده‌ای کنترل می‌شوند، از این‌رو استفاده از روش‌های به‌نژادی سنتی به‌تنهایی برای بهره‌مند شدن حداکثری از پتانسیل ژنتیکی گیاهان، در اغلب موارد زمان‌بر بوده و در برخی موارد نیز نتایج مطلوبی به‌همراه نخواهد داشت (27 و 28). در سال‌های اخیر، هم‌زمان با پیشرفت‌های صورت گرفته در ژنومیکس گیاهی، حجم بالایی از اطلاعات در مورد شبکه‌های برهمکنشی و تنظیمی ژن‌های مؤثر در بروز صفات حیاتی گیاهان از جمله تحمل به تنش‌های زیستی و غیرزیستی، تولید شده است و زمینه مناسبی برای شناسایی ژن‌های کنترل‌کننده‌ی این صفات را فراهم نموده است. توالی‌یابی نسل جدید، یکی از کلیدی­ترین فناوری­های مؤثر در ژنومیکس کارکردی به‌شمار می­رود که با تولید داده‌های ژنومی و ترنسکریپتومی در مقیاس بالا راه را برای شناسایی ژن‌ها و همچنین بازسازی شبکه‌های ژنی هموار کرده است (25).

میکرو RNA‌ها (میرناها) یکی از مهم‌ترین عناصر تنظیمی در اغلب شبکه‌های ژنی هستند (64). این کلاس ازRNAهای غیررمزگردان از طریق فرآیند تداخلRNA، بیان بسیاری از ژن‌ها را در سطوح مختلف از جمله؛ رونویسی، پردازش، پایداریRNA و ترجمه تنظیم می‌کنند (38). به‌طور کلی، در اولین مرحله از پردازش درون هسته‌ای، بخش ساقه از ساختار ساقه – حلقه میرنای اولیه توسط آنزیم RNaseIII (DCL1) بریده ‌شده و ساختار pre-miRNAs ایجاد می‌گردد. در ادامه، حلقه انتهایی بریده‌ شده و توالی دو رشته‌ای (miRNA/miRNA*duplex) با طول متوسط ∼22 نوکلئوتید ایجاد می‌گردد. در انتها با ورود ساختار دو رشته به سیتوپلاسم و تشکیل کمپلکس خاموشی القاء شده ساختار تک‌رشته و بالغ میرنا ایجاد می‌گردد (18). با پیشرفت دانش در رابطه با میرناها پایگاه‌های اطلاعات زیادی به‌صورت برخط ایجاد شد تا دسترسی به توالی‌ها، عملکرد، ویژگی‌ها و ژن‌های هدف میرناها آسان گردد؛ همچنین ابزار و نرم­افزارهای مختلف برای پیش‌بینی میرناها و ژن‌های هدف و تسهیل شبکه مطالعات عملکردی این مولکول‌های تنظیمی توسعه پیدا کردند (24 و 67). برای شناسایی ژن‌های هدف میرنا در پژوهش‌های مختلف از سه روش بیوانفورماتیکی، بیوشیمیایی و روش‌های مبتنی‌بر امیکس استفاده شده است (32). سرعت بالا و مقرون به‌صرفه‌تر بودن روش‌های بیوانفورماتیکی که از ویژگی حفاظت‌شدگی بالای میرناها در گونه‌های گیاهی استفاده می‌کنند، نسبت به سایر روش‌های شناسایی میرنا، موجب اقبال عمومی استفاده از این روش‌ها شده است (60). در رهیافت بیوانفورماتیکی مبتنی‌بر همولوژی، از پایگاه داده میرناهای شناسایی‌شده (Mirbase) به‌منظور شناسایی میرناهای حفاظت‌شده بالقوه، در مقابل پایگاه داده ترنسکریپتومی موجود برای گیاه مورد نظر استفاده می‌شود (24، 62، 67 و68). در مطالعات متعدد کارایی استفاده از داده‌های حاصل از تحلیل RNA-Seq جهت بازسازی و تحلیل ترنسکریپتوم گیاهان به‌ویژه گیاهان غیرمدلی که ژنوم مرجع کاملی ندارند، گزارش شده است (2 و 69). فرآیند سرهم‌بندی نوپدید، محتوای ترنسکریپتومی مطلوبی جهت شناسایی In silico ژن‌های کلیدی دخیل در شبکه ژنی ازجمله میرناها فراهم ساخته است.

عدس زراعی گیاهی دیپلوئید (2n = 2x = 14)، خودگرده‌افشان با اندازه ژنومی معادل 4 Gb (4) بوده که پس از نخود و نخودفرنگی سومین گیاه مهم گروه حبوبات دانه‌ای سردسیر محسوب می‌شود (39). در میان حبوبات دانه‌ای سردسیر، عدس غنی‌ترین لگوم از نظر اسیدآمینه‌های مهم مانند لیزین، آرژنین و لوسین است. از سوی دیگر این محصول با داشتن شاخص گلیسمی پایین به‌طور مؤثری در رژیم غذایی افراد مبتلا به دیابت، چاقی و بیماری‌های قلبی عروقی توصیه شده است (62). همچنین این گیاه با داشتن قابلیت تثبیت نیتروژن هوا در خاک، موجب افزایش حاصلخیزی خاک شده و در تناوب با غلات موجب کاهش مصرف کودهای شیمیایی و افزایش محصول غلات می‌شود (7). با توجه به محدوده وسیع کشت عدس در سر تا سر جهان، مواجه دوره رشد این گیاه با انواع تنش‌های زیستی و غیرزیستی اجتناب‌ناپذیر است. به‌دلیل تنوع ژرم‌پلاسمی پایین، اندازه ژنوم بزرگ و وجود توالی­های تکراری بالای DNA، اطلاعات بسیار اندکی از مکانیسم­های پاسخ عدس به تنش­های محیطی نسبت به سایر حبوبات، در دسترس می­باشد.

شوری یکی از شدیدترین تنش‌های محیطی است (26) که کاهش تولید محصولات مهم زراعی ازجمله عدس، به‌ویژه در مناطق خشک و نیمه‌خشک را در بر دارد. اثرات مضر این پدیده بر رشد، توسعه و کلیه فرآیندهای سوخت و سازی گیاهان از جمله فتوسنتز، سنتز پروتئین، سوخت و ساز چربی، هموستازی یون و تجمع اسمولیت‌ها در مطالعات متعددی گزارش شده است (1، 20، 28، 31 و 56). با این‌حال تاکنون اطلاعات جامعی از تغییرات ترنسکریپتوم عدس تحت تنش شوری گزارش نشده است. با توجه عدم وجود ژنوم مرجع مستندسازی شده برای عدس و همچنین در دسترس نبودن اطلاعات کافی در مورد میرناهای شناسایی‌شده این گیاه، هدف از این پژوهش شناسایی، تعیین خصوصیات و بررسی بیان میرناهای محافظت‌شده و اهداف آن‌ها از کتابخانه‌های ترنسکریپتومی گیاه عدس تحت تنش شوری، برای اولین بار می‌باشد.

مواد و روشها

مواد گیاهی: پس از تهیه بذور عدس (رقم گچساران) از موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، بذور به گلدان‌های حاوی ورمی­کولایت، پیت­ماس و شن (با نسبت مساوی) انتقال یافتند. سپس گلدان‌ها به اتاق کشت با شرایط شدت نوری ۱۴۰۰-۱۲۰۰ لوکسی، دوره نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد منتقل و روزانه با محلول نیم‌هوگلند آبیاری شدند. گلدان‌های حاوی گیاهچه‌های 21 روزه به‌منظور اعمال تنش شوری به دو گروه تیمار و کنترل تقسیم شدند. برای اعمال تیمار شوری از روش اضافه کردن نمک NaCl به محلول غذایی نیم‌هوگلند استفاده شد. میزان شوری محلول نیم‌هوگلند برای اعمال تنش شوری براساس مرور منابع 100 میلی‌مولار تعیین شد. به‌مدت 7 روز آبیاری با نیم‌هوگلند شور انجام و برای ممانعت از تجمع نمک هر 2 تا 3 روز یک‌بار آبشویی صورت گرفت. پس از اعمال تیمار، از بافت برگ و ریشه گیا‌هچه‌ها در هر دو گروه آزمایشی (کنترل و تیمار) به‌‌منظور استخراج RNA کل، نمونه‌برداری صورت گرفت. نمونه‌ها بلافاصله در ازت مایع قرار داده شده و تازمان توالی‌یابی در یخچال با دمای 80- سانتی‌گراد نگهداری شدند.

استخراج RNA، توالی‌یابی و پردازش داده‌ها: استخراج RNA کل با استفاده از محلول ترایزول (Trizolreagent) طبق پروتکل شرکت سازنده (Invitrogen,lifetechnology) برای همه نمونه‌ها (3 تکرار برای هر گروه-بافت) انجام شد. کمیت و کیفیت RNA استخراج شده با استفاده از دستگاه پیکودراپ و ژل (1درصد) الکتروفورز مورد بررسی قرار گرفت. پس از آماده­سازی کتابخانه‌های cDNA توسط کیت IlluminaTruSeq™RNASamplePreparation و در نهایت از پلتفرم IlluminaHiSeq2500 برای فرآیند توالی‌یابی کتابخانه‌ها استفاده شد. در نهایت از 8 نمونه با کیفیت بالا (دو تکرار در هر گروه-بافت)، توالی‌یابی به صورت از دو سو خوانش (Paired-end) و با طول150جفت‌باز صورت گرفت.

کیفیت اولیه توالی‌های خام برای همه نمونه‌های مورد بررسی با استفاده از نرم‌افزار v0.11.6 FastQC مورد ارزیابی قرار گرفت. برای حذف توالی‌های آداپتور باقی‌مانده از خوانش‌های خام، از نرم‌افزارهای Cutadapt (46) استفاده شد. درنهایت از نرم‌افزار v0.27 Trimmomatic برای حذف توالی‌های با کیفیت پایین (با میانگین Phred score کمتر از 30) و خوانش‌های با فراوانی بالای نوکلئوتیدهای خوانش نشده (N) استفاده شد (8).

سرهم‌بندی نوپدید خوانش‌های پردازش شده: پس از فرآیند پردازش داده‌های توالی­یابی شده، از خوانش‌های با کیفیت بالا به‌عنوان توالی‌های ورودی برای سرهم‌بندی (اسمبلی) ترنسکریپتوم گیاه عدس تحت تنش شوری استفاده شد. سرهم‌بندی نوپدید با استفاده از نرم‌افزار Trinity و بر اساس پارامترهای پیش‌فرض این نرم‌افزار انجام شد (29). نرم‌افزار، سرهم‌بندی قطعات را تا رسیدن به کانتیگ‌ها ادامه می‌دهد. از بسته نرم‌افزاریCD-Hit-EST، به‌منظور حذف کانتیگ‌های اضافی استفاده شد و کمیت‌­سنجی سرهم‌بندی نوپدید با تعیین آماره‌های تعداد کانتیگ، طول بزرگ‌ترین کانتیگ، N50، طول متوسط کانتیگ‌ها محاسبه­ شد (23 و 59).

شناسایی و بررسی ساختارهای ثانویه: از یونی‌ژن‌هایی که پس از انجام مراحل سرهم‌بندی نوپدید، کمیت‌سنجی و حذف کانتیگ‌های تکراری حاصل شده بودند، به‌عنوان منبعی برای شناسایی میرناهای محافظت‌شده استفاده شد. به این منظور، کلیه‌ی توالی‌های میرنای ثبت شده برای گونه‌های گیاهی، از پایگاه mirbase (http://www.mirbase.org) دریافت شدند. شناسایی یونی‌ژن‌های با بیشترین شباهت با توالی‌های میرنای بالغ با استفاده از ابزار BLASTn با در نظر گرفتن پارامترهای E-value ≤ 10 و mismatch < 4 صورت گرفت. از توالی میرناهای بالغ دریافت شده از پایگاه mirbase به‌عنوان ورودی و از یونی‌ژن‌ها به‌عنوان پایگاه مورد جستجو استفاده شد. توالی‌های حاصل از BLASTn با ابزار BLASTx نیز علیه پایگاه داده ‌NR مورد هم‌ردیفی قرار گرفت و توالی‌های دارای نتیجه در این پایگاه از تحلیل‌های پایین‌دستی حذف شدند.

نوع تاخوردگی‌ها و میزان انرژی آزاد ساختار میرنای اولیه در یونی‌ژن‌های حاصل با استفاده از ابزار RNA Folding Form موجود در وب‌سایت mfold (http://unafold.rna.albany.edu/) مورد بررسی قرار گرفت (80). به‌منظور اعتبارسنجی از قرارگیری توالی میرنای بالغ در محل و جهت صحیح احتمالی خود، یک ناحیه‌ی 100 نوکلئوتیدی در بالادست و پایین‌دست میرنای شناسایی‌شده از توالی یونی‌ژن‌های انتخابی با استفاده از ابزار Bedtools استخراج شد (55). توالی‎هایی که در یکی از بازوها خود شامل توالی میرنای بالغ بوده و همچنین دارای ساختارساقه–حلقه مناسب بودند به‌عنوان میرناهای احتمالی مورد بررسی قرار گرفتند. به‌منظور تعیین صحت ساختار میرناهای احتمالی و حذف نتایج کاذب از پارامترهای درصد GC/AU، حداقل انرژی آزاد تاخوردگی (MFE = -ΔG)، حداقل انرژی آزاد تاخوردگی تصحیح‌شده (MFE ÷ pre-miRNA length) × 100 و شاخص حداقل انرژی آزاد تاخوردگی (AMFE ÷ GC% = MFEI) استفاده شد (53 و 71). درنهایت توالی‌های با تاخوردگی مناسب و وجود ساختار ساقه حلقه، وجود توالی میرنای بالغ در یک بازو در ناحیه ساقه، عدم شکستگی در حلقه میرنا، حداکثر 6 جفت نوکلئوتید غیرمنطبق در ساختار میرنا، محتوای30 تا70 درصدیAU، حداکثر 3 نوکلئوتید فاصله در ساختار میرنا و میزان شاخص حداقل انرژی آزاد تاخوردگی بیشتر از 85 کیلوکالری بر مول (9 و 77) فیلتر و شناسایی شدند (43 و 49).

شناسایی ژن‌های هدفmiRNAهای مورد بررسی: با استفاده از پایگاه برخط psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget)، شناسایی ژن‌های هدف برای miRNAهای مورد بررسی با در نظر گرفتن معیارهای پیش‌فرض صورت گرفت. ضوابط و محدودیت­های پیش‌فرضی که برای شناسایی ژن­های هدف بالقوه در نظر گرفته شده شامل یک امتیاز به‌ ازای هر عدم جفت­شدگی میان miRNA و ژن هدف و نیم امتیاز به ازای هر جفت‌شدگی U:G و در نهایت دو امتیاز برای هر حباب بود. علاوه‌بر این حداکثر امتیاز مجاز برای معرفی ژن هدف جدید 3 در نظر گرفته شد و همچنین در ناحیه seed (نوکلئوتیدهای 2 تا 9miRNA ) که نقش اصلی را در شناسایی و اتصال miRNA به ژن هدف دارد تنها اجازه یک عدم جفت­شدگی داده شد (15). به منظور مستندسازی ژن‌های هدف میرناها، از ابزار BLASTx استفاده شد. تحلیل هستی‌شناسی (Gene Ontology, GO)، تفسیر و تعیین زیر گروه‌های عملکردی (فرآیندهای زیستی (Biological Process, BP)، اجزای سلولی (Cellular Component, CC) و عملکرد مولکولی (Molecular Function, MF)) ژن‌های هدف با استفاده از نرم‌افزار Blast2GO طبق مقادیر پیش‌فرض صورت گرفت (13). علاوه بر این به‌منظور ترسیم نقشه حرارتی بیان ژن‌های هدف میرناهای شناسایی شده برحسب تعداد قطعات در هر کیلوباز میلیون (Fragments Per Kilobase Million, FPKM)، از ابزار تحت وب Heatmaper با در نظر گرفتن مقادیر پیش‌فرض، استفاده شد (5).

نتایج و بحث

کاهش  اختلاف  بین  حداکثر  پتانسیل  ژنتیکی  گیاهان  و

عملکرد واقعی آن‌ها یکی از مهم‌ترین اهداف به‌نژادگران محسوب می­شود. امروزه تولید داده‌های امیکس (ژنومی و ترنسکریپتومی) مبتنی‌بر فناوری NGS، به‌طور چشم­گیری افزایش یافته است (58) و فرصت مناسبی برای تولید محتوای ژنتیکی برای تعداد زیادی از گیاهان غیرمدل که از این منظر بسیار فقیر محسوب می­شدند، فراهم شده است (65). سرهم‌بندی نوپدید ترنسکریپتوم با استفاده از داده‌های حاصل از توالی‌یابی RNA، بستر مناسبی برای شناسایی و بررسی تغییرات بیان اغلب ژن‌ها و عوامل دخیل در شبکه‌های زیستی از جمله میرناها، بدون نیاز به یک توالی ژنوم مرجع، فراهم ساخته است (19 و 47). ژنوم عدس نیز تاکنون به‌علت تنوع ژرم‌پلاسمی ضعیف، حجم ژنوم بالا و وجود توالی تکراری بالا به‌صورت کامل انتشار نیافته است؛ از این‌رو می‌توان چنین اظهار نمود که نسبت به سایر حبوبات مهم درصد بسیار کمی از کل ژنوم این گیاه مستندسازی شده است (61).

در مطالعه حاضر پس از اعمال تنش شوری، داده‌های حاصل از توالی‌یابی RNA عدس که تحت شرایط نرمال و تنش شوری دست آمده بودند، مورد پردازش قرار گرفتند. در مجموع 337367406 خوانش تمیز شده پس از حذف خوانش‌های کم کیفیت طی فرآیند پردازش حاصل شد (جدول 1) که از سرهم‌بندی این تعداد خوانش و همچنین حذف کانتیگ‌های تکراری، 55892 رونوشت منحصربه‌فرد به‌دست آمد. رونوشت‌های تکراری حاصل از سرهم‌بندی ناقص خوانش‌ها، به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای تجزیه و تحلیل و نتایج حاصل از توالی‌یابی RNA را با انحراف روبرو می‌سازند؛ از این­رو در مطالعات متعدد بر کاهش افزونگی کاذب رونوشت‌ها به‌ویژه هنگام مطالعه ترنسکریپتوم گیاهان غیرمدل تأکید شده است (52). مقادیر محاسبه شده برای سنجش کیفیت اسمبلی ایجاد شده نظیر N50 (1673 جفت‌باز) و میانگین طول (46/1168 جفت‌باز) کیفیت مطلوب ترنسکریپتوم سرهم‌بندی شده عدس را تأیید نمود (جدول 2). در مطالعات مختلف از N50 و میانگین طول توالی‌ها برای تعیین کیفیت اسمبلی استفاده می­شود. نتایج سرهم‌بندی ترنسکریپتوم عدس نشان داد که استفاده از فناوری NGS، می­تواند منبع مناسبی برای تولید محتوای ژنتیکی جهت تجزیه و تحلیل و شناسایی ژن‌ها و عوامل دخیل در فرآیندهای مختلف زیستی در عدس محسوب شود.

شناسایی میرناهای محافظت‌شده: نقش میرناها در تنظیم فرآیندهای مهم زیستی گیاهان از جمله تحمل به تنش­ها در مطالعات متعددی به اثبات رسیده است. تاکنون 48885 میرنا در موجودات مختلف شناسایی و در پایگاه mirbase ثبت شده است.

در این مطالعه از روش مبتنی‌بر همولوژی برای شناسایی میرناهای حفاظت‌شده در ترنسکریپتوم عدس تحت تنش شوری استفاده شد. کارایی استفاده از روش‌های محاسباتی برای شناسایی میرناهای محافظت‌شده در سایر مطالعات مشابه نیز مورد تأیید قرار گرفته است (24، 47، 48، 60، 67 و 70). نتایج هم‌ردیفی محلی میرناهای گیاهی با رونوشت‌های حاصل از سرهم‌بندی ترنسکریپتوم نشان داد که از 55892 رونوشت در ترنسکریپتوم مرجع، 5778 رونوشت با توالی‌های میرنای بالغ گیاهی مطابقت داشتند. پس از حذف رونوشت‌های رمزکننده پروتئین، تعداد رونوشت میرنای احتمالی به 1419 توالی رسید. با توجه به اینکه تمایز بین توالی میرنا با سایر انواع RNA تنها از طریق همولوژی منجر به شناسایی توالی‌های کاذب خواهد شد (77)، در مطالعه حاضر ساختار ثانویه توالی‌ها توسط ابزار RNA Folding Form موجود در وب‌سایت mfold مورد برسی قرار گرفت (32 و 70). ساختار ثانویه توالی‌های کاندید از نظر تناسب ساختار ساقه – حلقه و محل قرارگیری توالی میرنای بالغ در ساختار ثانویه پیش‌بینی‌ شده، در مرحله نخست کنترل شد. در دومین مرحله، توالی‌هایی نامطلوب از نظر مقدار شکاف در توالی و تعداد نوکلئوتید انطباق نیافته، حذف شدند. در نهایت بر اساس پارامتر درصد AU و MFEI (جدول 3)، شش میرنای محافظت‌شده با پتانسیل بسیار بالا متعلق به خانواده‌های miR390، miR396، miR169، miR2118، miR171 و miR167 شناسایی شدند که ساختار پیش ساز میرنا به‌همراه محل قرارگیری توالی میرنای بالغ هرکدام از میرناهای شناسایی‌شده در شکل 1 ارائه شده است. اکثریت میرناهای شناسایی شده، قبلاً در گونه‌های گیاهی مدل از قبیل آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana)، سویا (Glycine max)، کاملینا (Camelina sativa) و کاج (Pinus silvestris) گزارش شده­اند.

در این مطالعه طول توالی‌های بالغ میرناهای شناخته‌شده از nt 21 تا nt 24 متغیر بوده و تعداد سه میرنا یافت شدند که ابتدای ناحیه ′5 با باز یوراسیل U)) آغاز می­شود. یکی از ویژگی­های توالی میرنا دارا بودن توالی باز یوراسیل در ابتدای ناحیه ′5 می­باشد. تفاوت در طول میرناها نیز به منحصربه‌فرد بودن عملکردها برای تنظیم بیوژنز میرناها یا بیان ژن‌های هدف مرتبط اشاره دارد. ساختارهای پیش‌بینی شده با طول‌های متفاوت مشابه مطالعات انجام شده در آرابیدوپسیس، برنج (42) و گوجه­فرنگی (Solanum lycopersicum) می­باشد (73).

شکل 1- ساختار پیش‌ساز برای شش میرنای شناسایی‌شده در ترنسکریپتوم عدس تحت تنش شوری. بخش‌های هایلایت شده، توالی میرنای بالغ را نشان می‌دهد.

^*MFE: حداقل انرژی آزاد تاخوردگی؛ AMFE: حداقل انرژی آزاد تاخوردگی تصحیح‌شده؛ MFEI: شاخص حداقل انرژی آزاد تاخوردگی

به‌طور کلی با افزایش پایگاه‌های اطلاعاتی برای گیاهان احتمال موفقیت تشخیص میرناها نیز افزایش یافته است (50). پژوهش مِهتا و همکاران (48) که با هدف مقایسه شناسایی میرناهای حفاظت‌شده از دو منبع EST و سرهم‌بندی نوپدید ترنسکریپتوم حاصل از توالی‌یابی RNA در گیاه استویا (Stevia rebaudiana) بود، نشان داد که سرهم‌بندی نوپدید از کارایی بسیار بالاتری برای شناسایی میرناهای حفاظت‌شده برخوردار بوده؛ به‌طوری‌که از مجموع رونوشت ایجاد شده توسط فرآیند سرهم‌بندی نوپدید ترنسکریپتوم استویا، 4616 رونوشت با میرناهای بالغ تطابق یافته که در نهایت از بین این توالی‌ها 31 میرنای با پتانسیل بالا شناسایی شد (48). در مطالعه‌ای مشابه نیز هفت میرنای محافظت شده در ترنسکریپتوم عدس تحت تنش گرما شناسایی شد (34). احتمال حضور میرنا در توالی­های ترنسکریپتومی طبق پژوهش ژانگ و همکاران (76) 01/0 درصد گزارش شده است؛ با توجه به این موضوع می­توان گفت که تعداد میرنای شناسایی‌شده در مطالعه حاضر نیز با محاسبات ارائه شده برای احتمال حضور میرنا در ترنسکریپتوم مطابقت دارد. نتایج بررسی ساختار ثانویه میرناهای شناسایی‌شده در مطالعه حاضر نشان داد که میانگین A/U برای شش میرنای شناسایی‌شده 57 درصد می‌باشد. ساختار پیش­ساز میرناهایی که درصد A+U بالایی دارند نسبت به دیگر فرم‌های RNA غنی از باندهای هیدروژنی می‌باشند. باندهای هیدروژنی و جفت شدن بازها اغلب باعث پایداری ساختار سنجاق سری میرناها می‌شوند (75 و 76). از ‌این‌‌رو می‌توان گفت ساختار میرناهای شناسایی‌شده از نظر ویژگی درصدA/U وضعیت مناسبی دارند. میزان پارامتر MFEI مهم­ترین عامل در تمایز انواع ساختار ثانویه در انواع RNA می­باشد. کمترین مقدار این پارامتر برای تشخیص و تمایز RNA ریبوزومی (بیشتر از 59/0 کیلوکالری بر مول) و بیشترین مقدر آن برای تشخیص میرنا (بیشتر از 85/0 کیلوکالری بر مول) از سایر انواع RNA گزارش شده است (77). میانگین و کمترین میزان پارامتر MFEI محاسبه شده در مطالعه حاضر به‌ترتیب 09/1 و 95/0کیلوکالری بر مول می­باشد که از کمینه مقدار گزارش شده برای تمایز میرنا بیشتر می­باشند (جدول 3).

خانواده میرناهای شناسایی‌شده در اغلب فعالیت‌های زیستی به‌خصوص پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی دارای نقش تنظیمی مهمی می‌باشند. بررسی نقش miR156 در آرابیدوپسیس نشان داد که این گونه میرنا در تنظیم بیان ژن‌های SPL (Squamosal promoter binding protein-like (SPL) genes) نقش مستقیم داشته به‌طوری که بیش‌بیان این گونه میرنا، فرآیندهای مختلف در دوره‌های مختلف رشد و نمو آرابیدوپسیس را تحت تأثیر قرار می‌دهد (72). miR156 با تنظیم گلدهی به‌موقع در پاسخ به انواع تنش­های محیطی از نقش بسیار مهمی برخوردار است. نتایج پژوهش کویی و همکاران (14) نشان داد که کاهش بیان miR156 در گیاهان تراریخت موجب افزایش حساسیت به تنش‌های غیرزیستی از جمله تنش شوری می‌گردد. نقش مؤثر miR167 در پاسخ به تنش شوری ذرت (Zea mays) در پژوهش فو و همکاران (21) مورد تأیید قرار گرفت، با این حال تفاوت بیان قابل‌توجهی برای این گونه میرنا در بافت برگ و ریشه ذرت گزارش شده است. برخی از اعضای خانواده miR169 در تنش‌های خشکی (76)، سرما (40)، شوری (78) و کمبود ازت (79) افزایش بیان نشان داده و احتمالاً نقش مؤثری در تنظیم زمان گل‌دهی طی تنش‌های اکسیداتیو دارند (14). تجزیه و تحلیل ریزآرایه نشان داد که چندین میرنا، از جمله miR156، miR159، miR167، miR168، miR171، miR319 و miR396 در پاسخ به تنش شوری در آرابیدوپسیس نقش مؤثری دارند (3 و 41). مطالعات در ذرت (17)، گندم (Triticum aestivum) (30)، برنج (Oryza sativa) (22)، جو (Hordeum vulgare) (16) و نیشکر (Sacrum officinarum) (10) نشان داده­اند که miR171 یکی از مهم‌ترین miRNAهای پاسخگو به تنش‌های محیطی از جمله شوری می­باشد. در گونه‌های مختلف گیاهی miR396 از جمله میرناهای محافظت‌شده بوده که از طریق تنظیم ژن‌های هدف خود که اغلب عوامل رونویسی تنظیم‌کننده رشد می­باشند، در رشد و نمو و همچنین پاسخ به تنش‌های غیرزیستی نقش دارند (74). خوگیری گیاهان و رشد آن‌ها در محیط­های شور به‌شدت به سیستم ریشه گیاه و همچنین نحوه پیام‌رسانی اکسین بستگی دارد. miR390، RNAهای تداخل‌دهنده کوچک ترانس‌اکتین (tasiRNA) و عوامل پاسخ به اکسین یک ماژول تنظیمی را تشکیل می­دهند که در کنترل رشد ریشه جانبی نقش دارند. نتایج مطالعه هی و همکاران (33) نشان داد که بیان miR390 تحت تنش شوری به‌شدت افزایش یافته که این بیان بیش‌ازحد باعث تحریک توسعه ریشه‌های جانبی و افزایش تحمل به تنش شوری می­گردد، در حالی‌که با خاموشی miR390 رشد ریشه­های جانبی سرکوب‌شده و مقاومت در برابر تنش شوری کاهش می‌یابد (33).

شناسایی ژن‌های هدف: تکامل تنظیم ژن بدون توجه به توسعه نقش تنظیم‌کننده‌ها میسر نمی­شود. در یوکاریوت‌ها، شبکه‌های تنظیمی عوامل رونویسی به‌طور عمومی با تنظیم‌کننده‌های مختلف از جمله میرناها برهمکنش دارند. فراوانی ژن‌های هدفی که تحت کنترل احتمالی میرناهای شناسایی‌شده قرار می‌گیرند و همچنین نحوه کنترل بیان آن‌ها توسط میرناهای شناسایی‌شده در شکل 2 ارائه شده است. در مطالعه حاضر بیشترین تعداد ژن هدف مربوط به میرناهای lcu-miR390 و lcu-miR156 و کمترین تعداد ژن هدف مختص به میرنای lcu-miR396 بود. از مجموع 75 ژنی که توسط میرناهای شناسایی‌شده کنترل می‌گردند 57 ژن از طریق تخریب mRNA و 18 ژن از طریق ممانعت از ترجمه تنظیم می‌گردد.

تحلیل هستی‌شناسی ژن‌های هدف، نقش مهم این گروه از ژن‌ها در اغلب فرآیندهای زیستی را نشان داد (شکل 3). در گروه فرآیندهای زیستی (BP)، فراوانی GO ترم‌های "فرآیندهای سلولی"و " فرآیندهای متابولیکی" بیشترین فراوانی را به خود اختصاص دادند و در مقابل GO ترم‌های "فرآیندهای توسعه محور"و " پاسخ به محرک‌ها" کمترین میزان فراوانی را به خود اختصاص دادند. در گروه اجزای سلولی (CC)، سه  GOترم شامل "آناتومیک سلولی"، "درون‌سلولی" و "ترکیبات پروتئینی پیچیده" بیشترین میزان فراوانی ژنی را نشان دادند. "اتصال" و"فرآیندهای فروکافتی" دو GO ترمی بودند که فراوانی ژنی آن‌ها در گروه عملکرد مولکولی (MF) نسبت به سایر GOترم‌ها بیشتر بود. با توجه به نتایج هستی‌شناسی ژن‌های هدف می‌توان گفت، میرناهای شناسایی‌شده در مطالعه حاضر نیز مشابه با نتایج مطالعاتی که بر روی میرناهایی که تاکنون شناسایی‌شده‌اند، در اغلب فرآیندهای زیستی و متابولیکی همچون تمایز، رشد و نمو، انتقال از مرحله رویشی به زایشی، انتقال پیام و پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی، نقش مهمی ایفا می‌کنند (13-11، 37، 38 و 57).

میزان بیان میرناهای شناسایی‌شده برحسب FPKM در بافت­ها و شرایط محیطی نرمال و تنش شوری در قالب نقشه حرارتی (شکل 4) ارائه شده است. نتایج بررسی بیان میرناهای شناسایی‌شده نشان داد که بیان این میرناها در بافت‌های برگ و ریشه نسبت به هم متفاوت بوده، به‌طوری که در هر دو حالت تنش و نرمال بیان میرناهای شناسایی‌شده در بافت ریشه بیشتر از بافت برگ بود. از سوی دیگر گروه‌بندی میرناهای شناسایی‌شده نشان داد که بیان lcu-miR156 نسبت به پنج میرنای دیگر متفاوت بوده، به‌طوری که بیان lcu-miR156 برخلاف سایر میرناهای شناسایی‌شده در بافت برگ بیشتر از بافت ریشه می‌باشد.

مطالعه پگلر و همکاران (54) نشان داد که بیان میرناهای مختلف تحت تنش شوری در آرابیدوپسیس، برنج، ذرت و گندم متفاوت می‌باشد و هرکدام از گیاهان مختلف سطوح مختلفی از بیان صفر تا چند برابر شدن بیان را نشان می­دهند (54). با توجه به اینکه اغلب میرناها سطح اولیه از تنظیم شبکه­های ژنی را بر عهده داشته، اغلب با تنظیم بیان عوامل رونویسی اثر خود را بر کل شبکه تنظیمی نشان می­دهند (44 و 57). در مطالعه حاضر هم‌ردیفی ژن‌های هدف میرناهای شناسایی‌شده علیه پایگاه داده عوامل رونویسی گیاهی نیز صورت گرفت.

نتایج نشان داد که بیش از 50 درصد از ژن‌های هدف مورد بررسی اعضای خانواده­های مختلف عوامل رونویسی می‌باشند (شکل 5). نتایج مطالعه‌ حسینی و همکاران (34) نیز نشان داد که میرناهای حفاظت شده و ژ‌ن‌های هدف آن‌ها در پاسخ به تنش گرما در عدس، بیان فاکتورهای نسخه‌برداری دخیل در پاسخ به تنش گرما مانند HSF (Heat Shock transcription Factor) را تنظیم می‌کنند. میرناها با کنترل بیان عوامل رونویسی، به‌طور غیرمستقیم بیان ژن‌های متعدد دیگری را کنترل می‌کنند. نتایج نشان داد که بیشترین تأثیر میرناهای شناسایی‌شده بر خانواده SBP (Squamosa promoter binding protein) بوده و پس از آن خانواده‌های C2H2 (Cys2-His2 protein, C2H2)، GRAS(Gibberellin Acid Insensitive (Gai), Repressor Of Ga1 (Rga) and Scarecrow (Scr))، M-type_MADS (Minichromosome maintenance factor 1, Agamous from Arabidopsis, Deficiens from Antirrhinum majus, Serum response factor) و MYB (Myeloblastosis) دارای بیشترین ژن‌های هدف برای میرناهای شناسایی‌شده در این مطالعه بودند. در مقابل خانواده‌های WRKY (WRKYGQK and the zinc-finger-like motifs Cys(2)-His)، NAC(NAM, ATAF and CUC)، ERF (Ethylene Response Factors)، Dof (DNA binding with one finger)، CPP (Cell Penetrating Peptides)، C3H (CCCH type finger motifs) و bHLH (basic Helix-Loop-Helix) کمترین میزان فراوانی را در بین اهداف میرناهای شناسایی‌شده به خود اختصاص دادند.

با توجه به اهمیت و فراوانی ژنی خانواده SBP به بررسی این خانواده پرداخته شد. تعداد 16 عضو برای خانواده SBP در پایگاه TAIR ثبت شده است. در مطالعه وانگ و همکاران (66) نقش عوامل رونویسی SBP که از جمله عوامل رونویسی ویژه گیاهان می‌باشد در پاسخ به تنش شوری در گز چینی (Tamarix chinensis) مورد تأیید قرار گرفته است. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که ژن‌هایSBP تنظیم‌کننده مهمی در تحمل تنش‌های غیرزیستی در بسیاری از گیاهان هستند (63). مطالعات ژنتیکی گسترده­ای نقش خانواده SBP و شبه پروتئین‌های آن‌ها را در گونه‌های گیاهی مختلف در پاسخ به انواع تنش‌های محیطی از جمله شوری، خشکی، سرما و گرما را تأیید می­نماید (45). برخی از این عوامل رونویسی با تنظیم بیان ژن‌های درگیر در فرآیند انتقال پیام، مهار گونه­های واکنش‌دهنده اکسیژن (Reactive Oxygen Species, ROS)، تجمع POD/SOD (Peroxidase (POD)/Superoxide dismutase)، سنتز پرولین و متابولیسم آنتوسیانین در پاسخ به تنش خشکی و شوری شرکت می­کنند (51). در مطالعات مختلف تنظیم مثبت یا منفی دیگر خانواده­های عوامل رونویسی شناسایی‌شده در گونه‌های مختلف گیاهی مورد تائید قرار گرفته است (54 و 66).

شکل 5- توزیع فراوانی خانواده‌های مختلف عوامل رونویسی که توسط میرناهای شناسایی‌شده کنترل می‌شوند.

از پایگاه داده PlantTFDB (36) جهت شناسایی عوامل رونویسی استفاده شده است.