مقایسه خواص سیتوتوکسیک اسانس و عصاره سرشاخه های Juniperus excelsa  در دو منطقة البرز بر رده سلولی سرطان ریه A549

سیده مهدخت مداح^*، فرهنگ مراقبی و ستاره سرحدی

ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 09/08/1399          تاریخ پذیرش: 27/06/1400

چکیده

سرطان ریه یکی از شایع­ترین انواع سرطان در جهان و ایران، است. گیاهان منابعی از انواع ترکیبات آنتی­اکسیدان هستند که می‍توانند در جهت تولید داروهای ضد سرطانی استفاده شوند. در تحقیق حاضر اثر سمیت سلولی اسانس و عصاره­ی هیدروالکلی گیاه Juniperus excelsa ، بر روی سلول­های سرطان ریه ردة A549 بررسی شد. سرشاخه­های پایه های نر گیاه  ارس از دو منطقه­ی چهل چشمه در فیروزکوه و سیراچال در کرج جمع­آوری شده و اسانس و عصاره به ترتیب با روش کلونجر و خیساندن تهیه گردید. میزان سمیت سلولی، غلظت­های مختلف، اسانس و عصاره سرشاخه­های گیاه ارس دو منطقه، بر روی سلول­های رده A549 در سه زمان 24 ،48 و 72 ساعت با استفاده از روش MTT ارزیابی شد. از روش فلوسایتومتری برای بررسی مرگ سلولی و چرخه­ی سلولی در سلول­های تحت تیمار 72 ساعته با 10 µg/ml اسانس و عصاره دو منطقه استفاده گردید. نتایج بررسی میزان سمیت سلولی نشان داد قدرت کشندگی عصاره­ها از اسانس­ها به طور معنی داری بیشتر بود ولی بین مناطق مختلف تفاوت معنی داری از نظر میزان سمیت سلول وجود نداشت(P < 0.01). همچنین کاهش بیشتر تعداد سلول­های زنده و  افزایش ورود سلول­ها به فاز Sub G1 و در نتیجه افزایش آپوپتوز تحت تیمار با عصارة پایه­های نر ثابت شد. به این ترتیب عصارة سرشاخه­های این گیاه با توقف چرخه سلولی در مرحله G₂/M خواص ضد سرطانی دارد. 

واژه های کلیدی: Juniperus excelsa ، آپوپتوز، چرخه سلولی، سرطان ریه، سمیت سلولی

* نویسنده مسئول، تلفن 09122123712، پست الکترونیکی: s.m.maddah@iausr.ac.ir

مقدمه

در سراسر دنیا، سرطان ریه از جمله مهم­ترین سرطان­های تشخیص داده شده می­باشد و به عنوان یکی از محتمل­ترین علت مرگ و میر­های ناشی از سرطان به شمار می­رود. سرطان ریه در ایران جز یکی از پنج سرطان شایع است و میزان بروز آن روندی افزایشی دارد (15و24). دو نوع اصلی سرطان ریه وجود دارد: سرطان ریه سلول کوچک و سرطان ریه سلول غیر کوچک. در صورتی که سرطانی ویژگی­های هر دو نوع را داشته باشد به عنوان یک کارسینوم سلول کوچک و بزرگ (آمیخته) شناخته می­شود. حدود 85 الی 90 درصد سرطان­های ریه تشخیص داده شده از نوع سرطان سلول غیر کوچک هستند(34).

درمان­های مرسوم سرطان­ها باعث اثرهای جانبی جدی می­شود به طوری که دسترسی به دارویی با اثربخشی بالا، سمیت کم­، که به طور اختصاصی بر سلول­ها تاثیر گذاشته و ارزان باشد یکی از دغدغه­های مهم جوامع دارویی دنیا و حوزه درمان می­باشد. در این زمینه درمان با گیاهان دارویی می­تواند یکی از پایه­های اصلی کنترل و درمان سرطان باشد (31). خواص ضد توموری و مکانیزم عمل ترکیبات اپی­گلوکاتکین-3-گالات (EGCG) (Epigallocatechin-3-galate) در گیاه چای سبز، ایزوتیوسیانات­ها (Isothiocyanate) در گیاهان تیره کلم و ایزوفلاوون­ها (Isoflavone) که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی قوی هستند و نیز تیموکادروئینون (TQ)(Thymoquinone) که یک ترکیب فعال زیستی در اسانس سیاه دانه است ثابت و مشخص شده است همچنین تاکسول نیز که از پوست درخت سرخدار به دست می­آید امروزه به عنوان داروی ضد سرطانی استفاده می­شود (16). بسیاری از اسانس­های گیاهی دارای خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد توموری هستند. در سلول­های سرطانی، اسانس­ها از طریق القاء آپوپتوز در سلول­های سرطانی در درمان آن­ها نقش دارند. از طرف دیگر اسانس­ها متاستاز را مهار می­کنند در حالی که داروهای شیمی درمانی قادر به مهار متاستاز نیستند (37).

از جنس گیاه ارس (Juniperus) گونه­هایی مانند ,J.excelsa، J.communis, J.oblonga, J.sabina J.foetidissima در ایران موجود است و گسترش آنها به صورت لکه­ای و در استان­های مختلف می­باشد (19). گیاه اُرِس (Juniperus excels)، یک درخت یا درختچه­ای همیشه سبز از خانواده Cupressaceae می­باشد که در ایران در شیب­های شمالی و جنوبی رشته­کوه البرز از ارتفاع 1900تا2850 متر و به مقدار کمتر در رشته­کوه زاگرس پراکنش دارد (14). شیب جنوبی البرز که از لحاظ وضعیت آب و هوایی منطقه­ای نیمه خشک است، رویشگاه اصلی درختان ارس می­باشد که به علت تابش فراوان، خاک قلیایی و خشکی هوا خود به عنوان عوامل اصلی و موثر درتغییر متابولیسم ثانویه در این درختان نقش بازی می­کند (25). وجود ترکیبات آنتی اکسیدانت در انواع ارس­ها نوید مناسبی است زیرا آنتی اکسیدان­ها به عنوان ترکیبات جلوگیری کننده از سرطان که در مراحل اولیه از بین برنده تومور می­باشند شناخته شده­اند. اسانس و عصاره میوه و سرشاخه های این گیاه خواص بیولوژیکی و فارماکولوژیکی فراوانی دارد ( 1، 7، 26 و 30).

فعالیت ضد میکروبی، ضد قارچی و آنتی­اکسیدانی اسانس گیاه ارس (21) و رابطه بین محتویات بالقوه آنتی­اکسیدانی و فنولی میوة ارس (22) و همچنین فعالیت آنتی­اکسیدانی اسانس بخش­های مختلف دو زیر گونه گیاه ارس (12) نشان داده شده است. تاکنون اثر سیتوتوکسیتی عصارة بخش­های هوایی گیاه ارس بر لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده­های Nalm-6 و Reh (9و10) و عصاره­­ی سرشاخه­های نر و ماده و میوه دو زیر گونه J. excelsa   بر سلول­های MDA-MB-468 ، Hela و KB (28)، همچنین اثر سمیت عصاره گیاه ارس بر رده سلولی سرطان مری KYSE-30 و سلول­های فیبروبلاست معمولی HU02 (11) و رده سلولی MCF-7  سرطان سینه (8) مورد ارزیابی قرار گرفت و میزان توانایی خواص ضد سرطانی آنها تعیین گردیده است.

در این تحقیق ضمن بررسی خواص آنتی اکسیدانی عصاره و اسانس سرشاخه های پایه­های نرگیاهان ارس دامنه­های جنوبی البرز، خواص ضد سرطانی آنها و چگونگی تاثیر آنها بر چرخه سلولی سلول­های سرطان ریه A549 مورد سنجش قرار گرفت.

مواد و روشها

تهیه گیاه: نمونه­برداری از سرشاخه­های پایه­ی نر گیاه ارس از دو منطقه­ی کرج - منطقه حفاظت شده­ی سیراچال -(منطقه1) و فیروزکوه - چهل چشمه- (منطقه2) انجام شد. گونه­های جمع آوری شده با استفاده از کلیدهای شناسایی گونه های ارس در موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع مورد تایید قرار گرفت. پس از انتقال نمونه­ها به آزمایشگاه و شستشوی آن­ها با آب مقطر، سرشاخه­ها بر روی یک پارچه­ی تمیز قرار داده شدند تا در دمای اتاق خشک شوند.

عصاره گیاه ارس: عصاره­گیری به روش خیساندن، به طور

جداگانه از پایه­های نر گیاهان ارس مربوط به دو منطقه کرج و فیروزکوه انجام شد. ابتدا 10 گرم از پودر گیاه خشک شده به ظرف شیشه­ای دردار دارای 100 میلی­لیتر متانول 70% اضافه شد. ظرف در انکوباتور شیکردار(innova42) در دمای 45-40 درجه سانتی­گراد با دور rpm 100 به مدت 24 ساعت قرار داده شد. عصاره با کاغذ صافی واتمن صاف شد و با دستگاه روتاری(Heidolph Laborata Rotary Evaporator, WB eco, Germany) با دمای 40 درجه سانتی­گراد، فشار 180-150 و دور  rpm 40، تغلیظ گردید(6).

استخراج اسانس: اسانس­گیری از 150 گرم سرشاخه­های خشک شده پایه­ی نر گیاه ارس دو منطقه، به طور جداگانه و به روش کلونجر (تقطیر با آب) به مدت 4 ساعت انجام شد. در صورت وجود قطرات آب در اسانس جدا شده، آب به کمک سولفات سدیم از اسانس حذف گردید و اسانس در ظرف تیره و در دار در یخچال نگهداری شد(2).

کشت سلول: رده سلولی A549 سرطان ریه از انستیتوپاستور ایران خریداری گردید. سلول ها در فلاسک 75 حاوی محیط کشت DMEM به همراه سرم 10 درصد FBS وµg/ml 100 پنی­سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. فلاسک در دمای 37 درجه سانتی­گراد در داخل انکوباتور حاوی 5 درصد CO₂ و رطوبت 95% قرار داده شد(29).

بررسی سمیت سلولی: پس از رشد و تکثیر مناسب سلول­ها در فلاسک، سلول­ها در3 پلیت 96 خانه­ای توزیع گردیدند (10⁴ سلول در هر چاهک) و به مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور 37 درجه نگهداری شدند. سپس محیط کشت هر چاهک به آرامی خارج شد و به منظور تیماردهی، از هر یک از عصاره­ها و اسانس­ها با استفاده از آب استوک 16 میلی­گرم بر میلی­لیتر تهیه و از آن غلظت­های 250، 125، 60، 30 ، 10و صفر میکروگرم بر میلی­لیتر تهیه شد. برای بهتر حل شدن اسانس ابتدا اسانس در مقدار بسیار کمی(Dimethyl sulfoxide) DMSO حل شد. در هر سه پلیت 96 خانه برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. پلیت اول 24 ساعت بعد از انکوباتور خارج شد و پس از خروج مایة رویی، در تاریکی به هر چاهک 50 میکرولیتر محلول MTT 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر زرد رنگ، اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه گردید. سپس رنگ MTT خالی و به هر چاهک 50 میکرولیتر DMSO اضافه شد و پلیت با فویل آلومینیومی پیچیده شد؛ سپس حدود 1 ساعت در انکوباتور انکوبه شد تا کریستال­های ارغوانی رنگ حاصل از احیاء MTTدر آن حل شود و در نهایت جذب نوری هر نمونه در طول موج 570 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر نانودراپ(Milton Roy- Spectronic 21D- USA)  اندازه گیری شد. شدت رنگ ارغوانی حاصله معرف نسبت سلول­های زنده در هر چاهک است. این مراحل 48 ساعت بعد برای پلیت دوم و 72 ساعت بعد برای پلیت سوم تکرار شد(4و29).

ارزیابی نوع مرگ سلولی با تکنیک فلوسایتومتری: میزان آپوپتوز و نکروز سلول­های A549 که با غلظت µg/ml 10 از اسانس­ها و عصاره­­ها تیمار شده بودند، با استفاده از روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. به این منظور در پلیت 24 خانه­ای در هر چاهک به طور متوسط 10⁴ سلول تحت تیمار کشت شدند. پس از 72 ساعت، سلول­ها با PBS شستشو و با یک واحد آنزیم تریپسین از پلیت جدا و سانتریفیوژ شدند. سپس رسوب سلولی با محلول 10% بافر باندینگ شسته شده و 15 دقیقه در rpm 15000 سانتریفیوژ شدند. محلول FITS (Fluorescin Isothiocyanate) متصل به Annexin-V به میزان 5 میکرولیتر به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و محیط انکوبه شدند. رنگ Annexine به فسفاتیدیل سرین­های موجود در غشای سلول آپوپتوز یافته چسبیده و آن­ها را نشان­دار می­کند. سپس با استفاده از 5 میکرولیتر محلول PI (Propidum Iodide Ebioscience) آماده­ی شمارش توسط دستگاه فلوسایتومتری(FACS-Calibur) شدند. PI در سلول­های نکروز شده به DNAی هسته متصل شده و تعداد سلول­های نکروز شده را نشان می­دهد. در این آزمون از محیط کشت فاقد اسانس و عصاره به عنوان کنترل منفی استفاده شد (5 و 17).

ارزیابی چرخه سلولی با تکنیک فلوسایتومتری: به منظور تعیین اینکه سلول­ها در چه مرحله­ای از چرخه سلولی هستند، سلول هایA549 در پلیت 24 خانه کشت شدند، پس از 24 ساعت تحت تیمار با غلظتµg/ml 10 از اسانس­ها و عصاره­های دو منطقه قرار داده شدند. 72 ساعت پس از تیماردهی، سلول­ها از کف پلیت جدا شده و درg 800 سانتریفوژ شدند. پس از شستشو با PBS سرد با اتانول 70 درصد تثبیت شدند. برای بررسی فازهای چرخه سلولی، نمونه­های کنترل و تیمارشده، به مدت 30 دقیقه با 20 میکروگرم پروپیدیوم ایودید PI و20 میکروگرم RNase (حل شده در یک میلی­لیترPBS) مخلوط شدند و توسط دستگاه فلوسایتومتری(FACS-Calibur) مورد سنجش قرار گرفتند. با استفاده از نرم افزار Flowjo، درصد جمعیت سلولی در مراحل مختلف چرخه سلولی تعیین شد(3).   

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها: آزمایش بررسی اثر سیتوتوکسیک و بررسی چرخه و مرگ سلولی در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار انجام شد. پس از نرمال کردن داده ها آنالیز تجزیه واریانس دو طرفه (Two way ANOVA) اجرا شد. مقایسه میانگین ها(انحراف معیار± میانگین) با آزمون توکی با سطح احتمال P<0.05  و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزارهای22 SPSS  و GraphPad Prism 8 انجام شد.

نتایج

نتایج سمیت سلولی: اثر سمیت سلولی عصاره تهیه شده از پایه­های نر کرج (extact1) و فیروزکوه (extract2) و اسانس­های تهیه شده از پایه­­های نر کرج (Essential oil1) و فیروزکوه (Essential oil2) در سه زمان 24، 48 و 72 ساعت بر روی سلول­های A549 بررسی شد. از محیط کشت فاقد اسانس و عصاره به عنوان کنترل استفاده شد. نمونه­های کنترل بیشترین تعداد سلول های زنده نزدیک به 100 درصد را داشتند که ضمن نرمال سازی داده ها، 100 درصد در نظر گرفته شد. در شکل 1-الف، نمودار درصد زنده مانی سلول­ها، 24ساعت پس از تاثیر اسانس­ها و عصاره­ها، نشان داده شده است. تحت تیمار غلظت­های مختلف اسانس­ها و عصاره­ها درصد بسیار کمی از سلول­ها (زیر 20%) زنده ماندند. این کاهش تعداد سلول­های زنده نسبت به نمونة کنترل در هر سه زمان 24، 48 و72 ساعت در تمام غلظت­ها، تفاوت معنی دار داشتند (P<0.001). پس از 48 ساعت، میزان زنده­مانی سلول ها باز هم کاهش یافت و بین 12 تا 0.24 درصد در تیمارهای مختلف متغییر بود. البته به جز تیمار با اسانس منطقه فیروزکوه که خطای آزمایش در اعمال تیماردهی مشاهده شد(شکل1-ب). بر اساس نمودار ج شکل 1 پس از 72 ساعت بیشترین درصد زنده­مانی سلول­ها تحت اثر µg/ml10 اسانس فیروزکوه به میزان 1.21± 22.98 مشاهده شد و کمترین درصد زنده مانی سلول­های مربوز تحت تیمار با عصارة کرج با غلظت µg/ml125 به میزان  0.67±0.15 درصد مشاهده گردید. پس از 72 ساعت، IC50 برای عصاره کرج 0.172 میکروگرم، عصاره فیروزکوه 0.426، اسانس کرج 1.937 و اسانس فیروزکوه 0.690 میکروگرم بدست آمد(شکل1-د). همچنین در هر سه زمان یک اثر نسبی وابسته به غلظت نیز مشاهده شد که با افزایش غلظت اسانس­ها و عصاره­ها، اثر سیتوتوکسیک آن­ها افزایش پیدا کرد و در غلظت­های پایین­تر، زنده­مانی سلول­ها بیشتر بود (شکل1).

نتایج سنجش نوع مرگ سلولی: پس از 72 ساعت، درصد سلول­های زنده، نکروزه و آپوپتوز تحت تاثیر  µg/ml  10 از هریک از اسانس و عصاره دو منطقه به کمک دستگاه فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. پروتئین مزدوج شده با Annexin V-FITC به سطوح سلولی که فسفاتیدین سرین در آنها به لایه خارجی دو لایه فسفولیپیدی غشا آمده است متصل شده که نشانگر آپوپتوز اولیه است.

شکل1- الف) نمودار درصد زنده­مانی سلول­های سرطان ریهA549، پس از24 ساعت  ، ب) نمودار درصد زنده مانی سلول ها پس از 48 ساعت، ج) نمودار درصد سلول های زنده پس از 72 ساعت، د) نمودار IC50 72 ساعت پس از تیمار دهی.

اختلاف میانگین درصد زنده­مانی نمونه شاهد با سایر غلظت­های تیمار در هر سه زمان در سطح 0001/0 درصد معنی دار شد به جز غلظت های تیمار اسانس فیروزکوه در 48 ساعت که خطا داشت. اعداد به صورت میانگین± انحراف معیار مقایسه شدند. extrac1= عصاره سرشاخه­های ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخه­های ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخه­های ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخه­های ارس فیروزکوه است. *** = P<0.001.

سلول­هایی که توسط PI که یک رنگ غیر قابل نفوذ به DNA است رنگ شده­اند در حقیقت سلول­های نکروتیک هستند. سلول­های رنگ شده با هر دو رنگ نشان دهنده فاز انتهایی آپوپتوز و فاز اولیه نکروز می باشند. در شکل2 نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری سلول­های نمونة شاهد و نمونه­های تحت تیمار اسانس­ها و عصاره­های دو منطقه نشان داده شده است. بر اساس نمودار شکل3، درصد تعداد سلول­های زنده تحت تاثیر کلیة تیمارها نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی داری داشت. برعکس تعداد سلول­های نکروتیک و نیز سلول­های آپوپتوزی تاخیری تحت اثر اسانس­ها و عصاره­ها نسبت به نمونه کنترل افزایش معناداری را نشان داد( (P<0.05.

شکل2- نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری در تعیین نوع مرگ سلولی: پس از 72 ساعت، درصد سلول­های زنده، نکروزه و آپوپتوز تحت تاثیر  µg/ml 10از هریک از اسانس و عصاره دو منطقه به کمک دستگاه فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. CONTROL = شاهد، O1= عصاره سرشاخه های کرج، O2= عصاره سرشاخه های فیروزکوه، E1= اسانس سرشاخه های کرج، E2= اسانس سرشاخه های فیروزکوه. Q1= درصد سلول­های نکروزه، Q2= درصد سلول­های آپوپتوز تاخیری، Q3= درصد سلول­های آپوپتوزاولیه، Q4= درصد سلول­های زنده

شکل3- نمودار نوع مرگ سلولی: نمودار بر اساس داده­­های حاصل از دستگاه فلوسایتومتری در شکل2 رسم شده است. بیشترین کاهش تعداد سلول­های زنده مربوط به تیمار با عصاره­های گیاهان هر دو منطقه بود. تحت تیمار این عصاره­ها، درصد آپوپتوز اولیه به طور معنی داری بیش از نمونه­های شاهد بوده است؛ اما فقط تحت تاثیر عصاره گیاهان کرج درصد سلول­های آپوپتوز تاخیری نسبت به شاهد افزایش داشته است( (P<0.05. extrac1= عصاره سرشاخه­های ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخه­های ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخه­های ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخه­های ارس فیروزکوه است. live= سلول­های زنده، Apoptosis1= آپوپتوز اولیه، Apoptosis2= آپوپتوز تاخیری و Necrosis= سلول­های نکروز را نشان می دهد. ***= (P<0.001)،  **= (P<0.01)، *= (P<0.05) ، ns= بی معنی.

نتایج بررسی وضعیت چرخه سلولی: وضعیت چرخه­ی سلولی سلول­های A549 تحت تیمار 72 ساعته­ با غلظت 10 میکرو­گرم بر میلی­لیتر اسانس­های به دست آمده از پایه­­های نر کرج (اسانس 1) و فیروزکوه (اسانس 2) و نیز عصاره­های به دست آمده از پایه­­های نر کرج (عصاره­1) و فیروزکوه (عصاره­2)، با استفاده از روش فلوسایتومتری بررسی شد (شکل 4). داده­های حاصل همان­طور که در نمودار شکل5 نیز نشان داده شده است حاکی از آن بود که تحت اثر هر دو عصاره، فراوانی سلول­ها در مرحله­ی G1 به طور معناداری نسبت به نمونه کنترل کاهش داشته (P<0.001) و در مقابل فراوانی آن­ها در مراحلS, G2, sub G1 چرخه­ی سلولی افزایش معناداری داشته است (P<0.001). در رابطه با اثر اسانس­ها بر چرخه­ی سلولی، هر دو اسانس مانند عصاره­ها فراوانی سلول­ها در مرحله­ی G1 به طور معنی داری نسبت به شاهد  کاهش دادند و در مرحلهS  به طور معنی داری افزایش دادند اما در سایر مراحل اثر معنی داری نداشتند.

شکل4- نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری که درصد سلول­ها را در مراحل چرخه سلولی نشان می دهد. CONTROL = شاهد، O1= عصاره سرشاخه های کرج، O2= عصاره سرشاخه های فیروزکوه، E1= اسانس سرشاخه های کرج، E2= اسانس سرشاخه های فیروزکوه.

بحث

استفاده درمانی از گیاهان بخشی از تاریخ جهانی بشر است و محصولات مشتق شده از گیاهان به طور مکرر برای درمان یا پیشگیری از بیماری­ها استفاده می­شود. در سال­های اخیر، چندین محصول گیاهی با اثرات ضد سرطانی در سیستم آزمایش­های مختلف شناسایی شده است(20).

ارس یا Juniperus excelsa  به طور سنتی برای دیسمنوره، سرفه، برونشیت و سرماخوردگی، زردی و سل استفاده می­شد (36). در مطالعات نبی و همکاران (2012) عصاره متانولی ارس فعالیت ضد توموری شدید را با مهار 6/86 درصد و فرکشن دی اتیل اتر آن کمترین فعالیت ضد توموری را با مهار 6/46 درصد نشان داد. بررسی­های بعدی اسماعیلی و همکاران (2014) بر روی خواص ضد سرطانی 27 گیاه دارویی از جنوب کشور بر چند رده سلول سرطانی نیز خواص ضد توموری ارس را تایید کرد ولی گزارشی از اثر عصاره این گیاه بر روی رده سلولی A549 سرطان ریه ارائه ندادند (13و23).

شکل5- نمودار درصد سلول­ها در هریک از مراحل چرخه سلولی: مقایسه هر یک از عصاره ها و اسانس ها با نمونه شاهد اختلاف معنی دار آنها (P < 0.001) را در مرحله G1وS نشان داد. در مرحله G2 هر دو عصاره موجب افزایش معنی دار درصد سلولها نسبت شاهد شدند (P < 0.001) ولی تغییرات درصد سلول­ها تحت تاثیر اسانس ها در مرحله G2وSuperG2  معنی دار نبود. در مرحلهSubG1 افزایش معنی­دار درصد سلول­ها تحت تاثیر هردو عصاره نسبت به شاهد مشاهده شد(P < 0.001) extrac1 = عصاره سرشاخه­های ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخه­های ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخه­های ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخه­های ارس فیروزکوه است.***= (P < 0.001)،  **= (P < 0.01)، *= (P < 0.05) ، ns= بی معنی.

بررسی اثر سمیت سلولی عصاره­ها و اسانس­­ها بر زنده مانی سلول­های سرطانی A549 نشان داد، سمیت عصاره ها گیاهان ارس هر دو منطقه از دامنه جنوبی البرز، از اسانس­های این گیاه بیشتر بود ولی از نظر خواص سمیت سلولی اختلافی بین اسانس­ها و عصاره های دو منطقة وجود نداشت. در مجموع هم اسانس­ها و هم عصاره­ها اثر سمیت سلولی شدیدی داشتند به طوری که مقادیر زنده مانی همه آنها از IC50 کمتر بود و کاهش شدید تعداد سلول­ها 24 ساعت بعد از تاثیر آنها مشاهده شد. خباز آذر و همکاران (2012) نیز سمیت زیاد عصاره Juniperus excelsa را بر سلول­های سرطان HepG2 گزارش کردند همچنین نشان دادند عصاره این گیاه باعث کاهش ATP سلول به دلیل مهار تنفس میتوکندری شد این کاهش ATP وابسته به زمان و غلظت عصاره بود ولی به احتمال زیاد مکانیزم سمیت سلولی این عصاره استرس اکسیداتیو نبوده است(20). در تحقیق حاضر با افزایش غلظت اسانس­ها و عصاره­ها سمیت آنها بیشتر شد. در چند پروژه تحقیقاتی خواص ضد سرطانی عصاره گیاه ارس جمع آوری شده، از مناطق دیگر بر روی چندین رده سلولی دیگر نشان داده شده است که با نتایج تحقیق حاضر همسو است (13و27و28). سمیت سلولی­ اسانس گیاه ارس نیز توسط توپکو و همکارانش بر روی چندین رده سلول­ سرطانی از جمله سلول­های سرطان ریه رده­ی LU1 مورد مطالعه قرار گرفت و قدرت سمیت سلولی بالای آن مشخص گردید (33).

بررسی میزان مرگ سلولی تحت اثر تیمار 72 ساعته­ی سلول­های A549 با غلظت 10 میکرو­گرم بر میلی­لیتر اسانس­ها و عصاره­های پایه­های نر دو منطقه با استفاده از روش فلوسایتومتری کاهش تعداد سلول­های زنده نسبت به نمونه­های شاهد را تایید کرد و تعداد سلول­های زنده تحت تیمار عصاره­ها کمتر از تعداد آنها تحت تیمار اسانس­ها بود که نتایج سنجش درصد زنده مانی با تست MTT را تایید کرد. درصد سلول­هایی که در مرحله آپوپتوز اولیه بودند تحت تاثیر همه تیمارها به طور مشابه هم و بیشتر از نمونه شاهد بودند ولی تعداد سلول­هایی که در مرحله آپوپتوز تاخیری بودند تحت تاثیر عصاره­ها بیشتر از اسانس­ها بود که نشان می­دهد توان عصاره سرشاخه­های این گیاه به ویژه عصاره حاصل از گیاهان ارس کرج برای القای مرگ برنامه­ریزی شده سلول یا همان آپوپتوز بیشتر از اسانس آن است و با نتایج درویشی  و همکاران (2017)  در مورد اثر عصاره ارس بر روی رده های سلولی Nalm-6 وReh همسو می باشد(10). بیشتر بودن آپوپتوز تاخیری نسبت به آپوپتوز اولیه نشان دهنده شکسته شدن DNA و تغییرات غشایی است. در تحقیق حاضر آپوپتوز اولیه بیشتر است که نشان می­دهد عصاره و اسانس این گیاه بر روی غشا بیشتر از شکست DNA تاثیر گذاشته است. اختلال در فرآیند آپوپتوز عامل بسیار مهمی در ایجاد سرطان و گسترش آن به شمار می­رود و مقاومت به آپوپتوز از دلایل اصلی مقاومت دارویی سلول­های سرطانی در برابر شیمی درمانی است (5و18). 

بررسی وضعیت چرخه سلولی، سلول­های تحت تیمار 72 ساعته با اسانس­ها و عصاره­های با غلظت 10میکرو­گرم نشان داد، تعداد سلول­هایی که در مرحله G₁ چرخه سلولی بودند تحت تاثیر عصاره­های دو منطقه بویژه منطقه فیروزکوه کاهش معنی داری نسبت به شاهد داشت و بر عکس تحت تاثیر عصاره­ها تعداد سلول­هایی که در سایر مراحل چرخه بودند نسبت به شاهد افزایش یافت و مجدد این افزایش در سلول­های تحت تیمار عصاره­ها بیشتر از اسانس­ها بود. به این ترتیب به طور ویژه در اثر تیمار با عصاره سرشاخه­های ارس کاهش رشد و تجمع سلول­ها در نقاط کنترل چرخه سلولی مشاهده شد. مقایسه نمودارهای حاصل نشان داد که چرخه سلولی سلول­های تحت تیمار عصاره­ها در مقایسه با شاهد در مرحله G₂/M متوقف شدند در حالیکه سلول­های تحت تیمار اسانس­ها در مرحله G₀/G₁ متوقف گردید. این نتایج با یافته­های زنگ و همکاران (2015) همسو است(38).

تین و همکاران (2012) نشان دادن ترکیب گیاهی آرتمیسینین متعلق به برخی گیاهان خانواده کمپوزیته با تنظیم پایین بیان CDK2 ، CDK4 ، سیکلین E، سیکلین D1 و E2F1، و افزایش بیان p16 ، باعث توقف شدید چرخه سلولی G1 در سلول­های سرطانی پروستات، سلول­های سرطانی پستان انسان و سلو­ل­های سرطانی مری می­شود (32). اوریدونین ترکیب گیاهی دیگری متعلق به برخی گیاهان تیره لامیاسه می­تواند چرخة سلولی را در مرحله G2/M در سلول­های کارسینومای کبد HepG2 متوقف کند(35).

نتیجه گیری کلی

بررسی ها نشان داد عصاره­ها و اسانس­های گیاهان ارس منطقة معتدله دامنه­های جنوبی البرز نیز سمیت سلولی زیادی دارند، ولی تفاوت معنی­داری بین دو منطقه کرج و فیروزکوه نبود. در مجموع سمیت عصاره­ها از اسانس­ها به طور معنی داری بیشتر بود. علی رغم برابر بودن درصد سلول­های آپوپتوز اولیه تحت تاثیر عصاره­ها و اسانس­ها اما درصد تعداد سلول­هایی که تحت تاثیر عصاره­ها دچار آپوپتوز تاخیری و نکروز شده بودند بیشتر بود. تحت تیمار با عصاره­ها توقف درصد سلول­هایی که در مرحله  G2وSub G1 و تا حدودی S متوقف شدند بیشتر از شاهد و سلول­های تحت تیمار با اسانس بود و در گروه اخیر اکثر سلول­ها در G1 متوقف شدند. 

تشکر و قدردانی

نویسندگان بر خود لازم می­دانند مراتب تشکر و قدردانی

خود را از کارشناسان محترم آزمایشگاه تحقیقات زیست شناسی دانشگاه آزاد واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری و نیز آزمایشگاه ژنیران به سبب مساعدت­هایشان جهت انجام پروژة حاضر اعلام نمایند.