نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه مهندسی زیست فرآیند، پژوهشکده صنعت و محیط زیست، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری

چکیده

رنگ فلورسانت لوسیجنین (LCG) به مولکول سبد مانند پاراسولفوناتوکلیکس[4]آرن یا CX4 متّصل شده و ایجاد کمپلکس می کند. به موجب تشکیل کمپلکس CX4‧LCG رنگ لوسیجنین دچار خاموشی فلورسانسی یا کووینچ می شود. این کمپلکس برای جایگزینی مولکول لیگاند رقیب (به عنوان آنالیت (A)) با LCG مورد استفاده قرار می گیرد. طی "سنجش جایگزینی نشانگر" مولکول آنالیت با کمپلکس CX4‧LCG انکوبه می شود و آنالیت جای لوسیجنین را گرفته، کمپلکس CX4‧A تشکیل می شود و آزاد شدن LCG با افزایش نشر فلورسانس محلول همراه است. در این مطالعه یکبار CX4‧LCG با پپتید تتراآرژنین به عنوان آنالیت در بافر فسفات (محیط بدون لیگاند رقیب) پیش انکوبه شده و سپس با محیط کشت Ham’s F12 (حاوی انواع لیگاندهای رقیب) رقیق شده است و میزان LCG آزاد شده از طریق روبش فلورسانسی اندازه گیری شد. بار دیگر کل فرآیند تشکیل کمپلکس CX4‧LCG و انکوبه شدن با آنالیت تتراآرژنین از ابتدا در محیط کشت و در حضور لیگاندهای رقیب انجام شده است و سپس محلول مورد روبش فلورسانسی قرار گرفته است. بر خلاف باور رایج نتایج دو آزمایش تفاوت معنی داری نشان نمی دهند. به بیان دیگر ثابت اتّصال دستخوش تغییر نمی شود. بنابراین برهم کنش های سوپرامولکولی در نهایت به تعادل چند جانبه می رسد و از روش "سنجش جایگزینی نشانگر" جهت سنجش آنالیت در محیط های همراه با لیگاندهای رقیب و مزاحم –از جمله محیط کشت که بسیار پرکاربرد و مورد توجه گرایش های مختلف زیستی است– هم می توان استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The Role of Pre-incubation in Formation of Supramolecular Complex Between Lucigenin and p-Sulfonatocalix[4]arene in Cell Culture Medium

نویسندگان [English]

  • Reihaneh Khosravi 1
  • Amir Norouzy 2

1 Bioprocess engineering department, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB)

2 Bioprocess engineering department, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran

چکیده [English]

Lucigenin (LCG) is a fluorescent dye that can form supramolecular complex with p-Sulfonatoclix[4]arene by doing a simple incubation. By formation of CX4‧LCG complex, fluorescence intensity of LCG is quenched. The complex is used in indicator displacement assay (IDA), in which an analyte (A) is incubated with the CX4‧LCG complex, the A then displaces LCG and CX4‧A complex forms in real time. The liberated LCG regains its fluorescence. In cell culture medium there are ample of competitor ligand molecules for LCG. The presence of competitors decreases the association constant (ka) of LCG to CX4. In this study, the CX4‧LCG complex were pre-incubated with tetra-arginine peptide in phosphate buffer, a solution devoid of any competitor molecule, prior to dilution with the cell culture medium to the desired concentration. The fluorescence intensity of the solution was measured hoping for maximum fluorescence recovery. Next time, all incubations were performed in the medium then the fluorescence was measured. Contrary to popular belief, two experiments did not show a significant difference i.e., the ka value remains unchanged. We concluded that the supramolecular interactions will come to a multi-lateral equilibrium; therefore, IDA can be used for monitoring and measuring the concentration of analyte-of-interest even in the presence of competitors in the cell culture medium which is an interesting solvent in many biological sciences.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Fluorescence
  • Analyte
  • Supramolecular interaction
  • Indicator displacement assay