خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچة نمک ارومیه 

عزت عسگرانی^1،*، نسیم صفری¹ و داود زارع²

¹ تهران، دانشگاه الزهرا^(س)، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² تهران، پژوهشگاه عصر انقلاب، پژوهشکده بیوتکنولوژی 

تاریخ دریافت: 1/8/89                 تاریخ پذیرش: 15/5/91 

چکیده

یک سویة آرکیایی بسیار نمک دوست و مقاوم به پرتوهای پونیزه کننده گاما و نور فرابنفش به نام  Haloarcula sp. IRU1 که از آب دریاچة ارومیه جداسازی شده قادر به تولید رنگیزه های کاروتنوئیدی است. در این تحقیق، ابتدا به منظور استخراج کاروتنوئید­ها، پس از امتحان روشهای متداول و استفاده از حلالهای مختلف در نهایت، شکستن سلول به کمک پودر شیشه نسبتاً نرم و استفاده از حلالهای استون و هگزان  به عنوان بهترین روش انتخاب گردید.  سپس جداسازی پیگمانها به روش کروماتوگرافی با لایه نازک انجام شد. بدین منظور، حلالهای مختلف با نسبتهای متفاوت مورد بررسی قرار گرفت و بهترین الگوی جداسازی، با استفاده از حلالهای استون و پترولئوم اتر و به ترتیب با نسبت 35 : 65 به دست آمد. در این حالت شش باند مختلف بر روی پلیت TLC مشاهده شد که بزرگترین و قوی ­ترین باند در قسمت پایین و با کمترین مقدار RF بود. همچنین در این مرحله، از تعدادی استاندارد کاروتنوئیدی برای شناسایی مقدماتی پیگمانها استفاده گردید. بزرگترین باند مشاهده شده بر روی صفحه  TLC ( 70 درصد ،17/0   Rf-value: ) به عنوان پیگمان اصلی در این باکتری در نظر گرفته شد. سپس جذب نوری پیگمان اصلی در ناحیه طول موجهای 600-300 نانومتر اندازه گیری شد که طیف حاصله و نقاط ماکزیمم به دست آمده نشان دهنده شباهت ساختمانی این کاروتنویید با باکتریوروبرین است. نتایج  FT-IR کاروتنوئید اصلی نیز شباهت زیادی بین پیگمان کاروتنوئیدی اصلی  Haloarcula sp. IRU1 و باکتریوروبرین که دارای 13 پیوند دوگانه کانجوگه و چهار گروه هیدروکسیل نوع سوم است، را نشان می دهد. البته در طیفFT-IR  کاروتنوئید این آرکی علاوه بر مشاهده کششهای مربوط به پیوندهایC^_O  و O^_H در طیف حاصل که به خوبی قابل تشخیص می­باشد، کشش نسبتاً ضعیفی نیز مربوط به گروه کتونی نیز قابل مشاهده است. از طرف دیگر، نتایج اسپکتروفتومتری جرمی وزن مولکولی 783 را برای این پیگمان نشان می دهد که 43 دالتون با وزن مولکولی باکتریوروبرین اختلاف دارد. بر طبق اطلاعات به دست آمده از طیف H-NMR، علاوه بر مشخصه­های ساختار کاروتنوئید باکتریوروبرین، می­توان حضور یک گروه متیل کتون را نیز در ساختار این کاروتنوئید مورد توجه قرار داد. بنابراین، با توجه به نتایج به دست آمده از طیف سنجیهای انجام شده برای شناسایی پیگمان اصلی در این باکتری پیشنهاد می شود کاروتنوئید اصلی این آرکیهالوفیل نیز مانند سایر باکتریهای اکستریم هالوفیل، کاروتنوئید باکتریوروبرین می­باشد که در این­جا به صورت استری شده با گروه استات وجود دارد.

واژه های کلیدی: Haloarcula sp. IRU1 ، کاروتنوئید،TLC ، جذب نوری، FT-IR، اسپکتروفتومتری جرمی، H-NMR، دریاچه نمک ارومیه

* نویسنده مسئول، تلفن:  88044055  ، پست الکترونیکی: asgarani@gmail.com

مقدمه

کاروتنوئیدها رنگیزه های ایزوپرونوئیدی محلول در چربی می­باشند و در طبیعت به وفور یافت می­شوند. این ترکیبات عامل رنگهای سبز، زرد، قرمز و نارنجی در برگهای گیاهان، میوه­ها، گلها و حیوانات مانند پرندگان، حشرات، ماهیها وسخت­پوستان می باشند (5). کاروتنوئیدها رنگدانه­هایی هستند که معمولاً در گیاهان، جلبکها و باکتریهای فتوسنتتیک، به دلیل نقش حیاتی آنها در فرآیندهای فتوسنتزی یافت می­شوند. همچنین این رنگدانه­ها در بعضی از باکتریهای غیر فتوسنتزی، مخمرها و کپکها نیز به عنوان آنتی اکسیدانت و پایدارکنندة غشاهای سلولی و به منظور حفاظت در برابر آسیبهای ناشی از نور و اکسیژن تولید می شوند (8). حیوانات قادر به تولید این رنگدانه­ها نیستند و آنها را از رژیم غذایی دریافت می­کنند. کاروتنوئیدها در حیوانات باعث رنگی شدن آنها شده و در بدن آنها بعنوان آنتی اکسیدانهای بیولوژیک و پیش ساز ویتامین A فعالیت می­کنند (9) و علاوه بر دفاع درونی بدن در مقابل استرسهای اکسیداتیو، در حفاظت بدن در مقابل بیماریها و پدیده پیری نیز نقش دارند (2 و 17).

تاکنون 700 کاروتنوئید مختلف شناسایی شده است (7) و در حال حاضر این رنگیزه ها به عنوان مواد افزودنی مجازغذایی اهمیت ویژه ای پیدا کرده اند (15). بیوسنتز کاروتنوئیدها در میکروارگانیسم ها نیز مورد مطالعه قرار گرفته است (6). در این پژوهش کاروتنوئیدهای تولید شده توسط سویة Haloarcula sp. IRU1 بررسی گردیده است. این سویه متعلق به آرکیهای بسیار نمک دوست است و از آب دریاچة ارومیه جداسازی و شناسایی شده است (1). کلونیهای این آرکی به دلیل حضور پیگمان کاروتنوئیدی قرمز و نارنجی هستند. معمولاً پیگمانتاسیون آرکیهای نمک دوست منجر به تولید کاروتنوئیدهای قرمز- نارنجی رنگ، غالباً با ساختار 50 کربنه با نام باکتریوروبرین می گردد (10 و 11). در این مطالعه، ابتدا رنگدانه­های کاروتنوئیدی میکروارگانیسم مورد نظر به ویژه فراوان­ترین کاروتنوئید موجود در آن تخلیص و تا حد امکان شناسایی ­گردید. سپس به منظور تعیین ساختار پیگمان کاروتنوئیدی اصلی این سویه از روشهای اسپکتروفتومتری UV، TLC ، NMR واسپکتروفتومتری جرمی استفاده گردید.

مواد و روشها

آرکی و محیط کشت: در مطالعه قبلی سویه مورد بررسی از آب دریاچه ارومیه جداسازی شده و با روشهای استاندارد میکروبیولوژیکی، بیوشیمیایی و توالی یابی ژن16S rRNA  مورد شناسایی قرار گرفته و در بانک ژنی  NCBIبا شماره   HM625751.1 به ثبت رسیده است. این جدایه به صورت لیوفیلیزه در آزمایشگاه ملی میکروبیولوژی صنعتی دانشگاه الزهرا^(س) نگهداری می شود. طبق آزمایشات صورت گرفته توسط شیرزاد بهینه سازی شرایط رشد این آرکی اکستریموفیل انجام شده است. بنابراین در این تحقیق، محیط کشت مناسب و با شرایط بهینه به دست آمده برای رشد Haloarcula sp. IRU1 مورد استفاده قرار گرفت (1). برای تهیه یک لیتر محیط کشت از این مواد بر حسب گرم استفاده شد: 250 NaCl، 6/34MgCl₂.6H₂O ، 4/49MgSO₄.7H₂O ، 5extract  Yeast ،92/0CaCl₂.2H₂O ، 58/ 0NaBr، 5/0KCl، 17/0NaHCO_{3 .} همه مواد از شرکت Merck تهیه شده است.

برای تهیه این محیط کشت، نمکهای اصلی محیط کشت شامل NaCl ، MgCl₂.6H₂OوMgSO₄.7H₂O، در یک ارلن و سایر مواد محیط کشت که  شامل نمکهای با درصد پایین و عصاره مخمر می­باشند، در یک ارلن دیگر، به طور مجزا، پس از  اضافه کردن نیمی از آب مورد نیاز و تنظیم pH محیط بین 7 - 8/6 و رساندن به حجم نهایی، در دمای 120 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شده و سپس بلافاصله در شرایط استریل با هم مخلوط شدند. پس از تلقیح میکروارگانیسم، محیط کشت تهیه شده به نسبت یک به ده در چند ارلن­ مایر تقسیم شده و به مدت چهار روز در انکوباتور شیکردار با شرایط دمای 47 درجه سانتی گراد و 200 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از این مدت، محیط کشت حاوی باکتری، ابتدا در لوله­های فالکون، به مدت 20 دقیقه و با  g× 11000 سانتریفیوژ شد و پس از دور ریختن مایع رویی، رسوب حاصله توسط آب نمک 15 درصد به صورت سوسپانسیون درآمد و مجدداً سانتریفیوژ گردید. سپس بیومس باکتریایی جمع آوری و در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد.

تعیین بیومس آرکی:  محیط کشت این سویه حاوی مقادیر زیادی نمک می باشد، بنابراین برای تعیین وزن بیومس خالص آرکی، نیاز به برآورد میزان رسوب نمکی می باشد که احتمالاً در هنگام سانتریفیوژ کردن همزمان با بیومس حقیقی رسوب می کند. بدین منظور حدود 100 میلی لیتر محیط کشت حاوی آرکی و 100 میلی لیتر محیط کشت  فاقد آرکی که دارای تمام شرایط محیط کشت حاوی آرکی بود، در لوله های فالکونی که از قبل وزن آنها اندازه گیری شده بود سانتریفیوژ شدند. پس از خارج کردن محلول رویی، مجدداً فالکونها توزین شده و با کم کردن وزن رسوب نمک به دست آمده در فالکون حاوی محیط کشت فاقد باکتری از وزن به دست آمده از رسوب حاصله از فالکون حاوی محیط کشت واجد آرکی، وزن دقیق بیومس آرکی محاسبه گردید. برای تعیین وزن خشک آرکی فالکون حاوی بیومس به مدت 72 ساعت در آون 70 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از این مدت، وزن رسوب خشک به دست آمده، اندازه گیری گردید. 

شکستن دیواره سلول و استخراج عصاره کاروتنوئیدی: میزان مشخصی از بیومس آرکی درون یک لوله شیشه ای سرپوش دار ریخته شد و تقریباً به اندازه سه برابر وزن بیومس، به آن پودر شیشه نرم اضافه گردید. پس از افزودن استون به بیومس و پودر شیشه، به مدت پنج دقیقه ورتکس شد. سپس لایه رویی جمع آوری و مجدداً به رسوب باقیمانده استون اضافه گردید و عمل ورتکس کردن تکرار شد تا بیومس به طور کامل بی رنگ گردد.  پس از انتقال کامل پیگمانها به استون، محلول حاصل به مدت ده دقیقه و  با g × 11000 سانتریفیوژ شد تا ذرات پودر شیشه و باقی مانده سلولهای باکتری متلاشی شده از محیط خارج شوند. سپس به حجم محلول استون جمع آوری شده، هگزان اضافه گردید و به منظور جدا کردن دو فاز از یکدیگر، شستشو توسط آب مقطر انجام شد. این کار چندین بار تکرار گردید تا استون به طور کامل از هگزان جدا شده و تمامی پیگمانها به لایه هگزان منتقل شدند. به لایه رویی جمع آوری شده نمک سولفات سدیم بدون آب اضافه شد تا آب باقی مانده در محیط به طور کامل گرفته شود. برای تأیید روش انجام شده برای استخراج پیگمانها، این مراحل در شرایط مشابه سه بار تکرار گردید و هر بار بلافاصله جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 490  نانومتر خوانده شد.

اندازه گیری مقدار کل کاروتنوئیدها: برای تعیین میزان کل کاروتنوئیدهای استخراج شده مراحل کار تا مرحله استخراج در هگزان انجام شده و حجم هگزان یادداشت گردید. سپس با اسپکتروفتومتر جذب آن را در طول موج 490 نانومتر خوانده و با توجه به فرمول زیر غلظت کاروتنوئیدها بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتری محاسبه گردید :

Total carotenoid (μg/g of biomass) = (ml of acetone) × (A490) ×10000 / 2500 × (biomass dry weight)

پس از استخراج کاروتنوئیدها در هگزان، محلول حاصل توسط دستگاه  vacuum evaporator به طور کامل تغلیظ گردید. سپس عصاره باقی مانده در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته بود، حل شد. طیف جذب نوری محلول حاوی عصاره کاروتنوئیدی به دست آمده در هگزان، در ناحیه طول موجهای 600 - 300  نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد و نقاط جذب ماکزیمم آن به دست آمد.

جداسازی و شناسایی پیگمانها: پس از تهیه عصاره کاروتنوئیدی، به منظور جداسازی و شناسایی پیگمانها روش کروماتوگرافی با لایه نازک (TLC) با استفاده از تعدادی مارکر استاندارد کاروتنوئیدی شامل بتاکاروتن، آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین به کاربرده شد. برای تهیه صفحات TLC از پلیت­های شیشه­ای و پودر سیلیکاژل 60F₂₅₄  مرک استفاده شد. پلیت­ها با ضخامت 300 میکرون و توسط دستگاه مخصوص تهیه گردید. سپس برای فعال سازی صفحات TLC، پلیت های تهیه شده به مدت یک ساعت در آون با دمای 100 درجه سانتی گراد قرارداده شدند. به منظور انجام کروماتوگرافی، ابتدا محلول کاروتنوئیدی توسط vacuum evaporator به طور کامل تغلیظ شد و عصاره روغنی باقی مانده در مقدار بسیار کمی استون حل گردید. سپس مقداری از نمونه توسط لوله مویین برداشته شده و به فاصله یک سانتیمتری از انتهای پلیت بر روی صفحه  TLC  قرار داده شد و بلافاصله درون تانک کروماتوگرافی که دارای حجمی از حلالهای استون و پترولئوم اتر به ترتیب با نسبت 35 : 65 بود، به مدت تقریباً 45 دقیقه قرار داده شد. لازم به ذکر است که برای انجام کروماتوگرافی حلالهای مختلف با نسبتهای متفاوت مورد استفاده قرار گرفت. این حلال­ها شامل اتیل استات- بنزن، استون - بنزن، متانول- کلرفرم و استون- پترولئوم اتر بود، که در این میان، بهترین الگوی جداسازی مشاهده شده، با استفاده از استون و پترولئوم اتر و به ترتیب با نسبت 35 : 65 به دست آمد. پس از این که حلال به انتهای صفحه TLC رسید و لکه ها به طور کامل از یکدیگر تفکیک شدند، پلیت از تانک کروماتوگرافی خارج و بلافاصله RF تمامی لکه ها محاسبه گردید. در مراحل بعدی و به منظور مقایسه مارکرهای موجود با لکه های مشاهده شده، هر یک از استانداردهای بتاکاروتن، آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین، به طور جداگانه و همزمان با نمونه حاوی عصاره کاروتنوئیدی بر روی صفحات TLC قرار داده و با همان نسبت حلالها کروماتوگرافی شدند.

تخلیص کاروتنوئید اصلی با استفاده از روش TLC: پس از انجام کروماتوگرافی و جداسازی پیگمانها و آشکار شدن باندهای متعدد ، به منظور انجام آنالیزهای بیش­تر و تا حد امکان شناسایی دقیق تر، قوی ترین و بزرگترین باند مشاهده شده، از روی صفحه  TLC  برداشته شد.  بدین منظور بلافاصله پس از خارج کردن پلیت از تانک کروماتوگرافی،  ناحیه باند مورد نظر از روی صفحه TLC جمع آوری شد و فوراً درون ویالهای حاوی استون ریخته شد. در ادامه، ویالها ورتکس شده و سپس در دستگاه میکروفیوژ به مدت پنج دقیقه و با  g×  15000 سانتریفیوژ گردیدند. بلافاصله پس از خارج کردن ویالها، محلول رویی توسط پیپت پاستور از روی رسوب پودر سیلیکاژل برداشته شد و به ظرف دیگری منتقل گردید.

اندازه­گیری مقدار کاروتنوئید اصلی: پس از تخلیص و جمع آوری محلول استون حاوی کاروتنوئید اصلی، محلول حاصل کاملاً  تغلیظ شد. سپس عصاره باقی مانده، مجدداً در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته در مرحله استخراج کل پیگمانها برای میزان مشخصی بیومس بود، حل گردید و جذب آن در طول موج 490  نانومتر خوانده شد. سپس مقدار تقریبی این کاروتنوئید بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتری محاسبه گردید.

آنالیز و شناسایی کاروتنوئید اصلی: برای آنالیز پیگمان کاروتنوئیدی تخلیص شده با روش کروماتوگرافی با لایه نازک، از روشهای طیف سنجی  UV-Visible ، FT-IR ، MS و NMR استفاده شد.

طیف سنجی UV-Visible: در این مطالعه، با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر، نقاط ماکزیمم جذب کاروتنوئید اصلی در ناحیه طول موجهای 600 – 300  نانومتر اسکن شده و با طیف حاصل و نقاط ماکزیمم جذب به دست آمده از کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در حلال استون، در منابع موجود مقایسه گردید (10 و 18).

طیف سنجی FT-IR: برای گرفتن طیف پیگمان خالص سازی شده، از عصاره خشک به دست آمده دیسک KBr تهیه شد و طیف حاصل با طیف مربوط به کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در منابع موجود مقایسه گردید (10 و 18).

طیف سنجی جرمی: در این تحقیق، اسپکترومتری جرمی(EI MS)  برای تعیین وزن مولکولی پیگمان کاروتنوئیدی مورد نظر مورد استفاده قرار گرفت.

طیف سنجی NMR: برای گرفتن طیفH-NMR ، عصاره کاروتنوئید مورد نظر کاملاً خشک شده و با حلال کلروفرم دوتره در دستگاه  NMR 500 مگاهرتز،  طیف آن رسم گردید.

نتایج

آرکی مورد مطالعه یک میکروارگانیسم هوازی می­باشد. در صورت تهیه محیط کشت آن در حجم یک به ده در ارلن مایر، باکتری از سرعت رشد بالاتری برخوردار بوده و در زمان کمتری به حداکثر رشد خود می­رسد، که این زمان چهار روز می­باشد. در طی این مدت رنگ محیط کشت کدر شده و به رنگ قرمز _–  نارنجی تغییر پیدا می­کند. پس از سانتریفیوژ کردن محیط کشت حاوی باکتری و جمع آوری بیومس به دست آمده، میزان بیومس 2/8 گرم در لیتر محاسبه شد. وزن خشک بیومس حاصل نیز، پس از قرار دادن در آون 70 درجه سانتی گراد و به مدت 72 ساعت، 17/0گرم در هر گرم از بیومس تر محاسبه شد.

اولین مرحله برای استخراج پیگمانهای کاروتنوئیدی، شکستن دیواره سلولی میکروارگانیسم می­باشد. این آرکی اکستریموفیل که توانایی زیستن در غلظت بالای نمک را دارد، حداکثر تا نیم ساعت قادر به تحمل فشار اسمزی پایین آب مقطر می­باشد و بیشتر سلولها بلافاصله متلاشی می­شوند. البته در روند استخراج کاروتنوئیدها از این باکتری، استفاده از آب مقطر و سپس اضافه کردن حلال، شرایط چندان مطلوبی ایجاد نمی­کرد و ترجیحاً از این کار صرف­نظر شد. در این تحقیق، ابتدا سعی بر این بود که شکستن سلول و استخراج پیگمانها توسط متانول صورت گیرد. متانول به تنهایی حلال بسیار خوبی برای استخراج پیگمانهای کاروتنوئیدی از این باکتریها محسوب می­شود (4). البته این مشکل وجود داشت که در مرحله بعد با اضافه کردن حلال هگزان و شستشو با آب مقطر، مقدار قابل توجهی از کاروتنوئیدها تمایل زیادی به متانول از خود نشان می­دادند و انتقال آنها از متانول به هگزان به خوبی اتفاق نمی افتاد. البته در صورت انجام تکانهای شدید، در نهایت لایه متانول به طور کامل بی­رنگ می­شد، ولی مقداری از پیگمانها به شکل ذرات توده­ای شکل قرمز رنگ از محیط خارج شده و بین دو لایه قرار می­گرفتند. حلالهای آلی دیگری از جمله دی­اتیل اتر و همچنین مخلوط هگزان و دی­اتیل اتر نیز به جای هگزان مورد استفاده قرار گرفت  که تأثیر چندانی بر روند استخراج این پیگمانها نداشت. ناگزیر، روشهای دیگری مورد امتحان قرار گرفت که از جمله استفاده از استون به جای متانول در مرحله اول بود. استون نیز یکی از حلالهای رایج برای استخراج پیگمانهای کاروتنوئیدی از سلولهای مختلف محسوب می­شود، اما در اغلب موارد کارآیی آن به اندازه متانول نمی_­باشد و برای افزایش بازده کار، استفاده از روشهای فیزیکی در کنار استون ضروری به نظر می­رسد. بدین منظور همزمان با استون، پودر شیشه نسبتاً نرم نیز مورد استفاده قرار گرفت. با اضافه کردن استون و پودر شیشه به بیومس و ورتکس کردن آن، پیگمانها به طور قابل قبولی از بیومس خارج شد. پس از اضافه کردن هگزان به استون و شستشو با آب مقطر، پیگمانها به طور کامل به لایه هگزان منتقل شد. بنابراین، برای استخراج پیگمانها، در ابتدا از متانول استفاده شد . سپس با اضافه کردن استون و پودر شیشه به بیومس و ورتکس کردن آن، هر بار به مدت پنج دقیقه، پیگمانها به طور قابل قبولی از بیومس خارج شدند. این عمل دو الی سه بار تکرار گردید. پس از جمع آوری محلول استون و سانتریفیوژ کردن آن، محلول شفافی حاصل شد که فاقد ذرات پودر شیشه و باقی مانده سلولهای آرکی متلاشی شده بود. پس از اضافه کردن هگزان، برای جدا کردن دو فاز از یکدیگر، محلول حاصل چندین بار با آب مقطر شستشو داده شد. در نهایت، لایه هگزان جمع آوری شد و توسط نمک سولفات سدیم بدون آب، آبگیری شد. اضافه کردن نمک، هر بار به میزان کم بوده و تا زمانی ادامه داده می­شود که دیگر ذرات توده­ای شکل از نمک تشکیل نشود (7). هر بار استخراج کاروتنوئیدها از 2/0 گرم بیومس انجام شد و در هر بار تکرار، در نهایت ٨ میلی لیتر محلول هگزان حاوی پیگمانها جمع آوری شد. سپس جذب آنها در طول موج 490 نانومتر خوانده شد و  مقادیر 8/0، 75/ 0 و 85/0، در سه تکرار جداگانه به دست آمد. طیف جذبی پیگمانها نیز در هگزان، در ناحیه طول موجهای  600 ^_ 300  نانومتر اندازه­گیری شد (شکل- a  1).

برای محاسبه میزان کل کاروتنوئیدها در این سویه، متوسط ضریب خاموشی برای ماکزیمم جذب اصلی برای کاروتنوئیدها در استون در نظر گرفته شد، که مقدار2500 می­باشد. مقدار تقریبی کاروتنوئیدهای موجود در وزن خشک طبق رابطه مخصوص 2/828 میکروگرم در هر گرم وزن خشک آرکی محاسبه شد.

پس از تهیه عصاره کاروتنوئیدی، به منظور جداسازی، تخلیص و همچنین شناسایی پیگمانها، از روش کروماتوگرافی با لایه نازک و تعدادی از مارکرهای استاندارد کاروتنوئیدی استفاده گردید. در پایان کروماتوگرافی با لایة نازک شش باند مختلف بر روی پلیت TLC مشاهده شد و Rf آنها، محاسبه و اندازه­گیری شد ( 95/0،88/0 ، 78/0، 51/0، 4/0، 17/0 ، (Rf –values:  که در بین آنها، اولین و پایین­ترین باند، بزرگترین و قوی­ترین بود و به عنوان پیگمان اصلی این آرکی مد نظر قرار گرفت (Rf-value: 17/0، 70  درصد). این پیگمانها عمدتاً طیفی از رنگهای قرمز، نارنجی و صورتی را در بر می­گرفتند. به منظور شناسایی اولیه کاروتنوئیدها، از تعدادی مارکر استاندارد کاروتنوئیدی شامل بتاکاروتن، آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین استفاده شد.  لازم به یاد آوری است به دلیل عدم وجود باکتریوروبرین به صورت تجاری امکان تهیه آن وجود نداشت. جهت مقایسه مارکرهای موجود با لکه های مشاهده شده، استانداردهای ذکر شده هر یک به طور جداگانه و همزمان با نمونه حاوی عصاره کاروتنوئیدی بر روی صفحات TLC  قرار داده شد و با همان نسبت حلالها کروماتوگرافی شدند (نتایج نشان داده نشده است). طبق نتایج مشاهده شده از کروماتوگرافی نمونه عصاره کاروتنوئیدی با استانداردهای موجود، Rf استانداردهای آستاگزانتین و کانتاگزانتین، مشابه با Rf هیچ یک از لکه ­های موجود بر روی صفحه  TLCنبود. اما با توجه به مشابهت Rf استانداردهای بتاکاروتن و زئاگزانتین با Rf دو پیگمان موجود بر روی صفحه TLC، می­توان احتمال حضور این کاروتنوئیدها را در این آرکی مد نظر قرار داد.

به منظور انجام آنالیزهای بیشتر و تا حد امکان شناسایی دقیق­تر، قوی­ترین و بزرگترین باند مشاهده شده، از روی صفحه  TLC  برداشته شد. ابتدا، برای تعیین میزان تقریبی فراوان ترین رنگدانه کاروتنوئیدی موجود در این آرکی، پس از استخراج عصاره کاروتنوئیدی از 2/0 گرم بیومس و انجام کروماتوگرافی و جمع آوری پیگمان مورد نظر در استون، محلول حاصل کاملاً تغلیظ شد. سپس عصاره کاروتنوئیدی به دست آمده، مجدداً در ٨ میلی لیتر استون حل گردید و جذب آن در طول موج 490 نانومتر خوانده شد. مقدار این کاروتنوئید، 7/564 میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتری محاسبه شد.

شکل 1-  (a  طیف جذبی مجموعه پیگمانها در هگزان  (b طیف جذبی کاروتنوئید اصلی در استون.

پیگمان اصلی. باندهای جذبی ویژة پلی ان های ایزوپرونوئید به خوبی قابل مشاهده است. FT-IR شکل 2- طیف

طیف جذبی کاروتنوئید اصلی در ناحیه طول موجهای 600 ^_300 نانومتر اندازه­گیری شد (شکل  - b1).  مقادیر جذب ماکزیمم آن در حلال استون 9/468 و 98/494 و 41/528 می باشند. بنابراین، شباهت زیادی بین طیف جذبی و همچنین نقاط ماکزیمم جذب مربوط به کاروتنوئید باکتریوروبرین و پیگمان کاروتنوئیدی باکتری مورد نظر وجود دارد. در مقاله دکتر سایتو و همکاران (18)، ماکزیمم جذب کاروتنوئید باکتریوروبرین در حلالهای اتانول، متانول و استون، ارائه شده است. مقادیر ذکر شده برای ماکزیمم جذب در حلال استون، 469، 494 و527 نانومتر می­باشد. همچنین در مقاله دکتر کوشواها و همکاران (10)، علاوه بر نقاط ماکزیمم مطرح شده در استون، به وجود دو پیک کوچک مجاور نیز در طول موجهای 368 و 385 نانومتر اشاره شده است که این پیکها از مشخصه­های رنگدانه­های آلیفاتیک و کاملاً بدون حلقه می­باشند. 

طیف FT-IR پیگمان کاروتنوئیدی مورد نظر در مقایسه با منابع مورد استفاده، تا حد زیادی مشابه طیف باکتریوروبرین بوده و باندهای جذبی ویژه پلی­ان­های ایزوپرنوئید در آن قابل مشاهده است مانند باندهایcm^-1 3447 (دنبالة OH) ،  cm^-1 2929 (دنبالة C-H  از –CH₂ و –CH₃)، cm^-1  1090 (امتداد C-O)، و cm^-1 809  که معرف گروههای هیدروکسیل درجه سوم هستند (شکل 2). بنابراین، کشش­ پیوندهایC^_O  و O^_H در طیف حاصل به خوبی قابل تشخیص می­باشد. بخشی از کشش مربوط به گروههای هیدروکسیل نوع سوم ضعیف است، اما قابل صرف نظر کردن نیست. نکته قابل توجه در طیف گرفته شده، مشاهده پیک کوچکی مربوط به کشش گروهC=O  می­باشد که اگر چه چندان قوی نیست ولی حائز اهمیت است و می­تواند نشان­دهنده تفاوتی جزئی در ساختار این پیگمان نسبت به باکتریوروبرین و مشتقات شناخته شده نزدیک آن باشد.

در مقایسه با طیفهای FT-IR باکتریوروبرین و سه مشتق نزدیک آن شامل مونوانهیدرو، بیس انهیدرو و تتراانهیدرو باکتریوروبرین در منابع موجود (12-10)، طیف کاروتنوئید مورد نظر، بیشترین شباهت را با طیفهای باکتریوروبرین و مونوانهیدرو باکتریوروبرین نشان می­دهد. مونوانهیدروباکتریوروبرین نسبت به باکتریوروبرین، فاقد یک گروه OH می­باشد. در سایر ترکیبات به ترتیب دو گروه و چهار گروه OH، وجود ندارند.

به منظور تأیید نتیجه مشاهده شده در طیف سنجیFT-IR  و به دست آوردن اطلاعات بیشتر راجع به ساختار این پیگمان، جرم مولکولی پیگمان مورد نظر توسط دستگاه طیف سنجی جرمی(EI MS)  نیز اندازه­گیری شد. بر اساس طیف گرفته شده، وزن مولکولی 783 دالتون برای این کاروتنوئید به دست آمد. با بزرگنمایی طیف حاصل سه وزن مولکولی شاخص ساختار کاروتنوئید باکتریوروبرین و دو مشتق نزدیک آن در طیف اسپکترومتری جرمی مشاهده شد، که شامل 740 دالتون برای باکتریوروبرین، 722 و 704 دالتون به ترتیب برای مونوانهیدرو و بیس­انهیدرو باکتریوروبرین بود (شکل 3). دو ترکیب اخیر به ترتیب با از دست رفتن یک و دو مولکول آب از باکتریوروبرین به وجود می­آیند. در مقایسه با باکتریوروبرین با جرم مولکولی 740 دالتون، این پیگمان دارای اختلاف وزنی حدود 43 دالتون با این کاروتنوئید می­باشد. با بزرگنمایی طیف حاصل سه وزن مولکولی شاخص ساختار کاروتنوئید باکتریوروبرین و دو مشتق نزدیک آن در طیف اسپکترومتری جرمی مشاهده شد. بنابراین می­توان این گونه نتیجه گیری کرد که به احتمال قوی پیگمان اصلی موجود در این باکتری از نظر پایه­ای دارای ساختاری مشابه با کاروتنوئید باکتریوروبرین می­باشد، با این تفاوت که این پیگمان دارای گروه عملکردی اضافه­ای به اندازه وزن مولکولی به دست آمده می­باشد.

شکل 3-  طیف بزرگنمایی شده اسپکترومتری جرمی کاروتنوئید اصلی پس از جداسازی بر روی ستون سیلیکاژل 60 و خالص سازی آن. وزنهای مولکولی 740 و 722  دالتون در این طیف مشاهده می شود.

شکل 4- طیف بزرگنمایی شده H-NMR   کاروتنوئید اصلی