بررسیتاثیر نانوذرات نقره بر بیان ژن Bla-per1 موثر در استحکام بیوفیلم در سویه­های اسینتوباکتربومانی مقاوم به آنتی­بیوتیک، با استفاده از روش

Quantitative Real-Time PCR

توحید پیری قراقیه^1*، سید عطااله سادات شاندیز² و شیدا بیرانوند¹

¹ ایران، شهرکرد، دانشگاه آزاداسلامی، واحد شهرکرد، گروه زیست شناسی

² ایران، تهران، دانشگاه آزاداسلامی، واحد تهران مرکزی، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 02/10/1398          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

اسینتوباکتربومانی به دلیل افزایش مقاومت آنتی­بیوتیکی و حدت، عامل اصلی عفونت­های شدید بیمارستانی است. توانایی اسینتوباکتر بومانی در تشکیل بیوفیلم به بقای آن در شرایط نامساعد محیطی از جمله محیط بیمارستان و تجهیزات پزشکی کمک می­کند. هدف از این مطالعه بررسی اثرات نانوذرات نقره روی استحکام بیوفیلم ایزوله­های بالینی مقاوم به آنتی بیوتیک اسینتوباکتر بومانی می­باشد. پس از جداسازی و تشخیص افتراقی 100 نمونه بالینی اسینتوباکتر بومانی ، تعیین مقاومت میکروبی به روش آنتی بیوگرام انجام و سویه های تشکیل دهنده بیوفیلم با تست فنوتیپی و ژنوتیپی شناسایی شدند. حداقل غلظت بازدارندگی از رشد سویه ها علیه نانوذرات تجاری نقره تعیین و بررسی بیان ژن Bla-per1 سویه های مقاوم تیمار شده با غلظت SubMIC نانوذرات نقره به روش Quantitative Real- Time PCR انجام شد. تعداد 12 نمونه از باکتری ها جداشده مربوط به اسینتوباکتر بومانی به تمامی آنتی­بیوتیک­های مورد مطالعه بجز کلیستین مقاوم بوده و ساختار بیوفیلم قوی تشکیل دادند. بررسی مولکولی PCR تایید کننده حضور ژن Bla-per1 در سویه­های مقاوم بود. تیمار سویه­ها با غلظت SubMIC نانوذرات نقره کاهش بیان قابل قبولی در بیان ژن Bla-per1 در سطح معناداری P≤0.05 نشان داد. نانوذرات نقره دارای اثرات بیولوژیکی معناداری بر کاهش حدت و بیان ژن های مقاومت و تشکیل بیوفیلم اسینتوباکتربومانی می باشند، بنابراین به عنوان کاندید دارویی می توانند مورد توجه قرار گیرند.

وازه های کلیدی: ‌اسینتوباکتر بومانی، بیوفیلم، نانوذرات نقره ، ژن Bla-per1.

* نویسنده مسئول، تلفن:؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟  ، پست الکترونیکی: Ata.sadatshandiz@iauctb.ac.ir

مقدمه

اسینتوباکتر بومانی یک باکتری گرم منفی در ارتباط با عفونت­های کسب شده از بیمارستان، به خصوص عفونت­های بخش مراقبت­های ویژه یا ICU می باشد. این عفونت­ها شامل عفونت­های باکتریائی از جمله باکتریمی، پنومونی، عفونت­های مجاری ادراری، مننژیت و عفونت زخم می­باشند(1و 19). معمولا عفونت­های جدی و شدید ناشی از اسینتوباکتر بومانی با استفاده از ایمی­پنم به عنوان داروی انتخابی مورد درمان قرار می گیرند (2). با این وجود مقاومت به این دارو در سال­ها­ی اخیر در میان گونه­های اسینتوباکتر بومانی در حال افزایش می­باشد و این ایزوله­ها معمولا مولتی دراگ رسیستنت (multidrug resistance) یا MDR هستند(23). سویه­های MDR اسینتوباکتر بومانی ظرفیت ویران­کننده­ای برای مقاومت و گردش و انتقال در فضای بیمارستان دارند؛ دلیل این امر توانایی زیاد آن­ها در تشکیل بیوفیلم روی سطوح زنده و غیر زنده می­باشد (3 و 25). این کوکوباسیل ها بر روی سطوح مختلف از جمله تجهیزات پزشکی و انواع دستگاه­های در ارتباط با پزشکی همچون کاتترهای وریدی و ادراری و لوله تراشه­های مورد استفاده در گلو تشکیل بیوفیلم می دهند (3). با توجه به ماهیت چند فاکتوری تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی تعدادی از ژن­ها و محصولات آنها در این فرایند دخیل می­باشند که در مقالات متعدد این ژن­ها شامل OmpA، پروتئین مرتبط با بیوفیلم Bap (25) و همچنین بتالاکتامازper-1 یا Bla-per1 گزارش شده است که نقش بسیار مهمی در چسبندگی و تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی ایفا می­کنند (10). علاوه بر این طیف گسترده­ای از ژن­های بتالاکتاماز (ESBL) که یکی از مهمترین آنها در ارتباط با اسینتوباکتر ژن Bla-per1 می­باشد، عامل ایجاد مقاومت به پنیسیلین (penicillins) سفوتاکسیم (cefotaxime) سفتیبوتن (ceftibuten) سفتازیدیم (ceftazidime) و مونوباکتام (monobactam) می­باشد (24) اما مقاومت به کارباپنم (carbapenem) و سفامایسین (cephamycin) را کاهش می­دهد. در مطالعات سشی در سال ۲۰۰۴ نشان داده شد که چسبندگی اسینتوباکتر بومانی به سطوح پلاستیکی و سلول­های اپیتلیال برونش (bronchial epithelial cells) تا حد زیادی وابسته به حضور و بیان Bla-per1 و پروتئین­های ناشی از بیان  این ژن می­باشد(20). امروزه محققان در حال جستجوی راه­حل های جدید برای درمان باکتری­های مقاوم به دارو هستند. یکی از این رویکرد­ها بکارگیری نانوذرات که همواره یکی از زمینه‌های کاربردی نانوبیوتکنولوژی در درمان عفونت‌های میکروبی بوده، می­باشد (11). از زمان باستان خواص ضدمیکروبی نقره شناخته شده است ولی اخیرا به دلیل ساخته شدن نقره به صورت نانو ذرات، سطح تماس و خاصیت ضد میکروبی آن تا بیش از 99 درصد افزایش یافته است (12). ﻧﻘﺮه در اﺑﻌﺎد ﺑﺰرﮔﺘﺮ ﻓﻠﺰی ﺧﺎﺻﯿﺖ واﮐﻨﺶ­دﻫﯽ ﮐﻤﯽ دارد، وﻟﯽ زﻣﺎﻧﯽ ﮐﻪ ﺑﻪ اﺑﻌﺎد ﮐﻮﭼﮑﺘﺮ در ﺣﺪ ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ ﺗﺒﺪﯾﻞ ﻣﯽﺷﻮد، ﺧﺎﺻﯿﺖ ﻣﯿﮑﺮوب­ﮐﺸﯽ آن افزایش می­یابد، به همین دلیل در پزشکی به بررسی اثرات آن اهمیت داده می­شود (13). نانوذرات نقره به علت داشتن بار سطحی و نسبت سطح به حجم خود، آنزیم­ها و DNA میکروارگانیسم­ها را با تعادل الکترون بین گروه های دهنده الکترون مثل تیول، کربوکسیلات، آمید، ایمیدازول، اندول و هیدروکسیل غیر­فعال می­نماید. تغییرات ضد­میکروبی که از رشد باکتری بیماریزا ممانعت می­کنند، یک هدف مطلوب محسوب می­شود (17). از آنجا که در زمان تشکیل بیوفیلم هزینه­های درمان بالا رفته و گران­بودن درمان­های فعلی برای مبارزه با بیوفیلم این باکتری و همچنین عدم کارایی کافی این روش­ها، استفاده از نانوذرات نقره برای درمان می­تواند راهکار مناسبی تلقی شود. به دلیل مقاومت­های آنتی­بیوتیکی اسینتوباکتر بومانی­، کلاس­های کمی از آنتی­بیوتیک­ها برای درمان عفونت­های ناشی از این باکتری مورد استفاده قرار گرفته و درنتیجه ایمی­پنم­ها و کارباپنم­ها از مهم­ترین گزینه­­های مطرح برای درمان آنتی­بیوتیکی می­باشند. این آنتی­بیوتیک­ها آخرین خط درمانی در مبارزه با عفونت­های ناشی از باکتری­های گرم منفی، ازجمله اسینتوباکتر بومانی می­باشند. طبق مطالعات، کلید اصلی­ مقاومت به کارباپنم­ها را می­توان در بیان ژن­های Bla-per1جستجو کرد (16). اگرچه حضور و بیان ژنBla-per1 به­طور مستقیم با تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتربومانی در ارتباط نمی­باشد اما آنالیز سیلیکویی (silico analysis) نشان داد که این ژن در اسینتوباکتر بومانی بر روی پلاسمید حمل شده و با کلاس یک اینتگرون­ها و ترنسپوزون­ها در ارتباط است. این عناصر ژنتیکی قابل انتقال معمولا ژن­های مقاومت به آنتی­بیوتیک را حمل کرده و در برخی مواقع تکه­هایی از ژن­های متابولیک (که در کنار یکدیگر تجمع دارند) توسط این فرآیند به شکل انتقال ژن افقی (horizontal gene transfer mechanism) بین باکتری ها منتقل می شود(2). به کمک این مکانیسم مشخص شد که احتمالا ژن­های کناری ABC transporter و ATP binding protein ها که در کنار ژن Bla-per1 قرار گرفته­اند به عنوان رتروترنسپوزون­های (retrotransposon ISCR1) iscr1 می­توانند به گونه­ای در تشکیل ساختار بیوفیلم دارای نقش ایفا کنند (9). از آنجایی که نانوذرات نقره به عنوان نانوذرات فلزی اثرات خوبی روی سویه های مورد آزمایش اسینتوباکتر دارند، می توان از این ماده به شکل گسترده در ضدعفونی کردن محیط و پسماندهای بیمارستانی و همچنین به شکل خوراکی یا تماسی در بدن استفاده کرد. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر نانوذرات نقره بر میزان بیان ژن Bla-per1 می باشد که در استحکام بیوفیلم در سویه های مقاوم به داروی اسینتوباکتربومانی نقش دارد.

ﻣﻮاد و روشها

تهیه نانوذرات نقره و جمع آوری اﯾﺰوﻟﻪﻫﺎی باکتریایی: نانوذره نقره با اندازه متوسط 20 نانومتر و خلوص 99/99% ساخت شرکت آمریکایی  US Nanoاز شرکت برهان خریداری گردید. در این پژوهش طی سال های 1397 تا 1398، به مدت پنج ماه تعداد 100 نمونه بالینی مشکوک به اسینتوباکتر از بیمارستان­های شهر تهران جمع آوری و در محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد. به منظور تایید تشخیص جنس و گونه اسینتوباکتر، پس از انتقال نمونه­ها به محیط آزمایشگاه، هر یک از نمونه­ها را روی محیط­های کشت بلاد آگار و مک­کانکی ­آگار کشت داده و سپس محیط­های کشت به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور نگهداری شدند. ﺑﺮای ﻧﮕﻬﺪاری طولانی مدت ﺑﺎﮐﺘﺮی­ﻫﺎ، آﻧﻬﺎ را در ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﻣﺎﯾﻊ ﺣﺎوی ﮔﻠﯿﺴﺮول ﺗﻠﻘﯿﺢ و ﺳﭙﺲ در دﻣﺎی 70- درجه سانتیﮔﺮاد ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ.

تست حسایت آنتی بیوتیکی: جهت انجام کشت آنتی‏بیوگرام یا تست حساسیت میکروبی از روش استاندارد دیسک دیفیوژن طبق پروتکل (CLSI= Clinical and Laboratory Standard Institute) استفاده و دیسک­های آنتی­بیوتیکی مورد استفاده (Himedia، هند) شامل ایمی­پنم، جنتامایسین، کلیستین به میزان 10µg، سفتازیدین، ایمیکاسین 30µg، سیپروفلوکساسین به مقدار 5µg  و پیپرسیلین تازوباکتام بود.

تست فنوتیپی و ژنوتیپی تشخیص بیوفیلم: در تست فنوتیپی از روش فریمن و همکاران توسط محیط کشت کونگو­رد­آگار استفاده (5) و محیط کشت حاوی BHI، آگار، ساکارز و رنگ کونگو رد  به ترتیب به میزان 37 g/L ، 10g/L، 50g/L و 0.8 g/L می­باشد. سویه های بالینی اسنیتوباکتر بومانی در پلیت حاوی محیط کشت کنگو­رد در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت کشت داده شده و درصورت تشکیل بیوفیلم کلنی­های مشکی رنگ و در غیر این صورت کلنی­های قرمز رنگ تشکیل می­دهند. جهت تست ژنوتیپی، ابتدا محیط کشت TSB حاوی 2% گلوکز تهیه و استریل شد و جهت تهیه سوسپانسیون باکتری، به کدورت نیم مک فارلند رسید. در انتها در یک پلیت 96 خانه به هر چاهک 200 میکرولیتر از محیط یاد شده و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری اضافه و سپس پلیت 24 ساعت انکوبه شد. 3 چاهک کنترل منفی (عدم رشد باکتری در نتیجه عدم تشکیل بیوفیلم) و 3 چاهک کنترل مثبت (رشد باکتری و تشکیل بیوفیلم) در یک پلیت انتخاب و پس از گذشت 24 ساعت برای مطالعه بیوفیلم رنگ آمیزی انجام گردید. ابتدا محیط کشت ها از داخل چاهک ها دور ریخته شده و چاهک ها 2 بار با بافر PBS با حجم 200 میکرولیتر شستشو و پس از شستشوی مرحله قبل و خالی کردن چاهک ها، به چاهک ها 200 میکرولیتر متانول مطلق افزوده و 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس متانول را دور ریخته و پلیت جهت حذف الکل ثابت شد. مقدار 100 میکرولیتر کریستال ویوله %1 به چاهک ها اضافه کرده و 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و چاهک ها خالی شد. به هر یک از چاهک ها 200 میکرولیتر استیک اسید گلاسیال 33% افزوده و بعداز گذشت 20 دقیقه پلیت با دستگاه الایزا ریدر با طول موج 640 نانومتر خوانش شد. برای بررسی نتایج از روش Optical density cut-off (ODc) استفاده شد. به منظور بررسی، ابتدا انحراف معیار و میانگین OD چاهک های کنترل منفی محاسبه و سپس طبق فرمول زیر محاسبه تعیین میزان بیوفیلم انجام شد.

ODc = چاهک های کنترل منفی OD میانگین + (3 × انحراف معیار چاهک های کنترل منفی)

بعداز محاسبه ی ODc ، OD چاهک های مورد مطالعه به صورت زیر دسته بندی شد.

بیوفیلم قوی                                       OD > 4×ODc

بیوفیلم متوسط                       4×ODc 2×ODc ˂ OD ≤

بیوفیلم ضعیف                          2×ODc ODc ˂ OD ≤

بیوفیلم منفی                                          OD ≤ ODc

شناسایی مولکولی ژن Bla-per1 با استفاده از روش مولکولی PCR: در این تحقیق جهت بررسی مولکولی حضور ژن  Bla-per1در نمونه­­ها ابتدا استخراج DNA به روش Boilling انجام شد. به این ترتیب که از کشت تازه باکتری ها به کمک لوپ یک کلنی برداشته و پس از حل کردن در میکروتیوپ حاوی 1 میکرولیتر آب مقطر، در بشر در حال جوشیدن قرار داده و پس از 15 دقیقه میکروتیوپ سانتریفیوژ شد. مایع رویی در این حالت DNA است. سپس از پرایمرهای جدول 2 استفاده و شناسایی مولکولی ژن  Bla-per1به روش واکنش PCR در حجم نهائی μL 20 مطابق جدول 1 انجام شد. هر نمونه شامل 9 μL  از 2X Master mix (Ampliqon/ Denmark)، 2 μL از Primer F و Primer R، 3 μL از DNA استخراج شده و 6 μL آب تزریق دوبار تقطیر استریل بود. با هر سری آزمایش  PCRیک کنترل مثبت و یک کنترل منفی در نظر گرفته شد. برنامه دمایی برای هر دو ژن نیز در جدول 1 ثبت شد. برنامه دمایی 32 چرخه ادامه پیدا کرد. محصولات  PCRپس از انجام واکنش روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز و تائید نهائی شد.

جدول 1-  شرایط واکنش PCR

آزمون میکرودایلوشن براث برای تعیین حداقل غلظت بازدارندگی (MIC): برای تعیین MIC  از روش رقت گیری سریالی به صورت سه بار تکرار در محیط کشت انجام شد. رقت 100 میکرولیتر بر میلی لیتر از نانوذره نقره به چاهک اول پلیت 96 خانه اضافه و پس از پیپتاژ رقت سریالی از آن تا غلظت 125/3 ادامه یافت. سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی به هرچاهک اضافه و پلیت ها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب گرمخانه گذاری شدند. یک چاهک به عنوان بلانک (حاوی محیط کشت) و چاهک دیگر به عنوان کنترل مثبت (حاوی محیط کشت و اسینتوباکتر بومانی بدون تیمار با نانوذره) استفاده شد. نهایتا، کدورت تمام چاهک ها با استفاده از دستگاه قرائت­گر الایزا در طول موج 630 نانومتر خوانش شد.

بررسی بیان ژن  Bla-per-1به کمک Real-Time PCR و آنالیز آماری: استخراج RNA از اسینتوباکتر بومانی ﺑــﻪ ﻣﻨﻈـﻮر ﺑﺮرﺳــﯽ ﺑﯿـﺎن ژن­هایAb-16S-rRNA و Bla-per-1 پس از تیمار با غلظت subMIC نانوذرات نقره توسط کیت  RNX-Plus (شرکت سیناژن، ایران) انجام گرفت. ساخت cDNA از رویRNA استخراج شده، پس از تعیین مقدار و غلظت RNA حاصل از سلول‌های بیوفیلم مثبت اسنیتوباکتربومانی تیمار شده توسط دستگاه نانودراپ، مطابق با کیت شرکت یکتا تجهیز آزما (ایران) انجام گرفت.

جدول 2- توالی پرایمرﻫﺎیﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده در PCR

در این پژوهش برای انجام تست Real-Time PCR از کیت SYBER green یکتا تجهیز آزما (ایران) استفاده و ژن16s rRNA  به عنوان ژن مرجع (کنترل داخلی) جهت بررسی بیان ژن  Bla-per-1در باکتری­های تیمار شده با نانوذرات نقره استفاده شد. طراحی پرایمرهای این تحقیق با نرم افزارهای Primer Express وGene Runner انجام گرفت. در مرحله بعد به منظور تایید پرایمرها، با استفاده از توالی­های موجود در بانک­های ژنی و ابزار آنلاین BLAST، صحت پرایمرها تایید شد. در جدول 2 توالی جفت پرایمرهای جلوبر و برگشتی دو ژن  Bla-per-1و 16s rRNA ثبت شد. ﻃﺒﻖ ﭘﺮوﺗﮑـﻞ، ﻣـﺴﺘﺮﻣﯿﮑﺲ، ﭘﺮاﯾﻤﺮﻫـﺎ و  cDNAﺳﻨﺘﺰ ﺷﺪه در ﺣﺠﻢ ﻣﻨﺎﺳـﺒﯽ ﻣﺨﻠـﻮط ﺷـﺪه و ﺗﻮﺳـﻂ دﺳـﺘﮕﺎه Corbet Real-time PCR واکنش انجام گردید. حجم واکنش 15 میکرولیتر و شامل cDNA، ﭘﺮاﯾﻤﺮ جلوبر و برگشتی برای هر دو ژن  Bla-per-1و 16s rRNA، ﻣﺴﺘﺮﻣﯿﮑس سایبرگرین و آب ﻣﻘﻄﺮ دوﺑﺎر ﺗﻘﻄﯿـﺮ اﺳـﺘﺮﯾﻞ بود. چرخه دمایی شامل دناتوراسیون اولیه در 95 درجه سانتی گراد به مدت 6 دقیقه و به دنبال آن 40 سیکل در 95 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه، 61 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه و گسترش در 72 درجه بود. همچنین از سویه ATCC 25923 اسینتوباکتر بومانی به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. ﺑﺮای ﻫﺮﻧﻤﻮﻧﻪ، واﮐـﻨﺶ دو ﻣﺮﺗﺒـﻪ اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓﺘﻪ و ﻣﯿﺎﻧﮕﯿﻦ ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﺑﻪ دﺳﺖ آﻣﺪه ﺑﻪ ﻋﻨـﻮان ﻣﻘـﺪار (ﮐﻤﯿﺖ) ﺑﯿﺎن ژن ﺑﺮای آن ﻧﻤﻮﻧﻪ در ﻧﻈﺮ ﮔﺮﻓﺘﻪ ﺷﺪ. از ﻓﺮﻣـﻮل ﻣﺮﺟـﻊ ﻧـﺴﺒﯽ ﺑﯿـﺎن لیواک به روش ΔΔCt برای تعیین بیان ژن مورد نظر استفاده گردید. ΔΔCt توسط تفریق ΔCt نمونه تیمار شده با نانوذره نقره از ΔCt نمونه تیمار نشده استاندارد به دست آمد. نسبت ژن‌ هدف به ژن مرجع 16s rRNA از طریق 2 ^–ΔΔCt محاسبه شد. در این پژوهش محاسبه آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 21 انجام و نتایج با آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA مورد بررسی قرار گرفت. تفاوت بیان ژن‌های هدف، بین نمونه‌­های کنترل و تیمار­شده با روش آماری Tukey‘s HSD post-hoc test محاسبه و مرز معناداری روی 0.05­P ≤  قرار گرفته شد.

نتایج

اﯾﺰوﻟﻪﻫﺎی اﻧﺘﺨﺎبﺷﺪه و نتایج آنتی بیوگرام باکتری، تست فنوتیپی و ژنوتیپی تشخیص بیوفیلم: از 100 نمونه جمع آوری شده 12 نمونه اسینتوباکتر بومانی از بیماران بستری به دست آمد که براساس نوع نمونه انتخاب شد که  شامل: 3 نمونه زخم، 1 نمونه خون، 4 نمونه پوست و 2 نمونه ادرار و 2 نمونه تراشه بود. نتایج حاصل از تست حساسیت میکروبی مطابق جدول3 نشان داد که اسینتوباکترهای جداسازی شده به تمام آنتی بیوتیک های ایمی­پنم، جنتامایسین، سیپروفلوکسازین، سفتازیدین، ایمیکاسین، پیپرسیلین، تازوباکتام مقاوم و نسبت به کلیستین حساس بود. در این مطالعه، از محیط کشت کنگورد آگار برای بررسی فنوتیپی بیوفیلم استفاده شد. باکتری­های بیوفیلم مثبت کلنی­های مشکی رنگ تولید کرده در صورتی که باکتری­های فاقد بیوفیلم به همان حالت اولیه یعنی قرمز رنگ باقی می­مانند (شکل 2). از میان 12سویه بالینی، تمامی سویه ها از نظر تست فنوتیپی بیوفیلم مثبت بودند. سپس تست ژنوتیپی انجام و مطابق با جدول 3 تعداد 11 سویه از باکتری ها دارای بیوفیلم قوی و سویه شماره 18 دارای بیوفیلم متوسط بود.

جدول 3- نتایج حاصل از تست حساسیت میکروبی و سنجش ژنوتیپی بیوفیلم

نتایج تایید استخراج DNA، بررسی مولکولی حضور ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی و MIC نانوذرات نقره علیه سویه های بیوفیلم مثبت:  جهت تایید استخراج DNA و حضور ژن Bla-per1 در سویه های باکتریایی مورد مطالعه تست مولکولی PCR انجام و نتایج توسط الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. مطابق با نتایج باند مورد انتظار 933 جفت بازی در تمام سویه ها تشخیص داده شد که بیانگر حضور ژن Bla-per1 می باشد. همچنین ارزیابی کمی اثرات ضد بیوفیلمی نانوذرات نقره با کمک روش حداقل غلظت مهارکنندگی یا MIC انجام گرفت. سویه­های بیوفیلم مثبت تحت تاثیر غلظت­های 125/3  تا 100 میکروگرم در میلی­لیتر از نانوذرات نقره در مدت زمان 24 ساعت قرار گرفتند. نتایج نشان داد که سویه­های مختلف دارای محدوده ای از MIC بودند. نتایج این تست در جدول 4 ثبت شد.

شکل 1- الکتروفورز محصول تکثیر شده ی ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR. ردیف2-1: محصول تکثیر شده ژن Bla-per1 با اندازه ی 933bp در سویه استاندارد و سویه بالینی، ردیف 3: کنترل منفی و ردیف 4: مارکر 100bpDNA Ladder.

مطابق با جدول 4 میزان جذب در تمامی سویه­ها بعد از تیمار با نانوذرات نقره کاهش داشته که نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم سلول­های باکتریایی و کاهش جذب نوری در نتیجه توانایی کم اتصال به کف میکروپلیت بوده است.

جدول 4- تعیین MIC نانوذره نقره در سویه های مختلف.

نتایج بررسی بیان ژن Bla-per1 سویه­های بیوفیلم مثبت در غلظت­های subMIC از نانوذره توسط روش Quantitative Real-Time PCR : نتایج نشان داد که سویه­های باکتری با دارا بودن MIC­های مختلف، تحت تاثیر نانوذرات نقره تغییر بیان مختلفی را داشته و از نظر آماری تفاوت معناداری در مقایسه با بیان ژن  16S rRNAاز خود نشان دادند (P≤0.05). نتایج حاصل از تغییر بیان ژن Bla-per1 در سویه­های بیوفیلم مثبت در جدول 5 ثبت و نمودار حاصل از تکثیر و منحنی ذوب در شکل 2 نشان داده شد.

شکل 2 - نمودار حاصل از تکثیر ژن  Bla per1.  a. نمودار تکثیر ژن  Bla per1، b. نمودار منحنی ذوب ژن  Bla per1 با دمای 9/84

بر طبق نتایج حاصل از Real-Time PCR تمام سویه­های باکتریایی تغییر بیان در ژن Bla-per1 را نشان دادند. در این پژوهش که به صورت 3 بار تکرار انجام شد مطابق با نتایج ثبت شده در جدول 5، میانگین CT­ سویه­های تیمار نشده با نانوذره نقره در مقایسه با میانگین CT سویه­های تیمار شده با نانوذره نقره عدد کمتری را نشان داد. بر اساس اصل Real-Time PCR، هر چه میزان CT کمتر میزان بیان بیشتر است. به این ترتیب میزان بیان ژن Bla-per1 در اسینتوباکتربومانی تیمار نشده با نانوذره نسبت به همان باکتری پس از تیمار با نانوذره نقره بیشتر است. از طرفی مقایسه بیان ژن Bla-per1 نسبت به ژن مرجع نشان دهنده تغییر میزان بیان این ژن در غلظت­های زیرحد کشندگی نانوذرات نقره می­باشد. با توجه به نتایج، بیشترین میزان کاهش بیان ژن bla-per1 در سویه شماره 11 و کمترین میزان کاهش بیان مربوط به سویه شماره 5 بود. این امر بیانگر مقاومت بیشتر سویه شماره 5 نسبت به سایر باکتری ها به نانوذرات نقره می باشد. مکانیسم های متفاوت مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان فعالیت بیانی ژن های مقاومت و مکانیسم های دفاعی دیگر همچون بیوفیلم عوامل مهم تعیین کننده در مقابله با مواد آنتی باکتریال می باشد. سویه شماره 5 به علت فعالیت بیشتر مکانیسم های مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان بیان کمتری از ژن bla-per1 داشته، در صورتی که سویه شماره 11 با بیان بیشتر ژن bla-per1 نسبت به مبارزه با نانوذرات نقره اقدام نموده است. تفاوت بیان ژن در سویه های اسینتوباکتر بومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره توسط نرم افزار SPSS آنالیز و روش واریانس یک طرفه انجام و نتایج نشان دهنده ی معنی داری تفاوت بیان در سطح  P≤ 0.05بود. نانوذرات نقره با تاثیر مستقیم بر کاهش بیان ژن bla-per1 می توانند مقاومت این باکتری به انواع آنتی بیوتیک ها را کاهش دهند.

جدول 5- نتایج حاصل از تغییر بیان ژن Bla-per1 در سویه های بیوفیلم مثبت قبل و پس از تیمار با نانوذره در مقایسه با ژن 16srRNA

همچنین مقایسه توانایی تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی قبل  پس از تیمار با نانوذرات نقره، نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم در این باکتری شد. این نتایج تایید کننده رابطه بین استحکام بیوفیلم اسینتوباکتر بومانی و میزان بیان ژن Bla-per1 بود به طوری که میزان توانایی تشکیل و استحکام بیوفیلم در سویه های تیمار شده با نانوذره در مقایسه با سویه های تیمار نشده به طور چشمگیری کاهش یافت. شکل شماره 4 تغییر بیان ژن Bla-per1 را با سطح منعی داری P≤ 0.05 نشان می دهد.

شکل 3- میزان بیان ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی . A . مقایسه جذب نوری سویه­های تیمار شده با نانوذرات نقره با سویه­های تیمار نشده. B . کاهش معنا دار میزان بیان ژن Bla-per1 در سویه های تیمار شده با نانوذرات نقره نسبت به ژن کنترل.

بحث و نتیجه­گیری

اسینتوباکتر­بومانی شایع­ترین عامل بیماری­زای انسانی در جنس اسینتوباکتر می­باشد و به عنوان یکی از مهمترین عوامل عفونت­های بیمارستانی به شمار می آید. یکی از مشکلات عمده در درمان و پیش گیری از عفونت های ایجاد شده توسط اسینتوباکتر بومانی، مقاومت های آنتی بیوتیکی ایجاد شده در آن می باشد و کارباپنم ها به آخرین خط درمان در عفونت های ناشی از باکتری های گرم منفی، از جمله  اسینتوباکتر بومانی می باشند. اصلی ترین عامل مقاومت به کارباپنم را می توان تولید بیوفیلم دانست (6). در خصوص مقاومت اسینتوباکتر مطالعات زیادی صورت گرفته که نتایج آن ها برحسب زمان و مکان متفاوت بوده است. بنابراین از اهداف مهم این تحقیق، بررسی میزان تشکیل بیوفیلم در سویه های بالینی اسینتوباکتر بومانی مقام به آنتی بیوتیک بوده است. پژوهش بروی توانایی اتصال، تشکیل بیوفیلم و ژن های مداخله گر در تشکیل بیوفیلم در سویه­های مختلف اسینتوباکتر بومانی می تواند اطلاعات امیدوارکننده ای در مورد درک بهتر روند پیچیده ایجاد بیوفیلم و عفونت های ناشی از این ارگانیسم ها فراهم نماید. در سال های اخیر به دنبال مقاومت و ایجاد پایداری باکتری ها به آنتی بیوتیک ها،  دلیل مناسبی برای تحقیق در خصوص ژن های بیان کننده بیوفیلم مثل (Bla-per1) در باکتری های مختلف بوده است. لادن رحیم زاده ترابی و همکاران در سال 1395 میزان شیوع ژن های BlaIMP  و BlaVIM در سویه های سودوموناس آئیوجینوزا مقاوم به چندین دارو را در مراکز درمانی اصفهان مورد مطالعه قرار دادند و نتایج حاصل از این گروه نتایج نشان می دهد که اغلب نمونه ها مقاوم به دارو هستند و در میان سویه­های تولید کننده ESBL فراوانی ژن­های بتالاکتاماز BlaIMP بیشتر از ژن BlaVIM بوده است. لذا اندازه گیری سریع و بررسی دقیق مقاومت آنتی بیوتیکی امری ضروری می باشد زیرا فراوانی سویه های تولیدکننده ژن بتالاکتاماز در سویه­های بیمارستانی رو به افزایش است (7).

می­توان گفت محققین بسیاری وجود داشته اند که علاقه به بررسی مقاومت اسنیتوباکتر بومانی به آنتی­بیوتیک­های مختلف بوده­اند. لیهائو کی و همکارانش در سال 2016 میلادی مطالعه ای مبنی بر ارتباط بین مقاومت آنتی بیوتیکی، تشکیل بیوفیلم و مقاومت ویژه ی بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی انجام دادند. در مطالعه آنها ارتباط بین مقاومت آنتی بیوتیکی، تشکیل بیوفیلم و مقاومت ویژه­ی بیوفیلم در ایزوله های بالینی اسینتوباکتر بومانی بررسی گردید (14).

مجتبی ساده و همکارانش در سال 1392 شمسی مطالعه­ای با عنوان بررسی ژن های بتالاکتاماز (BlaTEM , blaCTX) مقاوم به دارو و گلوتارآلدئید در ایزوله های اسینتوباکتر بومانی انجام دادند. دستاورد آنها نشان داد که علاوه بر تنوع و شیوع ژن­های BlaTEM , BlaCTX مکانیسم های متعددی شامل پورین ها و Efflux pump درایجاد مقاومت­های اسینتوباکتربومانی نسبت به مواد ضد­میکروبی نقش دارند (8).

ریچا سینگ و همکارانش در سال 2016 میلادی مطالعه­ای مبنی بر نانوذرات برای کنترل عفونت ناشی از بیوفیلم گونه­های اسینتوباکتر انجام دادند. در گزارش آنها به اهمیت نقش نانوذرات مختلف به عنوان عوامل ضد بیوفیلمی در اسنیتوباکتر، مواد پوشاننده­ی سطح برای کنترل و درمان بیوفیلم های اسینتوباکتر پرداخته شد و نتیجه­ی مثبت تاثیر نانوذرات بر کاهش تولید بیوفیلم را گزارش نمودند(18).

اسلامی و همکاران در سال 1390 شمسی الگوی حساسیت و مقاومت آنتی­بیوتیکی در سویه های اسینتوباکتر جدا شده از نمونه های بالینی  بیمارستان آراد تهران را مورد مطالعه قرار دادند. نتایج مطالعه­ی این گروه نشان از افزایش مقاومت سویه­های اسینتوباکتر نسبت به آنتی­بیوتیک­های جنتامایسین و آمیکاسین بود که علت آن را به مصرف بی رویه آنتی­بیوتیک­ها نسبت دادند (1).

محققان دیگری در صدد بودند تا تاثیر بیوفیلم را در ثبات و بقای باکتری در محیط بخصوص در بیمارستان­ها (که عاملی برای ایجاد عفونت­های بیمارستانی است) را نشان دهند. ویدال و همکارانش در سال 1996 میلادی در خصوص ساختار بیوفیلم ثابت نمودند که در اسینتوباکتربومانی سلول­های چسبنده­ای که با روکش­های گوناگونی پوشیده می­شوند، به شکل حد­واسط در شرایط کمبود مواد غذایی ساختار بیوفیلم تشکیل داده و به پایدار آن کمک می­کنند. یافته­ها حاکی از افزایش سریع در شمار و تعداد سلول­های بیوفیلم و افزایش نسبی در شمار سلول های حاوی مقاومت وجود دارد. این تحقیق ثابت کرد که وجود بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی از این میکروارگانیسم در برابر فاکتورهای گوناگون ضد باکتریایی محافظت می­کند (21).

توانایی فوق العاده ی نقره به عنوان عامل ضد میکروبی سبب استفاده از نانوذرات این ماده در تحقیقات بسیاری از محققان بوده است. تحقیقات مختلفی نشان دادند که نانوذرات توانایی چشمگیری در مهار بیماری­های عفونی باکتریایی دارند. طبق تحقیقات هندیانی و همکاران در سال 2015 میلادی درخصوص سنتز نانوذرات نقره و اثرات سینرژیک آن­ها در ترکیب با ایمی­پنم و دو بیوساید (کشنده­ی زیستی) علیه بیوفیلم تشکیل شده توسط اسینتوباکتربومانی­، اثرات نانوذرات نقره به تنهایی و در ترکیب با بیوساید­ها و ایمی­پنم برضد بیوفیلم­های اسینتوباکتربومانیو فرم پلانکتونی آن بررسی شد. نتیجه و دستاورد تحقیق این گروه بیانگر این نکته بود که نانوذرات نقره به تنهایی می­توانند سبب مهار تشکیل بیوفیلم شوند اما اثر آنها در ترکیب با ایمی پنم برضد اشکال بیوفیلم­ها و شکل پلانکتونی اسینتوباکتربومانی موثرتر است (3). هندیایی و همکاران در سال 1391 مطالعه­ای درخصوص ﻣﻘﺎﯾﺴﻪ ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ ﺿﺪ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻤﯽ ﻧﺎﻧﻮ ذره ﻧﻘﺮه و ﭼﻨﺪ ﺗﺮﮐﯿﺐ ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ دﯾﮕﺮ ﻋﻠﯿﻪ سویه­های اسینتوباکتر ﻣﻮﻟﺪ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ انجام دادند. نتایج مطالعه­ی اخیر این بود که اﺳﺘﻔﺎده از ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت داروﯾﯽ ﺑﺎ ﻃﯿﻒ وﺳﯿﻊ­ﺗﺮ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه در ﺗﺮﮐﯿﺐ ﺑﺎ ﻣﻮاد ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ ﻣﻨﺎﺳﺐ ﻣﯽ­ﺗﻮاﻧﺪ ﺑﺎﻋﺚ ﮐﺎﻫﺶ ﺗﺸﮑﯿﻞ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ و ﺣﺬف ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ­ﻫﺎی ﺑﺎﻟﻎ، ﮐﺎﻫﺶ دوز ﻣﻮﺛﺮ دارو­ﻫﺎ، اﻓﺰاﯾﺶ ﮐﺎرآﯾﯽ درﻣﺎن و ﺟﻠﻮﮔﯿﺮی از ﺗﺸﮑﯿﻞ ﺳﻮﯾﻪ­ﻫﺎی ﻣﻘﺎوم ﺷﻮد (22).

جیان لوئیجی و همکاران در سال 2015 میلادی مطالعه­ای با عنوان نانوذرات نقره به عنوان عوامل ضد باکتریایی انجام دادند. این گروه در این مقاله تلاش­های جدید را برای مشخص کردن چالش ها و راه حل­های اخیر در درمان بیماری­های عفونی بویژه کاربرد نانونقره­ی آنتی­میکروبیال به صورت خلاصه ارائه کرده و نشان دادند که نانوذرات نقرات باعث کاهش رشد عوامل میکروبی می­شوند (9).

ﻧﺘﺎﯾﺞ اﯾﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺑﯿﺎﻧﮕﺮ اﯾﻦ اﺳﺖ ﮐﻪ نانوذرات نقره روی بیان ژن Bla-per1 بیوفیلم در اسنیتوباکتربومانی تاثیر داشته و باعث کاهش بیان این ژن می­گردد. کاهش بیان ژن باعث عملکرد ضعیف بیوفیلم شده و در واقع بیوفیلم تولید شده در مقایسه با سویه­های غیرتیمار شده با  نانوذره نقره داری بیان ژن Bla-per1 ضعیف­تر بوده و استحکام کمتری دارد. همچنین از میزان مقاومت باکتری به آنتی­بیوتیک­ها و سایر مواد ضدعفونی کننده و دارویی کاسته شد. مکانیسم های متفاوت مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان فعالیت بیانی ژن­های مقاومت و مکانیسم­های دفاعی دیگر همچون بیوفیلم و افلاکس پمپ­ها عوامل مهم تعیین کننده در مقابله با مواد آنتی­باکتریال می­باشد. تفاوت بیان ژن در سویه­های اسینتوباکتربومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره توسط نرم افزار SPSS و روش واریانس یک طرفه انجام و نتایج نشان دهنده­ی معنی­داری تفاوت بیان در سطح  P≤ 0.05بود. نانوذرات نقره با تاثیر مستقیم بر کاهش بیان ژن Bla-per1 می­توانند مقاومت این باکتری به انواع آنتی­بیوتیک­ها را کاهش دهند. همچنین مقایسه توانایی تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتربومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره، نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم در این باکتری بود. این نتایج تایید­کننده رابطه بین استحکام بیوفیلم اسینتوباکتربومانی و میزان بیان ژن Bla-per1 بود؛ به طوری که میزان توانایی تشکیل و استحکام بیوفیلم در سویه­های تیمار شده با نانوذره در مقایسه با سویه­های تیمار نشده به طور چشمگیری کاهش یافت. بنابراین نانوذرات نقره می­تواند به عنوان داروی مناسب آنتی­باکتریال مطرح و جهت نگه داری مواد غذایی جایگزین مواد شیمیایی و مضر گردد. از طرفی ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﻫﻤﯿﺖ ﻣﻘﺎوﻣﺖ آﻧﺘﯽ­ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ، ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺳﺎﯾﺮ ژن­های ویرولانس مرتبط با بیوفیلم مانند Csu، Vir، Tol، Sec و Tat و ارﺗﺒﺎط آن با تشکیل بیوفیلم ﭘﯿﺸﻨﻬﺎد ﻣﯽ­ﮔﺮدد. از آنجایی که نانوذرات نقره به عنوان نانوذرات فلزی اثرات خوبی روی سویه­های مورد آزمایش اسینتوباکتربومانی دارند می­توان از این ماده به شکل گسترده در ضدعفونی کردن محیط و پسماندهای بیمارستانی و همچنین به شکل خوراکی یا تماسی استفاده کرد.

ﺗﺸﮑﺮ و ﻗﺪرداﻧﯽ

از همکاری صمیمانه مسیولین محترم بیمارستان های شهر تهران به خصوص شریعتی، همچنین جناب آقای حسینی، مسئول آزمایشگاه میکروبی دانشگاه علوم دارویی، که ما را در انجام این پروژه یاری فرمودند، تشکر و قدردانی می­شود.