نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 فارغ التحصیل کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران.

2 . فارغ التحصیل کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران.

3 هیات علمی دانشگاه زنجان

چکیده

کتکول2و3 دی‌اکسیژنازها از آنزیم‌های کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتری‌های خاک می‌باشند که در زیست‌پالایی نقش بسزایی دارند. هدف از پژوهش حاضر، معرفی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز جدید و همچنین بررسی بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی آن در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گستره‌ی گوناگون pH در جهت استفاده وسیع از این دسته آنزیم‌ها در صنعت زیست‌پالایی می‌باشد.
برای این منظور، توالی رمزکننده آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز با روش PCRاز سویه Aneurinibacillus migulanus Znu12استخراج، با شماره دسترسی MN197546.1 در NCBI ثبت و درون وکتور pET28a همسانه سازی گردید. بررسی صحت همسانه سازی و عدم تغییر قالب خوانش با استفاده از تعیین توالی تایید شد. پس از تراریخت نمودن سلول‌های E. coli BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. سپس خالص‌سازی، سنجش و بهینه‌سازی فعالیت آنزیم مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعه‌ی ژنومی 915 جفت‌بازی معادل 304 باقی‌مانده آمینو‌اسیدی می-باشد. الکتروفورز با SDS-PAGE نیز تاییدکننده آنزیم تخلیص‌شده‌ی 34 کیلودالتونی از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز بود. بررسی عملکرد بیوشیمیایی آنزیم نیز نشان داد آنزیم در 2/7=pH دارای100 درصد فعالیت ولی در 4/7=pH فقط 70 درصد فعالیت داشت. بررسی ترجیح سوبسترایی نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوب‌تری نسبت به پیروگالول و فنول برای آنزیم بود. بررسی نتایج بیوانفورماتیکی تأییدکننده این ترجیح به علت نوع و موقعیت باقی مانده‌های آمینواسیدی جایگاه فعال آنزیم می باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Molecular and bioinformatics studies and determination of functional properties of Catechol 2,3-dioxygenase from Aneurinibacillus migulanus Znu12

نویسندگان [English]

  • soraya mohamadzadeh 1
  • nanasrin Ahmadpur 1
  • ziba mirzaee 2
  • Vahab Jafarian 3

1 Master’s Degree in Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Science, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

2 Master’s Degree in Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Science, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

چکیده [English]

Catechol 2,3-dioxygenases play a key role in the metabolism of aromatic molecules in the environment by soil bacteria. The aim of this study is to introduce the new catechol 2,3-dioxygenase and also to survey bioinformatics and biochemical characteristics in the presence of various substrates as well as to study its activity in various pH ranges for the widespread use of such enzymes in bioremediation industry.
In this study, the DNA sequences of Catechol 2,3-dioxygenase were separated from Aneurinibacillus migulanus Znu12 and recorded with accession number MN197546.1 in NCBI, then it was cloned in plasmid pET28a. The accuracy of cloning and not changing the frame shift was confirmed by sequencing. After transferring of plasmid into E. coli BL21 (DE3) cells, protein expression was assessed by SDS-PAGE. Afterwards, the purification, assay and optimization of enzyme activity were evaluated.
The results of PCR reaction on agarose gel indicated a sequence of 912 bp, an enzyme with 304 amino acid residues. Results of sequence alignment by ESPript3 server also confirmed highly conserved residues of His199 and Tyr 255 in the enzymes active site. Biochemical characterization of the enzyme showed that the enzyme had the highest (100%) activity at pH 7.2, while it had only 70% activity at pH 7.4. As compared with pyrogallol and phenol, catechol by optimal concentration of 0.032 was the most preferred substrate for the enzyme.
Bioinformatics results confirmed also such substrate preference based on the type and position of amino acid residues in the enzyme active site.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioinformatic
  • Bioremediation
  • Catechol 2 3-dioxygenase
  • cloning
  • Optimal pH