بهینه سازی  فرآیند زی تبدیلی ال تیروزین به ال دوپا توسط سویه جدید باکتری Paenibacillus sp. strain CT4W با استفاده از روش های تک عاملی و تاگوچی

مراحم آشنگرف^1*، مینا صیادی¹ و محمد مجدی²

¹ ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده علوم پایه، گروه علوم زیستی

² ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 26/05/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

ال-دوپا (3و 4 دی هیدروکسی فنیل ال-آلانین) از زمان ورود آن در ۱۹۶۰، به عنوان داروی طلایی برای درمان بیماری پارکینسون تشخیص داده شده است. در این مطالعه برای نخستین بار پتانسیل سویه جدید باکتریPaenibacillus sp. CT4W با قابلیت تبدیل زیستی ال-تیروزین به ال-دوپا بررسی شد. بهینه سازی پارامترهای موثر بر فرآیند زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا، تحت استراتژی سلول در حال استراحت، توسط روش­های تک عاملی و طراحی تاگوچی انجام شد. براساس نتایج بدست آمده از بهینه سازی به روش تک عاملی، بهترین شرایط برای زی تبدیلی عبارت است از توده زیستی در غلظت 6 گرم در لیتر، یون مس در غلظت 045/0 گرم در لیتر، دمای 30 درجه سیلسیوس، pH برابر 7، دور شیکر  150 و عصاره مخمر در غلظت 1 گرم در لیتر بعنوان سوبسترای کمکی. تحت شرایط بهینه شده فوق غلظت ال-دوپای بدست آمده پس از 16 ساعت گرماگذاری 29/0 گرم در لیتر است. در ادامه از آرایه متعامد L18 طراحی تاگوچی برای بهینه سازی فرآیند استفاده شد. براساس نتایج بدست آمده، بهترین شرایط برای زی تبدیلی عبارت است از ال-تیروزرین در غلظت 5/1 گرم در لیتر، توده زیستی در غلظت 5 گرم در لیتر و یون مس در غلظت 03/0 گرم در لیتر. تحت شرایط بهینه شده فوق غلظت ال-دوپای بدست آمده پس از 20 ساعت گرماگذاری 96/0 گرم در لیتر با راندمان مولی 5/53% است.

واژه­های کلیدی: زی تبدیلی، ال-تیروزین، ال- دوپا، بهینه سازی، Paenibacillus sp. CT4W

* نویسنده مسئول، تلفن/فاکس: 33664600-087، پست الکترونیکی: m.ashengroph@uok.ac.ir

مقدمه

فرآیند زی­تبدیلی به معنای ایجاد تغییرات شیمیایی در ترکیباتی همانند اسیدهای آمینه، توکسین­ها، زنوبیوتیک­ها و داروها بوسیله موجودات زنده برای تولید مولکول­های فعال از لحاظ زیستی می­باشد. آنزیمها کاتالیزگر واکنش­های زی­تبدیلی هستند. آنزیم تیروزیناز (مونوفنول، دی هیدروکسی فنیل آلانین: اکسیژن اکسیدو ردوکتاز) با EC نامبر ۱.۱۴.۱۸.۱ جزو گروه سه از پروتئین های مس دار می باشد که نقش مهمی در فرآیند بیوسنتز ملانین نیز ایفا می کند. یکی از مهمترین کاربردهای این آنزیم، زی تبدیلی اسید آمینه­ی  ال-تیروزین  به ملکول فعال زیستی ال-دوپا می باشد (22). ال-دوپا یک آنالوگ آمینواسیدی و پیش ساز دوپامین است که یکی از پرکاربردترین داروها جهت درمان پارکینسون می باشد. پارکینسون در واقع یک نوع اختلال تحلیل برنده مرتبط با پایین آمدن سطح دوپامین در مغز بوده که منجر به عوارضی همچون سفتی عضلانی، رعشه حرکتی، کند شدن توانایی تکلم و نهایتا جنون خواهد شد. مصرف مستقیم دوپامین توسط بیمار در فرایند بهبود بیماری بی تاثیر بوده چراکه دوپامین توانایی عبور از سد خونی مغزی را ندارد (4). میزان شیوع بیماری پارکینسون در غرب قاره اروپا به میزان ۱۰۰۰۰۰/۱۶۰ نفر میرسد که ۴٪ ازاین میزان را افراد بالای ۸۰ سال دربرمی گیرند (16). همچنین در ایالات متحده آمریکا به تنهایی، بیش از یک میلیون بیمار مبتلا به پارکینسون گزارش شده که سالانه چیزی حدود ۶/۵ بیلیون دلار هزینه دارند. بنابراین درمانهای متفاوتی برای این بیماری توسعه یافته و از این میان ال-دوپا به عنوان موثرترین دارو مورد توجه قرار گرفته است (21). فرایند سنتز شیمیایی ال-دوپا برای مصارف دارویی، چند مرحله ای بوده که درنتیجه فرایند مذکور زمانبر، نامناسب برای محیط زیست و همچنین غیراقتصادی می باشد. این در حالی است که تولید بیوتکنولوژیک ال-دوپا یک فرایند دوست دار محیط زیست بوده و در شرایط نسبتا آسانتری قابل انجام است. همچنین قابل ذکر است که فرایند زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا صرفا شامل یک مرحله اکسیداسیون توسط آنزیم تیروزیناز می باشد (5). ال-دوپای تولیدی در نهایت در بدن و مغز توسط آنزیم ال-آرماتیک آمینواسید دکربوکسیلاز به دوپامین تبدیل خواهد شد (4 و 22). زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا برای اولین بار در قارچ خوراکی Agaricus bisporus گزارش شد (14). سنتز میکروبی ال-دوپا توسط گونه های مختلف باکتریایی و قارچی از جمله Erwinia herbicola  (17)، Aspergillus oryzae  (6)، Yarrowia lipolytica  (7)،  Acremonium rutilum (18)،  Bacillus sp.      (23)، Aspergillus niger  (8) و Halobacillus sp. SL-7 (2) گزارش شده است. روش های طراحی آزمایش، ما را در رسیدن به تولید بهینه متابولیت های صنعتی و بهبود فرآیندهای زی تبدیلی یاری می نماید. روش آماری تاگوچی به­عنوان یک روش قدرتمند طراحی آزمایش، امکان بررسی متغیرهای مؤثر‏ بر فرآیند و بررسی میان کنش فاکتورهای مختلف را  با انجام تعداد کمی آزمایش فراهم می‏کند (3). در این مطالعه، برای نخستین بار ترکیب روش های تک عاملی و طراحی تاگوچی در بهینه سازی فرآیند زیست تبدیلی ال تیروزین به ال دوپا توسط سلول در حال استراحت سویه جدید باکتری Paenibacillus sp. CT4W بصورت موفقیت آمیز استفاده شد.

مواد و روشها

جمع آوری نمونه هاو تکنیک غنی سازی: نمونه ها از مناطق مختلفی از کشور شامل نمونه های آّبی جمع آوری شده از رودخانه باهوش در استان بوشهر، آب گرم اهرم-بوشهر، قنات درنگ- بوشهر، دریای رامسر، خلیج فارس، دریای خزر، چشمه زرین آباد- بیجار، رودخانه گلستان، چشمه شفابخش بانه، چشمه کلاته، چشمه سردشت، نمونه های مختلف آب چاه کرمانشاه و همدان در ظروف پلاستیکی استریل جمع آوری شدند. این نمونه ها پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سانتی گراد تا هنگام استفاده نگهداری شدند. برای غنی سازی و جداسازی سویه های باکتری آب زی با قابلیت تجزیه کنندگی ال-تیروزین، از محیط طراحی شدهTyr-medium agar  با ترکیب زیر استفاده شد (گرم در لیتر): سولفات آهن 03/0، کلرید کلسیم 015/0، کلرید سدیم 5/01، سولفات منیزیم 2/0، دی پتاسیم هیدروژن فسفات 4، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 12، آگار 20.  به محیط مذکور به میزان 5/2 گرم در لیتر تیروزین به عنوان تنها منبع کربن و ازت اضافه شد. محیط های کشت مذکور به مدت 24 تا 48 ساعت در شرایط دمایی 25 درجه سانتی گراد گرماگذاری گردید (2).

زی تبدیلی ال تیروزین به ال دوپا تحت واکنش سلول­های رویشی: سویه­های باکتریایی با قابلیت تجزیه کنندگی ال- تیروزین، در محیط تریپتیک سوی براث (TSB) به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس اسید آمینه ال- تیروزین، پس از فیلتراسیون از طریق پالایه های غشایی میلی پور22/0 میکرونی، در غلطت نهایی 5/2 گرم در لیتر به محیط افزوده شدند. پس از طی 24 ساعت گرمخانه گذاری اضافی، ابتدا کل مایع رویی از توده سلولی با استفاده از سانتریفیوژ (×g5000 به مدت 20 دقیقه) جدا گردید. در ادامه، میزان ال تیروزین مصرف شده و ال دوپای تولید شده در مخلوط واکنش زی تبدیلی، از روش اسپکتروفتومتری براساس روش پیشنهادی Rani و همکاران (2007) سنجش شد (21).

شناسایی فنوتیپی و ملکولی سویه باکتریCT4W: سویه باکتری CT4W که براساس آنالیزهای اسپکتروفتومتری بیشترین تولید ال-دوپا را در بین سویه های باکتری آب­زی غربالگری شده داشت را انتخاب و مورد شناسایی ریخت شناسی، بیوشیمیایی و فیلوژنتیک قرار گرفت. شناسایی اولیه سویه مذکور براساس تست های اولیه شامل شکل ظاهری، رنگ آمیزی گرم، آزمایش اکسیداز، آزمایش کاتالاز و تست حرکت انجام گرفت. شناسایی بیشتر براساس مطالعات فیزیولوژیک و انجام تست های بیوشیمیایی متعدد شامل رشد در دماهای مختلف، تست احیای نیترات، ذوب ژلاتین، هیدرولیزنشاسته، هیدرولیز کازئین، تست متیل رد/وژپروسکوئر، تولید اسید از منابع کربوهبدراتی و طبق دستورالعمل  کتاب "طبقه بندی سیستماتیک باکتری شناسی برجی" انجام شد (12). به منظور شناسایی ملکولی سویه CT4W از پرایمرهای همگانی ژن S rDNA 16، fd1 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) و rp2 (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) استفاده شد (26). واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در دستگاه ترموسایکلر مدل BIO RAD T100 با حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی پنج میکرولیتر مسترمیکس، یک میکرولیتر از هر پرایمر رفت و برگشت، یک میکرولیتر DNA الگو و 6/5 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه سترون انجام شد. چرخه حرارتی به صورت یک مرحله واسرشت سازی اولیه به مدت دو دقیقه در دمای 95 درجه سیلسیوس شروع و در ادامه بصورت 30 چرخه شامل واسرشت سازی در دمای 94 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه، اتصال پرایمر در دمای 52 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه و بسط در دمای 72 درجه سیلسیوس به مدت دو دقیقه و بسط نهایی در دمای 72 درجه سیلسیوس به مدت پنج دقیقه در نظر گرفته شد. توالی یابی محصول  PCR توسط ABI3730xl DNA sequencer  شرکت ماکروژن کره جنوبی انجام شد و توالی­های دریافتی توسط نرم افزار BioEdit ورژن7.0.5.3 ویرایش و با توالی­های موجود در بانک ژن با استفاده از ابزار جستجوی همردیفی (BLAST) مقایسه گردید. ترسیم درخت فیلوژنیک بر پایه روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار MEGA.7 انجام شد (19).

بهینه سازی تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در سویه CT4W تحت سلول های در حال استراحت: بعد از شناسایی فنوتیپی و مولکولی سویه جدا شده، به منظور بهبود راندمان تولید ال-دوپا، اثر چندین پارامتر در مخلوط واکنش زی تبدیلی تحت استراتژی سلول در حال استراحت مورد بررسی و بهینه سازی قرار گرفت. به منظور تهیه سلول­های در حال استراحت باکتری آب زی بومی و استفاده از آنها به­عنوان بیوکاتالیزگر در آزمایشات زیست تبدیلی، سلول­های باکتری در محیط آبگوشتی TSB در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور شیکر rpm 150 به مدت 24 ساعت (تا رسیدن به انتهای فاز رشد لگاریتمی) کشت داده شدند. سپس توده سلولی به کمک سانتریفیوژ برداشت و پس از شستشوی سلول ها در بافر فسفات، از سلول­های برداشت شده به­عنوان کاتالیزگر در آزمایشات زیست تبدیلی استفاده شد (20). با هدف بهبود بیوترانسفورماسیون ال-تیروزین به ال-دوپا تحت سلول­های در حال استراحت سویه مذکور، دو مرحله بهینه سازی با استفاده از روش تک فاکتوری و روش آماری تاگوچی انجام شد. با استفاده از روش تک فاکتوری تاثیر فاکتورهای مختلف شامل غلظت های مختلف بیومس سلولی (بر حسب وزن خشک)، غلظت های مختلف یون مس، اثر منابع کربن و ازت کمکی، دماهای مختلف، دور شیکرهای متفاوت و اثرات pH برروی زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در محیط بافری فسفات (K₂HPO₄/KH₂PO₄, 100 mM ) حاوی 5/0 گرم در لیتر سوبسترای ال-تیروزین مطالعه گردید. از روش طراحی تاگوچی جهت ارزیابی اثر چهار متغیر مستقل شامل غلظت ال-تیروزین، غلظت توده زیستی، غلظت یون مس و غلظت عصاره مخمر بر زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا توسط سلول های در حال استراحت سویه CT4W استفاده شد. برای متغیرهای مذکور آرایه متعامد L16 طراحی شد. آزمایش ها سه بار تکرار و میانگین مقادیر آنها به­صورت نتایج نهایی به کمک نرم افزار Qualitek-4 مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و در نهایت شرایط بهینه واکنش تخمین زده شد.

تایید ساختاری ال-دوپای تشکیل شده در مخلوط واکنش بیوترانسفورماسیون: ال دوپای تولید شده در مخلوط واکنش های زی تبدیلی، ابتدا استخراج و سپس از تکنیک کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، تحت شرایط کروماتوگرافی کلروفرم، بوتانول و آب با نسبت 3: 2: 1 بعنوان فاز متحرک (21)، تخلیص شد. شناسایی ال-دوپای تخلیص شده از طریق اسپکتروسکوپی جرمی مدل line-high: 90% > platform ساخت شرکت Micromass کشور انگلستان انجام شد.

نتایج

جداسازی و شناسایی سویه­های باکتری تجزیه کننده ی تیروزین با قابلیت زیست تبدیلی به ال-دوپا: هدف از انجام این مطالعه عبارت بود از جداسازی و تشخیص سویه های باکتری تجزیه کننده ی تیروزین با توان بالقوه زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا بود. در این راستا، 12 سویه باکتری با قابلیت استفاده از ال-تیروزین به عنوان تنها منبع کربن و ازت، در محیط کشت آبگوشتی TSB به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس سوبسترای ال-تیروزین در غلظت نهایی 5/2 گرم در لیتر به محیط زیست تبدیلی افزوده شد. بعد از 48 ساعت واکنش زی تبدیلی تحت سلول­های رویشی، مورد آنالیز کمی اسپکتروفتومتری قرار گرفتند که براساس نتایج بدست آمده، از میان سویه­های باکتری مذکور، سلول­های رویشی سویه CT4W بالاترین میزان تولید ال-دوپا (28/0گرم در لیتر) در حضور 5/2 گرم در لیتر سوبسترای ال-تیروزین را نشان داد. سویه CT4W که براساس آنالیز کمی اسپکتروفتومتری دارای بیشترین میزان ال-دوپای تشکیل شده در واکنش زی تبدیلی بود انتخاب و براساس ویژگی­های ریخت شناسی و کشتی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک مورد شناسایی قرار گرفت. سویه باکتری مذکور با سیل گرم مثبت، متحرک، کاتاز و اکسیداز مثبت بود. این سویه از نظر هیدرولیز نشاسته مثبت و از نظر تست های وژپروسکوئر، احیای نیترات، هیدرولیز کازئین و هیدرولیز ژلاتین منفی بود. از نظر رشد در دماهای مختلف سویه مذکور قابلیت رشد در دمای 4 تا 35 درجه سانتی گراد را دارا بود. همچنین از نطر تخمبر منابع قندی تست های مرتبط با تولید اسید از گلوکز، مانیتول و مانوز مثبت و از نظر تولید اسید از فروکتوز و مانیتول منفی بود. براساس خصوصیات مورفولوژیک و بیوشیمیایی و بر طبق کتاب­های مرجع و مقالات منتشره در این ارتباط، سویه CT4W به طور موقت به­عنوان Paenibacillus تشخیص داده شد. براساس نتایج حاصل از همردیفی این سویه دارای بیش از 97 درصد مشابهت با سویه های متعلق به Paenibacillus antarcticus  می باشد. بعد از تعیین توالی ژن 16S rDNA، این ژن در بانک ژنی با شماره دسترسی KX507264 ثبت شد. تجزیه و تحلیل­های فیلوژنیکی نیز تائید کرد که سویه­ی مورد نظر به جنس Paenibacillus  تعلق دارد و علاوه بر این احتمالا می تواند بطور  می­تواند به عنوان سویه­ی Paenibacillus antarcticus  از طبقه بندی شود. ترسیم درخت فیلوژنی که بر اساس آنالیزهای توالی ژن S rDNA16 به روش neighbor-joining بدست آمده است، موقعیت سویه­ی CT4W در جنس Paenibacillus  آمده است (شکل 1).

شکل 1- درخت فیلوژنی سویه­ی CT4W و دیگر اعضای جنس Paenibacillus  بر اساس ژن تکتیریافته­ی S rDNA16 با استفاده از روش neighbor-joining و نرم افزار MEGA. 7. شماره دسترسی سویه های ثبت شده در پرانتز آورده شده است.

نتایج بهینه سازی زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در باکتریsp. CT4W Paenibacillus   با استفاده از روش­های تک فاکتوری و تاگوچی: براساس نتایج بدست آمده از بهینه سازی به روش تک فاکتوری، بیشترین میزان تولید ال-دوپا در غلظت 6 گرم در لیتر توده­ی سلولی، غلظت یون مس 045/0 گرم در لیتر مشاهده شد. از بین منابع کربنی و ازتی استفاده شده بیشترین میزان تولید ال- دوپا در حضور عصاره مخمر مشاهده شد. میزان تولید ال-دوپا در دماها ، pH ها و دور شیکر متفاوت هم سنجیده شد. بیشترین تولید ال-دوپا در دمای 30 درجه، pH برابر 7 و دور شیکر rpm 150 مشاهده شد (شکل 2).

در ادامه و با هدف بهبود بیوترانسفورماسیون ال-تیروزین به ال-دوپا، اثرات دوره­ی انکوباسیون تحت شرایط بهینه شده در مخلوط واکنش زی تبدیلی مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 3). براساس نتایج بدست آمده، تحت شرایط بهینه شده بالا، 29/0گرم در لیتر ال-دوپا از 5/0 گرم در لیتر ال-تیروزین پس از 16 ساعت واکنش زی تبدیلی تولید شده است. راندمان مولی تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در فرآیند فوق 3/53 درصد بوده است.

براساس نتایج بدست آمده از بهینه سازی مرحله اول، بهترین ترکیب فاکتورها برای تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در باکتری sp. CT4W  Paenibacillus عبارتند از: بیومس سلول در غلظت 6 گرم در لیتر، یون مس در غلظت 045/0 گرم در لیتر، عصاره مخمر در غلظت 1 گرم در لیتر، دمای 30 درجه سانتی گراد، pH برابر 7 و دور شیکر rpm 150.

شکل 2- اثرات پارامترهای مختلف بر روی تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در باکتری sp. CT4W Paenibacillus   در محیط بافری فسفات حاوی 5/0 گرم در لیتر ال-دوپا تحت شرایط سلول­های در حال استراحت. نتایج ارائه شده میانگین سه بار آزمایش بوده و بار1± معرف انحراف معیار است.

شکل 3- بیوترانسفورماسیون ال-تیروزین به ال-دوپا بوسیله سلول­های  در حال استراحت sp. CT4W Paenibacillus   تحت شرایط بهینه شده توسط روش تک فاکتوری. نتایج ارائه شده میانگین سه بار آزمایش و بار1± معرف انحراف معیار است. نمودار مربع مربوط به ال تیروزین مصرف شده و نمودار دایره مربوط به ال دوپای تشکیل شده در مخلوط واکنش زی تبدیلی است.

پس از انتخاب بهترین ترکیب فاکتورها، بهینه سازی مرحله دوم بوسیله روش تاگوچی انجام شد. در این راستا، غلظت ال-تیروزین (5/0، 1، 5/1 و 2 گرم در لیتر)، غلظت یون مس (01/0، 02/0، 03/0 و 04/0 گرم در لیتر)، غلطت عصاره مخمر (5/0، 1، 5/1 و 2 گرم در لیتر) و غلطت بیومس سلول (5/2، 5، 5/7 و 10 گرم در لیتر) به عنوان فاکتورهای موثر بر روی تولید ال-دوپا تحت شرایط سلولهای در حال استراحت در نظر و در چهار سطح در نظر گرفته شدند. لازم به ذکر است که تمامی آزمایشات تحت شرایط دمایی 30 درجه سانتی گراد، pH برابر 7 و دور شیکر بهینه شده rpm 150 و  مدت زمان انکوباسیون 24 ساعت انجام شده است. با توجه به تعداد فاکتورها، سطوح و تاثیر متقابل دوتایی بین فاکتورها، درجه آزادی برابر 15 می باشد که لزوم انتخاب آرایه متعامد L16 (انجام 16 آزمایش مختلف) را به عنوان یک آرایه استاندارد ایجاب می کند (جدول 1). در جدول فوق غلظت های ال-دوپای تولیدی در 16 آزمایش مختلف اجرا شده ارائه شده است. نتایج نشان داد که مقدار ال-دوپا در مخلوط واکنش زیست تبدیلی براساس اثر ترکیبی فاکتورهای انتخاب شده در محدوده بین 11/0 تا 68/0  گرم در لیتر می باشد.

جدول 1- آرایه متعامد L16

اثر اصلی هر یک از فاکتورهای فردی بر روی تولید ال-دوپا در شکل (4) نشان داده شده است. همانگونه که مشاهده می شود مقادیر بالاتری از ال-دوپا در سطوح سه مس و ال-تیروزین و همچنین درسطح دو بیومس مشاهده شده است. سطح مناسب برای عصاره مخمرسطح یک می باشد. در واقع با بررسی اثرات اصلی هر کدام از پارامترهای مورد مطالعه می توان روند کلی تاثیر فاکتورها را بر روی فرآیند مورد نظر تمایز داد (3).

شکل 4- اثر فاکتورهای فردی در سطوح محتلف بر روی زیست تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در سویه باکتری آب زی
 sp. CT4W Paenibacillus  

با استفاده از روش تاگوچی می توان اینترکشن بین دو فاکتور مختلف را بررسی نمود که نتایج در جدول (2) ارائه شده است. در واقع با مطالعه اینترکشن­ها می توان نتیجه گرفت که تولید یک محصول خاص، بر حسب اینترکشن بین فاکتورها متفاوت بوده و تاثیر یک فاکتور متاثر از سطح فاکتور دیگری است. همانگونه که در جدول (2) مشاهده می شود در مجموع 6 اینترکشن مشاهده شده که بالاترین میزان اینترکشن (22/41 درصد) بین مس و بیومس سلول است و کمترین اینترکشن (89/7 درصد) بین بیومس سلول و تیروزین است که خود نشان دهنده­ی این است که اثر یک فاکتور روی تولید ال-دوپا کاملا وابسته به شرایط فاکتورهای دیگر در فرآیند بهینه سازی تولید ال-دوپا می باشد.

جدول 2- 6 اینترکشن تخمین زده شده بوسیله نرم افزار Qualitek-4

                     ^aSI (severity index) : شاخص شدت اینترکشن برای پارامترهای مختلف

                      ^bOpt: نشان دهنده سطوح مطالوب فاکتورها برای شرایط بهینه سازی

برای تجزیه و تحلیل آماری داده ها از روش تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) استفاده شد که نتایج در جدول (3) ارائه شده است. همانگونه که در جدول مشاهده می شود غلظت اولیه ال-تیروزین، غلظت اولیه یون مس و بیومس سلول دارای بیشترین تاثیر بر تولید ال-دوپا بوده اند و در مقابل کمترین تاثیر را عصاره مخمر داشته است. نتایج جدول ANOVA بصورت 2 قسمتی قبل از عمل pooling و بعد از عمل pooling) نشان داده شده که دلایل آن در زیر توضیح داده شده است. اساسا پس از تشکیل جدول ANOVA و انجام آزمون معنی داری باید واریانس خطاء انجام بگیرد که این عمل در روش تاگوچی با استفاده از تکنیک pooling انجام می شود (3و 9). در این روش فاکتورهایی که تاثیر ناچیز دارند بعنوان منبع خطاء در نظر گرفته می شوند. برای این منظور به ستونهای S  یا P در جدول ANOVA مراجعه نموده و عواملی را که دارای کمتر از 10درصد تاثیر داشته باشند، pool  می شوند (لازم به ذکر است که در برخی پروسه های صنعتی این مقدار متفاوت است). پس از مرحله pooling ، جدول ANOVA اصلاح شده و فاصله اطمینان محاسبه شده و در صورتی که فاصله اطمینان محاسبه شده از فاصله مطلوب کوچکتر شود، عمل pooling ادامه پیدا کرده و در غیر اینصورت متوقف می شود. بدین ترتیب فاکتورهایی که pool نشده باشند به عنوان فاکتورهای با تاثیر معناداری معرفی می شوند. در ارتباط با آزمایش فوق، قبل از عمل pooling فاصله اطمینان فاکتورهای ال-تیروزین، مس و بیومس سلول که بیشترین تاثیر پذیری را داشتند به ترتیب 8/96 درصد، 3/97 درصد و 6/96 درصد بودند. سایر فاکتورها زیر 95 درصد بودند. به دنبال عمل pooling و حذف عصاره مخمر که دارای کمترین تاثیرپذیری بودند، فاصله اطمینان برای فاکتورهای ذکر شده در بالا به ترتیب به 6/99 درصد، 2/99 درصد و 8/98 درصد افزایش یافته است (جدول 3).

برای تعیین شرایط بهینه از آنالیز Bigger to Better استفاده شد. سطح مطلوب، میزان تاثیرپذیری و همچنین بیشترین میزان ال-دوپا تولیدی پیش بینی شده تحت شرایط بهینه در جدول (4) نشان داده شده است. همانگونه که در جدول مشاهده می شود فاکتورهایی مانند بیومس سلول، ال-تیروزین و یون Cu⁺² نسبت به دیگر فاکتورها دارای تاثیرپذیری بیشتر در زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا بوده اند. مقدار ال-دوپا پیش بینی شده تحت شرایط بهینه حدود 732/0 گرم در لیتر بوده است.

جدول 3- نتایج ANOVA (قبل و بعد از تکنیک pooling)

جدول 4- شرایط بهینه و مقدار وانیلین تولیدی پیش بینی شده توسط نرم افزار Qualitek-4

contribution from all factors: 0.358

Current grand average of performance: 0.373

Expected result at optimum condition: 0.732

برای انجام آزمایش تاییدی میزان ال-دوپای تولیدی پیش بینی شده تحت شرایط بهینه، با میزان ال-دوپای بدست آمده در شرایط آزمایش با یکدیگر مقایسه می شود و چنانچه در فاصله مطلوب قرار گیرد طراحی آزمایش درست و بهینه سازی به پایان می رسد. به همین دلیل آزمایشی با استفاده از سلول های در حال استراحت سویه باکتری مذکور در محیط بافری فسفات (100 میلی مولار) و براساس ترکیب سطح بهینه متغیرهای بدست آمده در جدول (4) انجام و میزان ال-دوپای بدست آمده ارزیابی شد. براساس نتایج بدست آمده، میزان ال-دوپای تولیدی بدست آمده (728/0 گرم در لیتر) با میزان ال-دوپای تولیدی پیش بینی شده (732/0 گرم در لیتر) در فاصله مطلوب قرار گرفته است.  در ادامه و با هدف بهبود واکنش زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا، اثرات دوره ی گرماگذاری تحت شرایط بهینه شده از طریق روش تاگوچی در مخلوط واکنش زی تبدیلی مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 5). براساس نتایج بدست آمده، تحت شرایط بهینه شده بالا، 96/0گرم در لیتر ال-دوپا از 5/1 گرم در لیتر ال-تیروزین پس از 20 ساعت واکنش زی تبدیلی تولید شده است. راندمان مولی تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در فرآیند فوق 5/53 درصد بوده است.

شکل 5- زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا بوسیله سلول­های در حال استراحت sp. CT4W Paenibacillus   تحت شرایط بهینه شده توسط روش آماری تاگوچی. نتایج ارائه شده میانگین سه بار آزمایش و بار1± معرف انحراف معیار است. نمودار مربع مربوط به ال تیروزین مصرف شده و نمودار دایره مربوط به ال دوپای تشکیل شده در مخلوط واکنش زی تبدیلی است.

در نهایت، ال-دوپای تولید شده در مخلوط واکنش زی تبدیلی، پس از استخراج و تخلیص از طریق TLC ، مورد آنالیز اسپکتروسکوپی جرمی قرار گرفت (شکل 6). براساس نتایج طیف سنجی جرمی، وزن ملکولی ال-دوپای بدست آمده 197 گرم بر مول (m/z=197) بود که نمایانگر سنتز موفقیت آمیز ال-دوپا در واکنش زی تبدیلی است.

شکل 6- آنالیز اسپکتروسکوپی جرمی ال-دوپای سنتز شده در واکنش زی تبدیلی توسط سویه ی باکتری sp. CT4W Paenibacillus   

بحث و نتیجه گیری

در این پژوهش، جداسازی و شناسایی سویه های باکتری آبزی بومی با پتانسیل زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا مورد مطالعه قرار گرفت. میکروارگانیسم‌های ساکن در زیست‌گاه‌های دریایی نسبت به انواع خشکی­زی ازنظر خصوصیات فیزیولوژیک و تنوع متابولیکی متفاوت بوده و به‌طورمعمول توانمندی بالایی در تولید فرآورده‌های فعال زیستی دارند. با توجه به سازگاری طولانی‌مدت میکروارگانیسم‌های ساکن در زیست‌گاه دریایی با شرایط سخت محیطی ازنظر دما، pH، فشار، غلظت‌های مختلف نمک و عناصر کمیاب، کاندید‌های مناسب به‌عنوان کاتالیزور‌های مبتنی بر شیمی سبز محسوب می‌شوند. از میکروب‌های دریازی می‌‌توان به‌صورت طبیعی و بدون نیاز به دست‌کاری ژنتیکی برای این فرآیند بهره جست (11). در این راستا در بخش نخست این تحقیق، در طی یک برنامه غربالگری با هدف جداسازی انواع سویه های باکتری آب زی با قایلیت تجزیه کنندگی ال-دوپا و پتانسیل آنها برای مصرف ال-تیروزین به عنوان تنها منبع کربن و ازت، 12 سویه باکتری غربال گری شد که براساس نتایج بدست آمده از آنالیزهای کمی اسپکتروفتومتری، سلول های رویشی سویه باکتری CT4W Paenibacillus sp. strain (جدا شده از یک نمونه آب جمع آوری شده از سواحل بوشهر) ، به عنوان سویه برتر در تولید ال-دوپا انتخاب شد. در ادامه این تحقیق با هدف افزایش راندمان واکنش زی تبدلی و جلوگیری از تجزیه بیشتر متابولیت های تولیدی (ال-دوپا) میزان ال-دوپای تولید شده تحت شرایط سلولهای در حال استراحت در سویه مذکور سنجش شد. محققان زیادی از این استراتژی برای بهبود فرآیندهای زی تبدیلی استفاده نموده اند (1، 10 و 20 ). براساس نتایج بدست آمده چهار فاکتور شامل ال-تیروزین، یون مس، عصاره مخمر و بیومس سلول دارای بیشترین تاثیرپذیری بودند که موید فعالیت بیشتر آنزیم مسئول فرآیند زیست تبدیلی مربوطه (آنزیم تیروزیناز) در این شرایط می باشد. فاکتورهای مذکور بعنوان فاکتورهای تاثیرگذار انتخاب شده و در طی بهینه سازی مرحله دوم از روش آماری تاگوچی جهت یافتن ترکیب بهینه فاکتورهای مذکور استفاده شد. روش آماری تاگوچی یکی از پرکاربردترین روش‌های فاکتوریل جزئی می‌باشد. در این روش تعدادی از ترکیب‌های ممکن بین فاکتورها انتخاب می‌شوند و پس از انجام شدن آزمایش با ارزیابی آماری پاسخ‌های به‌دست‌آمده بهترین وضعیت که ممکن است در بین حالت‌های آزمایش‌شده موجود نباشد، عنوان شرایط بهینه تعیین می‌گردد. از مزیت‌های این روش، بررسی تأثیر عوامل چندگانه و مستقل مؤثر در آزمایش، بررسی اینترکشن های احتمالی بین فاکتورها و کاهش تعداد آزمایش‌ها در مقیاس آزمایشگاهی‌ و صنعتی است (9). برای انجام آزمایشات چهار فاکتور ال-تیروزین، یون مس، عصاره مخمر و بیومس سلول انتخاب و از طرح آزمایش تاگوچی L16 برای مطالعه فاکتورها و تعاملات بین آنها استفاده شد. براساس نتایج بدست آمده عوامل با تاثیر معنی داری بر زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا به ترتیب اهمیت یون مس، غلظت اولیه سوبسترای ال-تیروزین و بیومس ورودی تعیین شدند.. تحت شرایط بهینه در سطوح انتخاب شده این فاکتورها، ماکزیمم غلظت ال-دوپا در سطح معنی داری 5% (p< 0.05) 728/0گرم درلیتر تخمین زده شده است. نتایج نشان داد که طراحی تاگوچی ابزاری قدرتمند برای بهینه سازی و بهبود زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در سویه مورد مطالعه بوده چرا که در مرحله اول بهینه سازی به روش تک فاکتوری علیرغم تعدد آزمایشات، بیشترین میزان ال-دوپای تولیدی 29/0گرم درلیتر بوده که پس از بهینه سازی انجام شده با روش تاگوچی این میزان به 728/0 گرم درلیتر افزایش یافته است. پس از مشخص شدن ترکیب بهینه فاکتورها وسیله روش تاگوچی، با هدف افزایش غلظت ال-دوپا تولیدی در مخلوط واکنش زی تبدیلی اثر دوره گرماگذاری بررسی شد. براساس نتایج بدست آمده، تحت شرایط بهینه شده بالا، 96/0گرم در لیتر ال-دوپا از 5/1 گرم در لیتر ال-تیروزین پس از 20 ساعت واکنش زی تبدیلی تولید شده است. راندمان مولی تولید ال-دوپا از ال-تیروزین در فرآیند فوق 5/53 درصد بوده است. از آنجایی که بیوتکنولوژیست­ها همواره به دنبال روش­هایی هستند که با صرف کمترین هزینه اقتصادی و در کمترین زمان، بیشترین راندمان را بدست آورند، لذا تلاش­های زیادی صورت گرفته است تا به کمک فرآیندهای بهینه سازی (بهبود شرایط محیطی و تغذیه­ای) بتوان راندمان زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا توسط میکرواورگانیسم­ها را بهبود بخشید. امروزه برای صرف­جویی در زمان و هزینه­های پژوهشی، دانشمندان علم بیوتکنولوژی از یکسری روش­های آماری در فرآیندهای بهینه­سازی استفاده می­کنند. روش پاسخ سطحی (25)، فاکتوریل کامل (17 و 24)، طراحی پلاکت-بورمن (8) و روش آماری تاگوچی (که در مطالعه­ی اخیر از آن استفاده شده است) برخی از روش­های آماری مورد استفاده در بهینه سازی فرآیندهای زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا می­باشند. از مزایای روش­های آماری این است که با استفاده از آن­ها می­توان اثرات فاکتورهای مختلف را بصورت همزمان بررسی و برهمکنش­های احتمالی آن­ها را مورد تجزیه و تحلیل قرار داد. با مقایسه مطالعه اخیر با گزارشات منتشر شده در ارتباط با زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا (جدول 5)، می توان به راندمان های قابل قبول بدون استفاده از تکنیک های پیچیده و یا اضافه نمودن موادی که مستلزم صرف هزینه های بالای اقتصادی هستند، دست یافت.

جدول 5- مقایسه راندمان ال-دوپای بدست آمده از واکنش های زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در میکروارگانیسم­های مختلف

بنابراین استفاده از روش های بهینه سازی انجام شده در این تحقیق را می توان برای سویه های مشابه پیشنهاد نمود. لازم به توضیح است که مطالعه اخیر نخستین گزارش از زی تبدیلی ال-تیروزین به ال-دوپا در جنس باکتری Paenibacillus است.

تشکر و قدردانی

این مقاله بخشی از پایان نامه کارشناسی ارشد بوده که با حمایت دانشگاه کردستان به انجام رسیده است. نویسندگان این مقاله از تمام کسانی که در اجرای این مطالعه همکاری نموده اند، کمال قدردانی و سپاسگزاری را دارد.