پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)

تنوع باکتری‌های ریزوبیومی جدا شده از گره‌های ریبوزومی ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) با استفاده از قطعات برشی ژن 16rRNA

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه محیط زیست، دانشکده فنی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دماوند، دماوند، ایران.

2 گروه محیط زیست، دانشکده فنی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دماوند، دماوند، ایران

3 گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی، خرمشهر، ایران

4 گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز، اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم

چکیده

گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa)، از منطقه پشمینه‌زار اندیمشک و در فصل بهار سال 1398 جمع آوری شد. پس از کشت همسانه‌های هر جدایه روی محیط آگار مغذی، ویژگی‌های میکروسکپی بررسی شد. جهت بیان ژن 16S rDNA ، باکتری‌های ایزوله شده در محیط YMA در شرایط هوازی و در دمای 25-28 درجه‌ی سانتی‌گراد کشت داده شدند. پرایمرهای عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژن‌های باکتری‌های جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. ترادف‌های بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه‌ داده‌های NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند. سه سویه از ریزوسفر گیاه یونجه‌ی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد. در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی 3 سویه باکتری شناسایی شد. باکتری شماره 1 شناسایی شده گرم منفی و با ایجاد کلنی‌های کرم رنگ و برجسته، دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنی‌های قرمز رنگ و کلنی باکتری سوم جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. نتایج توالی‌یابی 16S rRNA سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری1)(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)، باکتری دوم Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2)(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲درصد) و باکتری سوم (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (درصد همپوشانی 04/96 و گپ های بازی 4 درصد) شناسایی شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Variation of rhizobium bacteria isolated from the ribosomal nodes of the root of alfalfa (Medicago sativa) plant using 16rRNA gene shear fragments

نویسندگان [English]

  • Shahrzad Golab Kesh 1
  • Ebrahim Rajabzadeh Ghatromi 3
  • Mohammad Rashno 4

1 Department of Environment, Damavand Branch, Islamic Azad University,Damavand,Iran

3 Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources of the Sea, Khormashahr University of Marine Sciences and Technology, Khormashahr, Iran.

4 Department of Immunology, Faculty of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran; Cellular and Molecular Research Center, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences Ahvaz, Iran

چکیده [English]

The alfalfa (Medicago sativa) plant was collected from the area of Andimeshk and in the spring of 2018. To express the 16S rDNA gene, the isolated bacteria were cultured in YMA environment under aerobic conditions and at a temperature of 25-28 °c. Genomic DNA localization was performed using the DNA extraction kit of SINA Gene Co. General and complete primers of sinobium bacteria were extracted from the NCBI site based on 16s rRNA gene sequences, and were used in sequencing the isolated bacteria genes in this study. The sequencing obtained by using Chromas Pro software was edited and compared using blasting software in NCBI database of three strains of alpha-alpha (Medicago sativa) were isolated and identified. The microscopic and macroscopic studies of the bacteria were identified. Bacterium 1 was identified as Gram-negative and caused by cream and embossed colonies, the second Gram-negative bacteria, with red-colored colonies and third bacterial colony isolated from the genus Alfalfa (Medicago sativa) plant. Sequencing results of 16S rRNA strains isolated from the Rhizoum species (Sequence ID = CP 021215.1) Sinorhizobium Meliloti (bacter1) (overlapping percentages 97 and game chats 2 percent), the second bacterium Sequence ID = CP-000738.1)) Sinorhizobium Medicae (bacteria 2) (the overlap percentage of 97 and 2-percent game chats) and third bacteria (Sequence ID = DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (overlapping percentages 04.96 and 4% game chats) were identified.

کلیدواژه‌ها [English]

  • diversity
  • pathogenic bacteria
  • Khak
  • alfalfa
  • 16rRNA gene

تنوع باکتری­های ریزوبیومی جدا شده از گره­های ریبوزومی ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) با استفاده از قطعات برشی ژن 16rRNA

شهرزاد گلابکش1، شهرزاد خرم نژادیان1*، ابراهیم رجب زاده قطرمی1و2 و محمد رشنو1و3و4

1 ایران، دماوند، دانشگاه آزاد اسلامی واحد دماوند، دانشکده فنی، گروه محیط زیست

2 ایران، خرمشهر، دانشگاه علوم و فنون دریایی، دانشکده منابع طبیعی دریا، گروه شیلات

3 ایران، اهواز، دانشگاه علوم پزشکی جندی­شاپور اهواز، دانشکده پزشکی، گروه ایمونولوژی

4 ایران، اهواز، دانشگاه علوم پزشکی جندی­شاپور اهواز، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 01/06/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

گیاه یونجه آلفا آلفا  (Medicago sativa)، از منطقه پشمینه­زار اندیمشک و در فصل بهار سال 1398 جمع آوری شد. پس از کشت همسانه­های هر جدایه روی محیط آگار مغذی، ویژگی­های میکروسکپی بررسی شد. جهت بیان ژن 16S rDNA ، باکتری­های ایزوله شده در محیط YMA در شرایط هوازی و در دمای 25-28 درجه­ی سانتی­گراد کشت داده شدند. پرایمرهای عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژن­های باکتری­های جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. ترادف­های بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه­ داده­های NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند. سه سویه از ریزوسفر گیاه یونجه­ی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد. در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی 3 سویه باکتری شناسایی شد. باکتری شماره 1 شناسایی شده گرم منفی و با ایجاد کلنی­های کرم رنگ و برجسته، دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنی­های قرمز رنگ و کلنی باکتری سوم جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. نتایج توالی­یابی 16S rRNA  سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری1)(درصد همپوشانی 97 و گپ­های بازی ۲ درصد)، باکتری دوم Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2)(درصد همپوشانی 97 و گپ­های بازی ۲ درصد) و باکتری سوم (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti (درصد همپوشانی 04/96 و گپ­های بازی 4 درصد) شناسایی شد. با توجه به نقش تثبیت کنندگی این باکتری­های ریبوزومی، با تکثیر این گروه­های باکتریایی و افزودن آن­ها به خاک می­توان، ضمن افزایش رشد گیاهان زراعی،  استفاده از کودهای شیمیایی را کاهش داد.

واژه های کلیدی: تنوع، باکتری ریزوبیومی، کرهک، یونجه، ژن 16rRNA.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02176301226 ، پست الکترونیکی: Khoramnejad@damavandiau.ac.ir

مقدمه

 

گیاهان خانواده لگومینوز شامل 19300 گونه از 750 جنس، با تولید مقادیر بالای پروتئین و تثبیت مقادیر بالای ازت به دلیل همزیستی با باکتریهای ریزوبیومی در سراسر جهان اهمیت زیادی دارند (1). بیشتر گیاهان تیره لگوم شامل نخود، لوبیاها و شبدرها گره­ها یا اجزای غده ای شکلی روی ریشه­های خود دارند. این گره­ها در شرایط کمبود ازت و در نتیجه آلودگی ریشه­های موئین این گیاهان با دسته­ای از باکتری­ها بنام ریزوبیوم ایجاد می­شوند (9). گیاه یونجه یکی از مهمترین گیاهان علوفه­ای بومی است که با داشتن سیستم ریشه­ای قوی و مقاوم به شرایط نامساعد محیطی با وجود باکتری­های همزیست ریزوبیومی، نقش بسیار مهمی در حاصلخیزی خاک­ها دارد (4). باکتری­های ریزوبیوم مهمترین میکروارگانیسم­های موجود در خاک هستند که در مقایسه با سایر میکروارگانیسم­های خاک نقش مهمی در تبدیل نیتروژن اتمسفر به اشکال آمونیوم و نیتروژن آلی و تثبیت ازت دارند (7،21). ریزوبیوم­ها گروهی از باکتری­ها هستند که قادر به تشکیل گره بر روی ریشه گیاهان خانواده بقولات می­باشند. این باکتری­ها هوازی بوده و قادر به استفاده از منابع مختلف قند مثل پنتوزها و هگزوزها به عنوان منبع کربن می­باشند و از آمونیوم و نیترات به عنوان منبع نیتروژن استفاده می­کنند. حضور این باکتری­ها در ساختار گیاه، علاوه بر افزایش قابلیت بقای گیاه در شرایط نامساعد نظیر شوری و دمای بالا، با انحلال فسفات و آهن خاک، جذب مواد کم مصرف و در برخی از موارد کنترل عوامل بیماری­زا رشد گیاه را نیز تحریک می­کنند (18). توانایی این باکتری­های ریزوبیومی در تطبیق با شرایط تنشی خاک، در بقا و همزیستی باکتری و گیاه نقش اساسی دارند. برخی از این باکتری­های همزیست دارای توانمندی بالاتری در برابر تنش­ها زیستی، فیزیکی و شیمیایی هستند (1). Zhang  و همکاران (1991) تنوع باکتری­ها ریزوبیومی ریشه را در گره زایی گیاهان تیره لوگوم را مورد بررسی قرار دادند (25). Hosseini و همکاران (2014) جداسازی و شناسایی سوش­های ریزوبیوم همزیست با یونجه و شنبلیه را مورد بررسی قرار دادند (11). Tashokri و همکاران (2016) صفات فنوتیپی و خصوصیات محرک رشدی باکتریهای ریزوبیومی گره­های ریشه­ای سویا را مورد بررسی قرار دادند (21).

برای شناسایی دقیق باکتری­های ریزوبیومی، روش­های مبتنی بر PCR به عنوان راه­حلی سریع و مطمئن هستند. ژن 16rRNA یک ژن باکتریایی عمومی و محافظت شده با اعمال ثبت و مشخص است. این ژن با توالی ژنی در باکتری­های مختلف در تعیین روابط فیلوژنی یا شناسایی باکتری­ها مورد استفاده قرار می­­گیرد که این روش را به عنوان یکی از مفیدترین روش­های شناسایی باکتری معرفی می­کند (22). Daduk و همکاران (2012) شناسایی فیلوژنیک باکتری­های تثبیت کننده نیتروژن جدا شده از ریزوسفر گیاه مارچوبه با استفاده از 16rRNA (6) و نیز استفاده از این ژن در مطالعه­ی Omidi Nasab و Khodakarmian (2017) در جداسازی باکتری­های اپی­فیت یونجه نیز گزارش شده است (16). Fuskhah و Darmawati (2019) جداسازی باکتری­های ریزوبیومی با استفاده از محیط کشت­های مختلف و نقش آنها در افزایش تولید سویا را مورد بررسی قرار دادند (7). در کشور ایران به علت تنوع آب و هوایی و نوع خاک احتمالاً سویه­های منحصر به فردی از نظر فیلوژنی و میزان کارایی همزیستی با یونجه وجود دارد که این امر شناسایی باکتری­های ریزوبیومی را به منظور استفاده از آن­ها به عنوان یک عامل بیولوژیک که با تثبیت نیتروژن، کاهش مصرف کودهای نیتروژن را به دنبال دارد را به موضوعی مهم تبدیل کرده است. علاوه بر این با توجه به توانایی تثبیت نیتروژن، می­توان از باکتری­های ریبوزومی شناسایی شده در کاهش فسفات و نیتروژن پساب­های صنعتی و شهری به عنوان یک مسیر دوستدار طبیعت استفاده کرد.  از اینرو، هدف از مطالعه­ی حاضر شناسایی تنوع باکتری­های ریزوبیومی جدا شده از گرهک­های ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) است.

مواد و روشها

جمع­آوری نمونه از گرهک ریشه گیاه یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa): گیاه یونجه آلفا آلفا  (Medicago sativa)، از منطقه پشمینه­زار اندیمشک و در فصل بهار 1398 جمع آوری شد. به منظور جداسازی کرهگ­ها، 15 سانتی­متر از خاک اطراف گیاه یونجه و به عمق 20 سانتی­متر کنار زده شد و ریشه­ گیاه یونجه بدون آسیب خارج شد. جهت حذف رطوبت و جلوگیری از انتقال آلودگی، ریشه پس از خروج از زمین با خاک اطرافی با قرار گیری درون کیسه­ی پلاستیکی، به آزمایشگاه انتقال پیدا کرد. در آزمایشگاه ریشه­ها درون ظرف پر از آب و با استفاده از جریان جاری آب به آرامی شستشو شدند. ضد عفونی کردن کرهگ­ها با استفاده از اتانول 95 درصد (10-5 ثانیه) و هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (3-2 دقیقه) انجام شد. سپس گره­ها 6-5 بار با آب مقطر استریل در کنار شعله شسته و سه بار آخر کرهک­ها به مدت 15 دقیقه در آب استریل نگهداری شدند. در هاون چینی استریل، گره­ها به همراه محلول نمک 5/8 گرم در لیتر استریل له شدند. از محیط کشت YMA (دی­پتاسیم فسفات 5/0 گرم، سولفات منیزیم 2/0 گرم، کلرید سدیم 1/0 گرم، مانیتول10 گرم، عصاره مخمر 5/0 گرم و آگار 15 گرم (2) برای جداسازی باکتری­ها استفاده شد. یک دهم میلی­لیتر از سوسپانسیون گره و محلول نمک بر روی پتری دیش حاوی محیط کشت YMA پخش و در انکوباتور در دمای 28-25 درجه­ی سانتی­گراد نگهداری شد. با مشاهده رشد کلنی باکتری در امتداد خطوط کشت، باکتری­ها به منظور خالص سازی جدایه ها روی محیط کشت دیگری کشت داده شدند و طی چند مرحله خالص سازی انجام گردید. پس از تهیه کشت­های خالص به منظور نگهداری طولانی مدت آنها ایزوله­های جداسازی شده در لوله­­های مورب دارای محیط YMA کشت داده  و در دمای یخچال نگهداری گردیدند. از هر سوش 5-4 نمونه تهیه گردید (7).

 

 الف  ب

شکل 1- گیاه یونجه الف- گیاه و ریشه ب- تراکم گره­های ریزوبیوم

 

شناسایی جدایه­های باکتری: شناسایی ساختار ظاهری جدایه­ها بر پایه راهنمای باکتری­شناسی رده­بندی (سیستماتیک) کلانس و برگیز (5) انجام شد. پس از کشت همسانه­های هر جدایه روی محیط آگار مغذی، به مدت سه روز در انکوباتور 28 درجه­ی سانتی­گراد قرار داده شدند و سپس ویژگی­های میکروسکپی همسانه­ها شامل شکل، واکنش گرم، حرکت، سیترات، تولید H2S، اکسیداز و کاتالاز بررسی شد (20).

تکثیر قطعه 16S rDNA باکتری­ها با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز: خالص­سازی DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سینا ژن انجام شد. واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر و شامل 18 میکرولیتر آب PCR، 5/2 میکرولیتر بافر PCR، 1 میکرولیتر پرایمر Forward، 1 میکرولیتر پرایمر Reverse، 1 میکرولیتر DNA ژنومی، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA Polymeraz انجام شد. آغازگرهای (پرایمر) عمومی و کامل باکتری سینوریزوبیوم بر اساس ژن 16s rRNA gene sequences از سایت NCBI استخراج و در توالی یابی ژن­های باکتری­های جداسازی شده در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند( جدول ۱).

 

جدول ۱- آغازگرهای عمومی 16s rRNA مورد استفاده در باکتری های ریبوزومی گیاه یونجه از سایت NCBI

آغازگر

ردیف

AGAAGTTTGATCMTGGCTCAG

آغازگر پیشرو  (27 F)

GGTTACCTTGTTACGACTT

آغازگرمعکوس (1492R)

 

واکنش به صورت دناتوراسیون DNA به مدت 1 دقیقه در دمای 95 درجه­ سانتی­گراد، دناتوراسیون ثانویه در دمای 95 درجه­سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و الحاق پرایمرها به DNA هدف در دمای 50 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه و توسعه پرایمر در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه در 30 چرخه تکرار و در انتها 10 دقیقه واکنش در 72 درجه سانتی­گراد صورت گرفت. PCR توسط ژل الکتروفورز 1 درصد آگارز در بافر تریس ارزیابی و تایید گردید. ترادف­های بدست آمده با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش و با استفاده از نرم افزار بلاست در پایگاه­ داده­های NCBI مورد تجزیه و تحلیل و مقایسه قرار گرفتند (17).

نتایج

سه سویه از ریزوبیوم گیاه یونجه­ی آلفا آلفا (Medicago sativa) جداسازی و شناسایی شد که همه جدایه ها مشخصات تست های بیوشیمیایی تیپیک باکتری های سینوریزوبیوم را نشان دادند. برخی از مشخصات بیوشیمیایی این باکتری­ها در جدول 1 آمده است.

 

جدول 1- خصوصیات بیوشیمیایی باکتری­های جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه­ی آلفا­ آلفا

 

رنگ آمیزی گرم

شکل سلول

سیترات

حرکت

تولید H2S

اکسیداز

کاتالاز

باکتری 1

گرم منفی

باسیل

-

+

-

+

+

باکتری 2

گرم منفی

باسیل

-

+

v

+

+

باکتری 3

گرم منفی

باسیل

-

+

v

+

+

 

 

در بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی، باکتری شماره 1 با ویژگی های گرم منفی و ایجاد کلنی­های کرم رنگ و برجسته بر روی محیط کشت YMA بود (شکل 2). نتایج توالی­یابی 16S rRNA سویه جدا شده از ریزوسفر گیاه یونجه را گونه (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti (باکتری 1) معرفی کرد.

 

 الف  ب

شکل 2- باکتری ریزوبیومی شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری، ج- توالی ژنی

 

دومین باکتری گرم منفی و دارای کلنی­های قرمز رنگ بر روی محیط کشت YMA بود (شکل 3). باکتری دوم شناسایی شده از ریزوبیوم گیاه یونجه گونه Sequence ID= CP-000738.1)) Sinorhizobium medicae (باکتری 2) بود.

کلنی باکتری شماره ۳ جداشده از گیاه جنس یونجه آلفا آلفا (Medicago sativa) صورتی بود. باکتری (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti شناسایی شد (شکل 4).

همترازی جفت بازی (بلاست) ژن­های ورودی در نرم افزار بلاست با تعداد بازهای ژن­های مختلف و نیز درصد همپوشانی و گپ­های بازی برای سه باکتری شناسایی شده در شکل 5 نشان داده شده است.

 

 الف  ب

شکل 3- باکتری ریزوبیومی شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium meliloti، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری، ج- توالی ژنی

 الف  ب

شکل 4- باکتری ریزوبیومی شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti ، الف- کلنی باکتری، ب-درخت فیلوژنی باکتری

 

 

باکتری شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti

(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)

 

باکتری شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium medicae

(درصد همپوشانی 97 و گپ های بازی ۲ درصد)

 

 

باکتری شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti

(درصد همپوشانی 04/96 و گپ های بازی 4 درصد)

شکل 5- هم­ترازی جفت بازی ژن­­های باکتری­های ریزوبیومی

 

همترازی چندبازی با انواع ژن­های موجود در بانک ژنی و مطابقت با نوع باکتری­های مشابه براساس تطابق جفت بازهای آنها برای 3 باکتری جدا شده در شکل 6 نشان داده شده است.

 

 

باکتری شماره 1 (Sequence ID= CP 021215.1) Sinorhizobium meliloti

 

باکتری شماره 2 (Sequence ID= CP-000738.1) Sinorhizobium medicae

 

باکتری شماره 3 (Sequence ID= DQ-145546.1) Sinorhizobium meliloti

شکل 6- همترازی چندبازی ژن­های باکتری­های ریزوبیومی با انواع ژن­های موجود در بانک ژنی

 

بحث

در بسیاری از نقاط دنیا گونه­های مختلف باکتری ریزوبیومی از گونه­های مختلف یونجه به جهت استفاده­ی تجاری در ثبیت ازت جداسازی شده­اند. ریزوبیوم از خانواده ریزوبیاسه، مشهورترین باکتری آندوفیت طبیعی لگوم و تثبیت کننده­ی نیتروژن مولکولی است که جز گروهی از باکتری­ها با نام ریزوباکتری­ها محرک رشد گیاه محسوب می­شود (4،10). از طرفی این روزها، مسیرهای ژنتیکی برای تعریف و درک سیستم­های ژنتیکی ارتبط باکتری­های همزیست و میزبان آن­ها استفاده می­شوند. توالی ژنوم نژادهایی از نودول­های ریزوبیومی سیمبیوتیک همانند E. meliloti 1021 (8)، Rlv 3841 (24)، M. loti MAFF303099 (13) یا Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110T (14) مشخص شده و بینش­های جدیدی را در خصوص این تعاملات همزیستی ایجاد کرده است.  

در این مطالعه از روش 16S rDNA PCR جهت شناسایی و تعیین گونه­ها­ی باکتری­ جدا شده از ریشه یونجه آلفا آلفای استان خوزستان استفاده شد. این روش که در آن از  قطعات اختصاصی باکتری استفاده می­شود، در مقایسه با روش­های قدیمی امکان تشخیص دقیق روابط خانوادگی بین باکتری­ها را فراهم ساخته و می­توان باکتری­های هم خانواده را به درستی تشخیص داد. تکثیر ژن 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای بیان شده منجر به تولید قطعاتی با طول 3781904- 144170 جفت باز در جدایه­های باکتریایی شد. براساس میزان تشابه باکتری­ها با توالی ژن­های ثبت شده در NCBI، باکتری­های شناسایی شده از جنس Sinorhizobium و شامل دو گونه (Sinorhizobium meliloti و Sinorhizobium medicae شامل دو نژاد (CP 021215.1 و DQ-145546.1) بودند.

Zhang و همکاران (1991) در مطالعه­ی که به بررسی باکتری­های جدا شده از گرهک­های ریشه گیاهان لوگومینوز پرداخته­ بودند از این دو باکتری به عنوان باکتری­های ریزوبیومی سریع الرشد نام بردند (25). Shafizadeh و همکاران (2007) در بررسی لگوم­های نمونه­های یونجه و اسپرس (19)، Jabli و همکاران (2007) در بررسی باکتری­های همزیست دو گونه یونجه Medicago rigidula و M. sativa در همدان (12) و Norooz Nejad و همکاران (2009) در جداسازی ریزوبیوم­های یونجه استان فارس، گونه­ی باکتری همزیست Sinorhizobium meliloti (15) را به عنوان گونه­ی غالب گزارش کردند. Hosseini و همکاران (2014) باکتری Rhizobium hainanense را به عنوان ریزوبیوم غالب در یونجه و شنبلیله در بیرجند گزارش کردند (11). علت تفاوت در نوع گونه باکتری و یا سویه­های مختلف، شرایط محیطی متفاوت شامل شوری و خشکی است که باعث می­شود به مرور زمان باکتری­ها مقاوم شده و توانایی استقرار بر روی ریشه و ایجاد رابطه­ی همزیستی را پیدا کنند.  Castro Pires و همکاران (2018) در بررسی ویژگی­های باکتری­های ریزوبیومی خاک در برزیل، عنوان کردند که نوع ریزوبیوم در هر منطقه تابعی از شرایط خاک و محیط است (4). به این ترتیب در هر منطقه با توجه به وجود استرس­های محیطی نوع خاصی از ریزوبیوم بومی و به شکل همزیست با گیاه وجود دارد (3) که با توجه به وابستگی نوع باکتری ریبوزومی به شرایط محیطی، می­توان از باکتری­های شناسایی به شکلی اختصاصی برای افزایش تثبیت نیتروژن و کاهش استفاده از کودهای شیمیایی در زمین­های کشاورزی خوزستان استفاده کرد.

نتیجه ­گیری

بعد از نمونه­برداری و جداسازی کرهگ­های گیاه یونجه­ی آلفا آلفا (Medicago sativa) از محیط کشت YMA برای جداسازی باکتری­ها استفاده شد. جداسازی باکتری­های ریزوبیومی با استفاده از  روش تکثیر قطعه 16S Rdna انجام شد که طی آن 3 گروه باکتریایی شامل گونه Sinorhizobium meliloti (باکتری1)،باکتری دوم Sinorhizobium medicae (باکتری 2) و باکتری سوم Sinorhizobium meliloti شناسایی شد.

 تقدیر و تشکر

با سپاس فراوان از سازمان آب و برق خوزستان در همراهی برای انجام این پژوهش.

  • Andrewa, M., Andrewa, M. 2017. Specificity in Legume-Rhizobia Symbioses. International Journal of Molecular Sciences. 18: 705- 744.
  • Beck, D.P., Materon, L. A., Afandi, F. 1993.Practical Rhizobium-Legume Technology Manual.Technical Manual. 389 pp.
  • Callahan, B.J., Wong, J., Heiner, C., Oh, S., Theriot, C.M., Gulati, A.S., McGill, S.K., Dougherty, M.K. 2019. High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research. 47:103-113.
  • Castro Pires, R., Jumior, F., Zilli, J., Fischer, D., Hofmann, A., James, E., Simon, M. 2018. Soil characteristics determine the rhizobia in association with different species of Mimosa in central Brazil. Plant Soil. 423: 411-428.
  • Claus, D., Berkely, R. 1986. Genus Bacillus. In Bergey’s manual of systematic bacteriology, ed. by Williams, S.T., Sharp, M.E., and Holt, J.C., Williams and Wilkins, Baltimor MD 21202, pp. 1105-1139.
  • Daduk, M., Begleran, M., Mehrabeian, Y., Zali, H., Adadi, M., Salehi, M., Malaki, M.H., Zargher, M. 2012. In the first place, the united states is the only country in the world to have a good time. Scientific Journal of Danish science supreme. 20: 129-123.
  • Fuskhah, E., Darmawati, A. 2019. Inoculation of rhizobium bacteria and nutrient of seawater to increase soybean production and quality as food. IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science.
  • Galibert, F., Finan, T.M., Long, S.R.; Puhler, A., Abola, P., Ampe, F., Barloy-Hubler, F., Barnett, M.J., Becker, A.; Boistard, P., et al. 2001. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293: 668–672
  • Ghorbani Z. 2010. Contains the muethr gene in competition and performance lgom family coexistence. Master thesis, College of agriculture, Isfahan University of technology. 20 (1): 2-10.
  • Gonzalez, V., Santamaria, R.I., Bustos, P., Hernandez-Gonzalez, I., Medrano-Soto, A., Moreno-Hagelsieb, G., Janga, S.C., Ramirez, M.A., Jimenez-Jacinto, V., Collado-Vides, J., et al. 2006. The partitioned Rhizobium etli genome:Genetic and metabolic redundancy in seven interacting replicons. Proceeding of the National Academy of Sciences. 103: 3834–3839
  • Hosseini, S.M., Mohammadi, A., Sayyari, M.H. 2014. Isolation and identification of rhisobiome scinus scinus leachate with alfalfa and fenuliyeh in Birjand. 3rd National Congress on Organic and Conventional Agriculture. University of Mohaghegh Ardabili.
  • Jabli, M., Naderi Shahab, M.A., Pourbababi, A.A., Ghamari Zare, A., Jafari, A., 2007. The study of the likeity of bacteria symbiotic with one year alfalfa (Medicago rigidula) and multi-year alfalfa ( sativa). Journal of Genetic Research and Breeding of Range and Forest Plants of Iran. 15: 295-284.
  • Kaneko, T., Nakamura, Y., Sato, S., Asamizu, E., Kato, T., Sasamoto, S., Watanabe, A., Idesawa, K., Ishikawa, A., Kawashima, K., et al. 2000. Complete genome structure of the nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti. DNA Research. 7: 331–338.
  • Kaneko, T., Nakamura, Y., Sato, S., Minamisawa, K., Uchiumi, T., Sasamoto, S., Watanabe, A., Idesawa, K., Iriguchi, M., Kawashima, K., et al. 2002. Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic bacterium Bradyrhizobium japonicum USDA110. DNA Research. 9: 189–197
  • Norooz Nejad, M.J., Kargar, M., Kargar, M., Kavus Ayazpour, K., Reisizadeh, S. 2009. Evaluation of Rhisobiome Native, Animal Manure and Urea Treatments on Alfalfa Growth in Fars Province. Journal of the World of Microbes. 2: 275-270.
  • Omidi Nasab, M., Khodakarmian, G. 2017. Decontamination of alfalfa epiphyte bacteria on the bacterium chowdge is the cause of alfalfa withering. Journal of the World of Microbes. 10: 68-59.
  • Sanatizadeh, S,. Alipour Babaei, A., Amoozgar, M. A. 2014. Determining the diversity of symbiotic bacteria isolated from alfalfa root nodules in Yazd region. Journal of Applied Biology. 4: 26-40.
  • Sarr, P.S., Araki, S., Begoude, D.A., Yemefack, M., Manga, G.A., Yamakawa, T., Htwe, A.Z. 2016. Phylogeny and nitrogen fixation potential of Bradyrhizobium species isolated from the legume cover crop Pueraria phaseoloides Roxb.) Benth. in Eastern Cameroon. Soil Science and Plant Nutrition. 62: 13–19.
  • Shafizadeh, SH., Seifollahi, A., Eskandari, Z., 2007. Extraction and identification of rhisobiome suscines with the most important rangeland legomes in Isfahan province. Range and Desert Research of Iran. 14: 312-302.
  • Swapna Nagalingam1, T.V., Nithya1, D., Gayathri1, A.S., Sagarika1, G., Supriya, D., Vidya, B., Kiran, K., Akhtar Rasool, Mir Morphological, M. I., 2020. Biochemical and Plant Growth Promoting Characterization of Rhizobia Isolated From Root Nodule of Cajanus Cajan L. Plant Archives. 20: 1293-1299.
  • Tashokri, F., Ghorbani Nasrabadi, R., Barani Motlagh, M., Movahedi Naeini, S.A. 2016. Phenotypic traits and some growth symbiotic characteristics of rhisobiome bacteria isolated from soybean root nouns. Journal of Soil Management and Sustainable Production. 6: 64-45.
  • Winand, R., Bogaerts, B., Hoffman, S., Lefever, L., Delvoye, M., Braekel. J., Fu, Q., Roosens, N., Keersmaecker, S., Vanneste, K. 2019. Targeting the 16S rRNA Gene for Bacterial Identification in Complex Mixed Samples: Comparative Evaluation of Second (Illumina) and Third (Oxford Nanopore Technologies) Generation Sequencing Technologies. International Journal of Molecular Sciences. 21: 298-320.
  • H.B. 2011. Isolution and characterization of Rizhospher. Biotechnology. 6(1):42-52.
  • Young, J.P., Crossman, L.C., Johnston, A.W., Thomson, N.R., Ghazoui, Z.F., Hull, K.H., Wexler, M., Curson, A.R., Todd, J.D., Poole, P.S., et al. 2006. The genome of Rhizobium leguminosarum has recognizable core and accessory components. Genome Biol. 7: 34-41.
  • Zhang, X., Haeper, R., Karsisto, M., Lindstrom, K. 1991. Diversirt of rhizobium bacteria isolated from the root nodules of leguminous trees. International journal of systematic bacteriology. 41: 104-113.
پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
دوره 35، شماره 3
مهر 1401
صفحه 478-491
  • تاریخ دریافت: 01 شهریور 1399
  • تاریخ بازنگری: 20 آبان 1399
  • تاریخ پذیرش: 24 دی 1399