معرفی باکتری­های مولد بیودمولسیفایر جدا شده از خاک­های آلوده به نفت

و سنجش عملکرد آن­ها در جداسازی آب از نفت

هدی سباتی¹ و حسین معتمدی^1و2*

¹ ایران، اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

² ایران، اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، مرکز تحقیقاتی بیوتکنولوژی و علوم زیستی

تاریخ دریافت: 20/07/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

بیودمولسیفایرها گروهی از ترکیبات بیوسورفاکتانت با توانایی شکست امولسیون هستند که مهم­ترین کاربردشان در جداسازی آب از نفت خام است. این ترکیبات با توجه به زیست­سازگاری جایگزین خوبی برای دمولسیفایرهای شیمیایی هستند. هدف از این پژوهش، جداسازی باکتری­های مولد بیودمولسیفایر و سنجش عملکرد آن­ها در شکست امولسیون­های آب از نفت می­باشد. بدین منظور پس از نمونه برداری، جداسازی اولیه در محیط کشت پایه نمکی، غنی­سازی در محیط کشت مولرهینتون براث و خالص­سازی با تکنیک کشت پی­درپی در محیط کشت مولر هینتون آگار انجام شد. تولید بیوسورفاکتانت توسط جدایه­ها از طریق روش­های کیفی مانند بررسی فعالیت همولیتیک، آزمون انهدام قطره، آزمون گسترش نفت و سنجش هیدروفوبیسیته سلولی براساس اندازه­گیری چسبندگی میکروبی به هیدروکربن­ها ارزیابی گردید. ماهیت بیودمولسیفایری این ترکیبات و موقعیت آن­ها در سلول از طریق بررسی میزان شکست امولسیون­های آب در نفت سفید در آزمون دمولسیفیکاسیون بررسی شد. جدایه­های مولد بیودمولسیفایر براساس آزمون­های بیوشیمایی و آنزیمی و نیز رنگ­آمیزی به عنوان Bacillus sp. HS9، Staphylococcus sp. HS10، Bacillus sp. HS11، Bacillus sp. HS12 شناسایی شدند. میزان دمولسیفیکاسیون این جدایه­ها در شکست امولسیون آب در نفت سفید به ترتیب 3±25، 5±57/28، 1±14/27 و 1±57/51 درصد گزارش شد. از میان جدایه­ها، جدایه­ی Bacillus sp. HS12 بیشترین درصد دمولسیفیکاسیون را نشان داد. با توجه به توانایی دمولسیفیکاسیون این جدایه­ها، پیشنهاد می شود با هدف کاربردی شدن جدایه ها از جمله افزایش استحصال نفت و حذف امولسیون های نامطلوب نفتی در صنایع بالادستی، توانایی امولسیون زدایی جدایه ها در نفت خام و شرایط عملکردی کارخانجات نمک زدایی بررسی گردد.

واژه های کلیدی: بیودمولسیفایر، دمولسیفیکاسیون، خاک های آلوده، باکتری

* نویسنده مسئول، تلفن: 06133331045 ، پست الکترونیکی: motamedih@scu.ac.ir

مقدمه

امولسیون­های نفتی سیستم­هایی کلوئیدی متشکل از دو مایع امتزاج­ناپذیر نفت وآب هستند که در مراحل مختلف حفاری، اکتشاف، ازدیاد برداشت، انتقال و فرآوری نفت خام ایجاد می­شوند. این نوع امولسیون­ها به ویژه امولسیون­هایی که از پراکنش آب در نفت  ایجاد می­شوند امولسیون­های نامطلوبی هستند که از ارزش نفت خام استخراجی می­کاهند و فرآیند پالایش نفت خام را دچار مشکل می­کنند؛ چرا که آب موجود در این امولسیون­ها علاوه بر افزایش هزینه­های پمپاژ و ذخیره نفت، می­تواند باعث ایجاد آسیب به تجهیزات و تاسیسات پالایشگاه، کاهش ظرفیت مخازن و انسداد خطوط انتقال شود؛ در نتیجه باید میزان آب در نفت خام استخراجی کاهش یابد و جداسازی آب از نفت می­تواند موجب ایجاد ارزش افزوده شود (13،15). روش­های جداسازی آب و نفت به طور کلی به سه دسته شیمیایی، فیزیکی- الکتریکی و زیستی تقسیم بندی می­شوند. روش­های یادشده ممکن است بتنهایی، بصورت همزمان و یا متوالی به کار روند. آلودگی زیست محیطی ایجاد شده توسط فرآورده های نفتی از جمله دمولسیفایرهای شیمیایی در حین انتقال، استفاده نامناسب و نشت در صنعت امروز باعث شده است که استفاده از روش زیستی در جداسازی آب از نفت توجه زیادی را به خود جلب کرده است (1،2،4). نخستین بار فعالیت دمولسیفیکاسیون میکروارگانیسم­ها در سال 1980 میلادی مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات صورت گرفته نشان داد که این توانایی در میکروارگانیسم­ها به دلیل تولید ترکیبات فعال سطحی و یا ترکیباتی است که خصوصیات سطح سلول­ها را تعیین می­کند. براین­­اساس بیودمولسیفایرها به دو گروه تقسیم می­شوند؛ دسته اول ترکیباتی هستند که جزئی از ساختار میکروارگانیسم می­باشند و با افزایش هیدروفوبیسیته سطحی سلول به تفکیک دو فاز آب و نفت در یک امولسیون نفتی کمک می­کنند تا امولسیون شکسته شود. دسته دوم، ترکیباتی هستند که به صورت یک متابولیت به خارج از سلول ترشح می شوند و عمدتاً از جنس استوئین، پلی­ساکارید­ها، گلیکولیپید­ها، فسفولیپیدها، گلیکوپروتئین­ها و رامنولیپید­ها هستند(8،12). بیودمولسیفایرها در مقایسه با دمولسیفایرهای شیمیایی درتعلیق شکنی کار­آمدترند، آلودگی محیطی ایجاد نمی­کنند، از منابع ارزان و تجدیدپذیر همچون ضایعات کشاورزی و صنعتی قابل تولید هستند و در شرایط افراطی(دما، pH ، نمک) به خوبی عمل می­کنند. از طرفی زیست سازگاری آن­ها با محیط باعث شده است که این ترکیبات گزینه­های خوبی برای شکست امولسیون­ها به ویژه امولسیون­های نفتی باشند. با جداسازی سویه­های مناسب و بررسی ویژگی­های فیزیولوژیکی، متابولیسمی و بهره برداری از سوبسترای خام ارزان قیمت با کمک بیوتکنولوژی، می­توان به تولید صنعتی بیودمولسیفایر دست یافت (17). هدف از این پژوهش، جداسازی باکتری­های مولد بیودمولسیفایر از خاک های آلوده به نفت و سنجش عملکرد آن­ها در جداسازی آب از نفت است.

مواد و روشها

نمونه گیری: نمونه­گیری در فصل پاییز و از پنج نقطه از خاک­های آلوده به نفت پالایشگاه نفت آبادان (34983/30 درجه شرقی و 27798/48 درجه شمالی) صورت گرفت. از هر کدام از نقاط یک نمونه خاک به میزان 500 گرم در ظرف شیشه­ای درپوش­دار استریل ریخته شد و سریعاً به آزمایشگاه تحقیقاتی میکروبیولوژی منتقل گردید و نمونه­ها تا زمان جداسازی باکتری­ها در فضایی تاریک در آزمایشگاه نگه­داری شدند. به منظور هوادهی مناسب درب آن­ها بصورت نیمه باز گذاشته شد.

جداسازی، غربال گری و غنی­سازی باکتری­های مولد بیودمولسیفایر: به منظور جداسازی باکتری ده گرم از هرنمونه خاک به ارلن مایر 250 میلی لیتری حاوی 90 میلی­لیتر سرم فیزیولوژی استریل اضافه شد و این نمونه­ها به مدت دو ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد با دور rpm 150 شیک شدند. سپس این ارلن­ها به مدت یک ساعت روی میزکار آزمایشگاه ثابت نگه داشته شدند تا ذرات درشت خاک در آن­ها ته نشین شود. سپس یک میلی­لیتر از محلول رویی هر ارلن به ارلن جدیدی حاوی 25 میلی لیتر محیط کشت پایه معدنی اصلاح شده (MMSM= Modified Mineral Salt Medium) پیشنهاد شده توسط هووانگ و همکاران (2009) ، اضافه گردید. محتویات این محیط کشت (2/7pH ) عبارتند از: (گرم بر لیتر) چهار گرم آمونیوم نیترات، چهار گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات، شش گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 2/0 گرم منیزیم سولفات هفت آبه و یک میلی لیتر محلول عناصر معدنی کم مقدار است. محلول عناصر معدنی کم مقدار(7 pH) حاوی ترکیبات: (گرم بر لیتر) یک گرم کلسیم کلرید دو آبه، یک گرم سولفات آهن (II) هفت آبه و 4/1 گرم اتیلن دی آمین تترا استیک اسید است. چهار درصد پارافین مایع به عنوان تنها منبع کربن و انرژی در این محیط کشت استفاده شد (11). محیط جامد با افزودن دو درصد آگار و یک درصد پارافین مایع به محیط کشت براث تهیه شد. به منظور غنی سازی، باکتری­های جداسازی شده به محیط کشت مولر هینتون براث منتقل و پس از 24 ساعت گرماگذاری در دمای 35 درجه سانتی­گراد جهت خالص­سازی به پلیت­های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده شدند. جدایه های خالص­سازی شده با استفاده از آزمون های شیمیایی، آنزیمی و نیز رنگ آمیزی، مطابق راهنمای شناسایی و طبقه بندی باکتری­های Bergey، مورد شناسایی قرار گرفتند (5).

سنجش کیفی تولید ترکیبات بیوسورفاکتانت در جدایه ها: با توجه به اینکه بیودمولسیفایرها زیرگروهی از ترکیبات فعال سطحی در ارتباط با سطح سلول هستند، از روش­های کیفی سنجش تولید ترکیبات بیوسورفاکتانت و اندازه گیری فعالیت سطحی سلول برای سنجش آنها استفاده گردید. این روش­ها عبارتند از (7):

روش گسترش نفت: در تکنیک گسترش نفت (Oil spreading assay)، 20 میلی لیتر آب مقطر استریل به یک پتری دیش هشت سانتی متری اضافه شد و سپس 20 میکرولیتر نفت خام به سطح آب افزوده شد که به صورت لایه نازکی در سطح آب قرار گرفت. ده میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتری در محیط مولر هینتون براث با سمپلر برداشته و به سطح نفت اضافه شد. پخش لکه نفتی و ظهور ناحیه شفاف در محل افزودن سوسپانسیون باکتریایی مؤید تولید بیوسورفاکتانت توسط باکتری است. قطر هاله ایجاد شده بیانگر میزان بیوسورفاکتانت تولیدی است. در این آزمون آب مقطر استریل به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. نتایج بصورت منفی (بدون هاله)، یک مثبت (هاله کوچک)، دو مثبت (هاله متوسط) و سه مثبت (هاله بزرگ) گزارش شد (22).

روش همولیز: یکی از روش های اولیه برای بررسی تولید بیوسورفاکتانت، بررسی لیز گلبول های قرمز خون است. همولیز ایجاد شده اطراف کلنی نشان دهنده توانایی باکتری در تولید بیوسورفاکتانت می­باشد. به منظور بررسی همولیز در جدایه­ها کشت خالصی از آنها بر روی محیط کشت آگار خون دار حاوی 10-5 درصد خون گوسفند تهیه گردید و در دمای 35 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرما گذاری شد. وجود همولیز آلفا و بتا در اطراف کلنی باکتری به عنوان فعالیت همولیتیک مثبت در نظر گرفته شد (22).

روش انهدام قطره: در روش انهدام قطره (Drop collapse assay) ابتدا جدایه­ها در محیط کشت مولر هینتون براث تلقیح و به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتی­گراد گرماگذاری شدند. پس از رشد جدایه ها، صد میکرولیتر از نفت خام استریل در چاهک­های پلیت الایزا ریخته شد و به مدت یک ساعت در دمای محیط ثابت نگه داشته شد تا سطحی یکنواخت از نفت خام در چاهک­های آن ایجاد شود. سپس ده میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی هر جدایه روی نفت خام موجود در چاهک ریخته شد.  پس از گذشت یک دقیقه شکل قطره ایجاد شده در سـطـح نفت خام بررسی گردید. از آب مقطر استریل به عنوان شاهد اسـتـفـاده شد. در صورت وجود بیوسورفاکتانت در سوسپانسیـون میکروبی، قطره بحالت مسطح و در غیر این صـورت قـطـره کاملاً گرد خواهد بود. نتایج بصورت یک مثبت (قطره کمـی متمایل)، دو مثبت (قطره خیلی متمایل) و سه مثبت (قطره کاملاً پهن) گزارش شد (22).

سنجش هیدروفوبیسیته سلولی براساس اندازه­گیری چسبندگی میکروبی به هیدروکربن­ها (MATH= Microbial adhesion to hydrocarbons): جهت تهیه توده سلولی سه میلی لیتر از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت مولر هینتون براث، سانتریفیوژ گردید. پس از دو بار شست و شو با بافرنمکی فسفاته (PBS= Phosphate buffer saline) جذب اولیه رسوب سلولی حاصل با  افزودن بافر PBS در طول موج 490 نانومتر بر روی 1-8/0 تنظیم شد. سه میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی حاصل با سه میلی لیتر از نفت سفید مخلوط و به مدت سه دقیقه با دور rpm 1800 ورتکس گردید. این سوسپانسیون به مدت 20 دقیقه بر روی میز کار آزمایشگاه ثابت نگه داشته شد. پس از آن دوفاز در لوله تشکیل گردید؛ فاز نفتی در بالای لوله و فاز آبی در پایین لوله که سوسپانسیون سلولی در آن قرار می گیرد. از سوسپانسیون سلولی در پایین لوله با سمپلر برداشته شد و جذب نهایی آن در طول موج 490 نانومتر اندازه­گیری گردید. هیدروفوبیسیته سلولی باکتری با توجه به جذب اولیه و نهایی براساس فرمول ذیل محاسبه شد(10،11):

تشخیص باکتری های مولد بیودمولسیفایر و تعیین موقعیت بیودمولسیفایر تولیدی: تشخیص باکتری­های مولد بیودمولسیفایر از سایر باکتری­ها براساس آزمون دمولسیفیکاسیون (Demulsification test) صورت گرفت. به منظور انجام این آزمون امولسیون­هایی از آب در نفت سفید تهیه شد. برای این منظور، آب مقطر استریل و نفت سفید به میزان 1:1 (حجمی/حجمی) در یک شیشه در پوش دار استریل مخلوط و به آن 67/1 درصد (حجمی/حجمی) سورفاکتانت غیر یونی سوربیتان مونواولئات یا اسپان80 (Span 80) اضافه گردید. این مخلوط به مدت سه دقیقه به صورت دستی هم زده شد. به منظور هموژنیزه کردن مخلوط و تهیه امولسیون، این مخلوط به مدت پنج دقیقه با حداکثر شدت سونیکه گردید (7). به منظور تعیین نوع امولسیون تهیه شده از آزمون حلالیت رنگ استفاده شد. در این آزمون از محلول رنگی یک درصد سافرانین (محلول در آب) و محلول رنگی یک درصد سودان (III) (محلول در نفت سفید) استفاده گردید. بدین صورت که از هر کدام از محلول­ها به میزان یک میلی­لیتر به نه میلی­لیتر از امولسیون تهیه شده از آب و نفت سفید اضافه شد. پراکنش یکنواخت هر کدام از محلول­های رنگی در امولسیون، فاز پیوسته آن را تعیین می­کند (21).

برای انجام آزمون دمولسیفیکاسیون، دو میلی لیتر از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت مولر هینتون براث به درون لوله آزمایش مدرج ده میلی لیتری که حاوی پنج میلی لیتر امولسیون آب در نفت سفید بود اضافه شد و به منظور اختلاط کامل این لوله به صورت دستی 200 بار سر و ته گردید. سپس این لوله به صورت ساکن در حمام آب گرم  با دمای 35 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. تغییرات حجم فاز نفتی (در بالای لوله )، فاز آبی ( در عمق لوله) و فاز امولسیون (میان این دو) بعد از 48 ساعت از قراردادن لوله در حمام آب ثبت گردید. در تمامی آزمون­های دمولسیفیکاسیون لوله کنترل یک که حاوی هفت میلی­لیتر امولسیون و لوله کنترل دو که حاوی دو میلی لیتر محیط کشت بدون تلقیح و پنج میلی لیتر امولسیون است در کنار سایر لوله ها استفاده شد. با جای­گذاری نتایج بدست آمده در فرمول­ (1) درصد شکست امولسیون توسط باکتری محاسبه گردید. براساس نتایج حاصل از این آزمون، جدایه برتر انتخاب شد (11).

محاسبه درصد دمولسیفیکاسیون طبق فرمول ذیل انجام گردید:

برای تعیین موقعیت بیودمولسیفایرهای تولیدی توسط جدایه­ها، عملکرد شکست امولسیون سوسپانسیون سلولی و مایع رویی بدون سلول هر یک از جدایه­ها در آزمون های دمولسیفیکاسیون مجزایی مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور ابتدا سه میلی لیتر از کشت 24 ساعته باکتری در دمای 35 درجه سانتی گراد در محیط کشت مولر هینتون براث جهت تهیه رسوب سلولی به مدت هشت دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی حاصل نگه داشته شد. به منظور شست وشو به میزان سه میلی لیتر آب مقطر استریل به رسوب سلولی حاصل اضافه گردید و لوله به آرامی تکان داده شد تا شست وشو به خوبی انجام شود. سپس بار دیگر محتوای لوله به مدت هشت دقیقه با دور   rpm4000 سانتریفیوژ گردید و مایع رویی دور ریخته شد. این شست و شو دو بار تکرار شد. به رسوب سلولی تهیه شده به میزان سه میلی لیتر از محیط کشت مولر هینتون براث استریل اضافه شد. فعالیت شکست امولسیون این سوسپانسیون سلولی تهیه شده و مایع رویی بدون سلول حاصل از سانتریفیوژ در آزمون های دمولسیفیکاسیون مجزایی بر روی امولسیون آب در نفت سفید مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این مطالعه باکتری­هایی به عنوان باکتری­های تعلیق شکن در نظر گرفته می­شوند که درصد دمولسیفیکاسیون آنها برای امولسیون آب در نفت سفید بیش از 20 درصد باشد. در صورتی که درصد دمولسیفیکاسیون مایع رویی بدون سلول این باکتری­ها بیش از 20 درصد باشد بیودمولسیفایر تولیدی توسط آنها خارج سلولی است و در صورتی که درصد دمولسیفیکاسیون سوسپانسیون سلولی آنها بیش از 20 درصد باشد بیودمولسیفایر تولیدی متصل به سلول است. در صورتی که درصد دمولسیفیکاسیون در هر دو حالت بیش از 20 درصد باشد بیودمولسیفایر تولیدی هم خارج سلولی و هم متصل به سلول است (10).

نتایج

در این پژوهش از نمونه­های خاک­های آلوده به نفت پالایشگاه نفت آبادان پس از کشت در محیط پایه نمکی اصلاح شده (MMSM)، غنی­سازی با محیط کشت مولر هینتون براث و خالص سازی با تکنیک کشت پی در پی در محیط کشت مولر هینتون آگار چهار جدایه باکتریایی جدا گردید. جهت شناسایی جدایه های به­دست آمده، تست­های اولیه بیوشیمیایی و بررسی مورفولوژیک کلنی برای آن­ها انجام شد. در جدول­های 1 و 2 به ترتیب نتایج رنگ آمیزی ، تست پتاسیم هیدروکسید (3 %)، کاتالاز، اکسیداز و بررسی مورفولوژی کلنی جدایه­ها آورده شده است.

جدول 1- نتایج آزمون های اولیه بیوشیمیایی

جدول 2- نتایج بررسی مورفولوژی کلنی

تولید ترکیبات بیوسورفاکتانت توسط جدایه­ها از طریق روش­های کیفی مانند بررسی فعالیت همولیتیک، آزمون انهدام قطره، آزمون گسترش نفت و سنجش هیدروفوبیسیته سلولی براساس اندازه­گیری چسبندگی میکروبی به هیدروکربن­ها مورد ارزیابی قرار گرفت (جدول 3). همانطور که از نتایج جدول سه مشخص می شود جدایه HS10 بیشترین توانایی چسبندگی به هیدروکربن ها را دارد و در آزمون های انهدام قطره و گسترش نفت عملکرد قوی از خود نشان می دهد در حالیکه جدایه HS12 قدرت چسبندگی به هیدروکربن کمتری نسبت به جدایه HS10 دارد ولی در آزمون­های گسترش نفت و انهدام قطره قویتر از HS10 عمل می کند. این نشان دهنده تفاوت در ماهیت و مقدار بیودمولسیفایر های تولید شده توسط این جدایه­هاست که بر شاخص های عملکردی آنها تاثرگذار است.

جدول 3- نتایج سنجش کیفی تولید بیوسورفاکتانت

^* نتایج به صورت متوسط داده های حاصل در دو سری سنجش ± انحراف معیار گزارش شد.

نتایج بررسی ماهیت و موقعیت بیودمولسیفایر تولیدی توسط جدایه­ها در جدول چهار آورده شده است. در تمامی آزمون های دمولسیفیکاسیون لوله های کنترل در کنار سایر لوله ها استفاده شد. (شکل1 (الف)). در بررسی نوع امولسیون پراکنش یکنواخت محلول­ رنگی سودان (III) در امولسیون آب در نفت سفید نشان می_دهد که فاز پیوسته این امولسیون نفت و امولسیون مورد بررسی یک امولسیون آب در نفت است. عدم یکنواختی و حالت گلبولی پراکنش محلول رنگی سافرانین در این امولسیون موید این مطلب است ( شکل1(ب)).

جدول 4- نتایج سنجش دمولسیفیکاسیون امولسیون آب در نفت سفید و تعیین موقعیت بیودمولسیفایر

^* نتایج به صورت متوسط داده های حاصل در دو سری سنجش دمولسیفیکاسیون ± انحراف معیار گزارش شد.

جدایه­های مولد بیودمولسیفایر به عنوان Bacillus sp. HS9، Staphylococcus sp. HS10، Bacillus sp. HS11، Bacillus sp. HS12 شناسایی شدند. میزان دمولسیفیکاسیون این جدایه ها در شکست امولسیون آب در نفت سفید به ترتیب 3±25، 5±57/28، 1±14/27 و 1±57/51 درصد گزارش شد. از این میان، جدایه ی Bacillus sp. HS12 بیشترین درصد دمولسیفیکاسیون را داشت. عملکرد دمولسیفیکاسیون این جدایه­ در شکست امولسیون آب در نفت سفید در شکل2 نشان داده شده است.

شکل1- (الف) امولسیون آب در نفت سفید (کنترل یک (لوله های سمت راست و چپ) و کنترل دو (لوله وسط))، (ب) پراکنش محلول رنگی سافرانین(سمت راست) وسودان (III) (سمت چپ) در امولسیون آب در نفت سفید

شکل2- عملکرد دمولسیفیکاسیون جدایه­ برتر در شکست امولسیون آب در نفت سفید

بحث

در این پژوهش به منظور به دست آوردن جدایه­هایی که توانایی تولید بیودمولسیفایر داشته باشند از خاک­های آلوده به نفت پالایشگاه نفت آبادان نمونه­گیری انجام شد. انتخاب این نقاط جهت نمونه­گیری به دلایل متعددی صورت گرفت که مهم­ترین این دلایل عبارتند از: وجود تحریک محیطی مناسب برای تولید ترکیبات بیودمولسیفایر توسط باکتری­ها مانند آلودگی بستر به نفت خام و عوامل هیدروکربنی، ارزیابی پتانسیل باکتری­های موجود در این محیط­ها در دمولسیفیکاسیون و امکان یافتن گونه­هایی مقاوم و کارآمد در شرایط افراطی و نامناسب محیطی به دلیل شرایط سخت آب و هوایی منطقه. براساس گزارشات موجود، تاکنون مطالعات بسیار کمی به منظور غربالگری باکتری­های مولد بیودمولسیفایر در جنوب کشور صورت گرفته است و همین امر شانس یافتن سویه­های بومی جدید را افزایش می­دهد. در مطالعات دیگری که به همین منظور انجام شده است نیز مکان­های مشابهی برای غربالگری مولد بیودمولسیفایر انتخاب شده است. هوو و همکاران (2014)  و کوتینهو و همکاران (2013) غربالگری باکتری­های مولد بیودمولسیفایر را با نمونه­گیری از خاک­های آلوده به نفت انجام دادند (6،8). محبعلی و همکاران (2012) از نفت، پساب و خاک­های آلوده به نفت و امولسیون­های نفتی میادین نفتی و پساب و خاک­های آلوده به روغن صنایع غذایی نمونه­گیری انجام دادند (18).  لیو و همکاران (2010)  از خاک­های آلوده به نفت برای غربالگری باکتری­های مولد بیودمولسیفایر استفاده کردند (17).  هووانگ و همکاران (2009) از لجن نفتی، درین و خاک­های آلوده به نفت نمونه­گیری انجام دادند (11).

در این پژوهش با استفاده از کشت نمونه­های خاک در محیط پایه نمکی اصلاح شده که تنها منبع کربن و انرژی آن پارافین مایع بود، چهار جدایه باکتریایی به دست آمد. عملکرد دمولسیفیکاسیون این جدایه ها بر روی امولسیون آب در نفت سفید مورد ارزیابی قرار گرفت و براین­اساس جدایه HS12  که بیشترین فعالیت دمولسیفیکاسیون را نشان داد به عنوان جدایه برتر انتخاب شد. مطالعات پیشین انجام شده در زمینه دمولسیفیکاسیون زیستی نشان می­دهد که عمده­ی باکتری­های مولد بیودمولسیفایر از جمله Alcaligenes sp  (11) Microbacterium sp. (19)، Dietzia sp. (16)، Paenibacillus alvei (3)، Bacillus cereus (8)، Bacillus mojavensis  (9) و Pseudomonas aeruginosa (23) از محیط­هایی جدا شدند که به منابع هیدروکربنی آلوده هستند. این امر نشان دهنده آن است که میان فعالیت دمولسیفیکاسیون سویه­های باکتریایی مولد بیودمولسیفایر و منابعی که از آن نمونه­گیری می­شوند ارتباط خاصی وجود دارد. وجود این ارتباط در بسیاری از مطالعات پیشین تاکید شده است. به عنوان مثال در مطالعه  هووانگ و همکاران مقایسه میان منابع نمونه­گیری سویه های مولد بیودمولسیفایر نشان داد که تمامی سویه­های باکتریایی که در دمولسیفیکاسیون کارآمد بودند از نواحی آلوده به نفت جداسازی شدند (11). این نتایج نشان دهنده این است که باکتری­های جدا شده از نواحی آلوده به منابع هیدروکربنی همچون نفت دارای پتانسیل خوبی برای تولید ترکیبات بیودمولسیفایر و انجام فعالیت دمولسیفیکاسیون هستند و در صورتی که هدف دستیابی به اینگونه باکتری ها باشد، این نواحی آلوده برای نمونه­گیری ترجیح داده می­شوند. نتایج مطالعه حاضر نیز این امر را تایید می کند و نشان می دهد که سویه های مولد بیودمولسیفایر جدا شده از بسترهای آلوده به منابع هیدروکربنی (مانند خاک های آلوده به نفت) دارای قابلیت مناسبی برای تولید بیودمولسیفایر هستند و توانایی سازگاری آنها با شرایط نامساعد محیطی بستر، آنها را گزینه های ایده آلی جهت تولید بیودمولسیفایرهای کارآمد می سازد.

با توجه به اینکه بیودمولسیفایرها گروهی از ترکیبات بیوسورفاکتانت با قابلیت شکست امولسیون هستند می توان از آزمون های سنجش تولید ترکیبات بیوسورفاکتانت برای بررسی تولید آن­ها استفاده کرد (7،11). بدین منظور در این پژوهش سنجش کیفی تولید بیوسورفاکتانت با استفاده از آزمون های سنجش فعالیت سطحی سلول ها صورت گرفت که این آزمون ها شامل سنجش فعالیت همولیتیک، آزمون گسترش نفت، آزمون انهدام قطره و سنجش هیدروفوبیسیته سلولی براساس MATH می باشند. بررسی فعالیت همولیتیک جدایه­ها از طریق کشت آن­ها بر روی پلیت­های آگار خون دار صورت گرفت. همولیز آلفای سویه HS12  تولید بیوسورفاکتانت توسط این جدایه را تایید می­کند. روش­های دیگری که برای بررسی تولید بیوسورفاکتانت در این پژوهش استفاده گردید تست­های گسترش نفت و انهدام قطره است. این آزمون­ها براساس تولید ماده بیوسورفاکتانت و نحوه قرارگیری آن در فاز میانی دو فاز آب و نفتی (هیدروکربنی) عمل می­کنند. اندازه هاله ایجاد شده در آزمون گسترش نفت و قطر قطره ایجاد شده در آزمون انهدام قطره با میزان تولید بیوسورفاکتانت و عملکرد آن رابطه­ای مستقیم دارد (22) به گونه­ای که جدایه­ برتر در مطالعه حاضر بیشترین اندازه هاله و قطر قطره را در تست­های گسترش نفت و انهدام قطره در مقایسه با سایر جدایه ها نشان داد. شوئب و همکاران از همولیز گلبول های قرمز، آزمون­های گسترش نفت و انهدام قطره برای سنجش تولید ترکیبات بیوسورفاکتانت استفاده کردند (20). هووانگ و همکاران غربال­گری باکتری­های مولد بیودمولسیفایر را با استفاده از آزمون­های سنجش فعالیت همولایتیک، گسترش نفت و انهدام قطره انجام دادند. این مطالعه گزارش می­دهد که در سنجش و غربال­گری باکتری­های مولد بیودمولسیفایر این آزمون­ها به تنهایی کافی نیستند و نمی­توانند جایگزین آزمون دمولسیفیکاسیون شوند چرا که فعالیت سطحی بالای یک ترکیب بیوسورفاکتانت ضرورتاً به معنای یک عملکرد دمولسیفیکاسیون خوب نیست. در این مطالعه گزارش شده است که برخی از جدایه های مولد بیودمولسیفایر جدا شده از نمونه­های محیطی علی رغم اینکه از فعالیت سطحی بالایی برخوردار هستند فعالیت دمولسیفیکاسیون خوبی را نشان نمی­دهند و برعکس. به همین دلیل این آزمون­ها به تنهایی برای سنجش تولید بیودمولسیفایر کافی نیستند و به صورت آزمون­هایی کمکی در کنار آزمون اصلی دمولسیفیکاسیون قابل استفاده هستند (11).

یکی دیگر از تکنیک­های سنجش فعالیت سلول، سنجش هیدروفوبیسیته سلولی براساس MATH یا پتانسیل اتصال سلول ها به ترکیبات هیدروکربنی است. این آزمون برای سنجش عملکرد دمولسیفیکاسیون سویه­های مولد بیودمولسیفایر به ویژه آن دسته از سویه­هایی که بیودمولسیفایر متصل به سلول تولید می­کنند اهمیت دارد چرا که حضور بیودمولسیفایرها در دیواره سلولی باکتری­ها می تواند یکی از دلایل هیدروفوبیسیته بالای آنها باشند. بر طبق نتایج سنجش MATH جدایه­ها در این پژوهش این استنتاج می­شود که میان هیدروفوبیسیته سلولی و عملکرد دمولسیفیکاسیون رابطه­ای وجود دارد چرا که جدایه­های مولد بیودمولسیفایر میزان هیدروفوبیسیته بالایی را نشان دادند به گونه­ای که میزان   MATH سویه­ی HS12 82±4/67 درصد گزارش شد. نتیجه بدست آمده در این زمینه در مطالعه حاضر در توافق با نتایج مطالعات پیشین است. به عنوان مثال لی و همکاران گزارش دادند که میان هیدروفوبیسیته سلولی و عملکرد دمولسیفیکاسیون آ­ن­ها رابطه­ای مستقیم خطی وجود دارد. این رابطه به صورت ذیل قابل توجیه است: در محیط­هایی که به منابع هیدروکربنی مانند نفت خام آلوده هستند تنوع میکروبی موجود در محیط به دلیل انتخاب طبیعی که طبیعت انجام می­دهد کاهش می­یابد و فقط سویه­هایی که بتوانند از این منابع هیدروکربنی استفاده کنند می­توانند در این محیط ها بقا داشته باشند و غالب شوند. این سویه­ها برای این که بتوانند از این منابع کربنی استفاده کنند و استفاده از این منابع برای آنها تسهیل شود به دو صورت عمل می­کنند: یا عوامل فعال سطحی دوگانه همچون بیودمولسیفایرها را تولید می­کنند یا تمایل خود را برای فاز هیدروکربنی با تغییر هیدروفوبیسیته سلولی افزایش می دهند (14). از طرفی حضور خود عوامل بیودمولسیفایر متصل به سلول در دیواره سلولی موجب افزایش هیدروفوبیسیته سلولی می­شود که به دنبال آن توانایی اتصال سویه به عوامل هیدروکربنی بیشتر خواهد بود. این امر موجب تسهیل استفاده از عوامل هیدروکربنی توسط سویه می شود (8،9).

به لحاظ موقعیت، بیودمولسیفایرها به دو گروه خارج سلولی و متصل به سلول تقسیم می­شوند (11). براساس نتایج بدست آمده در این بررسی مشخص شد که دو جدایه­ی Bacillus sp. HS9 و Bacillus sp. HS11 بیودمولسیفایرهایی خارج سلولی و جدایهStaphylococcus sp. HS10  بیودمولسیفایری متصل به سلول تولید می کند. بیودمولسیفایر تولیدی توسط جدایه Bacillus sp. HS12 هم متصل به سلول هم خارج سلولی است. بر طبق نتایج بدست آمده در پژوهش حاضر جدایه هایی که بیودمولسیفایر متصل به سلول تولید می­کنند بهترین عملکرد شکست امولسیون خود را زمانی نشان می­دهند که به صورت سلول تنها به امولسیون تزریق شوند. این نتیجه مشابه نتایج مطالعات پیشین در این زمینه است. بیشتر باکتری­های مولد بیودمولسیفایری که در مطالعات هوو و همکاران (15)، یان و همکاران (23)، هووانگ و همکاران (11) و لیو و همکاران (16) جداسازی شده­اند با استفاده از تزریق سلول به امولسیون عمل دمولسیفیکاسیون را انجام می­دهند چرا که بیودمولسیفایرهای تولیدی آنها متصل به سلول است. موقعیت یک بیودمولسیفایر سختی استخراج و خالص کردن آن را تعیین می­کند که به نوبه­ی خود بر آنالیز بیشتر آن بیودمولسیفایر و هزینه تولید آن موثر است. براین اساس بیودمولسیفایرهایی که متصل به سلول هستند در مقایسه با بیودمولسیفایرهای خارج سلولی دارای استخراج و خالص سازی سخت­تر و پرهزینه­تری می باشند. هووانگ و همکاران گزارش دادند که بیودمولسیفایرهای کارآمد (با درصد دمولسیفیکاسیون بالای 90 درصد) را می توان در هر دو موقعیت خارج سلولی و متصل به سلول یافت (10). بیودمولسیفایر تولیدی توسط جدایه­ی Bacillus sp. HS12 هم به صورت خارج سلولی و هم به صورت متصل به سلول است. بهترین عملکرد شکست امولسیون توسط این جدایه زمانی حاصل می شود که سلول­های کامل به کار برده شود. این دو موقعیتی بودن سهولت کاربرد عملی این بیودمولسیفایر را دو چندان و کم هزینه می سازد چرا که این بیودمولسیفایر بدون نیاز به استخراج بیودمولسیفایر یا تفکیک سلول های باکتریایی از مایع رویی از طریق تزریق سلول­های کامل به امولسیون بهترین عملکرد خود را به اجرا می گذارد.

نتیجه گیری

در این پژوهش چهار جدایه باکتریایی با توانایی شکست امولسیون آب در نفت سفید از خاک های آلوده و شرایط محیطی نامناسب پالایشگاه نفت آبادان جداسازی و شناسایی شد که از میان آنها جدایه HS12 که بیشترین درصد دمولسیفیکاسیون را نشان داد به عنوان جدایه برتر انتخاب شد. این جدایه براساس بررسی­های مورفولوژی و آزمون­های بیوشیمیایی اولیه به عنوان Bacillus sp. HS12 تشخیص داده شد. با توجه به پتانسیل باکتری­ منتخب در شکست امولسیون آب در نفت سفید و سازگاری و دوام آن در شرایط نامناسب محیطی پالایشگاه می­توان به کاربرد بالقوه آن­ در دمولسیفیکاسیون صنعتی امولسیون­های نامطلوب ایجاد شده در طی مراحل مختلف فرآوری نفت و تولید بیودمولسیفایر کارآمد امیدوار بود. بررسی بیشتر خصوصیات جدایه­ها و جستجو برای جدایه­های بومی جدید می تواند نقشی حیاتی در به کارگیری سویه­های بومی کشور در صنعت نفت داشته باشد.

قدردانی

نگارندگان لازم می دانند مراتب سپاس خود را از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به لحاظ تامین گرنت پژوهشی (SCU.SB98.673) و واحد پژوهش پالایشگاه نفت آبادان به لحاظ همکاری در اجرای این پژوهش اعلام نمایند.