نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد شهرکرد
2 3- گروه زیست شناسی، واحد تهران مرکزی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی ،دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد،ایران
چکیده
اسینتوباکتر بومانی یکی از عوامل پاتوژن شایع بیمارستانی است که به دلیل تولید بیوفیلم به بسیاری از آنتی بیوتیک ها مقاوم شده و درمان آن را مشکل ساخته است.
در این مطالعه تجربی، سویه های اسینتوباکتر بومانی از 100 نمونه بالینی جداسازی شد. بعد از شناسایی سویه های اسینتوباکتر بومانی و تعیین مقاومت میکروبی آن، سویه های تشکیل دهنده بیوفیلمی با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلی مرازی (PCR) شناسایی شدند. میزان MIC (Minimum Inhibitory Concentration) سویه ها علیه نانوذرات نقره تعیین شد، تیمار سویه ها با غلظت زیر حد مهارکنندگی (SubMIC) انجام گرفت و استخراج RNA و سنتز cDNA انجام گرفت. در نهایت، ارزیابی بیان ژن تشکیل بیوفیلم bla-per1 با استفاده از روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.
از میان 100 نمونه بالینی، 12 نمونه مربوط به اسینتوباکتر بومانی بودند که به تمامی آنتی بیوتیک ها بجز کلیستین مقاوم بودند. نتایج PCR نشان داد که تمامی 12 سویه دارای ژن bla-per1 بودند و دارای بیوفیلم بودند. نتایج Real Time PCR نشان داد که به دنبال تیمار سویه ها با غلظت SubMIC نانوذرات نقره، تمامی سویه ها دارای کاهش بیان معناداری در ژن bla-per1 (P
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evaluation of silver nanoparticles effects on bla-per1 gene expression for biofilm formation in isolates of antibiotic-resistant Acientobacter Bumanni by real time PCR method
نویسندگان [English]
1 azad shahrekord university
2 Department of Biology, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
3 Department of Biology,Faculty Of Science, Shahrekord Branch,Islamic Azad University,shahrekord,Iran
چکیده [English]
Acinetobacter bomanni is one of the most common opportunistic pathogen in hospital that is resistant to many antibiotics due to the production of biofilm.
: In this experimental study, Acientobacter bumanni were isolates from 100 clinical samples. After identification of Acientobacter bummani strains and determination of antibiotic resistant profiles, biofilm producer isolates were determined using PCR method. The Minimum inhibitory concentration (MIC) of strains against AgNPs was determined. After 24 hours exposure of strains with subMIC concentration of AgNPs, RNA extraction and cDNA synthesis was performed. Finally, evaluation of bla-per1 gene expression was measured using real time PCR method.
Results: out of 100 clinical isolates, 12 isolates were belonged to Acientobacter bummani and all of strains were resistant to antibiotics except colistin. PCR results show that 12 isolates have bla-per1 gene and they were biofilm positive. Real Time PCR results show that after treatment of isolates with subMIC concentration of AgNPs, all of strains had a significant reduction in bla-per1 gene expression (P
کلیدواژهها [English]
بررسیتاثیر نانوذرات نقره بر بیان ژن Bla-per1 موثر در استحکام بیوفیلم در سویههای اسینتوباکتربومانی مقاوم به آنتیبیوتیک، با استفاده از روش
Quantitative Real-Time PCR
توحید پیری قراقیه1*، سید عطااله سادات شاندیز2 و شیدا بیرانوند1
1 ایران، شهرکرد، دانشگاه آزاداسلامی، واحد شهرکرد، گروه زیست شناسی
2 ایران، تهران، دانشگاه آزاداسلامی، واحد تهران مرکزی، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 02/10/1398 تاریخ پذیرش: 07/07/1399
چکیده
اسینتوباکتربومانی به دلیل افزایش مقاومت آنتیبیوتیکی و حدت، عامل اصلی عفونتهای شدید بیمارستانی است. توانایی اسینتوباکتر بومانی در تشکیل بیوفیلم به بقای آن در شرایط نامساعد محیطی از جمله محیط بیمارستان و تجهیزات پزشکی کمک میکند. هدف از این مطالعه بررسی اثرات نانوذرات نقره روی استحکام بیوفیلم ایزولههای بالینی مقاوم به آنتی بیوتیک اسینتوباکتر بومانی میباشد. پس از جداسازی و تشخیص افتراقی 100 نمونه بالینی اسینتوباکتر بومانی ، تعیین مقاومت میکروبی به روش آنتی بیوگرام انجام و سویه های تشکیل دهنده بیوفیلم با تست فنوتیپی و ژنوتیپی شناسایی شدند. حداقل غلظت بازدارندگی از رشد سویه ها علیه نانوذرات تجاری نقره تعیین و بررسی بیان ژن Bla-per1 سویه های مقاوم تیمار شده با غلظت SubMIC نانوذرات نقره به روش Quantitative Real- Time PCR انجام شد. تعداد 12 نمونه از باکتری ها جداشده مربوط به اسینتوباکتر بومانی به تمامی آنتیبیوتیکهای مورد مطالعه بجز کلیستین مقاوم بوده و ساختار بیوفیلم قوی تشکیل دادند. بررسی مولکولی PCR تایید کننده حضور ژن Bla-per1 در سویههای مقاوم بود. تیمار سویهها با غلظت SubMIC نانوذرات نقره کاهش بیان قابل قبولی در بیان ژن Bla-per1 در سطح معناداری P≤0.05 نشان داد. نانوذرات نقره دارای اثرات بیولوژیکی معناداری بر کاهش حدت و بیان ژن های مقاومت و تشکیل بیوفیلم اسینتوباکتربومانی می باشند، بنابراین به عنوان کاندید دارویی می توانند مورد توجه قرار گیرند.
وازه های کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، بیوفیلم، نانوذرات نقره ، ژن Bla-per1.
* نویسنده مسئول، تلفن:؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟ ، پست الکترونیکی: Ata.sadatshandiz@iauctb.ac.ir
مقدمه
اسینتوباکتر بومانی یک باکتری گرم منفی در ارتباط با عفونتهای کسب شده از بیمارستان، به خصوص عفونتهای بخش مراقبتهای ویژه یا ICU می باشد. این عفونتها شامل عفونتهای باکتریائی از جمله باکتریمی، پنومونی، عفونتهای مجاری ادراری، مننژیت و عفونت زخم میباشند(1و 19). معمولا عفونتهای جدی و شدید ناشی از اسینتوباکتر بومانی با استفاده از ایمیپنم به عنوان داروی انتخابی مورد درمان قرار می گیرند (2). با این وجود مقاومت به این دارو در سالهای اخیر در میان گونههای اسینتوباکتر بومانی در حال افزایش میباشد و این ایزولهها معمولا مولتی دراگ رسیستنت (multidrug resistance) یا MDR هستند(23). سویههای MDR اسینتوباکتر بومانی ظرفیت ویرانکنندهای برای مقاومت و گردش و انتقال در فضای بیمارستان دارند؛ دلیل این امر توانایی زیاد آنها در تشکیل بیوفیلم روی سطوح زنده و غیر زنده میباشد (3 و 25). این کوکوباسیل ها بر روی سطوح مختلف از جمله تجهیزات پزشکی و انواع دستگاههای در ارتباط با پزشکی همچون کاتترهای وریدی و ادراری و لوله تراشههای مورد استفاده در گلو تشکیل بیوفیلم می دهند (3). با توجه به ماهیت چند فاکتوری تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی تعدادی از ژنها و محصولات آنها در این فرایند دخیل میباشند که در مقالات متعدد این ژنها شامل OmpA، پروتئین مرتبط با بیوفیلم Bap (25) و همچنین بتالاکتامازper-1 یا Bla-per1 گزارش شده است که نقش بسیار مهمی در چسبندگی و تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی ایفا میکنند (10). علاوه بر این طیف گستردهای از ژنهای بتالاکتاماز (ESBL) که یکی از مهمترین آنها در ارتباط با اسینتوباکتر ژن Bla-per1 میباشد، عامل ایجاد مقاومت به پنیسیلین (penicillins) سفوتاکسیم (cefotaxime) سفتیبوتن (ceftibuten) سفتازیدیم (ceftazidime) و مونوباکتام (monobactam) میباشد (24) اما مقاومت به کارباپنم (carbapenem) و سفامایسین (cephamycin) را کاهش میدهد. در مطالعات سشی در سال ۲۰۰۴ نشان داده شد که چسبندگی اسینتوباکتر بومانی به سطوح پلاستیکی و سلولهای اپیتلیال برونش (bronchial epithelial cells) تا حد زیادی وابسته به حضور و بیان Bla-per1 و پروتئینهای ناشی از بیان این ژن میباشد(20). امروزه محققان در حال جستجوی راهحل های جدید برای درمان باکتریهای مقاوم به دارو هستند. یکی از این رویکردها بکارگیری نانوذرات که همواره یکی از زمینههای کاربردی نانوبیوتکنولوژی در درمان عفونتهای میکروبی بوده، میباشد (11). از زمان باستان خواص ضدمیکروبی نقره شناخته شده است ولی اخیرا به دلیل ساخته شدن نقره به صورت نانو ذرات، سطح تماس و خاصیت ضد میکروبی آن تا بیش از 99 درصد افزایش یافته است (12). ﻧﻘﺮه در اﺑﻌﺎد ﺑﺰرﮔﺘﺮ ﻓﻠﺰی ﺧﺎﺻﯿﺖ واﮐﻨﺶدﻫﯽ ﮐﻤﯽ دارد، وﻟﯽ زﻣﺎﻧﯽ ﮐﻪ ﺑﻪ اﺑﻌﺎد ﮐﻮﭼﮑﺘﺮ در ﺣﺪ ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ ﺗﺒﺪﯾﻞ ﻣﯽﺷﻮد، ﺧﺎﺻﯿﺖ ﻣﯿﮑﺮوبﮐﺸﯽ آن افزایش مییابد، به همین دلیل در پزشکی به بررسی اثرات آن اهمیت داده میشود (13). نانوذرات نقره به علت داشتن بار سطحی و نسبت سطح به حجم خود، آنزیمها و DNA میکروارگانیسمها را با تعادل الکترون بین گروه های دهنده الکترون مثل تیول، کربوکسیلات، آمید، ایمیدازول، اندول و هیدروکسیل غیرفعال مینماید. تغییرات ضدمیکروبی که از رشد باکتری بیماریزا ممانعت میکنند، یک هدف مطلوب محسوب میشود (17). از آنجا که در زمان تشکیل بیوفیلم هزینههای درمان بالا رفته و گرانبودن درمانهای فعلی برای مبارزه با بیوفیلم این باکتری و همچنین عدم کارایی کافی این روشها، استفاده از نانوذرات نقره برای درمان میتواند راهکار مناسبی تلقی شود. به دلیل مقاومتهای آنتیبیوتیکی اسینتوباکتر بومانی، کلاسهای کمی از آنتیبیوتیکها برای درمان عفونتهای ناشی از این باکتری مورد استفاده قرار گرفته و درنتیجه ایمیپنمها و کارباپنمها از مهمترین گزینههای مطرح برای درمان آنتیبیوتیکی میباشند. این آنتیبیوتیکها آخرین خط درمانی در مبارزه با عفونتهای ناشی از باکتریهای گرم منفی، ازجمله اسینتوباکتر بومانی میباشند. طبق مطالعات، کلید اصلی مقاومت به کارباپنمها را میتوان در بیان ژنهای Bla-per1جستجو کرد (16). اگرچه حضور و بیان ژنBla-per1 بهطور مستقیم با تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتربومانی در ارتباط نمیباشد اما آنالیز سیلیکویی (silico analysis) نشان داد که این ژن در اسینتوباکتر بومانی بر روی پلاسمید حمل شده و با کلاس یک اینتگرونها و ترنسپوزونها در ارتباط است. این عناصر ژنتیکی قابل انتقال معمولا ژنهای مقاومت به آنتیبیوتیک را حمل کرده و در برخی مواقع تکههایی از ژنهای متابولیک (که در کنار یکدیگر تجمع دارند) توسط این فرآیند به شکل انتقال ژن افقی (horizontal gene transfer mechanism) بین باکتری ها منتقل می شود(2). به کمک این مکانیسم مشخص شد که احتمالا ژنهای کناری ABC transporter و ATP binding protein ها که در کنار ژن Bla-per1 قرار گرفتهاند به عنوان رتروترنسپوزونهای (retrotransposon ISCR1) iscr1 میتوانند به گونهای در تشکیل ساختار بیوفیلم دارای نقش ایفا کنند (9). از آنجایی که نانوذرات نقره به عنوان نانوذرات فلزی اثرات خوبی روی سویه های مورد آزمایش اسینتوباکتر دارند، می توان از این ماده به شکل گسترده در ضدعفونی کردن محیط و پسماندهای بیمارستانی و همچنین به شکل خوراکی یا تماسی در بدن استفاده کرد. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر نانوذرات نقره بر میزان بیان ژن Bla-per1 می باشد که در استحکام بیوفیلم در سویه های مقاوم به داروی اسینتوباکتربومانی نقش دارد.
ﻣﻮاد و روشها
تهیه نانوذرات نقره و جمع آوری اﯾﺰوﻟﻪﻫﺎی باکتریایی: نانوذره نقره با اندازه متوسط 20 نانومتر و خلوص 99/99% ساخت شرکت آمریکایی US Nanoاز شرکت برهان خریداری گردید. در این پژوهش طی سال های 1397 تا 1398، به مدت پنج ماه تعداد 100 نمونه بالینی مشکوک به اسینتوباکتر از بیمارستانهای شهر تهران جمع آوری و در محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد. به منظور تایید تشخیص جنس و گونه اسینتوباکتر، پس از انتقال نمونهها به محیط آزمایشگاه، هر یک از نمونهها را روی محیطهای کشت بلاد آگار و مککانکی آگار کشت داده و سپس محیطهای کشت به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور نگهداری شدند. ﺑﺮای ﻧﮕﻬﺪاری طولانی مدت ﺑﺎﮐﺘﺮیﻫﺎ، آﻧﻬﺎ را در ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﻣﺎﯾﻊ ﺣﺎوی ﮔﻠﯿﺴﺮول ﺗﻠﻘﯿﺢ و ﺳﭙﺲ در دﻣﺎی 70- درجه سانتیﮔﺮاد ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ.
تست حسایت آنتی بیوتیکی: جهت انجام کشت آنتیبیوگرام یا تست حساسیت میکروبی از روش استاندارد دیسک دیفیوژن طبق پروتکل (CLSI= Clinical and Laboratory Standard Institute) استفاده و دیسکهای آنتیبیوتیکی مورد استفاده (Himedia، هند) شامل ایمیپنم، جنتامایسین، کلیستین به میزان 10µg، سفتازیدین، ایمیکاسین 30µg، سیپروفلوکساسین به مقدار 5µg و پیپرسیلین تازوباکتام بود.
تست فنوتیپی و ژنوتیپی تشخیص بیوفیلم: در تست فنوتیپی از روش فریمن و همکاران توسط محیط کشت کونگوردآگار استفاده (5) و محیط کشت حاوی BHI، آگار، ساکارز و رنگ کونگو رد به ترتیب به میزان 37 g/L ، 10g/L، 50g/L و 0.8 g/L میباشد. سویه های بالینی اسنیتوباکتر بومانی در پلیت حاوی محیط کشت کنگورد در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت کشت داده شده و درصورت تشکیل بیوفیلم کلنیهای مشکی رنگ و در غیر این صورت کلنیهای قرمز رنگ تشکیل میدهند. جهت تست ژنوتیپی، ابتدا محیط کشت TSB حاوی 2% گلوکز تهیه و استریل شد و جهت تهیه سوسپانسیون باکتری، به کدورت نیم مک فارلند رسید. در انتها در یک پلیت 96 خانه به هر چاهک 200 میکرولیتر از محیط یاد شده و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری اضافه و سپس پلیت 24 ساعت انکوبه شد. 3 چاهک کنترل منفی (عدم رشد باکتری در نتیجه عدم تشکیل بیوفیلم) و 3 چاهک کنترل مثبت (رشد باکتری و تشکیل بیوفیلم) در یک پلیت انتخاب و پس از گذشت 24 ساعت برای مطالعه بیوفیلم رنگ آمیزی انجام گردید. ابتدا محیط کشت ها از داخل چاهک ها دور ریخته شده و چاهک ها 2 بار با بافر PBS با حجم 200 میکرولیتر شستشو و پس از شستشوی مرحله قبل و خالی کردن چاهک ها، به چاهک ها 200 میکرولیتر متانول مطلق افزوده و 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس متانول را دور ریخته و پلیت جهت حذف الکل ثابت شد. مقدار 100 میکرولیتر کریستال ویوله %1 به چاهک ها اضافه کرده و 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و چاهک ها خالی شد. به هر یک از چاهک ها 200 میکرولیتر استیک اسید گلاسیال 33% افزوده و بعداز گذشت 20 دقیقه پلیت با دستگاه الایزا ریدر با طول موج 640 نانومتر خوانش شد. برای بررسی نتایج از روش Optical density cut-off (ODc) استفاده شد. به منظور بررسی، ابتدا انحراف معیار و میانگین OD چاهک های کنترل منفی محاسبه و سپس طبق فرمول زیر محاسبه تعیین میزان بیوفیلم انجام شد.
ODc = چاهک های کنترل منفی OD میانگین + (3 × انحراف معیار چاهک های کنترل منفی)
بعداز محاسبه ی ODc ، OD چاهک های مورد مطالعه به صورت زیر دسته بندی شد.
بیوفیلم قوی OD > 4×ODc
بیوفیلم متوسط 4×ODc 2×ODc ˂ OD ≤
بیوفیلم ضعیف 2×ODc ODc ˂ OD ≤
بیوفیلم منفی OD ≤ ODc
شناسایی مولکولی ژن Bla-per1 با استفاده از روش مولکولی PCR: در این تحقیق جهت بررسی مولکولی حضور ژن Bla-per1در نمونهها ابتدا استخراج DNA به روش Boilling انجام شد. به این ترتیب که از کشت تازه باکتری ها به کمک لوپ یک کلنی برداشته و پس از حل کردن در میکروتیوپ حاوی 1 میکرولیتر آب مقطر، در بشر در حال جوشیدن قرار داده و پس از 15 دقیقه میکروتیوپ سانتریفیوژ شد. مایع رویی در این حالت DNA است. سپس از پرایمرهای جدول 2 استفاده و شناسایی مولکولی ژن Bla-per1به روش واکنش PCR در حجم نهائی μL 20 مطابق جدول 1 انجام شد. هر نمونه شامل 9 μL از 2X Master mix (Ampliqon/ Denmark)، 2 μL از Primer F و Primer R، 3 μL از DNA استخراج شده و 6 μL آب تزریق دوبار تقطیر استریل بود. با هر سری آزمایش PCRیک کنترل مثبت و یک کنترل منفی در نظر گرفته شد. برنامه دمایی برای هر دو ژن نیز در جدول 1 ثبت شد. برنامه دمایی 32 چرخه ادامه پیدا کرد. محصولات PCRپس از انجام واکنش روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز و تائید نهائی شد.
جدول 1- شرایط واکنش PCR
Bla-per1 |
واسرشت اولیه |
واسرشت |
اتصال |
ساخت |
ساخت پایانی |
دما (◦C) |
95 |
94 |
55.5 |
72 |
72 |
زمان |
5 دقیقه |
1 دقیقه |
1 دقیقه |
1 دقیقه |
5 دقیقه |
آزمون میکرودایلوشن براث برای تعیین حداقل غلظت بازدارندگی (MIC): برای تعیین MIC از روش رقت گیری سریالی به صورت سه بار تکرار در محیط کشت انجام شد. رقت 100 میکرولیتر بر میلی لیتر از نانوذره نقره به چاهک اول پلیت 96 خانه اضافه و پس از پیپتاژ رقت سریالی از آن تا غلظت 125/3 ادامه یافت. سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی به هرچاهک اضافه و پلیت ها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب گرمخانه گذاری شدند. یک چاهک به عنوان بلانک (حاوی محیط کشت) و چاهک دیگر به عنوان کنترل مثبت (حاوی محیط کشت و اسینتوباکتر بومانی بدون تیمار با نانوذره) استفاده شد. نهایتا، کدورت تمام چاهک ها با استفاده از دستگاه قرائتگر الایزا در طول موج 630 نانومتر خوانش شد.
بررسی بیان ژن Bla-per-1به کمک Real-Time PCR و آنالیز آماری: استخراج RNA از اسینتوباکتر بومانی ﺑــﻪ ﻣﻨﻈـﻮر ﺑﺮرﺳــﯽ ﺑﯿـﺎن ژنهایAb-16S-rRNA و Bla-per-1 پس از تیمار با غلظت subMIC نانوذرات نقره توسط کیت RNX-Plus (شرکت سیناژن، ایران) انجام گرفت. ساخت cDNA از رویRNA استخراج شده، پس از تعیین مقدار و غلظت RNA حاصل از سلولهای بیوفیلم مثبت اسنیتوباکتربومانی تیمار شده توسط دستگاه نانودراپ، مطابق با کیت شرکت یکتا تجهیز آزما (ایران) انجام گرفت.
جدول 2- توالی پرایمرﻫﺎیﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده در PCR
دمای اتصال |
محصول (bp) |
توالی ها |
ژن هدف |
55.5 |
933 |
5´-ATGAATGTCATTATAAAAGC-3´ F 5´-TTAATTTGGGCTTAGGGCAGAA-3´ R |
Bla-per-1 |
60 |
110 |
F 5’TATCAGGACCATCTGGAGTAGG-3’ R 5’-CATCAACTTCACCTTCACGC-3’ |
16S rRNA |
در این پژوهش برای انجام تست Real-Time PCR از کیت SYBER green یکتا تجهیز آزما (ایران) استفاده و ژن16s rRNA به عنوان ژن مرجع (کنترل داخلی) جهت بررسی بیان ژن Bla-per-1در باکتریهای تیمار شده با نانوذرات نقره استفاده شد. طراحی پرایمرهای این تحقیق با نرم افزارهای Primer Express وGene Runner انجام گرفت. در مرحله بعد به منظور تایید پرایمرها، با استفاده از توالیهای موجود در بانکهای ژنی و ابزار آنلاین BLAST، صحت پرایمرها تایید شد. در جدول 2 توالی جفت پرایمرهای جلوبر و برگشتی دو ژن Bla-per-1و 16s rRNA ثبت شد. ﻃﺒﻖ ﭘﺮوﺗﮑـﻞ، ﻣـﺴﺘﺮﻣﯿﮑﺲ، ﭘﺮاﯾﻤﺮﻫـﺎ و cDNAﺳﻨﺘﺰ ﺷﺪه در ﺣﺠﻢ ﻣﻨﺎﺳـﺒﯽ ﻣﺨﻠـﻮط ﺷـﺪه و ﺗﻮﺳـﻂ دﺳـﺘﮕﺎه Corbet Real-time PCR واکنش انجام گردید. حجم واکنش 15 میکرولیتر و شامل cDNA، ﭘﺮاﯾﻤﺮ جلوبر و برگشتی برای هر دو ژن Bla-per-1و 16s rRNA، ﻣﺴﺘﺮﻣﯿﮑس سایبرگرین و آب ﻣﻘﻄﺮ دوﺑﺎر ﺗﻘﻄﯿـﺮ اﺳـﺘﺮﯾﻞ بود. چرخه دمایی شامل دناتوراسیون اولیه در 95 درجه سانتی گراد به مدت 6 دقیقه و به دنبال آن 40 سیکل در 95 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه، 61 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه و گسترش در 72 درجه بود. همچنین از سویه ATCC 25923 اسینتوباکتر بومانی به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. ﺑﺮای ﻫﺮﻧﻤﻮﻧﻪ، واﮐـﻨﺶ دو ﻣﺮﺗﺒـﻪ اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓﺘﻪ و ﻣﯿﺎﻧﮕﯿﻦ ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﺑﻪ دﺳﺖ آﻣﺪه ﺑﻪ ﻋﻨـﻮان ﻣﻘـﺪار (ﮐﻤﯿﺖ) ﺑﯿﺎن ژن ﺑﺮای آن ﻧﻤﻮﻧﻪ در ﻧﻈﺮ ﮔﺮﻓﺘﻪ ﺷﺪ. از ﻓﺮﻣـﻮل ﻣﺮﺟـﻊ ﻧـﺴﺒﯽ ﺑﯿـﺎن لیواک به روش ΔΔCt برای تعیین بیان ژن مورد نظر استفاده گردید. ΔΔCt توسط تفریق ΔCt نمونه تیمار شده با نانوذره نقره از ΔCt نمونه تیمار نشده استاندارد به دست آمد. نسبت ژن هدف به ژن مرجع 16s rRNA از طریق 2 –ΔΔCt محاسبه شد. در این پژوهش محاسبه آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 21 انجام و نتایج با آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA مورد بررسی قرار گرفت. تفاوت بیان ژنهای هدف، بین نمونههای کنترل و تیمارشده با روش آماری Tukey‘s HSD post-hoc test محاسبه و مرز معناداری روی 0.05P ≤ قرار گرفته شد.
نتایج
اﯾﺰوﻟﻪﻫﺎی اﻧﺘﺨﺎبﺷﺪه و نتایج آنتی بیوگرام باکتری، تست فنوتیپی و ژنوتیپی تشخیص بیوفیلم: از 100 نمونه جمع آوری شده 12 نمونه اسینتوباکتر بومانی از بیماران بستری به دست آمد که براساس نوع نمونه انتخاب شد که شامل: 3 نمونه زخم، 1 نمونه خون، 4 نمونه پوست و 2 نمونه ادرار و 2 نمونه تراشه بود. نتایج حاصل از تست حساسیت میکروبی مطابق جدول3 نشان داد که اسینتوباکترهای جداسازی شده به تمام آنتی بیوتیک های ایمیپنم، جنتامایسین، سیپروفلوکسازین، سفتازیدین، ایمیکاسین، پیپرسیلین، تازوباکتام مقاوم و نسبت به کلیستین حساس بود. در این مطالعه، از محیط کشت کنگورد آگار برای بررسی فنوتیپی بیوفیلم استفاده شد. باکتریهای بیوفیلم مثبت کلنیهای مشکی رنگ تولید کرده در صورتی که باکتریهای فاقد بیوفیلم به همان حالت اولیه یعنی قرمز رنگ باقی میمانند (شکل 2). از میان 12سویه بالینی، تمامی سویه ها از نظر تست فنوتیپی بیوفیلم مثبت بودند. سپس تست ژنوتیپی انجام و مطابق با جدول 3 تعداد 11 سویه از باکتری ها دارای بیوفیلم قوی و سویه شماره 18 دارای بیوفیلم متوسط بود.
جدول 3- نتایج حاصل از تست حساسیت میکروبی و سنجش ژنوتیپی بیوفیلم
Biofilm |
CL |
PTZ |
MEN |
AMI |
CIR |
CAZ |
GEN |
IMI |
Sym/ St |
R |
R |
R |
I |
S |
S |
R |
R |
R |
5 |
R |
R |
R |
R |
R |
S |
R |
I |
R |
9 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
11 |
I |
R |
I |
R |
R |
S |
R |
R |
I |
18 |
R |
R |
R |
R |
R |
S |
R |
R |
R |
24 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
28 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
31 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
33 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
36 |
R |
R |
R |
S |
R |
R |
R |
R |
R |
38 |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
40 |
R |
S |
I |
R |
S |
R |
R |
I |
S |
44 |
R |
S |
I |
R |
R |
I |
R |
S |
I |
ATCC 25923 |
نتایج تایید استخراج DNA، بررسی مولکولی حضور ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی و MIC نانوذرات نقره علیه سویه های بیوفیلم مثبت: جهت تایید استخراج DNA و حضور ژن Bla-per1 در سویه های باکتریایی مورد مطالعه تست مولکولی PCR انجام و نتایج توسط الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. مطابق با نتایج باند مورد انتظار 933 جفت بازی در تمام سویه ها تشخیص داده شد که بیانگر حضور ژن Bla-per1 می باشد. همچنین ارزیابی کمی اثرات ضد بیوفیلمی نانوذرات نقره با کمک روش حداقل غلظت مهارکنندگی یا MIC انجام گرفت. سویههای بیوفیلم مثبت تحت تاثیر غلظتهای 125/3 تا 100 میکروگرم در میلیلیتر از نانوذرات نقره در مدت زمان 24 ساعت قرار گرفتند. نتایج نشان داد که سویههای مختلف دارای محدوده ای از MIC بودند. نتایج این تست در جدول 4 ثبت شد.
1 2 3 4 |
933 bp |
شکل 1- الکتروفورز محصول تکثیر شده ی ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR. ردیف2-1: محصول تکثیر شده ژن Bla-per1 با اندازه ی 933bp در سویه استاندارد و سویه بالینی، ردیف 3: کنترل منفی و ردیف 4: مارکر 100bpDNA Ladder.
مطابق با جدول 4 میزان جذب در تمامی سویهها بعد از تیمار با نانوذرات نقره کاهش داشته که نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم سلولهای باکتریایی و کاهش جذب نوری در نتیجه توانایی کم اتصال به کف میکروپلیت بوده است.
جدول 4- تعیین MIC نانوذره نقره در سویه های مختلف.
Absorption difference |
Light absorption after treatment |
Light absorption before treatment |
MIC concentration (µg/ml) |
Bacterial strain number |
0.13 |
0.13 |
0.26 |
6.25 |
5 |
0.03 |
0.08 |
0.11 |
12.5 |
9 |
0.07 |
0.18 |
0.25 |
50 |
11 |
0.17 |
0.17 |
0.34 |
12.5 |
18 |
0.17 |
0.09 |
0.26 |
25 |
24 |
0.29 |
0.15 |
0.44 |
12.5 |
28 |
0.19 |
0.19 |
0.38 |
6.25 |
31 |
0.504 |
0.086 |
0.52 |
3.125 |
33 |
0.211 |
0.089 |
0.30 |
25 |
36 |
0.28 |
0.23 |
0.51 |
6.25 |
38 |
0.39 |
0.23 |
0.62 |
6.25 |
40 |
0.35 |
0.16 |
0.51 |
25 |
44 |
0.398 |
0.082 |
0.48 |
500 |
ATCC 25923 |
نتایج بررسی بیان ژن Bla-per1 سویههای بیوفیلم مثبت در غلظتهای subMIC از نانوذره توسط روش Quantitative Real-Time PCR : نتایج نشان داد که سویههای باکتری با دارا بودن MICهای مختلف، تحت تاثیر نانوذرات نقره تغییر بیان مختلفی را داشته و از نظر آماری تفاوت معناداری در مقایسه با بیان ژن 16S rRNAاز خود نشان دادند (P≤0.05). نتایج حاصل از تغییر بیان ژن Bla-per1 در سویههای بیوفیلم مثبت در جدول 5 ثبت و نمودار حاصل از تکثیر و منحنی ذوب در شکل 2 نشان داده شد.
b |
a |
شکل 2 - نمودار حاصل از تکثیر ژن Bla per1. a. نمودار تکثیر ژن Bla per1، b. نمودار منحنی ذوب ژن Bla per1 با دمای 9/84
بر طبق نتایج حاصل از Real-Time PCR تمام سویههای باکتریایی تغییر بیان در ژن Bla-per1 را نشان دادند. در این پژوهش که به صورت 3 بار تکرار انجام شد مطابق با نتایج ثبت شده در جدول 5، میانگین CT سویههای تیمار نشده با نانوذره نقره در مقایسه با میانگین CT سویههای تیمار شده با نانوذره نقره عدد کمتری را نشان داد. بر اساس اصل Real-Time PCR، هر چه میزان CT کمتر میزان بیان بیشتر است. به این ترتیب میزان بیان ژن Bla-per1 در اسینتوباکتربومانی تیمار نشده با نانوذره نسبت به همان باکتری پس از تیمار با نانوذره نقره بیشتر است. از طرفی مقایسه بیان ژن Bla-per1 نسبت به ژن مرجع نشان دهنده تغییر میزان بیان این ژن در غلظتهای زیرحد کشندگی نانوذرات نقره میباشد. با توجه به نتایج، بیشترین میزان کاهش بیان ژن bla-per1 در سویه شماره 11 و کمترین میزان کاهش بیان مربوط به سویه شماره 5 بود. این امر بیانگر مقاومت بیشتر سویه شماره 5 نسبت به سایر باکتری ها به نانوذرات نقره می باشد. مکانیسم های متفاوت مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان فعالیت بیانی ژن های مقاومت و مکانیسم های دفاعی دیگر همچون بیوفیلم عوامل مهم تعیین کننده در مقابله با مواد آنتی باکتریال می باشد. سویه شماره 5 به علت فعالیت بیشتر مکانیسم های مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان بیان کمتری از ژن bla-per1 داشته، در صورتی که سویه شماره 11 با بیان بیشتر ژن bla-per1 نسبت به مبارزه با نانوذرات نقره اقدام نموده است. تفاوت بیان ژن در سویه های اسینتوباکتر بومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره توسط نرم افزار SPSS آنالیز و روش واریانس یک طرفه انجام و نتایج نشان دهنده ی معنی داری تفاوت بیان در سطح P≤ 0.05بود. نانوذرات نقره با تاثیر مستقیم بر کاهش بیان ژن bla-per1 می توانند مقاومت این باکتری به انواع آنتی بیوتیک ها را کاهش دهند.
جدول 5- نتایج حاصل از تغییر بیان ژن Bla-per1 در سویه های بیوفیلم مثبت قبل و پس از تیمار با نانوذره در مقایسه با ژن 16srRNA
|
Untreated with nanoparticles |
Treated with nanoparticles |
|
|||
Strain Number |
Avrage CT of 16srRNA |
Avrage CT of Bla-per1 |
Avrage CT of 16srRNA |
Avrage CT of Bla-per1 |
Altered Bla-per1 gene expression |
16srRNA gene expression |
5 |
6/19 |
9/18 |
1/20 |
25/22 |
129/0 |
1 |
9 |
8/18 |
8/20 |
7/19 |
7/26 |
023/0 |
1 |
11 |
5/19 |
65/19 |
2/20 |
6/23 |
085/0 |
1 |
18 |
7/19 |
75/19 |
4/20 |
2/27 |
008/0 |
1 |
24 |
19 |
4/20 |
3/20 |
95/26 |
014/0 |
1 |
28 |
3/19 |
05/20 |
1/20 |
8/25 |
025/0 |
1 |
31 |
9/18 |
55/20 |
6/19 |
25/25 |
051/0 |
1 |
33 |
2/19 |
65/18 |
8/19 |
3/22 |
109/0 |
1 |
36 |
5/18 |
95/18 |
2/20 |
9/24 |
021/0 |
1 |
38 |
8/19 |
6/19 |
4/20 |
75/24 |
037/0 |
1 |
40 |
5/19 |
6/19 |
1/20 |
56/27 |
041/0 |
1 |
44 |
5/18 |
95/18 |
2/20 |
9/24 |
021/0 |
1 |
ATCC 25923 |
4/19 |
5/22 |
5/19 |
9/27 |
032/0 |
1 |
ATCC 12228 |
7/18 |
- |
9/19 |
- |
- |
1 |
همچنین مقایسه توانایی تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی قبل پس از تیمار با نانوذرات نقره، نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم در این باکتری شد. این نتایج تایید کننده رابطه بین استحکام بیوفیلم اسینتوباکتر بومانی و میزان بیان ژن Bla-per1 بود به طوری که میزان توانایی تشکیل و استحکام بیوفیلم در سویه های تیمار شده با نانوذره در مقایسه با سویه های تیمار نشده به طور چشمگیری کاهش یافت. شکل شماره 4 تغییر بیان ژن Bla-per1 را با سطح منعی داری P≤ 0.05 نشان می دهد.
شکل 3- میزان بیان ژن Bla-per1 در سویه های اسینتوباکتر بومانی . A . مقایسه جذب نوری سویههای تیمار شده با نانوذرات نقره با سویههای تیمار نشده. B . کاهش معنا دار میزان بیان ژن Bla-per1 در سویه های تیمار شده با نانوذرات نقره نسبت به ژن کنترل.
بحث و نتیجهگیری
اسینتوباکتربومانی شایعترین عامل بیماریزای انسانی در جنس اسینتوباکتر میباشد و به عنوان یکی از مهمترین عوامل عفونتهای بیمارستانی به شمار می آید. یکی از مشکلات عمده در درمان و پیش گیری از عفونت های ایجاد شده توسط اسینتوباکتر بومانی، مقاومت های آنتی بیوتیکی ایجاد شده در آن می باشد و کارباپنم ها به آخرین خط درمان در عفونت های ناشی از باکتری های گرم منفی، از جمله اسینتوباکتر بومانی می باشند. اصلی ترین عامل مقاومت به کارباپنم را می توان تولید بیوفیلم دانست (6). در خصوص مقاومت اسینتوباکتر مطالعات زیادی صورت گرفته که نتایج آن ها برحسب زمان و مکان متفاوت بوده است. بنابراین از اهداف مهم این تحقیق، بررسی میزان تشکیل بیوفیلم در سویه های بالینی اسینتوباکتر بومانی مقام به آنتی بیوتیک بوده است. پژوهش بروی توانایی اتصال، تشکیل بیوفیلم و ژن های مداخله گر در تشکیل بیوفیلم در سویههای مختلف اسینتوباکتر بومانی می تواند اطلاعات امیدوارکننده ای در مورد درک بهتر روند پیچیده ایجاد بیوفیلم و عفونت های ناشی از این ارگانیسم ها فراهم نماید. در سال های اخیر به دنبال مقاومت و ایجاد پایداری باکتری ها به آنتی بیوتیک ها، دلیل مناسبی برای تحقیق در خصوص ژن های بیان کننده بیوفیلم مثل (Bla-per1) در باکتری های مختلف بوده است. لادن رحیم زاده ترابی و همکاران در سال 1395 میزان شیوع ژن های BlaIMP و BlaVIM در سویه های سودوموناس آئیوجینوزا مقاوم به چندین دارو را در مراکز درمانی اصفهان مورد مطالعه قرار دادند و نتایج حاصل از این گروه نتایج نشان می دهد که اغلب نمونه ها مقاوم به دارو هستند و در میان سویههای تولید کننده ESBL فراوانی ژنهای بتالاکتاماز BlaIMP بیشتر از ژن BlaVIM بوده است. لذا اندازه گیری سریع و بررسی دقیق مقاومت آنتی بیوتیکی امری ضروری می باشد زیرا فراوانی سویه های تولیدکننده ژن بتالاکتاماز در سویههای بیمارستانی رو به افزایش است (7).
میتوان گفت محققین بسیاری وجود داشته اند که علاقه به بررسی مقاومت اسنیتوباکتر بومانی به آنتیبیوتیکهای مختلف بودهاند. لیهائو کی و همکارانش در سال 2016 میلادی مطالعه ای مبنی بر ارتباط بین مقاومت آنتی بیوتیکی، تشکیل بیوفیلم و مقاومت ویژه ی بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی انجام دادند. در مطالعه آنها ارتباط بین مقاومت آنتی بیوتیکی، تشکیل بیوفیلم و مقاومت ویژهی بیوفیلم در ایزوله های بالینی اسینتوباکتر بومانی بررسی گردید (14).
مجتبی ساده و همکارانش در سال 1392 شمسی مطالعهای با عنوان بررسی ژن های بتالاکتاماز (BlaTEM , blaCTX) مقاوم به دارو و گلوتارآلدئید در ایزوله های اسینتوباکتر بومانی انجام دادند. دستاورد آنها نشان داد که علاوه بر تنوع و شیوع ژنهای BlaTEM , BlaCTX مکانیسم های متعددی شامل پورین ها و Efflux pump درایجاد مقاومتهای اسینتوباکتربومانی نسبت به مواد ضدمیکروبی نقش دارند (8).
ریچا سینگ و همکارانش در سال 2016 میلادی مطالعهای مبنی بر نانوذرات برای کنترل عفونت ناشی از بیوفیلم گونههای اسینتوباکتر انجام دادند. در گزارش آنها به اهمیت نقش نانوذرات مختلف به عنوان عوامل ضد بیوفیلمی در اسنیتوباکتر، مواد پوشانندهی سطح برای کنترل و درمان بیوفیلم های اسینتوباکتر پرداخته شد و نتیجهی مثبت تاثیر نانوذرات بر کاهش تولید بیوفیلم را گزارش نمودند(18).
اسلامی و همکاران در سال 1390 شمسی الگوی حساسیت و مقاومت آنتیبیوتیکی در سویه های اسینتوباکتر جدا شده از نمونه های بالینی بیمارستان آراد تهران را مورد مطالعه قرار دادند. نتایج مطالعهی این گروه نشان از افزایش مقاومت سویههای اسینتوباکتر نسبت به آنتیبیوتیکهای جنتامایسین و آمیکاسین بود که علت آن را به مصرف بی رویه آنتیبیوتیکها نسبت دادند (1).
محققان دیگری در صدد بودند تا تاثیر بیوفیلم را در ثبات و بقای باکتری در محیط بخصوص در بیمارستانها (که عاملی برای ایجاد عفونتهای بیمارستانی است) را نشان دهند. ویدال و همکارانش در سال 1996 میلادی در خصوص ساختار بیوفیلم ثابت نمودند که در اسینتوباکتربومانی سلولهای چسبندهای که با روکشهای گوناگونی پوشیده میشوند، به شکل حدواسط در شرایط کمبود مواد غذایی ساختار بیوفیلم تشکیل داده و به پایدار آن کمک میکنند. یافتهها حاکی از افزایش سریع در شمار و تعداد سلولهای بیوفیلم و افزایش نسبی در شمار سلول های حاوی مقاومت وجود دارد. این تحقیق ثابت کرد که وجود بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی از این میکروارگانیسم در برابر فاکتورهای گوناگون ضد باکتریایی محافظت میکند (21).
توانایی فوق العاده ی نقره به عنوان عامل ضد میکروبی سبب استفاده از نانوذرات این ماده در تحقیقات بسیاری از محققان بوده است. تحقیقات مختلفی نشان دادند که نانوذرات توانایی چشمگیری در مهار بیماریهای عفونی باکتریایی دارند. طبق تحقیقات هندیانی و همکاران در سال 2015 میلادی درخصوص سنتز نانوذرات نقره و اثرات سینرژیک آنها در ترکیب با ایمیپنم و دو بیوساید (کشندهی زیستی) علیه بیوفیلم تشکیل شده توسط اسینتوباکتربومانی، اثرات نانوذرات نقره به تنهایی و در ترکیب با بیوسایدها و ایمیپنم برضد بیوفیلمهای اسینتوباکتربومانیو فرم پلانکتونی آن بررسی شد. نتیجه و دستاورد تحقیق این گروه بیانگر این نکته بود که نانوذرات نقره به تنهایی میتوانند سبب مهار تشکیل بیوفیلم شوند اما اثر آنها در ترکیب با ایمی پنم برضد اشکال بیوفیلمها و شکل پلانکتونی اسینتوباکتربومانی موثرتر است (3). هندیایی و همکاران در سال 1391 مطالعهای درخصوص ﻣﻘﺎﯾﺴﻪ ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ ﺿﺪ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻤﯽ ﻧﺎﻧﻮ ذره ﻧﻘﺮه و ﭼﻨﺪ ﺗﺮﮐﯿﺐ ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ دﯾﮕﺮ ﻋﻠﯿﻪ سویههای اسینتوباکتر ﻣﻮﻟﺪ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ انجام دادند. نتایج مطالعهی اخیر این بود که اﺳﺘﻔﺎده از ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت داروﯾﯽ ﺑﺎ ﻃﯿﻒ وﺳﯿﻊﺗﺮ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﻧﺎﻧﻮذرات ﻧﻘﺮه در ﺗﺮﮐﯿﺐ ﺑﺎ ﻣﻮاد ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ ﻣﻨﺎﺳﺐ ﻣﯽﺗﻮاﻧﺪ ﺑﺎﻋﺚ ﮐﺎﻫﺶ ﺗﺸﮑﯿﻞ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ و ﺣﺬف ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢﻫﺎی ﺑﺎﻟﻎ، ﮐﺎﻫﺶ دوز ﻣﻮﺛﺮ داروﻫﺎ، اﻓﺰاﯾﺶ ﮐﺎرآﯾﯽ درﻣﺎن و ﺟﻠﻮﮔﯿﺮی از ﺗﺸﮑﯿﻞ ﺳﻮﯾﻪﻫﺎی ﻣﻘﺎوم ﺷﻮد (22).
جیان لوئیجی و همکاران در سال 2015 میلادی مطالعهای با عنوان نانوذرات نقره به عنوان عوامل ضد باکتریایی انجام دادند. این گروه در این مقاله تلاشهای جدید را برای مشخص کردن چالش ها و راه حلهای اخیر در درمان بیماریهای عفونی بویژه کاربرد نانونقرهی آنتیمیکروبیال به صورت خلاصه ارائه کرده و نشان دادند که نانوذرات نقرات باعث کاهش رشد عوامل میکروبی میشوند (9).
ﻧﺘﺎﯾﺞ اﯾﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺑﯿﺎﻧﮕﺮ اﯾﻦ اﺳﺖ ﮐﻪ نانوذرات نقره روی بیان ژن Bla-per1 بیوفیلم در اسنیتوباکتربومانی تاثیر داشته و باعث کاهش بیان این ژن میگردد. کاهش بیان ژن باعث عملکرد ضعیف بیوفیلم شده و در واقع بیوفیلم تولید شده در مقایسه با سویههای غیرتیمار شده با نانوذره نقره داری بیان ژن Bla-per1 ضعیفتر بوده و استحکام کمتری دارد. همچنین از میزان مقاومت باکتری به آنتیبیوتیکها و سایر مواد ضدعفونی کننده و دارویی کاسته شد. مکانیسم های متفاوت مقاومت به مواد آنتی باکتریال، میزان فعالیت بیانی ژنهای مقاومت و مکانیسمهای دفاعی دیگر همچون بیوفیلم و افلاکس پمپها عوامل مهم تعیین کننده در مقابله با مواد آنتیباکتریال میباشد. تفاوت بیان ژن در سویههای اسینتوباکتربومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره توسط نرم افزار SPSS و روش واریانس یک طرفه انجام و نتایج نشان دهندهی معنیداری تفاوت بیان در سطح P≤ 0.05بود. نانوذرات نقره با تاثیر مستقیم بر کاهش بیان ژن Bla-per1 میتوانند مقاومت این باکتری به انواع آنتیبیوتیکها را کاهش دهند. همچنین مقایسه توانایی تشکیل بیوفیلم در اسینتوباکتربومانی قبل و پس از تیمار با نانوذرات نقره، نشان دهنده کاهش توانایی تشکیل بیوفیلم در این باکتری بود. این نتایج تاییدکننده رابطه بین استحکام بیوفیلم اسینتوباکتربومانی و میزان بیان ژن Bla-per1 بود؛ به طوری که میزان توانایی تشکیل و استحکام بیوفیلم در سویههای تیمار شده با نانوذره در مقایسه با سویههای تیمار نشده به طور چشمگیری کاهش یافت. بنابراین نانوذرات نقره میتواند به عنوان داروی مناسب آنتیباکتریال مطرح و جهت نگه داری مواد غذایی جایگزین مواد شیمیایی و مضر گردد. از طرفی ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﻫﻤﯿﺖ ﻣﻘﺎوﻣﺖ آﻧﺘﯽﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ، ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﺳﺎﯾﺮ ژنهای ویرولانس مرتبط با بیوفیلم مانند Csu، Vir، Tol، Sec و Tat و ارﺗﺒﺎط آن با تشکیل بیوفیلم ﭘﯿﺸﻨﻬﺎد ﻣﯽﮔﺮدد. از آنجایی که نانوذرات نقره به عنوان نانوذرات فلزی اثرات خوبی روی سویههای مورد آزمایش اسینتوباکتربومانی دارند میتوان از این ماده به شکل گسترده در ضدعفونی کردن محیط و پسماندهای بیمارستانی و همچنین به شکل خوراکی یا تماسی استفاده کرد.
ﺗﺸﮑﺮ و ﻗﺪرداﻧﯽ
از همکاری صمیمانه مسیولین محترم بیمارستان های شهر تهران به خصوص شریعتی، همچنین جناب آقای حسینی، مسئول آزمایشگاه میکروبی دانشگاه علوم دارویی، که ما را در انجام این پروژه یاری فرمودند، تشکر و قدردانی میشود.