مطالعات مولکولی، بیوانفورماتیکی و تعیین ویژگی های عملکردی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز از سویه Aneurinibacillus migulanus Znu12

ثریا محمدزاده، نسرین احمدپور، زیبا میرزایی و وهب جعفریان^*

ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 16/07/1399          تاریخ پذیرش: 18/12/1399

چکیده

کتکول2و3 دی­اکسیژنازها از آنزیم­های کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتری­های خاک می­باشند که در زیست­پالایی نقش بسزایی دارند. هدف از پژوهش حاضر، معرفی آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز جدید و همچنین بررسی بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی آن در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گستره­ی گوناگون pH در جهت استفاده وسیع از این دسته آنزیم­ها در صنعت زیست­پالایی می­باشد. برای این منظور، توالی رمزکننده آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز با روش  PCRاز سویه  Aneurinibacillus migulanus Znu12 استخراج، با شماره دسترسی MN197546.1 در NCBI ثبت و درون وکتور pET28a همسانه سازی گردید. بررسی صحت همسانه سازی و عدم تغییر قالب خوانش با استفاده از تعیین توالی تایید شد. پس از تراریخت نمودن سلول­های E. coli BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. سپس خالص­سازی، سنجش و بهینه­سازی فعالیت آنزیم مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعه­ی ژنومی 915 جفت­بازی معادل 304 باقی­مانده آمینو­اسیدی می­باشد. الکتروفورز با SDS-PAGE نیز تاییدکننده آنزیم تخلیص­شده­ی 34 کیلودالتونی از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز بود. بررسی عملکرد بیوشیمیایی آنزیم نیز نشان داد آنزیم در 2/7=pH  دارای100 درصد  فعالیت ولی در 4/7=pH فقط 70 درصد فعالیت داشت. بررسی ترجیح سوبسترایی نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوب­تری نسبت به پیروگالول و فنول برای آنزیم بود. بررسی نتایج بیوانفورماتیکی تأییدکننده این ترجیح به علت نوع و موقعیت باقی مانده­های آمینواسیدی جایگاه فعال آنزیم می باشد. 

واژه­های کلیدی: بیوانفورماتیک، زیست پالایی، pH بهینه، کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز، همسانه­سازی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02433052531 ،  پست الکترونیکی: v.jafarian@znu.ac.ir

مقدمه

ریز­آلایندها شامل انواع مختلفی از مواد مانند فلزات سنگین و مواد آلی )رنگ­های نساجی، هورمون­ها، داروهای متابولیک و آفت­کش­ها( می­باشند که توسط فعالیت­های انسانی در محیط پخش می­شوند و سال­هاست به یک تهدید جهانی تبدیل شده­ است و سبب ایجاد عوارضی نظیر سمیت حاد، از دست دادن باروری، تولدهای ناقص، تغییر جنسیت و اختلال در غدد درون­ریز می­باشد (4). کتکول از تجزیه بسیاری از ترکیبات آروماتیک نظیر فنول، تولوئن، بنزن، آنیلین، فنلات و مشتقات آن به صورت ترکیبات حدواسط شکل می­گیرد و همچنین سمیت کتکول از فنول بیشتر است و به­راحتی در آب، خاک و محیط زیست نفوذ می­کند. بنابراین تهدیدی برای محیط زیست و سلامت انسان محسوب شده  و حذف آلایندگی آن از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است (14). کتکول دارای اثرات جهش­زایی، سرطا­ن­زایی و اثرات سمی می‌باشد که به­راحتی از طریق پوست جذب گردیده و باعث درماتیت می‌‌شود و همچنین اثرات مسمومیت با کتکول شبیه مسمومیت با فنول می‌باشد (19). کتکول به دلیل سمی بودن می­تواند باعث سرطان لنفاوی، آسیب به سیستم اعصاب مرکزی و عدم رونویسی DNA شود. بنابراین به­عنوان یکی از عوامل سرطان در انسان شناخته شده است (16).

کتکول به­دست­آمده از تجزیه ترکیبات آروماتیک دچار سرنوشت­های متفاوتی خواهد شد. مسیر ارتو (Ortho pathway)  توسط آنزیم کتکول 1و2 دی­اکسیژناز و مسیر متا (Meta pathway) توسط آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز را طی کرده و به چرخه تری کربوکسیک اسید ختم می‌شود. شکل 1 مسیر تجزیه فنول و تبدیل آن به کتکول و سرنوشت کتکول را نشان می­دهد (18).

شکل 1-  مسیر تجزیه کتکول و ختم آن به چرخه تری­کربوکسیلیک­اسید (17).

کتکول 2و3 دی­اکسیژناز حلقه آروماتیک کتکول را در موقعیت متا (2.3) می شکند، در نهایت کتکول را به 2-هیدروکسی موکونیک سمی­آلدهید تبدیل می­کند (2). کتکول دی­اکسیژنازها از آنزیم­های کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتری­های خاک می­باشند که در زیست­پالایی نقش بسزایی دارند. کتکول 2و3 دی اکسیژناز به دو گروه آنزیم­های شکننده اینترادیول و اکسترادیول تقسیم می­شوند. هر دو نوع آنزیم در جایگاه فعال خود دارای آهن می­باشند که برای فعالیت آنزیم ضروری هستند. اینترادیول­ها داری آهن سه ظرفیتی و اکسترادیول­ها دارای آهن دو ظرفیتی می­باشند (7).

اکسترادیول دی­اکسیژناز­ها آنزیم­های متنوعی هستند که با طیف گسترده­ای از سوبستراها واکنش می­دهند و به دو گروه تقسیم می­شوند: 1-گروهی که با سوبستراهای تک حلقوی واکنش می­دهند. 2-گروهی که با سوبستراهای چند حلقوی واکنش می­دهند. کتکول 2و3 دی اکسیژناز ترکیبات تک حلقوی را تجزیه می­کند که دارای دو دمین و اولیگومر می­باشد و در جایگاه فعال خود دارای آهن دو ظرفیتی یا منگنز دو ظرفیتی می­باشند. اکسترادیول دی­اکسیژناز شکستن حلقه ترکیبات آروماتیک را از کربن دارای گروه هیدروکسیل و بدون هیدروکسیل کاتالیز می­کند. مکانیسم عمل آنزیم با اتصال دو جانبه سوبسترا به عنوان مونوآنیون به آهن دو ظرفیتی در جایگاه فعال و جایگزینی دو مولکول آب به طور همزمان آغاز می­شود که با اتصال اکسیژن به آهن دو ظرفیتی یک حدواسط سمی کینون- فروس- سوپراکسید شکل می­گیرد. سپس در مراحل بعدی گروه کربونیل اکسید با دو بار مرکزی و باند اکسیژن- اکسیژن شکافته می­شود و حدواسط لاکتون شکل می­گیرد. باند آهن دو ظرفیتی و یون هیدروکسید تشکیل می شود درنهایت هیدرولیز لاکتون باعث تشکیل سمی­آلدهید می­شود (شکل 2). به­دلیل اهمیت کتکول 2و3 دی اکسیژناز در تخریب ترکیبات آروماتیک در دهه­های گذشته مورد توجه قرار گرفته است و مطالعات زیادی در مورد ساختار مولکولی، ویژگی­های سوبسترایی، عملکرد و انتقال آن­ها به میکروارگانیسم­های مختلف برای تجزیه ترکیبات آروماتیک صورت گرفته است (8و 11).

شکل 2- مکانیسم عمل اکسترادیول دی اکسیژناز (7).

آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز (متوپیروکتکاز) به اکسیژن و فرم­های کاهشی آن حساس می‌باشد و به­راحتی توسط اکسنده­های مختلف غیرفعال می­شود که از این اکسیدکننده­ها می­توان هوا یا H₂O₂ را نام برد. این اکسیداسیون در اثر تبدیل آهن دوظرفیتی به آهن سه­ظرفیتی و آزادشدن آن از پروتئین می­باشد که در اثر این اکسیداسیون آنزیم غیرفعال می­شود و در نهایت می­توان با انکوباسیون با آهن سه­ظرفیتی و یک کاهش­دهنده در شرایط بی­هوازی دوباره فعال کرد که از غیرفعال شدن آنزیم در حضور کتکول جلوگیری می­کند، ناگفته نماند که کوفاکتور آهن توسط هالوکتکول نیز غیرفعال می­شود (20و 22). دراکثر ساختارهای اکسترادیول دی­اکسیژناز­ها، در جایگاه فعال یون آهن دو ظرفیتی با دو باقی­مانده هیستیدین، یک گلوتامات و یک تیروزین به­صورت حفظ شده وجود دارد. نتایج مطالعات قبلی نشان می­دهد که اکثر اکسترادیول دی­اکسیژنازها از مکانیسم واحد و شناخته شده­ای برای اتصال به سوبسترا و شکستن ترکیبات آروماتیک استفاده می­کنند که این ساختار حفظ شده در آنزیم­های زیادی مشاهده شده است (9).

با توجه به کاربرد این آنزیم در حفاظت از محیط زیست، کتکول 2.3 دی اکسیژناز از میکروارگانیسم­های مختلفی از جمله Alcaligenes, Bacillus, Planococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Variovorax,و  Sphingomonas مورد مطالعه قرار گرفته است (10). مطالعات مختلف جهت بررسی مکانیسم واکنش آنزیمی توسط Shu و همکاران در سال 1995 و  Bugg &lin در سال 2001 شکل گرفت و ساختار اولیه کتکول 2.3 دی اکسیژناز برای اولین بار سال 1983توسط  Nakai و همکاران در Pseudomonas putida m­t₂ شناسایی شد و توسط Kita  و همکارانش در سال 1999 توضیح داده شد (12).

آلودگی­های روزافزون زیست محیطی و تهدید سلامت جهانی منجر به روی­آوری به روش­های سازگار با محیط از جمله استفاده از باکتری­های موجود در خاک با توانایی تجزیه ترکیبات آروماتیک، جهت کاهش یا حذف این آلاینده­ها شده است. کتکول 2و 3 دی­اکسیژنازها، آنزیم­های شکننده ترکیبات آروماتیک و تبدیل آن­ها به مواد بی­خطر یا کم­خطر است و مطالعه حاضر در راستای شناسایی، همسانه سازی و تخلیص آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز از باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12  جدا شده از شیل­های نفتی کرمانشاه انجام گردید. تا با مطالعات بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی این آنزیم در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گستره­ pH  گامی به سوی استفاده گسترده از این دسته آنزیم ها در صنعت زیست­پالایی برداشته شود.

مواد و روشها

مواد شیمیایی و آنزیم ها: محیط کشت Nutriant Broth، محیط کشت Nutrient Agar، کوماسی­بلو، آگارز، تریپتون، کانامایسین، پتاسیم دی هیدروژن فسفات، دی پتاسیم فسفات، اسیدآسکوربیک، کتکول، فروس­سولفات­هیدراته، نمک­تریس و سایر مواد شیمیایی که از شرکت مرک (Darmstadt,Germany) تهیه گردید. آنزیم هایBamHI ، XhoI  و T4 DNA Ligase از شرکت Thermal scientific و کیت تخلیص محصول PCR و کیت استخراج پلاسمید از Bioneer  کره جنوبی تهیه گردید و خدمات سنتز پرایمر و تعیین توالی توسط شرکت تکاپو زیست نماینده Bioneer  کره جنوبی انجام گردید.

تکثیر توالی کد کننده آنزیم کتکول 2و3دی­اکسیژناز: در این مطالعه از باکتری Aneurinibacillus migulanus که پیش­تر از خاک شیل­های نفتی مربوط به ارتفاعات منطقه دودان (N "2/3´01˚35 و E "6/8´11˚46) واقع در غرب استان کرمانشاه جداسازی شده بود استفاده شده است (1). پس از بررسی­های مولکولی (شناسایی توالی 16S rDNA) باکتری با عنوان Znu12 Aneurinibacillus migulanus  نامگذاری گردید. توالی 16SrDNA باکتری Aneurinibacillus migulanusZnu12 در blast NCBI بررسی شد و باکتری­های دارای بیشترین تشابه با جنس و گونه باکتری مورد نظر مشخص گردید و بعد از بررسی آن­ها باکتری Aneurinibacillus migulanus strain DSM 2895 که دارای ژن مربوط به توالی آمینو­اسیدی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز بود انتخاب شد. سپس با استفاده از نرم­افزار GenRunner طراحی پرایمرهای )'CGAGGATCCATGAACAGCATTTTGCGTATCG-3-'   Forward (5 و (3´-GTGCTCGAGCTATGTTAATGCTTTTGAAAACGATTC-'5) Reverse  انجام شد. واکنش PCR مورد نظر به این صورت بود: مرحله اول: ˚^C94 (3دقیقه)،  مرحله دوم: ˚^C94 (1دقیقه)، ˚^C52  (1 دقیقه)، ˚^C72 ( 5/1 دقیقه) در 35 چرخه، مرحله آخر: ˚^C72 (3دقیقه) انجام شد و محصول PCR  روی ژل آگاروز 1 درصد بارگذاری شد.

همسانه‌سازی ژن کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در میزبان پروکاریوتی: بعد از خالص­سازی محصول PCR توسط کیت تخلیص محصول PCR، برش توسط آنزیم‌‌‌‌‌‌‌‌‌های برشی XhoI و BamHI به مدت 15 دقیقه در ˚^C 37 انجام شد. به­منظور همسانه‌سازی و بیان ژن کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز از وکتور بیانی pET28a و جهت جای­گذاری توالی آنزیم از باکتری DH5α E.coli به عنوان میزبان برای انتقال حامل نوترکیب استفاده گردید. پس از برش پلاسمید مورد نظر توسط آنزیم­های برشی BamHI، XhoI در دو مرحله به مدت 15دقیقه در دمای ˚^C 37، آلکالین فسفاتاز به پلاسمید برش یافته اضافه گردید. این واکنش به مدت 15 دقیقه در دمای ˚^C 37 انجام شد. به منظور غیر­فعال کردن آنزیم محصول واکنش به مدت 5 دقیقه در دمای ˚^C 75 قرار گرفت. سپس واکنش اتصال با حضور آنزیم T4 DNA Ligase به منظور قرارگیری ژن موردنظر در جایگاه همسانه‌‌‌سازی حامل بیانی pET28a به مدت 20-24 ساعت در ˚^C 22 صورت گرفت و درنهایت حامل به باکتری مستعد  E.coli DH5α انتقال یافت.

پس از انجام عمل ترانسفورم، همسانه‌‌‌سازی محصول PCR تخلیص شده طی مراحلی در میزبان پروکاریوتی E.coli DH5α انجام گردید. برای تایید عمل ترانسفرم و همسانه­سازی از روش­های غربال­گری با استفاده از کلونی PCR، غربال­گری با استفاده از هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد.

بیان و تخلیص آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز : استخراج پلاسمید نوترکیب حاوی توالی آنزیم مورد مطالعه از باکتری E.coli سویه DH5α توسط کیت استخراج پلاسمید در محیط کشت LB Broth حاوی کانامایسین 50 میلی­مولار صورت گرفت سپس به سویه بیانی BL21 انتقال یافت. جهت القا بیان ژن به محیط کشت حاوی باکتری، IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside) (1میلی‌مولار) و سولفات­آهن (1 مولار) اضافه گردید. القا بیان آنزیم به مدت 17 ساعت در دمای ˚^C 25، 180 دور بر دقیقه در انکوباتور انجام گردید. محیط کشت حاوی باکتری به مدت 20 دقیقه با 500 دور بردقیقه در دمای ˚^C 4 سانتریفیوژ شد. به رسوب باکتری 3 میلی‌لیتر‌ بافر لیز­کننده به­صورت سوسپانسیون اضافه گردید. پس از آن سوسپانسیون باکتری تحت سونیکاسیون (شامل20مرحله-20ثانیه) قرار گرفت. برای جلوگیری از تخریب گرمایی تمام مراحل سونیکاسیون در یخ انجام گردید. سلول­های لیز­شده در دمای ˚^C 4 با 12000 دور بر دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی برای انجام مراحل بعدی جدا گردید. تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کرماتوگرافی نیکل آگاروز انجام شد. سپس از سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز SDS-PAGE)) با ، درصد ژل بالای الکتروفورز 5 درصد و ژل پایین 5/12، برای آنالیز کیفی و تعیین خلوص پروتئین­ها با استفاده گردید

سنجش فعالیت آنزیم: فعالیت آنزیم کتکول 2و3دی­اکسیژناز با واکنشی به حجم دو میلی­لیتر که حاوی اسیدآسکوربیک 2 میلی­مولار، آهن 1 میلی­مولار برای جلوگیری از غیرفعال شدن آنزیم، آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز (2/0 میلی­گرم)، سوبسترای کتکول (10میلی­مولار) و بافر تریس (50میلی­مولار) می­باشد، فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز در دمای ˚^C 25 در طول موج 375 نانومتر که تبدیل کتکول به 2- هیدروکسی موکونیک سمی آلدهید را انجام می­دهد، توسط دستگاه اسپکتوفتومتر مورد سنجش قرار گرفت (4). غلظت پروتئین با روش برادفورد سنجش گردید و از استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد (14).

اثر pH بر فعالیت آنزیم: فعالیت نسبی آنزیم در 3 تکرار در دمای ˚^C 25 در pH ­های مختلف تعیین گردید. بدین­منظور از بافر مخلوط (حاوی تریس و فسفات) استفاده شد. از محلول­های سود و اسید­کلریدریک جهت تنظیم و تهیه pH­ های مختلف (6- 5/8) استفاده گردید.

اختصاصیت سوبسترایی و بهینه کردن غلظت سوبسترا: مطابق بخش 2-5 فعالیت آنزیم در دمای اتاق و 2/7 =pH در غلظت­های مختلف کاتکول (75/0، 5/0، 25/0، 125/0، 063/0، 032/0میلی­مولار) مورد سنجش قرارگرفت و در ادامه همچنین جهت بررسی اختصاصیت سوبسترایی، فعالیت آنزیم در حضور سوبسترا­های مختلف کتکول، فنول و پیروگالول (10 میلی‌مولار) در 2/7=pH و دمای ˚^C 25 (مطابق بخش 2-5) مورد سنجش قرار گرفت.

مطالعات بیوانفورماتیکی: ساختار آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12 با استفاده از ابزارهای مختلف بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت. از این رو، توالی­های پروتئینی مشابه با توالی این آنزیم در NCBI به­دست آمد. سپس مشابه­ترین توالی به پروتئین باکتری مورد نظر گزینش و مدل­های آن با استفاده از نرم افزار9v18 Modeller طراحی شد و بهترین مدل با مقایسه­ی پارامترهای به دست آمده از محاسبات توسط نرم افزارهای ModEval، SAVES، SPdbViewer وPIC Server انتخاب و مورد ارزیابی قرار گرفت. افزون بر این، میانکش­های مختلف بین پروتئین الگو با مدل انتخابی بررسی و مقایسه شد که نشان دهنده­ی انتخاب درست مدل بود. آمینواسیدهای حفظ شده و متصل به اتم آهن توسط سرور ESPript3 شناسایی شدند که نشان­دهنده­ی شباهت دیگر توالی­های پروتئینی به­دست آمده از NCBI با توالی پروتئین مدل و الگو بود. باتوجه به تطبیق مدل و الگو از طریق نرم­افزارها و سرورها، مدل پروتئین باکتری مورد نظر نیز ساخته شد. افزون بر این، ساختار سه بعدی این پروتئین توسط نرم افزار Chimera رسم گردید و جایگاه فعال آنزیم متصل به اتم آهن با استفاده از این نرم­افزار نشان داده شد و شباهت و تفاوت بین ساختارهای سوم پروتئین الگو و مدل نیز مورد بررسی قرارگرفت. تطبیق توالی آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز در باکتری­های Aneurinibacillus  migulanus(A.m) ، Pseudomonas putida (P.p), Bacillusbacterium(B.b)، Geobacillus (G.b)، Quasibacillus thermotolorans (Q.t) Parageobacillus thermoglucosidasius (P.t), با سرور ESPript3  ترسیم شد.

نتایج

تکثیر توالی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز: نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعه­ی ژنومی مربوط به توالی ژنومی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز می­باشد که در ناحیه 915 جفت­بازی قرار گرفته است و معادل 304 باقی­مانده آمینو­اسیدی در توالی پروتئینی مربوط به آنزیم می­باشد که نشان­دهنده­ی صحت انجام واکنش PCR و درستی طراحی پرایمر می­باشد.

همسانه‌سازی و تعیین توالی ژن کد­کننده کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز: محصول PCR برش یافته توسط آنزیم های برشی BamHI وXhoI در ناقل pET28a همسانه سازی شده و صحت همسانه سازی با PCR کلونی ها (شکل 4)، هضم آنزیمی (شکل 5) و تعیین توالی تایید شد.

شکل 3- محصول PCR، (M) مارکر وزن مولکولی 100-10000 جفت­باز.

با توجه به نتایج غربال­گری با استفاده از کلونی PCR، که تمامی کلونی­های ذکر شده در محیط کشت مایع حاوی کاناماسین رشد کردند و همچنین این کلونی­ها قبل از کشت، مستقیما به عنوان الگو در PCR مورد استفاده قرار گرفتند و محصول PCR آن­ها با ژل آگاروز مورد بررسی قرار گرفت (شکل 4). همان­طور که در شکل (4) نشان داده شده است از 6 کلونی انتخاب شده کلونی­های 1و2و3و4 مثبت شد که نشان داد این کلونی­ها حاوی ژن مورد­نظر بود. بنابراین کلونی­های 1 و 4 برای ادامه کار انتخاب شدند.

شکل4- کلونی PCR ژن کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در ژل آگاروز 1 درصد. نمونه­های 1تا 4 بیانگر نتیجه واکنش PCR  انجام شده از کلونی رشد کرده در فرآیند انتقال پلاسمید حاوی ژن کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز به باکتری می‌باشد. نمونه 7 کنترل منفی بیانگر واکنش PCR انجام شده بدونDNA  الگو می‌باشد.

نتایج غربال­گری با استفاده از هضم آنزیمی تاییدی بر عمل ترنسفرم و همسانه­سازی بود. هضم آنزیمی وکتور pET28a نو­ترکیب در یک نمونه (وکتور حاصل از کلونی شماره 1) جهت تایید واکنش اتصال قطعه مورد­نظر با حامل با استفاده از آنزیم­برشی BamHI انجام گرفت به طوری­که قطعه برش­یافته نسبت به هضم وکتور   pET28aغیر نو­ترکیب سنگین­تر و دارای وزن بیشتری می‌باشد (شکل5).

شکل 5- غربال­گری بر اساس هضم­آنزیمی. A- پلاسمید غیر نو­ترکیب M-مارکر وزن مولکولی100-10000 B –پلاسمید نوترکیب حامل ژن همسان سازی شده (مشخص شده با فلش).

پلاسمید نوترکیب استخراج شده، جهت غربال­گری با استفاده از تعیین توالی به شرکت Bioneer ارسال گردید و آنالیز نتایج تعیین توالی بیانگر . توالی نوکلئوتیدی استخراج شده از گونه Aneurinibacillus migulanus Znu12 با 915 جفت­باز و 304 باقی­مانده آمینو­اسیدی را کد می­کند که در بانک ژن با با شماره دسترسی MN197546.1 ثبت شد و نتایج بررسی تطبیق توالی نشانگر همسانی توالی استخراج شده با  catechol 2,3-dioxygenase [Aneurinibacillus migulanus]  با (WP-043071689.1) با 99 درصد همسانی بود.

بررسی بیان و تخلیص پروتئین کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز: نتایج الکتروفورز پروتئین به­روش SDS-PAGE احیایی بیان­گر بیان پروتئین کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در میزبان بیانی همسان­سازی ­شده­ی E.coli BL21 می‌باشد (شکل6). نتایج الکتروفوز SDS-PAGE تایید کننده این مسئله می‌باشد که آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز تخلیص شده با استفاده از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز دارای درجه خلوص بالای 90 درصد و وزن مولکولی حدود 34 کیلودالتون بدون در نظر گرفتن برچسب هیستیدینی می‌باشد.

شکل6-  تصویر ژل SDS PAGE آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز: A – نتایج الکتروفورز رسوب نمونه بعد از شکست سلولی B-نتایج الکتروفورز محلول رویی سلول­های القا­شده بعد از شکست سلولی C- نتایج الکتروفورزبعد از فرآیند تخلیص با کرماتوگرافی تمایلی نیکل-آگاروز M- مارکر پروتئین با کد .PM2600

3-4- تاثیر pH بر فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز: در این آزمایش آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز با بافر مختلط در pH های  6، 5/6، 7، 2/7، 4/7 ،6/7، 8 و 5/8  با سوبسترای کتکول با سه تکرار در سه روز متفاوت سنجیده شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که آنزیم در 2/7pH= حداکثر فعالیت را دارا بود. همان­طور که در نمودار 1دیده می‌‌شود. آنزیم در2/7=pH دارای بیشترین (100 درصد) فعالیت می‌باشد. اما در 4/7 دارای 70 درصد فعالیت بود. در برخی بررسی­های انجام شده بهینه  pHبرای آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در سویه­های مختلف باکتری 5/8-7 گزارش شده بود (16و 17) که با نتایج حاصل از تحقیق ما تطابق داشت. باتوجه به این مسئله که جایگاه فعال آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز دارای دو باقی­مانده اسید­آمینه هیستیدین و یک باقیمانده گلوتامات می‌باشد. به دلیل pKa  آمینو­اسید هیستیدین، پروتئین را دارای قدرت بافری موثری در  pHنزدیک خنثی می­کند.

نمودار1) بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز در pH های مختلف با سه تکرار در سه روز متفاوت.

ترجیح سوبسترایی آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز: در این آزمایش میزان فعالیت آنزیم بر روی سه سوبسترای مختلف در بافر تریس 50 میلی مولار 2/7 pH= با سه تکرار در سه روز متفاوت مورد بررسی قرار گرفت و همانطور که نمودار 2  نشان می­دهد کتکول به عنوان سوبسترای اصلی آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز می‌باشد که بیشترین فعالیت را روی آن داشت. آنزیم روی سوبسترا­های دیگر نسبت به کتکول فعالیت کمتری از خود نشان داد که با مطالعات دیگر انجام شده تطابق داشت، به نظرمی­رسد با توجه به جایگاه فعال آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز و همچین ساختار کتکول، که دارای دوگروه هیدروکسیل می‌باشد. کتکول برهمکنش مناسب­تری نسبت به سایر سوبسترا با جایگاه فعال دارد.

نمودار 2- بررسی ترجیح سوبسترایی آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز بر روی سوبستراهای کتکول، فنول و پیروگالول. کلیه آزمایش ها با سه تکرار و در سه روز متفاوت انجام شده است.

بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز در غلظت­های مختلف سوبسترا: در این پژوهش فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز بر غلظت­های مختلف (75/0، 5/،0 125/0، 25/0، 063/0 ،032/0و 016/0میلی­مولار) کتکول سنجیده شد که آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز بیشترین فعالیت را  در غلظت 032/0 میلی­مولار کتکول نشان داد (نمودار3).

نمودار3- بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز در غلظت­های مختلف سوبسترای کتکول.

مطالعات بیوانفورماتیک: مطالعات بیوانفورماتیک با اهداف شناسایی، مقایسه توالی و ساختار آنزیم مورد نظر با آنزیم­های مشابه در جهت درک بهتر مکانیسم عمل آنزیم الگو با استفاده از آنزیم هایی است که اطلاعات ساختاری و عملکردی بیشتر در مورد آن­ها وجود دارد. و این مطالعات بستر ساز مطالعات آینده با اهداف مهندسی پروتئین در راستای طراحی آنزیم هایی با اختصاصیت سوبسترایی، پایداری حرارتی، افزایش فعالیت و تغییر pH مطلوب می باشد.

بررسی­ها بر روی پروتئین الگو نشان داد که در جایگاه فعال اتم آهن، به ترتیب به باقی­مانده­های His153)،His214،Glu265) ، ((Tyr255 و His 199) ، His 246) متصل می­شود که در همه توالی­های مورد بررسی حفاظت شده بودند. همچنین باقی­مانده (His199) در جایگاه کاتالتیک نیز قرار دارد به صورت حفاظت شده می‌باشد (2). نتایج تطبیق توالی با سرور ESPript3 نیز تاییدکننده باقیمانده­های به شدت حفظ شده در آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز مورد مطالعه می­باشد.

شکل7- پروتئین کتکول 2.3 دی اکسیژناز در باکتریAneurinibacillus migulanus(A.m)   توسط سرورهای Clastelw و ESPript3  بر اساس ساختار دوم ، Pesedomonas putdi mt2(1MPY)  تطبیق داده شد و ساختار دوم توسط(α )  α-Helix،β-strand (β) ، turn(T)،  3₁₀-helix (ƞ) و همچنین اکتیوسایت دارای آهن متصل به هیستیدین153و214و265 (   ) متصل تیروزین 255 ( ) و آهن متصل با رزیدوهای هیستیدین 199 و246 (    ) نشان داده شده است که پروتئین کتکول 2و3دی اکسیژناز در همه باکتریهای Aneurinibacilluers migulanus (A.m) ،Pesedomounas putdia mt2 (1MPY) ، Quasi bacillus thermotolerans (Q.t) parageobacillus thermoglucosidasius (P.t)، Bacillaceae Bacterium (B.b) ، Geobacillus (G.b)   حفاظت شده می باشد.

با توجه به اطلاعات بدست آمده از سرورPoratParam  و مقایسه انجام شده بین نمونه پروتئین کتکول 2و3دی‌اکسیژناز(1MPY)   و کتکول 2و3دی‌اکسیژناز (CTD2.3)، دلیل بر صحت مدل ساخته شده برای پروتئین مورد نظر می‌باشد (جدول 1).

جدول1- نتایج به­دست آمده از مقایسه پارامترهای مختلف در سرورهای Protparam، SAVES ،ModEval و نرم افزار Spdbviewer

با توجه به جدول 2 می­توان نتیجه­گیری کرد که مقایسه وضعیت تعداد میانکش های آنزیم های مورد مطالعه (CTD2.3)،  با آنزیم 1MPY نشانگر تفاوت تعداد میان­کنش­های داخلی ساختار دو آنزیم­ می باشد و  به نظر می رسد این تغییرات در تعداد این میان­کنش­ها، می تواند نقش موثری در مکانیسم واکنش آنزیمی و تشکیل حدواسط­ها داشته باشد از اینرو با مطالعه و بررسی جزئی­تر این میان­کنش­ها و باقیمانده های ایجاد کننده این میانکنش ها، می­توان با اعمال جهش ها، تغییراتی در گستره فعالیت آ­نزیم در pH های مختلف، دماهای مختلف و پایداری آنزیم با هدف تجاری سازی آنزیم ها و کاربرد آن ها در صنعت زیست پالایی ایجاد کرد.

ساختار آنزیم کتکول 2.3 دی‌اکسیژناز توسط نرم­افزار کایمرا مورد بررسی قرارگرفت و جایگاه­های اتصال آهن و رزیدوهای درگیر در این اتصال شناسایی شد. شکل 8 میزان شباهت این دو آنزیم و اهمیت مطالعه رزیدوهایی که درگیر در میان­کنش­های بین مولکولی هستند را نشان می­دهد.

بحث و نتیجه گیری

امروزه استفاده از مسیرهای متابولیک میکروبی برای پاکسازی آلودگی­های زیست محیطی مورد توجه قرار گرفته است. با وجود تنوع متابولیسمی میکروارگانیسم­ها، ما هنوز شاهد آلودگی­های زیستی هستیم که تایید کننده این مساله می­باشد که این روش­ها برای حفاظت و تجزیه ترکیبات مضر محیطی کافی نبوده است (21). آنزیم کتکول 2و3 دی‌اکسیژناز یکی از آنزیم­های مهم تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک است و در زیست پالایی نقش بسزایی دارد (3).

جدول2- مقایسه میان­کنش­های داخلی پروتئین کتکول 2.3دی‌اکسیژناز باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12  (Ctd2.3) و پروتئین (1MPY) Pseudomonas putida mt2 با استفاده از .PICserver

شکل 8- بررسی تفاوت ساختار سه بعدی پروتئین کتکول 2.3 دی‌اکسیژناز (MPY1) (A) و کتکول 2.3دی‌اکسیژناز (CTD2.3)      (B) و مقایسه تطبیق همسانی ساختاری 1MPY و CTD2.3، (C) با استفاده از نرم افزار  Chimera می باشد.  در این شکل مدل ساختاری به رنگ سفید مربوط به آنزیم الگو (MPY1) و رنگ آبی مربوط به مدل آنزیم CTD2.3  می باشد. در این مدل جایگاه فعال آنزیم در مرکز ساختار مشخص می باشد.

بررسی مطالعات انجام گرفته قبلی از قبیل Fujita و همکاران در 1991 که آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را به صورت نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی تولید کردند و میزان تجزیه کتکول را سنجیدند (6) و در سال 1961 Kojima و همکاران آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را در باکتری ترموفیلBacillus thermoleovorans strain A2 شناسایی و در باکتری اشرشیاکلی همسانه­سازی و بیان کردند (13) که این مطالعات می تواند نشانگر اهمیت آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز ­باشد. با توجه به اینکه آنزیم­های موجود در طبیعت با شرایط زیستی فعلی خودشان بهینه شده­اند و از طرفی دیگر اهمیت زیست پالایی و حذف ترکیبات آروماتیک سمی، نیاز به پژوهش­های بیشتر در این زمینه را آشکار می­سازد. شناسایی و معرفی آنزیم­های جدید، بررسی میزان فعالیت، مطالعه ساختار و میان­کنش­های بین مولکولی و درون مولکولی آن­ها، استفاده از تکنیک­های بیوتکنولوژی جهت معرفی آنزیم با فعالیت بالا در گستره وسیعی از فعالیت در pH و دماهای مختلف، قدم بزرگی در حل مساله زیست پالایی می­باشد. در سال 2018 ژی و همکارانش آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را از باکتری Thauera s K1 تخلیص و خواص زیستی و شیمیایی آن را شناسایی و نشان دادند که آنزیم هموتترامر و دارای وزن مولکولی 140 کیلودالتون می­باشد و هر زیرواحد شامل آهن می­باشد و دارای pH بهینه برابر 8 و دمای مطلوب ˚^C 45 می­باشد. مقایسه توالی آمینواسیدی این آنزیم ها بیانگر همسانی در باقیمانده­های آمینواسیدی جایگاه فعال می­باشد و بررسی تفاوت ها و همسانی های این خانواده آنزیمی می تواند مسیری در جهت الگوگیری  با هدف طراحی آنزیم­هایی با ویژگی­های عملکردی مناسب در صنعت ­باشد (23).آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز آنزیمی هومو­تترامر می­باشد که از دو دایمر تشکیل شده است. دایمرها از جفت شدن پیوندهای هیدروژنی بین مولکولی تشکیل می­شود که 3 باقیمانده Val133 تا Pro135  در تشکیل این پیوند هیدروژنی نقش دارند. هر زیرواحد 2 دومین (-Nترمینال و -C ترمینال) دارد. -Nترمینال شامل آمینواسیدهای 1تا 149 بوده که در انتهای پایانی آن از گلایسین 130 تا تریپتوفان 139 لوپ بلندی تشکیل می­شود که باعث نزدیکی زیرواحدها در تترامر می شود. جایگاه فعال آنزیم در حفره ای بین دومین -C ترمینال قرار دارد (22).نتایج تعیین توالی و بیان ژن آنزیم مورد مطالعه، بیانگر یک توالی 915 جفت بازی (آنزیمی با 304 باقی­مانده آمینواسیدی) و تک باند پروتئینی با وزن مولکولی 34 کیلو دالتون بود. آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز 34 کیلو دالتونی مورد مطالعه در دمای˚^C 25،  pH بهینه برابر با 2/7 و غلظت بهینه سوبسترا 032/0 بیشترین فعالیت را از خود نشان داده است. در مطالعه­ای که توسط Junca و همکاران انجام گرفت آنزیم کتکول 2و3 دی­اکسیژناز را در  Pseudomonas putida mt-2 مطالعه و گزارش کردند که باقیمانده­های به شدت حفظ شده His199 و Tyr 255 در جایگاه­های فعال آنزیم می­باشد (12). نتایج تطبیق توالی با سرور ESPript3 نیز بیانگر این جایگاه­های حفظ شده در آنزیم مورد مطالعه  می­باشد. همچنین مطالعه  Juncaنشان داد که برخی اسیدهای­آمینه نتیجه مستقیم بر فعالیت آنزیم ندارند و اکوسیستم بهترین و تکامل­یافته­ترین نوع را درطبیعت انتخاب کرده است. با بررسی­های ساختاری و توالی  آنزیم  Pseudomonas putida mt-2 مشخص شد در جایگاه 201 باقیمانده والین و در جایگاه 254 باقیمانده لوسین قرار دارد که در مورد آنزیم مورد مطالعه ما نیز در این جایگاه­ها به ترتیب لوسین و والین قرار گرفته است و با توجه به اینکه ساختارهای حد واسط تشکیل شده بین سوبسترا-آنزیم و میان­کنش­های مولکولی که صورت می­گیرد کاهش و افزایش یک گروه متیل در میزان فعالیت آنزیم و احتمالا اختصاصیت سوبسترایی تغییر ایجاد کند. نتایج بدست آمده در زمینه اختصاصیت سوبسترایی آنزیم در میان سوبستراهای مختلف کتکول، پیروگالول و فنول نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوب­تری برای آنزیم می­باشد که احتمالاً به دلایل ساختار کتکول و میان­کنش­های تشکیل شده بین سوبسترا-آنزیم باعث اتصال بهتر آن در جایگاه فعال آنزیم می­شود. فعالیت 80 درصدی آنزیم در حضور سوبسترای فنول به­علت کمتر بودن یک گروه هیدروکسیل نسبت به کتکول قابل توجیه می­باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی آنزیم 1MPY نیز بیانگر این می­باشد که جایگاه فعال آنزیم شامل آمینواسیدهای هیدروفوبیک: Val180 ،Val188 ،Ala189 ،Ile 204 Leu298 ،Phe302 ، Met 303 می­باشد. که باقیمانده Phe302  و Met303  به واسطه زنجیره جانبی غیر قطبی­شان در ناحیه باز صفحه بتا واقع در دومین-C ترمینال باعث پوشش­دهی و باریک شدن آن ناحیه شده و در نهایت باعث اختصاصی شدن آنزیم به سوبسترای کتکول می شود (2). در آنزیم مورد مطالعه ما نیز در جایگاه­های 303 و 189 به ترتیب آمینو اسید سرین و گلایسین قرار گرفته است که احتمالا این جایگزینی در مورد جایگاه 303 می تواند با اضافه شدن یک گروه هیدروکسیلی (سرین) و کوتاه شدن زنجیره جانبی، در اختصاصیت سوبسترایی و سرعت واکنش تغییراتی ایجاد کند. این بررسی­ها ضرورت اهمیت و مطالعه بر روی آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را بیشتر می­کند.تقدیر و تشکراین مقاله از محل پایان نامه خانم ثریا محمد زاده دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی دانشگاه زنجان و با حمایت معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه زنجان انجام شده است.