نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 فارغ التحصیل کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران.
2 . فارغ التحصیل کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران.
3 هیات علمی دانشگاه زنجان
چکیده
کتکول2و3 دیاکسیژنازها از آنزیمهای کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتریهای خاک میباشند که در زیستپالایی نقش بسزایی دارند. هدف از پژوهش حاضر، معرفی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز جدید و همچنین بررسی بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی آن در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گسترهی گوناگون pH در جهت استفاده وسیع از این دسته آنزیمها در صنعت زیستپالایی میباشد.
برای این منظور، توالی رمزکننده آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز با روش PCRاز سویه Aneurinibacillus migulanus Znu12استخراج، با شماره دسترسی MN197546.1 در NCBI ثبت و درون وکتور pET28a همسانه سازی گردید. بررسی صحت همسانه سازی و عدم تغییر قالب خوانش با استفاده از تعیین توالی تایید شد. پس از تراریخت نمودن سلولهای E. coli BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. سپس خالصسازی، سنجش و بهینهسازی فعالیت آنزیم مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعهی ژنومی 915 جفتبازی معادل 304 باقیمانده آمینواسیدی می-باشد. الکتروفورز با SDS-PAGE نیز تاییدکننده آنزیم تخلیصشدهی 34 کیلودالتونی از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز بود. بررسی عملکرد بیوشیمیایی آنزیم نیز نشان داد آنزیم در 2/7=pH دارای100 درصد فعالیت ولی در 4/7=pH فقط 70 درصد فعالیت داشت. بررسی ترجیح سوبسترایی نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوبتری نسبت به پیروگالول و فنول برای آنزیم بود. بررسی نتایج بیوانفورماتیکی تأییدکننده این ترجیح به علت نوع و موقعیت باقی ماندههای آمینواسیدی جایگاه فعال آنزیم می باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Molecular and bioinformatics studies and determination of functional properties of Catechol 2,3-dioxygenase from Aneurinibacillus migulanus Znu12
نویسندگان [English]
1 Master’s Degree in Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Science, University of Zanjan, Zanjan, Iran.
2 Master’s Degree in Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Science, University of Zanjan, Zanjan, Iran.
چکیده [English]
Catechol 2,3-dioxygenases play a key role in the metabolism of aromatic molecules in the environment by soil bacteria. The aim of this study is to introduce the new catechol 2,3-dioxygenase and also to survey bioinformatics and biochemical characteristics in the presence of various substrates as well as to study its activity in various pH ranges for the widespread use of such enzymes in bioremediation industry.
In this study, the DNA sequences of Catechol 2,3-dioxygenase were separated from Aneurinibacillus migulanus Znu12 and recorded with accession number MN197546.1 in NCBI, then it was cloned in plasmid pET28a. The accuracy of cloning and not changing the frame shift was confirmed by sequencing. After transferring of plasmid into E. coli BL21 (DE3) cells, protein expression was assessed by SDS-PAGE. Afterwards, the purification, assay and optimization of enzyme activity were evaluated.
The results of PCR reaction on agarose gel indicated a sequence of 912 bp, an enzyme with 304 amino acid residues. Results of sequence alignment by ESPript3 server also confirmed highly conserved residues of His199 and Tyr 255 in the enzymes active site. Biochemical characterization of the enzyme showed that the enzyme had the highest (100%) activity at pH 7.2, while it had only 70% activity at pH 7.4. As compared with pyrogallol and phenol, catechol by optimal concentration of 0.032 was the most preferred substrate for the enzyme.
Bioinformatics results confirmed also such substrate preference based on the type and position of amino acid residues in the enzyme active site.
کلیدواژهها [English]
مطالعات مولکولی، بیوانفورماتیکی و تعیین ویژگی های عملکردی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز از سویه Aneurinibacillus migulanus Znu12
ثریا محمدزاده، نسرین احمدپور، زیبا میرزایی و وهب جعفریان*
ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 16/07/1399 تاریخ پذیرش: 18/12/1399
چکیده
کتکول2و3 دیاکسیژنازها از آنزیمهای کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتریهای خاک میباشند که در زیستپالایی نقش بسزایی دارند. هدف از پژوهش حاضر، معرفی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز جدید و همچنین بررسی بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی آن در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گسترهی گوناگون pH در جهت استفاده وسیع از این دسته آنزیمها در صنعت زیستپالایی میباشد. برای این منظور، توالی رمزکننده آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز با روش PCRاز سویه Aneurinibacillus migulanus Znu12 استخراج، با شماره دسترسی MN197546.1 در NCBI ثبت و درون وکتور pET28a همسانه سازی گردید. بررسی صحت همسانه سازی و عدم تغییر قالب خوانش با استفاده از تعیین توالی تایید شد. پس از تراریخت نمودن سلولهای E. coli BL21(DE3) بیان پروتئین با روش SDS-PAGE ارزیابی شد. سپس خالصسازی، سنجش و بهینهسازی فعالیت آنزیم مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعهی ژنومی 915 جفتبازی معادل 304 باقیمانده آمینواسیدی میباشد. الکتروفورز با SDS-PAGE نیز تاییدکننده آنزیم تخلیصشدهی 34 کیلودالتونی از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز بود. بررسی عملکرد بیوشیمیایی آنزیم نیز نشان داد آنزیم در 2/7=pH دارای100 درصد فعالیت ولی در 4/7=pH فقط 70 درصد فعالیت داشت. بررسی ترجیح سوبسترایی نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوبتری نسبت به پیروگالول و فنول برای آنزیم بود. بررسی نتایج بیوانفورماتیکی تأییدکننده این ترجیح به علت نوع و موقعیت باقی ماندههای آمینواسیدی جایگاه فعال آنزیم می باشد.
واژههای کلیدی: بیوانفورماتیک، زیست پالایی، pH بهینه، کتکول 2و3 دیاکسیژناز، همسانهسازی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 02433052531 ، پست الکترونیکی: v.jafarian@znu.ac.ir
مقدمه
ریزآلایندها شامل انواع مختلفی از مواد مانند فلزات سنگین و مواد آلی )رنگهای نساجی، هورمونها، داروهای متابولیک و آفتکشها( میباشند که توسط فعالیتهای انسانی در محیط پخش میشوند و سالهاست به یک تهدید جهانی تبدیل شده است و سبب ایجاد عوارضی نظیر سمیت حاد، از دست دادن باروری، تولدهای ناقص، تغییر جنسیت و اختلال در غدد درونریز میباشد (4). کتکول از تجزیه بسیاری از ترکیبات آروماتیک نظیر فنول، تولوئن، بنزن، آنیلین، فنلات و مشتقات آن به صورت ترکیبات حدواسط شکل میگیرد و همچنین سمیت کتکول از فنول بیشتر است و بهراحتی در آب، خاک و محیط زیست نفوذ میکند. بنابراین تهدیدی برای محیط زیست و سلامت انسان محسوب شده و حذف آلایندگی آن از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است (14). کتکول دارای اثرات جهشزایی، سرطانزایی و اثرات سمی میباشد که بهراحتی از طریق پوست جذب گردیده و باعث درماتیت میشود و همچنین اثرات مسمومیت با کتکول شبیه مسمومیت با فنول میباشد (19). کتکول به دلیل سمی بودن میتواند باعث سرطان لنفاوی، آسیب به سیستم اعصاب مرکزی و عدم رونویسی DNA شود. بنابراین بهعنوان یکی از عوامل سرطان در انسان شناخته شده است (16).
کتکول بهدستآمده از تجزیه ترکیبات آروماتیک دچار سرنوشتهای متفاوتی خواهد شد. مسیر ارتو (Ortho pathway) توسط آنزیم کتکول 1و2 دیاکسیژناز و مسیر متا (Meta pathway) توسط آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز را طی کرده و به چرخه تری کربوکسیک اسید ختم میشود. شکل 1 مسیر تجزیه فنول و تبدیل آن به کتکول و سرنوشت کتکول را نشان میدهد (18).
شکل 1- مسیر تجزیه کتکول و ختم آن به چرخه تریکربوکسیلیکاسید (17).
کتکول 2و3 دیاکسیژناز حلقه آروماتیک کتکول را در موقعیت متا (2.3) می شکند، در نهایت کتکول را به 2-هیدروکسی موکونیک سمیآلدهید تبدیل میکند (2). کتکول دیاکسیژنازها از آنزیمهای کلیدی در متابولیسم ترکیبات آروماتیک موجود در باکتریهای خاک میباشند که در زیستپالایی نقش بسزایی دارند. کتکول 2و3 دی اکسیژناز به دو گروه آنزیمهای شکننده اینترادیول و اکسترادیول تقسیم میشوند. هر دو نوع آنزیم در جایگاه فعال خود دارای آهن میباشند که برای فعالیت آنزیم ضروری هستند. اینترادیولها داری آهن سه ظرفیتی و اکسترادیولها دارای آهن دو ظرفیتی میباشند (7).
اکسترادیول دیاکسیژنازها آنزیمهای متنوعی هستند که با طیف گستردهای از سوبستراها واکنش میدهند و به دو گروه تقسیم میشوند: 1-گروهی که با سوبستراهای تک حلقوی واکنش میدهند. 2-گروهی که با سوبستراهای چند حلقوی واکنش میدهند. کتکول 2و3 دی اکسیژناز ترکیبات تک حلقوی را تجزیه میکند که دارای دو دمین و اولیگومر میباشد و در جایگاه فعال خود دارای آهن دو ظرفیتی یا منگنز دو ظرفیتی میباشند. اکسترادیول دیاکسیژناز شکستن حلقه ترکیبات آروماتیک را از کربن دارای گروه هیدروکسیل و بدون هیدروکسیل کاتالیز میکند. مکانیسم عمل آنزیم با اتصال دو جانبه سوبسترا به عنوان مونوآنیون به آهن دو ظرفیتی در جایگاه فعال و جایگزینی دو مولکول آب به طور همزمان آغاز میشود که با اتصال اکسیژن به آهن دو ظرفیتی یک حدواسط سمی کینون- فروس- سوپراکسید شکل میگیرد. سپس در مراحل بعدی گروه کربونیل اکسید با دو بار مرکزی و باند اکسیژن- اکسیژن شکافته میشود و حدواسط لاکتون شکل میگیرد. باند آهن دو ظرفیتی و یون هیدروکسید تشکیل می شود درنهایت هیدرولیز لاکتون باعث تشکیل سمیآلدهید میشود (شکل 2). بهدلیل اهمیت کتکول 2و3 دی اکسیژناز در تخریب ترکیبات آروماتیک در دهههای گذشته مورد توجه قرار گرفته است و مطالعات زیادی در مورد ساختار مولکولی، ویژگیهای سوبسترایی، عملکرد و انتقال آنها به میکروارگانیسمهای مختلف برای تجزیه ترکیبات آروماتیک صورت گرفته است (8و 11).
شکل 2- مکانیسم عمل اکسترادیول دی اکسیژناز (7).
آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز (متوپیروکتکاز) به اکسیژن و فرمهای کاهشی آن حساس میباشد و بهراحتی توسط اکسندههای مختلف غیرفعال میشود که از این اکسیدکنندهها میتوان هوا یا H2O2 را نام برد. این اکسیداسیون در اثر تبدیل آهن دوظرفیتی به آهن سهظرفیتی و آزادشدن آن از پروتئین میباشد که در اثر این اکسیداسیون آنزیم غیرفعال میشود و در نهایت میتوان با انکوباسیون با آهن سهظرفیتی و یک کاهشدهنده در شرایط بیهوازی دوباره فعال کرد که از غیرفعال شدن آنزیم در حضور کتکول جلوگیری میکند، ناگفته نماند که کوفاکتور آهن توسط هالوکتکول نیز غیرفعال میشود (20و 22). دراکثر ساختارهای اکسترادیول دیاکسیژنازها، در جایگاه فعال یون آهن دو ظرفیتی با دو باقیمانده هیستیدین، یک گلوتامات و یک تیروزین بهصورت حفظ شده وجود دارد. نتایج مطالعات قبلی نشان میدهد که اکثر اکسترادیول دیاکسیژنازها از مکانیسم واحد و شناخته شدهای برای اتصال به سوبسترا و شکستن ترکیبات آروماتیک استفاده میکنند که این ساختار حفظ شده در آنزیمهای زیادی مشاهده شده است (9).
با توجه به کاربرد این آنزیم در حفاظت از محیط زیست، کتکول 2.3 دی اکسیژناز از میکروارگانیسمهای مختلفی از جمله Alcaligenes, Bacillus, Planococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Variovorax,و Sphingomonas مورد مطالعه قرار گرفته است (10). مطالعات مختلف جهت بررسی مکانیسم واکنش آنزیمی توسط Shu و همکاران در سال 1995 و Bugg &lin در سال 2001 شکل گرفت و ساختار اولیه کتکول 2.3 دی اکسیژناز برای اولین بار سال 1983توسط Nakai و همکاران در Pseudomonas putida mt2 شناسایی شد و توسط Kita و همکارانش در سال 1999 توضیح داده شد (12).
آلودگیهای روزافزون زیست محیطی و تهدید سلامت جهانی منجر به رویآوری به روشهای سازگار با محیط از جمله استفاده از باکتریهای موجود در خاک با توانایی تجزیه ترکیبات آروماتیک، جهت کاهش یا حذف این آلایندهها شده است. کتکول 2و 3 دیاکسیژنازها، آنزیمهای شکننده ترکیبات آروماتیک و تبدیل آنها به مواد بیخطر یا کمخطر است و مطالعه حاضر در راستای شناسایی، همسانه سازی و تخلیص آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز از باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12 جدا شده از شیلهای نفتی کرمانشاه انجام گردید. تا با مطالعات بیوانفورماتیکی و بیوشیمیایی این آنزیم در حضور سوبستراهای گوناگون و بررسی فعالیت در گستره pH گامی به سوی استفاده گسترده از این دسته آنزیم ها در صنعت زیستپالایی برداشته شود.
مواد و روشها
مواد شیمیایی و آنزیم ها: محیط کشت Nutriant Broth، محیط کشت Nutrient Agar، کوماسیبلو، آگارز، تریپتون، کانامایسین، پتاسیم دی هیدروژن فسفات، دی پتاسیم فسفات، اسیدآسکوربیک، کتکول، فروسسولفاتهیدراته، نمکتریس و سایر مواد شیمیایی که از شرکت مرک (Darmstadt,Germany) تهیه گردید. آنزیم هایBamHI ، XhoI و T4 DNA Ligase از شرکت Thermal scientific و کیت تخلیص محصول PCR و کیت استخراج پلاسمید از Bioneer کره جنوبی تهیه گردید و خدمات سنتز پرایمر و تعیین توالی توسط شرکت تکاپو زیست نماینده Bioneer کره جنوبی انجام گردید.
تکثیر توالی کد کننده آنزیم کتکول 2و3دیاکسیژناز: در این مطالعه از باکتری Aneurinibacillus migulanus که پیشتر از خاک شیلهای نفتی مربوط به ارتفاعات منطقه دودان (N "2/3´01˚35 و E "6/8´11˚46) واقع در غرب استان کرمانشاه جداسازی شده بود استفاده شده است (1). پس از بررسیهای مولکولی (شناسایی توالی 16S rDNA) باکتری با عنوان Znu12 Aneurinibacillus migulanus نامگذاری گردید. توالی 16SrDNA باکتری Aneurinibacillus migulanusZnu12 در blast NCBI بررسی شد و باکتریهای دارای بیشترین تشابه با جنس و گونه باکتری مورد نظر مشخص گردید و بعد از بررسی آنها باکتری Aneurinibacillus migulanus strain DSM 2895 که دارای ژن مربوط به توالی آمینواسیدی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز بود انتخاب شد. سپس با استفاده از نرمافزار GenRunner طراحی پرایمرهای )'CGAGGATCCATGAACAGCATTTTGCGTATCG-3-' Forward (5 و (3´-GTGCTCGAGCTATGTTAATGCTTTTGAAAACGATTC-'5) Reverse انجام شد. واکنش PCR مورد نظر به این صورت بود: مرحله اول: ˚C94 (3دقیقه)، مرحله دوم: ˚C94 (1دقیقه)، ˚C52 (1 دقیقه)، ˚C72 ( 5/1 دقیقه) در 35 چرخه، مرحله آخر: ˚C72 (3دقیقه) انجام شد و محصول PCR روی ژل آگاروز 1 درصد بارگذاری شد.
همسانهسازی ژن کتکول 2و3 دیاکسیژناز در میزبان پروکاریوتی: بعد از خالصسازی محصول PCR توسط کیت تخلیص محصول PCR، برش توسط آنزیمهای برشی XhoI و BamHI به مدت 15 دقیقه در ˚C 37 انجام شد. بهمنظور همسانهسازی و بیان ژن کتکول 2و3 دیاکسیژناز از وکتور بیانی pET28a و جهت جایگذاری توالی آنزیم از باکتری DH5α E.coli به عنوان میزبان برای انتقال حامل نوترکیب استفاده گردید. پس از برش پلاسمید مورد نظر توسط آنزیمهای برشی BamHI، XhoI در دو مرحله به مدت 15دقیقه در دمای ˚C 37، آلکالین فسفاتاز به پلاسمید برش یافته اضافه گردید. این واکنش به مدت 15 دقیقه در دمای ˚C 37 انجام شد. به منظور غیرفعال کردن آنزیم محصول واکنش به مدت 5 دقیقه در دمای ˚C 75 قرار گرفت. سپس واکنش اتصال با حضور آنزیم T4 DNA Ligase به منظور قرارگیری ژن موردنظر در جایگاه همسانهسازی حامل بیانی pET28a به مدت 20-24 ساعت در ˚C 22 صورت گرفت و درنهایت حامل به باکتری مستعد E.coli DH5α انتقال یافت.
پس از انجام عمل ترانسفورم، همسانهسازی محصول PCR تخلیص شده طی مراحلی در میزبان پروکاریوتی E.coli DH5α انجام گردید. برای تایید عمل ترانسفرم و همسانهسازی از روشهای غربالگری با استفاده از کلونی PCR، غربالگری با استفاده از هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد.
بیان و تخلیص آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز : استخراج پلاسمید نوترکیب حاوی توالی آنزیم مورد مطالعه از باکتری E.coli سویه DH5α توسط کیت استخراج پلاسمید در محیط کشت LB Broth حاوی کانامایسین 50 میلیمولار صورت گرفت سپس به سویه بیانی BL21 انتقال یافت. جهت القا بیان ژن به محیط کشت حاوی باکتری، IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside) (1میلیمولار) و سولفاتآهن (1 مولار) اضافه گردید. القا بیان آنزیم به مدت 17 ساعت در دمای ˚C 25، 180 دور بر دقیقه در انکوباتور انجام گردید. محیط کشت حاوی باکتری به مدت 20 دقیقه با 500 دور بردقیقه در دمای ˚C 4 سانتریفیوژ شد. به رسوب باکتری 3 میلیلیتر بافر لیزکننده بهصورت سوسپانسیون اضافه گردید. پس از آن سوسپانسیون باکتری تحت سونیکاسیون (شامل20مرحله-20ثانیه) قرار گرفت. برای جلوگیری از تخریب گرمایی تمام مراحل سونیکاسیون در یخ انجام گردید. سلولهای لیزشده در دمای ˚C 4 با 12000 دور بر دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند و محلول رویی برای انجام مراحل بعدی جدا گردید. تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کرماتوگرافی نیکل آگاروز انجام شد. سپس از سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز SDS-PAGE)) با ، درصد ژل بالای الکتروفورز 5 درصد و ژل پایین 5/12، برای آنالیز کیفی و تعیین خلوص پروتئینها با استفاده گردید
سنجش فعالیت آنزیم: فعالیت آنزیم کتکول 2و3دیاکسیژناز با واکنشی به حجم دو میلیلیتر که حاوی اسیدآسکوربیک 2 میلیمولار، آهن 1 میلیمولار برای جلوگیری از غیرفعال شدن آنزیم، آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز (2/0 میلیگرم)، سوبسترای کتکول (10میلیمولار) و بافر تریس (50میلیمولار) میباشد، فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در دمای ˚C 25 در طول موج 375 نانومتر که تبدیل کتکول به 2- هیدروکسی موکونیک سمی آلدهید را انجام میدهد، توسط دستگاه اسپکتوفتومتر مورد سنجش قرار گرفت (4). غلظت پروتئین با روش برادفورد سنجش گردید و از استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد (14).
اثر pH بر فعالیت آنزیم: فعالیت نسبی آنزیم در 3 تکرار در دمای ˚C 25 در pH های مختلف تعیین گردید. بدینمنظور از بافر مخلوط (حاوی تریس و فسفات) استفاده شد. از محلولهای سود و اسیدکلریدریک جهت تنظیم و تهیه pH های مختلف (6- 5/8) استفاده گردید.
اختصاصیت سوبسترایی و بهینه کردن غلظت سوبسترا: مطابق بخش 2-5 فعالیت آنزیم در دمای اتاق و 2/7 =pH در غلظتهای مختلف کاتکول (75/0، 5/0، 25/0، 125/0، 063/0، 032/0میلیمولار) مورد سنجش قرارگرفت و در ادامه همچنین جهت بررسی اختصاصیت سوبسترایی، فعالیت آنزیم در حضور سوبستراهای مختلف کتکول، فنول و پیروگالول (10 میلیمولار) در 2/7=pH و دمای ˚C 25 (مطابق بخش 2-5) مورد سنجش قرار گرفت.
مطالعات بیوانفورماتیکی: ساختار آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12 با استفاده از ابزارهای مختلف بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت. از این رو، توالیهای پروتئینی مشابه با توالی این آنزیم در NCBI بهدست آمد. سپس مشابهترین توالی به پروتئین باکتری مورد نظر گزینش و مدلهای آن با استفاده از نرم افزار9v18 Modeller طراحی شد و بهترین مدل با مقایسهی پارامترهای به دست آمده از محاسبات توسط نرم افزارهای ModEval، SAVES، SPdbViewer وPIC Server انتخاب و مورد ارزیابی قرار گرفت. افزون بر این، میانکشهای مختلف بین پروتئین الگو با مدل انتخابی بررسی و مقایسه شد که نشان دهندهی انتخاب درست مدل بود. آمینواسیدهای حفظ شده و متصل به اتم آهن توسط سرور ESPript3 شناسایی شدند که نشاندهندهی شباهت دیگر توالیهای پروتئینی بهدست آمده از NCBI با توالی پروتئین مدل و الگو بود. باتوجه به تطبیق مدل و الگو از طریق نرمافزارها و سرورها، مدل پروتئین باکتری مورد نظر نیز ساخته شد. افزون بر این، ساختار سه بعدی این پروتئین توسط نرم افزار Chimera رسم گردید و جایگاه فعال آنزیم متصل به اتم آهن با استفاده از این نرمافزار نشان داده شد و شباهت و تفاوت بین ساختارهای سوم پروتئین الگو و مدل نیز مورد بررسی قرارگرفت. تطبیق توالی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در باکتریهای Aneurinibacillus migulanus(A.m) ، Pseudomonas putida (P.p), Bacillusbacterium(B.b)، Geobacillus (G.b)، Quasibacillus thermotolorans (Q.t) Parageobacillus thermoglucosidasius (P.t), با سرور ESPript3 ترسیم شد.
نتایج
تکثیر توالی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز: نتایج واکنش PCR بر روی ژل آگاروز بیانگر قطعهی ژنومی مربوط به توالی ژنومی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز میباشد که در ناحیه 915 جفتبازی قرار گرفته است و معادل 304 باقیمانده آمینواسیدی در توالی پروتئینی مربوط به آنزیم میباشد که نشاندهندهی صحت انجام واکنش PCR و درستی طراحی پرایمر میباشد.
همسانهسازی و تعیین توالی ژن کدکننده کتکول 2و3 دیاکسیژناز: محصول PCR برش یافته توسط آنزیم های برشی BamHI وXhoI در ناقل pET28a همسانه سازی شده و صحت همسانه سازی با PCR کلونی ها (شکل 4)، هضم آنزیمی (شکل 5) و تعیین توالی تایید شد.
شکل 3- محصول PCR، (M) مارکر وزن مولکولی 100-10000 جفتباز.
با توجه به نتایج غربالگری با استفاده از کلونی PCR، که تمامی کلونیهای ذکر شده در محیط کشت مایع حاوی کاناماسین رشد کردند و همچنین این کلونیها قبل از کشت، مستقیما به عنوان الگو در PCR مورد استفاده قرار گرفتند و محصول PCR آنها با ژل آگاروز مورد بررسی قرار گرفت (شکل 4). همانطور که در شکل (4) نشان داده شده است از 6 کلونی انتخاب شده کلونیهای 1و2و3و4 مثبت شد که نشان داد این کلونیها حاوی ژن موردنظر بود. بنابراین کلونیهای 1 و 4 برای ادامه کار انتخاب شدند.
شکل4- کلونی PCR ژن کتکول 2و3 دیاکسیژناز در ژل آگاروز 1 درصد. نمونههای 1تا 4 بیانگر نتیجه واکنش PCR انجام شده از کلونی رشد کرده در فرآیند انتقال پلاسمید حاوی ژن کتکول 2و3 دیاکسیژناز به باکتری میباشد. نمونه 7 کنترل منفی بیانگر واکنش PCR انجام شده بدونDNA الگو میباشد.
نتایج غربالگری با استفاده از هضم آنزیمی تاییدی بر عمل ترنسفرم و همسانهسازی بود. هضم آنزیمی وکتور pET28a نوترکیب در یک نمونه (وکتور حاصل از کلونی شماره 1) جهت تایید واکنش اتصال قطعه موردنظر با حامل با استفاده از آنزیمبرشی BamHI انجام گرفت به طوریکه قطعه برشیافته نسبت به هضم وکتور pET28aغیر نوترکیب سنگینتر و دارای وزن بیشتری میباشد (شکل5).
شکل 5- غربالگری بر اساس هضمآنزیمی. A- پلاسمید غیر نوترکیب M-مارکر وزن مولکولی100-10000 B –پلاسمید نوترکیب حامل ژن همسان سازی شده (مشخص شده با فلش).
پلاسمید نوترکیب استخراج شده، جهت غربالگری با استفاده از تعیین توالی به شرکت Bioneer ارسال گردید و آنالیز نتایج تعیین توالی بیانگر . توالی نوکلئوتیدی استخراج شده از گونه Aneurinibacillus migulanus Znu12 با 915 جفتباز و 304 باقیمانده آمینواسیدی را کد میکند که در بانک ژن با با شماره دسترسی MN197546.1 ثبت شد و نتایج بررسی تطبیق توالی نشانگر همسانی توالی استخراج شده با catechol 2,3-dioxygenase [Aneurinibacillus migulanus] با (WP-043071689.1) با 99 درصد همسانی بود.
بررسی بیان و تخلیص پروتئین کتکول 2و3 دیاکسیژناز: نتایج الکتروفورز پروتئین بهروش SDS-PAGE احیایی بیانگر بیان پروتئین کتکول 2و3 دیاکسیژناز در میزبان بیانی همسانسازی شدهی E.coli BL21 میباشد (شکل6). نتایج الکتروفوز SDS-PAGE تایید کننده این مسئله میباشد که آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز تخلیص شده با استفاده از ستون کرماتوگرافی تمایلی نیکل آگاروز دارای درجه خلوص بالای 90 درصد و وزن مولکولی حدود 34 کیلودالتون بدون در نظر گرفتن برچسب هیستیدینی میباشد.
شکل6- تصویر ژل SDS PAGE آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز: A – نتایج الکتروفورز رسوب نمونه بعد از شکست سلولی B-نتایج الکتروفورز محلول رویی سلولهای القاشده بعد از شکست سلولی C- نتایج الکتروفورزبعد از فرآیند تخلیص با کرماتوگرافی تمایلی نیکل-آگاروز M- مارکر پروتئین با کد .PM2600
3-4- تاثیر pH بر فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز: در این آزمایش آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز با بافر مختلط در pH های 6، 5/6، 7، 2/7، 4/7 ،6/7، 8 و 5/8 با سوبسترای کتکول با سه تکرار در سه روز متفاوت سنجیده شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که آنزیم در 2/7pH= حداکثر فعالیت را دارا بود. همانطور که در نمودار 1دیده میشود. آنزیم در2/7=pH دارای بیشترین (100 درصد) فعالیت میباشد. اما در 4/7 دارای 70 درصد فعالیت بود. در برخی بررسیهای انجام شده بهینه pHبرای آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در سویههای مختلف باکتری 5/8-7 گزارش شده بود (16و 17) که با نتایج حاصل از تحقیق ما تطابق داشت. باتوجه به این مسئله که جایگاه فعال آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز دارای دو باقیمانده اسیدآمینه هیستیدین و یک باقیمانده گلوتامات میباشد. به دلیل pKa آمینواسید هیستیدین، پروتئین را دارای قدرت بافری موثری در pHنزدیک خنثی میکند.
نمودار1) بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز در pH های مختلف با سه تکرار در سه روز متفاوت.
ترجیح سوبسترایی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز: در این آزمایش میزان فعالیت آنزیم بر روی سه سوبسترای مختلف در بافر تریس 50 میلی مولار 2/7 pH= با سه تکرار در سه روز متفاوت مورد بررسی قرار گرفت و همانطور که نمودار 2 نشان میدهد کتکول به عنوان سوبسترای اصلی آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز میباشد که بیشترین فعالیت را روی آن داشت. آنزیم روی سوبستراهای دیگر نسبت به کتکول فعالیت کمتری از خود نشان داد که با مطالعات دیگر انجام شده تطابق داشت، به نظرمیرسد با توجه به جایگاه فعال آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز و همچین ساختار کتکول، که دارای دوگروه هیدروکسیل میباشد. کتکول برهمکنش مناسبتری نسبت به سایر سوبسترا با جایگاه فعال دارد.
نمودار 2- بررسی ترجیح سوبسترایی آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز بر روی سوبستراهای کتکول، فنول و پیروگالول. کلیه آزمایش ها با سه تکرار و در سه روز متفاوت انجام شده است.
بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در غلظتهای مختلف سوبسترا: در این پژوهش فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز بر غلظتهای مختلف (75/0، 5/،0 125/0، 25/0، 063/0 ،032/0و 016/0میلیمولار) کتکول سنجیده شد که آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز بیشترین فعالیت را در غلظت 032/0 میلیمولار کتکول نشان داد (نمودار3).
نمودار3- بررسی فعالیت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز در غلظتهای مختلف سوبسترای کتکول.
مطالعات بیوانفورماتیک: مطالعات بیوانفورماتیک با اهداف شناسایی، مقایسه توالی و ساختار آنزیم مورد نظر با آنزیمهای مشابه در جهت درک بهتر مکانیسم عمل آنزیم الگو با استفاده از آنزیم هایی است که اطلاعات ساختاری و عملکردی بیشتر در مورد آنها وجود دارد. و این مطالعات بستر ساز مطالعات آینده با اهداف مهندسی پروتئین در راستای طراحی آنزیم هایی با اختصاصیت سوبسترایی، پایداری حرارتی، افزایش فعالیت و تغییر pH مطلوب می باشد.
بررسیها بر روی پروتئین الگو نشان داد که در جایگاه فعال اتم آهن، به ترتیب به باقیماندههای His153)،His214،Glu265) ، ((Tyr255 و His 199) ، His 246) متصل میشود که در همه توالیهای مورد بررسی حفاظت شده بودند. همچنین باقیمانده (His199) در جایگاه کاتالتیک نیز قرار دارد به صورت حفاظت شده میباشد (2). نتایج تطبیق توالی با سرور ESPript3 نیز تاییدکننده باقیماندههای به شدت حفظ شده در آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز مورد مطالعه میباشد.
شکل7- پروتئین کتکول 2.3 دی اکسیژناز در باکتریAneurinibacillus migulanus(A.m) توسط سرورهای Clastelw و ESPript3 بر اساس ساختار دوم ، Pesedomonas putdi mt2(1MPY) تطبیق داده شد و ساختار دوم توسط(α ) α-Helix،β-strand (β) ، turn(T)، 310-helix (ƞ) و همچنین اکتیوسایت دارای آهن متصل به هیستیدین153و214و265 ( ) متصل تیروزین 255 ( ) و آهن متصل با رزیدوهای هیستیدین 199 و246 ( ) نشان داده شده است که پروتئین کتکول 2و3دی اکسیژناز در همه باکتریهای Aneurinibacilluers migulanus (A.m) ،Pesedomounas putdia mt2 (1MPY) ، Quasi bacillus thermotolerans (Q.t) parageobacillus thermoglucosidasius (P.t)، Bacillaceae Bacterium (B.b) ، Geobacillus (G.b) حفاظت شده می باشد.
با توجه به اطلاعات بدست آمده از سرورPoratParam و مقایسه انجام شده بین نمونه پروتئین کتکول 2و3دیاکسیژناز(1MPY) و کتکول 2و3دیاکسیژناز (CTD2.3)، دلیل بر صحت مدل ساخته شده برای پروتئین مورد نظر میباشد (جدول 1).
جدول1- نتایج بهدست آمده از مقایسه پارامترهای مختلف در سرورهای Protparam، SAVES ،ModEval و نرم افزار Spdbviewer
Instability |
pI |
VERYFY3D |
RMSD |
z-DOPE |
ERRAT |
|
26.28 |
5.41 |
99.2 |
- |
1.794- |
86.288 |
1MPY |
21.56 |
5.47 |
89.80 |
0.47 |
0.962- |
83.108 |
CTD2.3 |
با توجه به جدول 2 میتوان نتیجهگیری کرد که مقایسه وضعیت تعداد میانکش های آنزیم های مورد مطالعه (CTD2.3)، با آنزیم 1MPY نشانگر تفاوت تعداد میانکنشهای داخلی ساختار دو آنزیم می باشد و به نظر می رسد این تغییرات در تعداد این میانکنشها، می تواند نقش موثری در مکانیسم واکنش آنزیمی و تشکیل حدواسطها داشته باشد از اینرو با مطالعه و بررسی جزئیتر این میانکنشها و باقیمانده های ایجاد کننده این میانکنش ها، میتوان با اعمال جهش ها، تغییراتی در گستره فعالیت آنزیم در pH های مختلف، دماهای مختلف و پایداری آنزیم با هدف تجاری سازی آنزیم ها و کاربرد آن ها در صنعت زیست پالایی ایجاد کرد.
ساختار آنزیم کتکول 2.3 دیاکسیژناز توسط نرمافزار کایمرا مورد بررسی قرارگرفت و جایگاههای اتصال آهن و رزیدوهای درگیر در این اتصال شناسایی شد. شکل 8 میزان شباهت این دو آنزیم و اهمیت مطالعه رزیدوهایی که درگیر در میانکنشهای بین مولکولی هستند را نشان میدهد.
بحث و نتیجه گیری
امروزه استفاده از مسیرهای متابولیک میکروبی برای پاکسازی آلودگیهای زیست محیطی مورد توجه قرار گرفته است. با وجود تنوع متابولیسمی میکروارگانیسمها، ما هنوز شاهد آلودگیهای زیستی هستیم که تایید کننده این مساله میباشد که این روشها برای حفاظت و تجزیه ترکیبات مضر محیطی کافی نبوده است (21). آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز یکی از آنزیمهای مهم تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک است و در زیست پالایی نقش بسزایی دارد (3).
جدول2- مقایسه میانکنشهای داخلی پروتئین کتکول 2.3دیاکسیژناز باکتری Aneurinibacillus migulanus Znu12 (Ctd2.3) و پروتئین (1MPY) Pseudomonas putida mt2 با استفاده از .PICserver
انواع میانکنشها |
1MPY |
CTD2.3 |
Intraprotein Hydrophobic Interactions |
262 |
224 |
Intraprotein Main Chain-Main Chain Hydrogen Bonds |
306 |
312 |
Intraprotein Main Chain-Side Chain Hydrogen Bonds |
95 |
99 |
Intraprotein Side Chain-Side Chain Hydrogen Bonds |
138 |
93 |
Intraprotein Ionic Interactions |
49 |
38 |
Intraprotein Aromatic-Aromatic Interactions |
15 |
14 |
Intraprotein Aromatic-Sulphur Interaction |
2 |
4 |
Intraprotein Cation-Pi Interactions |
8 |
5 |
شکل 8- بررسی تفاوت ساختار سه بعدی پروتئین کتکول 2.3 دیاکسیژناز (MPY1) (A) و کتکول 2.3دیاکسیژناز (CTD2.3) (B) و مقایسه تطبیق همسانی ساختاری 1MPY و CTD2.3، (C) با استفاده از نرم افزار Chimera می باشد. در این شکل مدل ساختاری به رنگ سفید مربوط به آنزیم الگو (MPY1) و رنگ آبی مربوط به مدل آنزیم CTD2.3 می باشد. در این مدل جایگاه فعال آنزیم در مرکز ساختار مشخص می باشد.
بررسی مطالعات انجام گرفته قبلی از قبیل Fujita و همکاران در 1991 که آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را به صورت نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی تولید کردند و میزان تجزیه کتکول را سنجیدند (6) و در سال 1961 Kojima و همکاران آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را در باکتری ترموفیلBacillus thermoleovorans strain A2 شناسایی و در باکتری اشرشیاکلی همسانهسازی و بیان کردند (13) که این مطالعات می تواند نشانگر اهمیت آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز باشد. با توجه به اینکه آنزیمهای موجود در طبیعت با شرایط زیستی فعلی خودشان بهینه شدهاند و از طرفی دیگر اهمیت زیست پالایی و حذف ترکیبات آروماتیک سمی، نیاز به پژوهشهای بیشتر در این زمینه را آشکار میسازد. شناسایی و معرفی آنزیمهای جدید، بررسی میزان فعالیت، مطالعه ساختار و میانکنشهای بین مولکولی و درون مولکولی آنها، استفاده از تکنیکهای بیوتکنولوژی جهت معرفی آنزیم با فعالیت بالا در گستره وسیعی از فعالیت در pH و دماهای مختلف، قدم بزرگی در حل مساله زیست پالایی میباشد. در سال 2018 ژی و همکارانش آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را از باکتری Thauera s K1 تخلیص و خواص زیستی و شیمیایی آن را شناسایی و نشان دادند که آنزیم هموتترامر و دارای وزن مولکولی 140 کیلودالتون میباشد و هر زیرواحد شامل آهن میباشد و دارای pH بهینه برابر 8 و دمای مطلوب ˚C 45 میباشد. مقایسه توالی آمینواسیدی این آنزیم ها بیانگر همسانی در باقیماندههای آمینواسیدی جایگاه فعال میباشد و بررسی تفاوت ها و همسانی های این خانواده آنزیمی می تواند مسیری در جهت الگوگیری با هدف طراحی آنزیمهایی با ویژگیهای عملکردی مناسب در صنعت باشد (23).آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز آنزیمی هوموتترامر میباشد که از دو دایمر تشکیل شده است. دایمرها از جفت شدن پیوندهای هیدروژنی بین مولکولی تشکیل میشود که 3 باقیمانده Val133 تا Pro135 در تشکیل این پیوند هیدروژنی نقش دارند. هر زیرواحد 2 دومین (-Nترمینال و -C ترمینال) دارد. -Nترمینال شامل آمینواسیدهای 1تا 149 بوده که در انتهای پایانی آن از گلایسین 130 تا تریپتوفان 139 لوپ بلندی تشکیل میشود که باعث نزدیکی زیرواحدها در تترامر می شود. جایگاه فعال آنزیم در حفره ای بین دومین -C ترمینال قرار دارد (22).نتایج تعیین توالی و بیان ژن آنزیم مورد مطالعه، بیانگر یک توالی 915 جفت بازی (آنزیمی با 304 باقیمانده آمینواسیدی) و تک باند پروتئینی با وزن مولکولی 34 کیلو دالتون بود. آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز 34 کیلو دالتونی مورد مطالعه در دمای˚C 25، pH بهینه برابر با 2/7 و غلظت بهینه سوبسترا 032/0 بیشترین فعالیت را از خود نشان داده است. در مطالعهای که توسط Junca و همکاران انجام گرفت آنزیم کتکول 2و3 دیاکسیژناز را در Pseudomonas putida mt-2 مطالعه و گزارش کردند که باقیماندههای به شدت حفظ شده His199 و Tyr 255 در جایگاههای فعال آنزیم میباشد (12). نتایج تطبیق توالی با سرور ESPript3 نیز بیانگر این جایگاههای حفظ شده در آنزیم مورد مطالعه میباشد. همچنین مطالعه Juncaنشان داد که برخی اسیدهایآمینه نتیجه مستقیم بر فعالیت آنزیم ندارند و اکوسیستم بهترین و تکاملیافتهترین نوع را درطبیعت انتخاب کرده است. با بررسیهای ساختاری و توالی آنزیم Pseudomonas putida mt-2 مشخص شد در جایگاه 201 باقیمانده والین و در جایگاه 254 باقیمانده لوسین قرار دارد که در مورد آنزیم مورد مطالعه ما نیز در این جایگاهها به ترتیب لوسین و والین قرار گرفته است و با توجه به اینکه ساختارهای حد واسط تشکیل شده بین سوبسترا-آنزیم و میانکنشهای مولکولی که صورت میگیرد کاهش و افزایش یک گروه متیل در میزان فعالیت آنزیم و احتمالا اختصاصیت سوبسترایی تغییر ایجاد کند. نتایج بدست آمده در زمینه اختصاصیت سوبسترایی آنزیم در میان سوبستراهای مختلف کتکول، پیروگالول و فنول نشان داد که کتکول سوبسترای مطلوبتری برای آنزیم میباشد که احتمالاً به دلایل ساختار کتکول و میانکنشهای تشکیل شده بین سوبسترا-آنزیم باعث اتصال بهتر آن در جایگاه فعال آنزیم میشود. فعالیت 80 درصدی آنزیم در حضور سوبسترای فنول بهعلت کمتر بودن یک گروه هیدروکسیل نسبت به کتکول قابل توجیه میباشد. مطالعات انجام گرفته بر روی آنزیم 1MPY نیز بیانگر این میباشد که جایگاه فعال آنزیم شامل آمینواسیدهای هیدروفوبیک: Val180 ،Val188 ،Ala189 ،Ile 204 Leu298 ،Phe302 ، Met 303 میباشد. که باقیمانده Phe302 و Met303 به واسطه زنجیره جانبی غیر قطبیشان در ناحیه باز صفحه بتا واقع در دومین-C ترمینال باعث پوششدهی و باریک شدن آن ناحیه شده و در نهایت باعث اختصاصی شدن آنزیم به سوبسترای کتکول می شود (2). در آنزیم مورد مطالعه ما نیز در جایگاههای 303 و 189 به ترتیب آمینو اسید سرین و گلایسین قرار گرفته است که احتمالا این جایگزینی در مورد جایگاه 303 می تواند با اضافه شدن یک گروه هیدروکسیلی (سرین) و کوتاه شدن زنجیره جانبی، در اختصاصیت سوبسترایی و سرعت واکنش تغییراتی ایجاد کند. این بررسیها ضرورت اهمیت و مطالعه بر روی آنزیم کتکول 2و3 دی اکسیژناز را بیشتر میکند.تقدیر و تشکراین مقاله از محل پایان نامه خانم ثریا محمد زاده دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی دانشگاه زنجان و با حمایت معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه زنجان انجام شده است.