نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو هیئت علمی گروه علوم و فنون زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری، تهران، ایران
2 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه علوم و فنون زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری، تهران، ایران
چکیده
سرطان ریه یکی از شایعترین انواع سرطان در جهان و ایران، است. گیاهان منابعی از انواع ترکیبات آنتی-اکسیدان هستند که میتوانند در جهت تولید داروهای ضد سرطانی استفاده شوند. در تحقیق حاضر اثر سمیت سلولی اسانس و عصارهی هیدروالکلی گیاه Juniperus excelsa ، بر روی سلولهای سرطان ریه ردة A549 بررسی شد. سرشاخههای پایه های نر گیاه ارس از دو منطقهی چهل چشمه در فیروزکوه و سیراچال در کرج جمعآوری شده و اسانس و عصاره به ترتیب با روش کلونجر و خیساندن تهیه گردید. میزان سمیت سلولی، غلظتهای مختلف اسانس و عصاره سرشاخههای گیاه ارس دو منطقه، بر روی سلولهای ردة A549 در سه زمان 24 ،48 و 72 ساعت با استفاده از روش MTT ارزیابی شد. از روش فلوسایتومتری برای بررسی مرگ سلولی و چرخهی سلولی در سلولهای تحت تیمار 72 ساعته با 10 µg/ml اسانس و عصاره دو منطقه استفاده گردید. نتایج بررسی میزان سمیت سلولی نشان داد قدرت کشندگی عصارهها از اسانسها به طور معنی داری بیشتر بود ولی بین مناطق مختلف تفاوت معنی داری از نظر میزان سمیت سلول وجود نداشت(P<0.01). همچنین کاهش بیشتر تعداد سلولهای زنده و افزایش ورود سلولها به فاز Sub G1 و در نتیجه افزایش آپوپتوز تحت تیمار با عصارة پایههای نر ثابت شد. به این ترتیب عصارة سرشاخههای این گیاه با توقف چرخه سلولی در مرحله G2/M خواص ضد سرطانی دارد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Comparison of cytotoxic properties of essential oil and extract of Juniperus excelsa branches of Alborz region on lung cancer cell line A549
نویسندگان [English]
1 Department of Biology, Yadegar-e-Imam Khomeini (RAH) Shahre Rey Branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of Iran
2 Master student, of Department of Biology, Yadegar-e-Imam Khomeini (RAH) Shahre Rey Branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of Iran
چکیده [English]
Lung cancer is one of the most common types of cancer in the world and Iran. Herbs are a source of a variety of antioxidant compounds that can be used to produce anti-cancer drugs. In the present study, the effect of cytotoxicity of essential oil and hydroalcoholic extract of Juniperus excelsa on A549 lung cancer cells was investigated. The branches of male rootstocks of Aras plant were collected from Chehel Cheshmeh in Firoozkooh and Sirachal in Karaj and the essential oil and extract were prepared by Clevenger and soaking methods, respectively. The degree of cytotoxicity, different concentrations of essential oil and extract of the two regions, on A549 cells in three times of 24, 48, and 72 hours Was evaluated using MTT method. Flow cytometry was used to evaluate cell death and cell cycle in cells treated for 72 hours with 10 µg/ml of essential oil and extract of two regions. The results of cytotoxicity showed that the lethal power of extracts was significantly higher than essential oils, but there was no significant difference between different regions (P <0.01). Also, a further decrease in the number of viable cells and an increase in cell entry into the Sub G1 phase, resulting in an increase in apoptosis treated with male root extract, was proven. Thus, the extract of the branches of this plant has anti-cancer properties by stopping the cell cycle in the G2 / M stage.
کلیدواژهها [English]
مقایسه خواص سیتوتوکسیک اسانس و عصاره سرشاخه های Juniperus excelsa در دو منطقة البرز بر رده سلولی سرطان ریه A549
سیده مهدخت مداح*، فرهنگ مراقبی و ستاره سرحدی
ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 09/08/1399 تاریخ پذیرش: 27/06/1400
چکیده
سرطان ریه یکی از شایعترین انواع سرطان در جهان و ایران، است. گیاهان منابعی از انواع ترکیبات آنتیاکسیدان هستند که میتوانند در جهت تولید داروهای ضد سرطانی استفاده شوند. در تحقیق حاضر اثر سمیت سلولی اسانس و عصارهی هیدروالکلی گیاه Juniperus excelsa ، بر روی سلولهای سرطان ریه ردة A549 بررسی شد. سرشاخههای پایه های نر گیاه ارس از دو منطقهی چهل چشمه در فیروزکوه و سیراچال در کرج جمعآوری شده و اسانس و عصاره به ترتیب با روش کلونجر و خیساندن تهیه گردید. میزان سمیت سلولی، غلظتهای مختلف، اسانس و عصاره سرشاخههای گیاه ارس دو منطقه، بر روی سلولهای رده A549 در سه زمان 24 ،48 و 72 ساعت با استفاده از روش MTT ارزیابی شد. از روش فلوسایتومتری برای بررسی مرگ سلولی و چرخهی سلولی در سلولهای تحت تیمار 72 ساعته با 10 µg/ml اسانس و عصاره دو منطقه استفاده گردید. نتایج بررسی میزان سمیت سلولی نشان داد قدرت کشندگی عصارهها از اسانسها به طور معنی داری بیشتر بود ولی بین مناطق مختلف تفاوت معنی داری از نظر میزان سمیت سلول وجود نداشت(P < 0.01). همچنین کاهش بیشتر تعداد سلولهای زنده و افزایش ورود سلولها به فاز Sub G1 و در نتیجه افزایش آپوپتوز تحت تیمار با عصارة پایههای نر ثابت شد. به این ترتیب عصارة سرشاخههای این گیاه با توقف چرخه سلولی در مرحله G2/M خواص ضد سرطانی دارد.
واژه های کلیدی: Juniperus excelsa ، آپوپتوز، چرخه سلولی، سرطان ریه، سمیت سلولی
* نویسنده مسئول، تلفن 09122123712، پست الکترونیکی: s.m.maddah@iausr.ac.ir
مقدمه
در سراسر دنیا، سرطان ریه از جمله مهمترین سرطانهای تشخیص داده شده میباشد و به عنوان یکی از محتملترین علت مرگ و میرهای ناشی از سرطان به شمار میرود. سرطان ریه در ایران جز یکی از پنج سرطان شایع است و میزان بروز آن روندی افزایشی دارد (15و24). دو نوع اصلی سرطان ریه وجود دارد: سرطان ریه سلول کوچک و سرطان ریه سلول غیر کوچک. در صورتی که سرطانی ویژگیهای هر دو نوع را داشته باشد به عنوان یک کارسینوم سلول کوچک و بزرگ (آمیخته) شناخته میشود. حدود 85 الی 90 درصد سرطانهای ریه تشخیص داده شده از نوع سرطان سلول غیر کوچک هستند(34).
درمانهای مرسوم سرطانها باعث اثرهای جانبی جدی میشود به طوری که دسترسی به دارویی با اثربخشی بالا، سمیت کم، که به طور اختصاصی بر سلولها تاثیر گذاشته و ارزان باشد یکی از دغدغههای مهم جوامع دارویی دنیا و حوزه درمان میباشد. در این زمینه درمان با گیاهان دارویی میتواند یکی از پایههای اصلی کنترل و درمان سرطان باشد (31). خواص ضد توموری و مکانیزم عمل ترکیبات اپیگلوکاتکین-3-گالات (EGCG) (Epigallocatechin-3-galate) در گیاه چای سبز، ایزوتیوسیاناتها (Isothiocyanate) در گیاهان تیره کلم و ایزوفلاوونها (Isoflavone) که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی قوی هستند و نیز تیموکادروئینون (TQ)(Thymoquinone) که یک ترکیب فعال زیستی در اسانس سیاه دانه است ثابت و مشخص شده است همچنین تاکسول نیز که از پوست درخت سرخدار به دست میآید امروزه به عنوان داروی ضد سرطانی استفاده میشود (16). بسیاری از اسانسهای گیاهی دارای خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد توموری هستند. در سلولهای سرطانی، اسانسها از طریق القاء آپوپتوز در سلولهای سرطانی در درمان آنها نقش دارند. از طرف دیگر اسانسها متاستاز را مهار میکنند در حالی که داروهای شیمی درمانی قادر به مهار متاستاز نیستند (37).
از جنس گیاه ارس (Juniperus) گونههایی مانند ,J.excelsa، J.communis, J.oblonga, J.sabina J.foetidissima در ایران موجود است و گسترش آنها به صورت لکهای و در استانهای مختلف میباشد (19). گیاه اُرِس (Juniperus excels)، یک درخت یا درختچهای همیشه سبز از خانواده Cupressaceae میباشد که در ایران در شیبهای شمالی و جنوبی رشتهکوه البرز از ارتفاع 1900تا2850 متر و به مقدار کمتر در رشتهکوه زاگرس پراکنش دارد (14). شیب جنوبی البرز که از لحاظ وضعیت آب و هوایی منطقهای نیمه خشک است، رویشگاه اصلی درختان ارس میباشد که به علت تابش فراوان، خاک قلیایی و خشکی هوا خود به عنوان عوامل اصلی و موثر درتغییر متابولیسم ثانویه در این درختان نقش بازی میکند (25). وجود ترکیبات آنتی اکسیدانت در انواع ارسها نوید مناسبی است زیرا آنتی اکسیدانها به عنوان ترکیبات جلوگیری کننده از سرطان که در مراحل اولیه از بین برنده تومور میباشند شناخته شدهاند. اسانس و عصاره میوه و سرشاخه های این گیاه خواص بیولوژیکی و فارماکولوژیکی فراوانی دارد ( 1، 7، 26 و 30).
فعالیت ضد میکروبی، ضد قارچی و آنتیاکسیدانی اسانس گیاه ارس (21) و رابطه بین محتویات بالقوه آنتیاکسیدانی و فنولی میوة ارس (22) و همچنین فعالیت آنتیاکسیدانی اسانس بخشهای مختلف دو زیر گونه گیاه ارس (12) نشان داده شده است. تاکنون اثر سیتوتوکسیتی عصارة بخشهای هوایی گیاه ارس بر لوسمی لنفوبلاستیک حاد ردههای Nalm-6 و Reh (9و10) و عصارهی سرشاخههای نر و ماده و میوه دو زیر گونه J. excelsa بر سلولهای MDA-MB-468 ، Hela و KB (28)، همچنین اثر سمیت عصاره گیاه ارس بر رده سلولی سرطان مری KYSE-30 و سلولهای فیبروبلاست معمولی HU02 (11) و رده سلولی MCF-7 سرطان سینه (8) مورد ارزیابی قرار گرفت و میزان توانایی خواص ضد سرطانی آنها تعیین گردیده است.
در این تحقیق ضمن بررسی خواص آنتی اکسیدانی عصاره و اسانس سرشاخه های پایههای نرگیاهان ارس دامنههای جنوبی البرز، خواص ضد سرطانی آنها و چگونگی تاثیر آنها بر چرخه سلولی سلولهای سرطان ریه A549 مورد سنجش قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه گیاه: نمونهبرداری از سرشاخههای پایهی نر گیاه ارس از دو منطقهی کرج - منطقه حفاظت شدهی سیراچال -(منطقه1) و فیروزکوه - چهل چشمه- (منطقه2) انجام شد. گونههای جمع آوری شده با استفاده از کلیدهای شناسایی گونه های ارس در موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع مورد تایید قرار گرفت. پس از انتقال نمونهها به آزمایشگاه و شستشوی آنها با آب مقطر، سرشاخهها بر روی یک پارچهی تمیز قرار داده شدند تا در دمای اتاق خشک شوند.
عصاره گیاه ارس: عصارهگیری به روش خیساندن، به طور
جداگانه از پایههای نر گیاهان ارس مربوط به دو منطقه کرج و فیروزکوه انجام شد. ابتدا 10 گرم از پودر گیاه خشک شده به ظرف شیشهای دردار دارای 100 میلیلیتر متانول 70% اضافه شد. ظرف در انکوباتور شیکردار(innova42) در دمای 45-40 درجه سانتیگراد با دور rpm 100 به مدت 24 ساعت قرار داده شد. عصاره با کاغذ صافی واتمن صاف شد و با دستگاه روتاری(Heidolph Laborata Rotary Evaporator, WB eco, Germany) با دمای 40 درجه سانتیگراد، فشار 180-150 و دور rpm 40، تغلیظ گردید(6).
استخراج اسانس: اسانسگیری از 150 گرم سرشاخههای خشک شده پایهی نر گیاه ارس دو منطقه، به طور جداگانه و به روش کلونجر (تقطیر با آب) به مدت 4 ساعت انجام شد. در صورت وجود قطرات آب در اسانس جدا شده، آب به کمک سولفات سدیم از اسانس حذف گردید و اسانس در ظرف تیره و در دار در یخچال نگهداری شد(2).
کشت سلول: رده سلولی A549 سرطان ریه از انستیتوپاستور ایران خریداری گردید. سلول ها در فلاسک 75 حاوی محیط کشت DMEM به همراه سرم 10 درصد FBS وµg/ml 100 پنیسیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. فلاسک در دمای 37 درجه سانتیگراد در داخل انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 و رطوبت 95% قرار داده شد(29).
بررسی سمیت سلولی: پس از رشد و تکثیر مناسب سلولها در فلاسک، سلولها در3 پلیت 96 خانهای توزیع گردیدند (104 سلول در هر چاهک) و به مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور 37 درجه نگهداری شدند. سپس محیط کشت هر چاهک به آرامی خارج شد و به منظور تیماردهی، از هر یک از عصارهها و اسانسها با استفاده از آب استوک 16 میلیگرم بر میلیلیتر تهیه و از آن غلظتهای 250، 125، 60، 30 ، 10و صفر میکروگرم بر میلیلیتر تهیه شد. برای بهتر حل شدن اسانس ابتدا اسانس در مقدار بسیار کمی(Dimethyl sulfoxide) DMSO حل شد. در هر سه پلیت 96 خانه برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. پلیت اول 24 ساعت بعد از انکوباتور خارج شد و پس از خروج مایة رویی، در تاریکی به هر چاهک 50 میکرولیتر محلول MTT 5 میلیگرم بر میلیلیتر زرد رنگ، اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور انکوبه گردید. سپس رنگ MTT خالی و به هر چاهک 50 میکرولیتر DMSO اضافه شد و پلیت با فویل آلومینیومی پیچیده شد؛ سپس حدود 1 ساعت در انکوباتور انکوبه شد تا کریستالهای ارغوانی رنگ حاصل از احیاء MTTدر آن حل شود و در نهایت جذب نوری هر نمونه در طول موج 570 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر نانودراپ(Milton Roy- Spectronic 21D- USA) اندازه گیری شد. شدت رنگ ارغوانی حاصله معرف نسبت سلولهای زنده در هر چاهک است. این مراحل 48 ساعت بعد برای پلیت دوم و 72 ساعت بعد برای پلیت سوم تکرار شد(4و29).
ارزیابی نوع مرگ سلولی با تکنیک فلوسایتومتری: میزان آپوپتوز و نکروز سلولهای A549 که با غلظت µg/ml 10 از اسانسها و عصارهها تیمار شده بودند، با استفاده از روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. به این منظور در پلیت 24 خانهای در هر چاهک به طور متوسط 104 سلول تحت تیمار کشت شدند. پس از 72 ساعت، سلولها با PBS شستشو و با یک واحد آنزیم تریپسین از پلیت جدا و سانتریفیوژ شدند. سپس رسوب سلولی با محلول 10% بافر باندینگ شسته شده و 15 دقیقه در rpm 15000 سانتریفیوژ شدند. محلول FITS (Fluorescin Isothiocyanate) متصل به Annexin-V به میزان 5 میکرولیتر به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و محیط انکوبه شدند. رنگ Annexine به فسفاتیدیل سرینهای موجود در غشای سلول آپوپتوز یافته چسبیده و آنها را نشاندار میکند. سپس با استفاده از 5 میکرولیتر محلول PI (Propidum Iodide Ebioscience) آمادهی شمارش توسط دستگاه فلوسایتومتری(FACS-Calibur) شدند. PI در سلولهای نکروز شده به DNAی هسته متصل شده و تعداد سلولهای نکروز شده را نشان میدهد. در این آزمون از محیط کشت فاقد اسانس و عصاره به عنوان کنترل منفی استفاده شد (5 و 17).
ارزیابی چرخه سلولی با تکنیک فلوسایتومتری: به منظور تعیین اینکه سلولها در چه مرحلهای از چرخه سلولی هستند، سلول هایA549 در پلیت 24 خانه کشت شدند، پس از 24 ساعت تحت تیمار با غلظتµg/ml 10 از اسانسها و عصارههای دو منطقه قرار داده شدند. 72 ساعت پس از تیماردهی، سلولها از کف پلیت جدا شده و درg 800 سانتریفوژ شدند. پس از شستشو با PBS سرد با اتانول 70 درصد تثبیت شدند. برای بررسی فازهای چرخه سلولی، نمونههای کنترل و تیمارشده، به مدت 30 دقیقه با 20 میکروگرم پروپیدیوم ایودید PI و20 میکروگرم RNase (حل شده در یک میلیلیترPBS) مخلوط شدند و توسط دستگاه فلوسایتومتری(FACS-Calibur) مورد سنجش قرار گرفتند. با استفاده از نرم افزار Flowjo، درصد جمعیت سلولی در مراحل مختلف چرخه سلولی تعیین شد(3).
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: آزمایش بررسی اثر سیتوتوکسیک و بررسی چرخه و مرگ سلولی در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار انجام شد. پس از نرمال کردن داده ها آنالیز تجزیه واریانس دو طرفه (Two way ANOVA) اجرا شد. مقایسه میانگین ها(انحراف معیار± میانگین) با آزمون توکی با سطح احتمال P<0.05 و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزارهای22 SPSS و GraphPad Prism 8 انجام شد.
نتایج
نتایج سمیت سلولی: اثر سمیت سلولی عصاره تهیه شده از پایههای نر کرج (extact1) و فیروزکوه (extract2) و اسانسهای تهیه شده از پایههای نر کرج (Essential oil1) و فیروزکوه (Essential oil2) در سه زمان 24، 48 و 72 ساعت بر روی سلولهای A549 بررسی شد. از محیط کشت فاقد اسانس و عصاره به عنوان کنترل استفاده شد. نمونههای کنترل بیشترین تعداد سلول های زنده نزدیک به 100 درصد را داشتند که ضمن نرمال سازی داده ها، 100 درصد در نظر گرفته شد. در شکل 1-الف، نمودار درصد زنده مانی سلولها، 24ساعت پس از تاثیر اسانسها و عصارهها، نشان داده شده است. تحت تیمار غلظتهای مختلف اسانسها و عصارهها درصد بسیار کمی از سلولها (زیر 20%) زنده ماندند. این کاهش تعداد سلولهای زنده نسبت به نمونة کنترل در هر سه زمان 24، 48 و72 ساعت در تمام غلظتها، تفاوت معنی دار داشتند (P<0.001). پس از 48 ساعت، میزان زندهمانی سلول ها باز هم کاهش یافت و بین 12 تا 0.24 درصد در تیمارهای مختلف متغییر بود. البته به جز تیمار با اسانس منطقه فیروزکوه که خطای آزمایش در اعمال تیماردهی مشاهده شد(شکل1-ب). بر اساس نمودار ج شکل 1 پس از 72 ساعت بیشترین درصد زندهمانی سلولها تحت اثر µg/ml10 اسانس فیروزکوه به میزان 1.21± 22.98 مشاهده شد و کمترین درصد زنده مانی سلولهای مربوز تحت تیمار با عصارة کرج با غلظت µg/ml125 به میزان 0.67±0.15 درصد مشاهده گردید. پس از 72 ساعت، IC50 برای عصاره کرج 0.172 میکروگرم، عصاره فیروزکوه 0.426، اسانس کرج 1.937 و اسانس فیروزکوه 0.690 میکروگرم بدست آمد(شکل1-د). همچنین در هر سه زمان یک اثر نسبی وابسته به غلظت نیز مشاهده شد که با افزایش غلظت اسانسها و عصارهها، اثر سیتوتوکسیک آنها افزایش پیدا کرد و در غلظتهای پایینتر، زندهمانی سلولها بیشتر بود (شکل1).
نتایج سنجش نوع مرگ سلولی: پس از 72 ساعت، درصد سلولهای زنده، نکروزه و آپوپتوز تحت تاثیر µg/ml 10 از هریک از اسانس و عصاره دو منطقه به کمک دستگاه فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. پروتئین مزدوج شده با Annexin V-FITC به سطوح سلولی که فسفاتیدین سرین در آنها به لایه خارجی دو لایه فسفولیپیدی غشا آمده است متصل شده که نشانگر آپوپتوز اولیه است.
ب |
الف
|
د
|
ج
|
شکل1- الف) نمودار درصد زندهمانی سلولهای سرطان ریهA549، پس از24 ساعت ، ب) نمودار درصد زنده مانی سلول ها پس از 48 ساعت، ج) نمودار درصد سلول های زنده پس از 72 ساعت، د) نمودار IC50 72 ساعت پس از تیمار دهی.
اختلاف میانگین درصد زندهمانی نمونه شاهد با سایر غلظتهای تیمار در هر سه زمان در سطح 0001/0 درصد معنی دار شد به جز غلظت های تیمار اسانس فیروزکوه در 48 ساعت که خطا داشت. اعداد به صورت میانگین± انحراف معیار مقایسه شدند. extrac1= عصاره سرشاخههای ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخههای ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخههای ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخههای ارس فیروزکوه است. *** = P<0.001.
سلولهایی که توسط PI که یک رنگ غیر قابل نفوذ به DNA است رنگ شدهاند در حقیقت سلولهای نکروتیک هستند. سلولهای رنگ شده با هر دو رنگ نشان دهنده فاز انتهایی آپوپتوز و فاز اولیه نکروز می باشند. در شکل2 نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری سلولهای نمونة شاهد و نمونههای تحت تیمار اسانسها و عصارههای دو منطقه نشان داده شده است. بر اساس نمودار شکل3، درصد تعداد سلولهای زنده تحت تاثیر کلیة تیمارها نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی داری داشت. برعکس تعداد سلولهای نکروتیک و نیز سلولهای آپوپتوزی تاخیری تحت اثر اسانسها و عصارهها نسبت به نمونه کنترل افزایش معناداری را نشان داد( (P<0.05.
O2 |
O1 |
CONTROL |
E2 |
E1 |
Apoptosis Analysis Q1= Necrotic Cells Q2= Late apoptotic Cells Q3= Early apoptotic Cells Q4= Viable Cells |
شکل2- نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری در تعیین نوع مرگ سلولی: پس از 72 ساعت، درصد سلولهای زنده، نکروزه و آپوپتوز تحت تاثیر µg/ml 10از هریک از اسانس و عصاره دو منطقه به کمک دستگاه فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. CONTROL = شاهد، O1= عصاره سرشاخه های کرج، O2= عصاره سرشاخه های فیروزکوه، E1= اسانس سرشاخه های کرج، E2= اسانس سرشاخه های فیروزکوه. Q1= درصد سلولهای نکروزه، Q2= درصد سلولهای آپوپتوز تاخیری، Q3= درصد سلولهای آپوپتوزاولیه، Q4= درصد سلولهای زنده
شکل3- نمودار نوع مرگ سلولی: نمودار بر اساس دادههای حاصل از دستگاه فلوسایتومتری در شکل2 رسم شده است. بیشترین کاهش تعداد سلولهای زنده مربوط به تیمار با عصارههای گیاهان هر دو منطقه بود. تحت تیمار این عصارهها، درصد آپوپتوز اولیه به طور معنی داری بیش از نمونههای شاهد بوده است؛ اما فقط تحت تاثیر عصاره گیاهان کرج درصد سلولهای آپوپتوز تاخیری نسبت به شاهد افزایش داشته است( (P<0.05. extrac1= عصاره سرشاخههای ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخههای ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخههای ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخههای ارس فیروزکوه است. live= سلولهای زنده، Apoptosis1= آپوپتوز اولیه، Apoptosis2= آپوپتوز تاخیری و Necrosis= سلولهای نکروز را نشان می دهد. ***= (P<0.001)، **= (P<0.01)، *= (P<0.05) ، ns= بی معنی.
نتایج بررسی وضعیت چرخه سلولی: وضعیت چرخهی سلولی سلولهای A549 تحت تیمار 72 ساعته با غلظت 10 میکروگرم بر میلیلیتر اسانسهای به دست آمده از پایههای نر کرج (اسانس 1) و فیروزکوه (اسانس 2) و نیز عصارههای به دست آمده از پایههای نر کرج (عصاره1) و فیروزکوه (عصاره2)، با استفاده از روش فلوسایتومتری بررسی شد (شکل 4). دادههای حاصل همانطور که در نمودار شکل5 نیز نشان داده شده است حاکی از آن بود که تحت اثر هر دو عصاره، فراوانی سلولها در مرحلهی G1 به طور معناداری نسبت به نمونه کنترل کاهش داشته (P<0.001) و در مقابل فراوانی آنها در مراحلS, G2, sub G1 چرخهی سلولی افزایش معناداری داشته است (P<0.001). در رابطه با اثر اسانسها بر چرخهی سلولی، هر دو اسانس مانند عصارهها فراوانی سلولها در مرحلهی G1 به طور معنی داری نسبت به شاهد کاهش دادند و در مرحلهS به طور معنی داری افزایش دادند اما در سایر مراحل اثر معنی داری نداشتند.
O2 |
O1 |
CONTROL
|
E2 |
E1 |
شکل4- نمودارهای حاصل از فلوسایتومتری که درصد سلولها را در مراحل چرخه سلولی نشان می دهد. CONTROL = شاهد، O1= عصاره سرشاخه های کرج، O2= عصاره سرشاخه های فیروزکوه، E1= اسانس سرشاخه های کرج، E2= اسانس سرشاخه های فیروزکوه.
بحث
استفاده درمانی از گیاهان بخشی از تاریخ جهانی بشر است و محصولات مشتق شده از گیاهان به طور مکرر برای درمان یا پیشگیری از بیماریها استفاده میشود. در سالهای اخیر، چندین محصول گیاهی با اثرات ضد سرطانی در سیستم آزمایشهای مختلف شناسایی شده است(20).
ارس یا Juniperus excelsa به طور سنتی برای دیسمنوره، سرفه، برونشیت و سرماخوردگی، زردی و سل استفاده میشد (36). در مطالعات نبی و همکاران (2012) عصاره متانولی ارس فعالیت ضد توموری شدید را با مهار 6/86 درصد و فرکشن دی اتیل اتر آن کمترین فعالیت ضد توموری را با مهار 6/46 درصد نشان داد. بررسیهای بعدی اسماعیلی و همکاران (2014) بر روی خواص ضد سرطانی 27 گیاه دارویی از جنوب کشور بر چند رده سلول سرطانی نیز خواص ضد توموری ارس را تایید کرد ولی گزارشی از اثر عصاره این گیاه بر روی رده سلولی A549 سرطان ریه ارائه ندادند (13و23).
شکل5- نمودار درصد سلولها در هریک از مراحل چرخه سلولی: مقایسه هر یک از عصاره ها و اسانس ها با نمونه شاهد اختلاف معنی دار آنها (P < 0.001) را در مرحله G1وS نشان داد. در مرحله G2 هر دو عصاره موجب افزایش معنی دار درصد سلولها نسبت شاهد شدند (P < 0.001) ولی تغییرات درصد سلولها تحت تاثیر اسانس ها در مرحله G2وSuperG2 معنی دار نبود. در مرحلهSubG1 افزایش معنیدار درصد سلولها تحت تاثیر هردو عصاره نسبت به شاهد مشاهده شد(P < 0.001) extrac1 = عصاره سرشاخههای ارس کرج، extrac2= عصاره سرشاخههای ارس فیروزکوه، Essential oil1= اسانس سرشاخههای ارس کرج، Essential oil2= اسانس سرشاخههای ارس فیروزکوه است.***= (P < 0.001)، **= (P < 0.01)، *= (P < 0.05) ، ns= بی معنی.
بررسی اثر سمیت سلولی عصارهها و اسانسها بر زنده مانی سلولهای سرطانی A549 نشان داد، سمیت عصاره ها گیاهان ارس هر دو منطقه از دامنه جنوبی البرز، از اسانسهای این گیاه بیشتر بود ولی از نظر خواص سمیت سلولی اختلافی بین اسانسها و عصاره های دو منطقة وجود نداشت. در مجموع هم اسانسها و هم عصارهها اثر سمیت سلولی شدیدی داشتند به طوری که مقادیر زنده مانی همه آنها از IC50 کمتر بود و کاهش شدید تعداد سلولها 24 ساعت بعد از تاثیر آنها مشاهده شد. خباز آذر و همکاران (2012) نیز سمیت زیاد عصاره Juniperus excelsa را بر سلولهای سرطان HepG2 گزارش کردند همچنین نشان دادند عصاره این گیاه باعث کاهش ATP سلول به دلیل مهار تنفس میتوکندری شد این کاهش ATP وابسته به زمان و غلظت عصاره بود ولی به احتمال زیاد مکانیزم سمیت سلولی این عصاره استرس اکسیداتیو نبوده است(20). در تحقیق حاضر با افزایش غلظت اسانسها و عصارهها سمیت آنها بیشتر شد. در چند پروژه تحقیقاتی خواص ضد سرطانی عصاره گیاه ارس جمع آوری شده، از مناطق دیگر بر روی چندین رده سلولی دیگر نشان داده شده است که با نتایج تحقیق حاضر همسو است (13و27و28). سمیت سلولی اسانس گیاه ارس نیز توسط توپکو و همکارانش بر روی چندین رده سلول سرطانی از جمله سلولهای سرطان ریه ردهی LU1 مورد مطالعه قرار گرفت و قدرت سمیت سلولی بالای آن مشخص گردید (33).
بررسی میزان مرگ سلولی تحت اثر تیمار 72 ساعتهی سلولهای A549 با غلظت 10 میکروگرم بر میلیلیتر اسانسها و عصارههای پایههای نر دو منطقه با استفاده از روش فلوسایتومتری کاهش تعداد سلولهای زنده نسبت به نمونههای شاهد را تایید کرد و تعداد سلولهای زنده تحت تیمار عصارهها کمتر از تعداد آنها تحت تیمار اسانسها بود که نتایج سنجش درصد زنده مانی با تست MTT را تایید کرد. درصد سلولهایی که در مرحله آپوپتوز اولیه بودند تحت تاثیر همه تیمارها به طور مشابه هم و بیشتر از نمونه شاهد بودند ولی تعداد سلولهایی که در مرحله آپوپتوز تاخیری بودند تحت تاثیر عصارهها بیشتر از اسانسها بود که نشان میدهد توان عصاره سرشاخههای این گیاه به ویژه عصاره حاصل از گیاهان ارس کرج برای القای مرگ برنامهریزی شده سلول یا همان آپوپتوز بیشتر از اسانس آن است و با نتایج درویشی و همکاران (2017) در مورد اثر عصاره ارس بر روی رده های سلولی Nalm-6 وReh همسو می باشد(10). بیشتر بودن آپوپتوز تاخیری نسبت به آپوپتوز اولیه نشان دهنده شکسته شدن DNA و تغییرات غشایی است. در تحقیق حاضر آپوپتوز اولیه بیشتر است که نشان میدهد عصاره و اسانس این گیاه بر روی غشا بیشتر از شکست DNA تاثیر گذاشته است. اختلال در فرآیند آپوپتوز عامل بسیار مهمی در ایجاد سرطان و گسترش آن به شمار میرود و مقاومت به آپوپتوز از دلایل اصلی مقاومت دارویی سلولهای سرطانی در برابر شیمی درمانی است (5و18).
بررسی وضعیت چرخه سلولی، سلولهای تحت تیمار 72 ساعته با اسانسها و عصارههای با غلظت 10میکروگرم نشان داد، تعداد سلولهایی که در مرحله G1 چرخه سلولی بودند تحت تاثیر عصارههای دو منطقه بویژه منطقه فیروزکوه کاهش معنی داری نسبت به شاهد داشت و بر عکس تحت تاثیر عصارهها تعداد سلولهایی که در سایر مراحل چرخه بودند نسبت به شاهد افزایش یافت و مجدد این افزایش در سلولهای تحت تیمار عصارهها بیشتر از اسانسها بود. به این ترتیب به طور ویژه در اثر تیمار با عصاره سرشاخههای ارس کاهش رشد و تجمع سلولها در نقاط کنترل چرخه سلولی مشاهده شد. مقایسه نمودارهای حاصل نشان داد که چرخه سلولی سلولهای تحت تیمار عصارهها در مقایسه با شاهد در مرحله G2/M متوقف شدند در حالیکه سلولهای تحت تیمار اسانسها در مرحله G0/G1 متوقف گردید. این نتایج با یافتههای زنگ و همکاران (2015) همسو است(38).
تین و همکاران (2012) نشان دادن ترکیب گیاهی آرتمیسینین متعلق به برخی گیاهان خانواده کمپوزیته با تنظیم پایین بیان CDK2 ، CDK4 ، سیکلین E، سیکلین D1 و E2F1، و افزایش بیان p16 ، باعث توقف شدید چرخه سلولی G1 در سلولهای سرطانی پروستات، سلولهای سرطانی پستان انسان و سلولهای سرطانی مری میشود (32). اوریدونین ترکیب گیاهی دیگری متعلق به برخی گیاهان تیره لامیاسه میتواند چرخة سلولی را در مرحله G2/M در سلولهای کارسینومای کبد HepG2 متوقف کند(35).
نتیجه گیری کلی
بررسی ها نشان داد عصارهها و اسانسهای گیاهان ارس منطقة معتدله دامنههای جنوبی البرز نیز سمیت سلولی زیادی دارند، ولی تفاوت معنیداری بین دو منطقه کرج و فیروزکوه نبود. در مجموع سمیت عصارهها از اسانسها به طور معنی داری بیشتر بود. علی رغم برابر بودن درصد سلولهای آپوپتوز اولیه تحت تاثیر عصارهها و اسانسها اما درصد تعداد سلولهایی که تحت تاثیر عصارهها دچار آپوپتوز تاخیری و نکروز شده بودند بیشتر بود. تحت تیمار با عصارهها توقف درصد سلولهایی که در مرحله G2وSub G1 و تا حدودی S متوقف شدند بیشتر از شاهد و سلولهای تحت تیمار با اسانس بود و در گروه اخیر اکثر سلولها در G1 متوقف شدند.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم میدانند مراتب تشکر و قدردانی
خود را از کارشناسان محترم آزمایشگاه تحقیقات زیست شناسی دانشگاه آزاد واحد یادگار امام خمینی(ره) شهرری و نیز آزمایشگاه ژنیران به سبب مساعدتهایشان جهت انجام پروژة حاضر اعلام نمایند.