ارزیابی کارایی نشانگر مولکولی SCoT در بررسی روابط ژنتیکی میان گونه­های دیپلوئید جنس Aegilops و Triticum

علی اشرف مهرابی^1* و هومن شیروانی²

¹ ایران، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، بخش تحقیقات منابع طبیعی

² ایران، ایلام، دانشگاه ایلام، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 01/04/1399           تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

تنوع و روابط ژنتیکی 25 جمعیت از­ پنج گونه دیپلوئید جنس­های Aegilops و Triticum با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که 12 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز بودند. بر اساس پارامترهای نشانگری PIC، RP، EMR و MI آغازگرهای SC6، SC11، SC63 و SC20 که میزان بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم گونه­های Aegilops و Triticum در تحقیقات بعدی معرفی گردیدند. فاصله ژنتیکی جمعیت‌های مورد بررسی با استفاده از ضریب فاصله جاکارد نشان داد که میانگین فاصله بین جمعیت‌ها 307/0 و متوسط فاصله بین گونه‌ای نیز 636/0 بود. همچنین دو زیرگونه
Ae. tauschii و  Ae. strangulateکه هردو دارای ژنوم D هستند کمترین فاصله را با یکدیگر داشتند. نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA براساس ضریب فاصله جاکارد نشان داد که جمعیت‌ها در 5 گروه قرار گرفتند به طوری که گونه­ها بصورت صد در صد از یکدیگر تفکیک شدند که نشان­دهنده کارایی بالای نشانگر مورد استفاده می­باشد، این نتایج با نتایج حاصل از ماتریس فاصله و تجزیه به مختصات اصلی صد در صد مطابقت داشت. آنالیز شاخص‌های ژنتیکی برای گونه‌های مورد بررسی نشان داد بیشترین تنوع درون جمعیتی و تنوع ژنی مربوط گونه Ae. tauschii بود. همچنین بیشترین میزان پلی مورفیسم نیز در بین جمعیت­های این گونه مشاهده گردید.

واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، نشانگر مولکولی، Aegilops، Triticum

*نویسنده مسئول، تلفن: 09124946488، پست الکترونیکی: alia.mehrabi@yahoo.com

مقدمه

طایفه تریتیسه یکی از مهمترین قبیله‌های خانواده پواسه (Poaceae) می‌باشد، که از نظر اقتصادی مهمترین غلات در این قبیله قرار دارند (5). آژیلوپس‌ها از خویشاوندان نزدیک گندم بوده و از اجداد وحشی گندم محسوب می‌شوند، که منابع ژنتیکی بی نظیری برای اصلاح گندم بوده و بهره‌برداری از آنها در اصلاح نباتات موجب بهبود کمیت و کیفیت ارقام زراعی خواهد شد (10).این جنس بیش از 20 گونه یکساله را شامل شده که به عنوان خزانه ژنی ثانویه برای گندم محسوب می‌گردد (26 و 31). گونه‌های جنس Aegilops در شمال‌غربی و مرکز آسیا، در ایران و سرتاسر دریای مدیترانه پراکنده شده‌اند (15). اطلاعات در مورد تنوع ژنتیکی گیاه برای توسعه استراتژی‌های مناسب در زیست‌شناسی حفاظتی و همچنین در بسیاری دیگر از زمینه های کاربردی ضروری است. از نقطه نظر اساس تکاملی، تنوع ژنتیکی به عنوان پتانسیل تکاملی یک گونه، حیاتی و مهم می‌باشد. فیلوژنتیک مولکولی و تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی می‌تواند به روشن شدن وضعیت طبقه‌بندی و روابط تکاملی بین گونه‌های زراعی و خویشاوندان وحشی آنها کمک کند. همچنین می‌توانید جهت برنامه‌ریزی دقیق استراتژی‌های مدیریت ژرم پلاسم و جلوگیری از ایجاد اشتباه به‌طور موثر کمک نماید (23). خویشاوندان وحشی محصولات زراعی یک منبع بالقوه مفید و با ارزش تنوع ژنتیکی هستند که اخیراً توجه به‌نژادگران را به خودجلب نموده‌اند و حتی برخی معتقدند که موفقیت آینده اصلاح نباتات در استفاده از منابع ژنتیکی وحشی نهفته است (12). به‌منظور تعیین تنوع ژنتیکی انواع مختلفی از سیستم‌های نشانگری توسط به‌نژادگران گیاهی استفاده می‌شود که از جمله آن‌ها می‌توان به نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی شامل بیوشیمیائی و DNA اشاره کرد (29). نشانگر‌های مولکولیDNA  بر اساس شناسایی چندشکلی در توالی DNA بوده که تحت تأثیر شرایط محیطی و مراحل رشد گیاه نیستند (9). در طی سال‌‌های اخیر انواع مختلفی از روش‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) ابداع شده‎اند که از جملة آن‌ها مـی‎تـوان مـواردی چـون Nested PCR، Boster PCR، Hot start PCR، Touch down PCR، Ampliwax PCR Gems و غیره را نام برد (17). نشانگر مولکولی (SCoT= Start codon targeted) یا در ترجمه فارسی، کدون­های آغاز هدف واقع شده، روشی است که در آن پرایمرها بر اساس توالی­های آغاز (ATG) طراحی شده و نواحی بین کدون­های آغاز طی واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر، و تفاوت­ها آشکار می­شود. پرایمرهای SCoT معمولاً 24-18 نوکلئوتیدی هستند و محتوای C و G آنها 50% تا 72% است (13). نشانگرهای SCoT به طور کلی در مقایسه با ISSR و RAPD از تکرارپذیری بیشتری برخوردارند و عقیده بر این است که طول و دمای اتصال آغازگرها، تنها عواملی نیستند که در تکرارپذیری الگوی نواربندی آنها نقش دارند (6). از مزایای این نشانگر می­توان به آسان بودن و کم هزینه بودن بکارگیری آن، چندشکلی بالا، آشکارسازی اطلاعات ژنتیکی وسیع و فراگیر بودن آغازگرهای آن در ژنوم گیاهان اشاره کرد. افزون براین، در طراحی آغازگرهای این نشانگر به اطلاع از توالی نوکلئوتیدی ژنوم نیاز نیست (6). لذا هدف از این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی و روابط بین گونه‌ای برای سه گونه دیپلوئید جنس Aegilops (ژنوم D و U) به همراه دو گونه دیپلوئید جنس Triticum (ژنوم A) با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT می­باشد. همچنین از آنجایی که این نشانگر تنوع را براساس مناطق ژنی نشان می­دهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونه­ها در جهت اصلاح و رانش ژنی می­تواند مفید باشد.

مواد و روشها

به منظور ارزیابی روابط بین گونه‌ای برخی گونه­های دیپلوئید و نیای وحشی گندم، تعداد 25 جمعیت از 5 گونه با توجه به بذر­های موجود در بانک ژن دانشگاه ایلام انتخاب شد. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد بانک ژن، منشاء و کد جمعیت در جدول 1 نشان داده شده است.

استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (7) برای هر جمعیت انجام گرفت. بعد از انتقال ۲۰ تا ۵۰ میلی­گرم نمونه خرد شده با ازت مایع به تیوب، ۸۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج (۴ گرم CTAB، ۳۶/۱۶ گرم NaCl، ۱۵/۳ گرم Tris-HCl، ۴۸/۱ گرم EDTA، ۴۰۰ میکرولیتر
b-mercaptoetchanol در ۸=pH به حجم 100 میلی­لیتر) به تیوب­ها اضافه شد و به مدت یک ساعت نمونه­ها در حمام آبی با دمای ۶۵ درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس به هر نمونه مقدار ۸۰۰ میکرولیتر محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) اضافه گردید و به مدت 20 دقیقه خوب بهم زده شد تا محلول داخل تیوپ یکنواخت شود. پس از آن نمونه­ها را به مدت ۱۰ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه، سانتریفیوژ و فاز رویی به یک تیوب تمیز منتقل گردید و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر محلول ایزوپروپانول سرد اضافه­ و به مدت یک ساعت در فریزر در دمای ۲۰-­ درجه سانتی گراد قرار­ داده شدند.

سپس تیوب­ها را به مدت ۱۵ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ­ گردید و بعد از آن فاز مایع به آرامی خالی و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر اتانول 80% سرد اضافه و یک سانتریفیوژ کوتاه صورت گرفت و به آرامی فاز مایع خالی شد (این مرحله دو بار تکرار شد) در پایان نیز تیوب­ها در دمای اتاق قرار گرفت تا خشک شوند و بعد به هر تیوب میزان ۱۰۰ میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل اضافه ­گردید. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل ۸/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتوفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl₂، 05/0 میلی­مولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد و به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت­سازی به ترتیب ۳۰  ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود (52 تا 60 درجه). همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به  DNA­های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهک­های ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ­آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شده نوارها استفاده شد. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق فرمول   محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه ژنوتیپ­ها است (11). همچنین شاخص نشانگری
(MI= Marker Index) از رابطه MI= PIC × N× β بدست آمد که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود (24). شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR= Effective multiplex ratio) از رابطه EMR= NPB × β که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد نوارهای چند­شکل (NPB) بدست آمد (16) و قدرت تفکیک (RP= Resolving power) از رابطه RP=∑IB محاسبه گردید. RP=∑IB در رابطه [(IB=1-[2×(0.5-Pi و Pi نسبت افراد دارای نوار است (4). در پایان نیز داده­های حاصل، با استفاده از نرم افزارهای Darwin 6 برای محاسبه ماتریس فاصله (21)، MEGA 6 جهت تجزیه کلاستر (27) و GenAlEx 6.2 برای تجزیه به مختصات اصلی (20) مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

چندشکلی: تنوع ژنتیکی جمعیت­های مورد مطالعه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که تنها 12 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز بودند. شکل 1 الگوی باندی جمعیت­ها با استفاده از آغازگر SC11 برای 25 جمعیت را نشان می­دهد. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 92 مکان را تکثیر کنند که از این تعداد 7 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند، که آغازگرهای SC6، SC11، SC63 و SC20 بیشترین تعداد باند (10) و آغازگر SC35 کمترین تعداد باند (4) را نشان داد. میانگین درصد چند شکلی برابر 25/93% بود که کمترین میزان درصد چند شکلی را آغازگرهای SC60 و SC23 (80%) و SC21 (21/83 %) داشتند .نتایج به‌دست آمده برای آغازگرهای مورد بررسی در جدول 2 ارائه شده است.

شکل1- الگوی باندی جمعیت­های مورد بررسی با استفاده از آغازگر  SC11

میانگین PIC در آغازگر­های مورد بررسی برابر 40/0 بود، بیشترین میزان محتوای اطلاعات چند­شکلی (PIC) مربوط به آغازگرهای SC36، SC5، SC28، SC13 و SC40 بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگرها توانستند فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کنند. آغازگر SC63 و SC20 با کمترین میزان محتوای اطلاعات چند­شکلی (PIC) توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند. میانگین شاخص RP برابر 33/6 بود که آغازگرهای SC20، SC5 و SC11 بیشترین میزان و آغازگرهای SC35 و SC21 دارای کمترین میزان بودند. همچنین میانگین شاخص­های MI و EMR به ترتیب برابر 81/2 و 68/6 بود. بیشترین میزان MI و EMR را آغازگرهای  SC5و SC11 و کمترین میزان را آغازگرهای  SC21و SC35 داشتند.

جدول 2- اطلاعات چند شکلی، شاخص نشانگری، نسبت چندگانه موثر و شاخص قدرت تفکیک در آغازگرهای مورد بررسی

شباهت ژنتیکی: فاصله ژنتیکی جمعیت‌های مورد بررسی با استفاده از ضریب فاصله جاکارد (جدول 3) نشان داد که میانگین فاصله بین جمعیت‌ها 307/0، متوسط فاصله بین گونه‌ای نیز 636/0 بود. در بین 5 گونه مورد مطالعه جمعیت‌های گونه T. boeticum دارای کمترین متوسط ضریب فاصله درون گونه‌ای نسبت به جمعیت‌های سایر گونه‌ها با میزان 150/0 بود و جمعیت‌های گونه
Ae. tauschii نیز ضریب فاصله بالایی (196/0) نسبت به دیگر گونه‌ها نشان داد. بیشترین فاصله بین جمعیت St306 (تاجیکستان) با Ur154 (کهگیلویه) با ضرایب 806/0 بود و کمترین فاصله ژنتیکی بین جمعیت Bo19 (کرمانشاه) با Bo368 (ایلام) با میزان 068/0 بود. نتایج تشابه ژنتیکی بین گونه‌های مورد بررسی با ضریب فاصله جاکارد در جدول 4 ارائه شده است. همچنانکه ملاحظه می‌گردد، کمترین فاصله ژنتیکی بین دو گونه Ae. strangulata و
Ae. tauschii وجود داشت (310/0) و بیشترین فاصله بین گونه‌های T. boeticum وAe. strangulata  با ضریب 776/0 وجود داشت.

جدول 3- فاصله ژنتیکی بین جمعیت­ها با استفاده از ضریب تشابه جاکارد بر اساس نشانگر SCoT

جدول 4-  فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگر SCoT در بین گونه­ها با استفاده از ضریب فاصله جاکارد

تجزیه خوشه­ای: نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای به روش UPGMA براساس ضریب فاصله جاکارد برای جمعیت‌های مورد بررسی در شکل 2 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه می‌گردد، جمعیت‌ها در 5 گروه قرار گرفتند و نتایج حاصل از گروه بندی با نتایج بدست آمده از ماتریس فاصله کاملا مطابقت داشت. بنابراین به خوبی می‌توان دریافت که نشانگر مورد استفاده توانایی بالایی در تفکیک گونه‌ها داشت و جمعیت‌های مورد بررسی را به خوبی در زیرگروه خود قرار داد و حتی جمعیت­های با منشاء جغرافیایی یکسان نیز تا حدود بالایی در کنار یکدیگر قرار گرفتند. دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه‌ای گونه‌ها با روش UPGMA و بر اساس ضریب فاصله جاکارد در شکل 3 ارائه شده است که بر این اساس گونه‌های 2 جنس کاملا از هم تفکیک شدند و در دو گروه جدا قرار گرفتند. گونه‌‌هایAe. tauschii  و
Ae. stranguiata با بیشترین شباهت قبل دو گونه دیگر در یک گروه قرار گرفتند و در مرحله بعد گونه
Ae. umbellulata با فاصله نسبتا متوسطی که با دو گونه قبلی داشت با آنها هم گروه شد. گونه Ae. umbellulata در بین سه گونه مورد مطالعه جنس Aegilops بیشترین فاصله را با دیگر گونه‌ها با توجه به نمودار تهیه شده بر اساس نشانگر SCoT نشان داد.

شکل 2- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس نشانگر SCoT در 25 جمعیت به روش UPGMA: اعداد روی شکل نشان دهنده فاصله ژنتیکی جمعیت­ها بوده، که نزدیکترین جمعیت­ها بر اساس ضریب فاصله جاکارد در کنار یکدیگر قرار گرفته و بر اساس میزان فاصله با یکدیگر  ادغام و خوشه جدید را تشکیل داده­اند.

شکل 3- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه­ای گونه­ها بر اساس نشانگر SCoT به روش UPGMA : اعداد روی شکل نشان دهنده فاصله ژنتیکی گونه­ها از یکدیگر  می­باشد که نزدیکترین گونه­ها بر اساس ضریب فاصله جاکارد در کنار یکدیگر قرار گرفته و بر اساس میزان فاصله با یکدیگر  ادغام و گروهبندی شده­اند.

تجزیه به مختصات اصلی: بر اساس داده‌های حاصل از آغازگرهای مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای جمعیت‌های مورد بررسی انجام گردید. دو مولفه استخراج شد که در مجموع 93/77% واریانس موجود در ساختار داده‌ها بیان گردید بطوریکه محور مختصات اول و دوم به ترتیب 00/53 و 93/24 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند. همچنین نمودار دو بعدی مختصات اول و دوم نیز در شکل 4 ارائه گردید. همچنان‌که ملاحظه می‌گردد پراکنش جمعیت‌ها با نتایج تجزیه خوشه­ای و ماتریس تشابه کاملا مطابقت داشت و جمعیت­ها به  جمعیت‌ها گروه تقسیم شدند بنحوی که جمعیت‌ ­هایی که دارای بیشترین تشابه در ماتریس فاصله بودند و در تجزیه خوشه­ای نیز در کنار یکدیگر قرار گرفته بودند، در تجزیه به مختصات اصلی نیز در کنار یکدیگر قرار گرفتند. همچنین تجزیه به مختصات اصلی برای 5 گونه مورد بررسی به منظور ارزیابی روابط بین گونه‌ای انجام شد که دو محور مختصات اول در مجموع 26/88% واریانس موجود در ساختار داده‌ها را توضیح دادند. نمودار دو بعدی مختصات اول و دوم نیز در شکل 5 ارائه گردید. با توجه به نمودار مشاهده شد که گونه‌های دو جنس از همدیگر تفکیک شدند و دو گونه Ae. stranguiata و Ae. tauschii با داشتن شباهت بالا در یک منظقه نمودار قرار گرفتند.

شکل4- پراکنش مختصات اول و دوم تجزیه به مختصات اصلی 25 جمعیت مورد بررسی بر اساس نشانگر SCoT: مختصات اول و دوم به ترتیب 00/53 و 93/24 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند. تجمع جمعیت­ها در یک ناحیه از پلات نشان دهنده تشابه ژنتیکی جمعیت­ها است

شکل 5- پراکنش حاصل از تجزیه به مختصات اصلی 5 گونه مورد بررسی بر اساس نشانگر SCoT: مختصات اول و دوم به ترتیب 77/62 و 01/25 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند. تجمع گونه­ها در یک ناحیه از پلات نشان دهنده تشابه ژنتیکی گونه­ها است

شاخص­های ژنتیکی: شاخص‌های ژنتیکی برای گونه‌های مورد بررسی در جدول 5 ارائه گردید. با توجه به نتایج حاصل از بررسی مولکولی گونه­های مورد بررسی با مارکر SCoT برای هر گونه شاخص‏های درصد چندشکلی (P%)، هتروژنتیکی مورد انتظار نا اریب (Uhe)، هتروژنتیکی مورد انتظار (He) و شاخص شانون (I) محاسبه گردید (جدول 5) که با توجه به نتایج بدست آمده بیشترین تنوع درون جمعیتی و تنوع ژنی مربوط گونه Ae. tauschii  بود. همچنین بیشترین میزان پلی مورفیسم نیز در بین ژنوتیپ­های این گونه بود.

جدول 5- میزان تنوع درون گونه­ای برای گونه های مورد بررسی

بحث

تغییرات ژنتیکی در جمعیت‌های گیاهی می‌تواند به‌وسیله مکانیسم‌های مختلف از قبیل جهش، نوترکیبی ژنتیکی، مهاجرت، جریان ژنی، رانده‌شدگی ژنتیکی و گزینش به‌ وجود ‌آید. از آنجا که تنوع مبنای گزینش است، می­توان این تنوع را در گیاهان وحشی جستجو کرد. با استفاده از نشانگر SCoT همانطور که مشاهده شد تنوع قابل ملاحظه­ای در بین جمعیت­های هر پنج گونه وجود داشت و چندشکلی مطلوبی بر اساس این نشانگر مشاهده گردید بطوریکه نشانگر مورد استفاده به خوبی تنوع ژنتیکی موجود در ساختار جمعیت‌ها و روابط بین گونه‌ای را نشان داد. Mohammadi و همکاران (19) تنوع ژنتیکی 35 جمعیت از گونه Ae. cylindrical را با استفاده از 17 آغازگر ISSR مورد بررسی قرار دادند و در مجموع 190 آلل تکثیر شد که تعداد 188 آلل چندشکل بودند (95/98%) و تنوع ژنتیکی بالایی در بین جمعیت‌ها گزارش کردند.

در این پژوهش، با استفاده از 12 آغازگر SCoT، 92 نوار امتیازدهی شد که 87 باند آن چند شکل بودند. تعدادی از این باندها در برخی از آغازگرها منحصربه‌فرد (اختصاصی) بودند (در مجموع 13 باند و به‌طور میانگین 13/14%). باندهای اختصاصی را می‌توان در شناسایی گونه‌ها و نیز تهیه شناسنامه آن‌ها بکار برد. Shirmohammadli  و همکاران (28) با توجه به سطح بالایی از اطلاعات چندشکلی، بهترین نشانگرها برای ارزیابی تنوع ژنتیکی برنج معرفی نمودند. بهترین شاخص برای انتخاب آغازگر مناسب، شاخص قدرت تفکیک Rp)) است زیرا هم از تعداد افراد دارای نوار و هم از تعداد آلل تأثیر می‌پذیرد. قدرت تفکیک (Rp) پارامتری است که توانایی تفکیک آغازگرهای انتخابی را نشان می‌دهد (14). شاخص نشانگر (MI) یک برآورد مناسب برای کارآیی آغازگرها است که به تعداد نوارهای چندشکلی به‌دست‌آمده و به پوشش بالای ژنوم توسط نشانگر نسبت داده می‌شود (18). بالا بودن شاخص نشانگر، نشان از فراهم کردن اطلاعات بیشتر از ژنوم با توجه به تولید تعداد نوار چندشکلی بیشتر است. میزان اطلاعات چندشکلی یکی از شاخص‌های مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف ازنظر قدرت تمایز آن‌ها است. مقادیر بالای این شاخص، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد (30). در مجموع پیشنهاد می­گردد با توجه به این شاخص­ها از آغازگرهای SC6، SC11، SC63 و SC20 که میزان بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم گونه­های Aegilops و Triticum در تحقیقات بعدی استفاده گردد. نوریان (2) و فرشادفر و همکاران (1) در بررسی تنوع ژنتیکی گونه‌های مختلف جنس پنیرک و مریم نخودی با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT بر اساس پارامترهای نشانگری PIC، RP، EMR و MI آغازگرهای مناسب جهت بررسی تنوع ژنتیکی در گونه­های مورد مطالعه معرفی نمود.

میانگین فاصله بین جمعیت­ها در این مطالعه برابر 307/0 بود که پایین بودن فاصله ژنتیکی یاد شده می­تواند به سبب طول بلند آغازگرهای SCoT و تکثیر انتخابی­تر باشد. هیبریداسیون بین جمعیت­ها با فاصله ژنتیکی زیاد می­تواند یک روش مناسب برای برنامه­های اصلاحی در این گیاه باشد. از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان می­دهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونه­های هر گونه با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس، همچنین جمعیت­هایی که در بین گونه­ها بیشترین تشابه را داشتند جهت تلاقی و جریان ژنی به منظور پروژه­های اصلاحی استفاده نمود. متوسط فاصله بین گونه‌ای نیز 636/0 بود که بالا بودن متوسط ضریب تشابه بین گونه‌ای و پایین بودن ضریب تشابه درون گونه‌ای بیانگر این مطلب است که نشانگر مورد بررسی تنوع بیشتری در بین گونه‌ها نشان داد و درون جمعیت‌های هر گونه تنوع کمتری وجود داشت و همین مسئله باعث تفکیک گونه‌های مورد بررسی شد. Aliyev و همکاران (3) با استفاده از ماتریس تشابه Nei و Li روابط بین گونه‌ای در ژنوتیپ‌های دیپلوئید و تتراپلوئید جنس Triticum بر اساس الگوی باندی حاصل از نشانگرهای RAPD را مورد بررسی قرار داد و بیان داشت که T. boeticum با T.monococcum بر اساس ماتریس تشابه فاصله ژنتیکی بالایی داشتند.

کمترین فاصله ژنتیکی بین دو گونه Ae. strangulata و Ae. tauschii وجود داشت (310/0) و بیشترین فاصله بین گونه‌های T. boeticum وAe. strangulata  با ضریب 776/0 وجود داشت. دو گونه Ae. strangulata و Ae. tauschii هردو دارای ژنوم D هستند و وجود فاصله کم در بین آنها طبیعی است و همچنین برای دو گونه T. urartu و T. boeticum باتوجه به اینکه دارای ژنوم A هستند نتیجه بدست آمده با ساختار ژنتیکی آنها مطابقت داشت. این نتایج با گزارش Sallares و Brown (26) که با استفاده از نشانگر EST روابط بین گونه‌ای گونه‌های دیپلوئید آژیلوپس و خویشاوندان آنها را بررسی کردند، مطابقت نشان داد. همچنین Petersen و همکاران (22) روابط فیلوژنتیکی بین گندم نان و گندم نیای وحشی را به منظور یافتن منشاء ژنوم A، B و D در گندم با استفاده از مارکر مولکولی مورد ارزیابی قرار دادند و بیان داشتند که منشاء ژنوم D از Ae. tauschii و ژنوم B از A. Speltoides منشاء گرفته است.

در این تحقیق برای مشخص کردن  بهترین شاخص تشابه و تشخیص بهترین الگوریتم برای ترسیم مناسب­ترین دندروگرام برای گزارش نتایج، شاخص­های تشابه شامل دایس و جاکارد با روش­­های اتصال میانگین (UPGMA) و اتصال مجاور (NJ) محاسبه و بر اساس ضرایب کوفنتیک حاصل از آزمون مانتل مقایسه شدند. با  توجه  به  نتایج  به دست  آمده الگوریتم UPGMA و شاخص جاکارد در آزمون مانتل ضریب کوفنتیک بالاتری نشان داد (89%). بر اساس نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای جمعیت­ها در 5 گروه قرار گرفتند به طوری که گونه­ها بصورت صد در صد از یکدیگر تفکیک شدند که نشان­دهنده کارایی بالای نشانگر مورد استفاده می­باشد همچنین بخش‌هایی از خوشه‌بندی حاصل از دندروگرام، بیانگر آن است که تنوع ژنتیکی در گونه­های مورد بررسی با منشأ جغرافیایی آن‌ها در برخی موارد مطابقت و در برخی موارد مطابقت نداشت. این حالت ممکن است به دلیل جابجایی فیزیکی ژرم‌پلاسم باشد. این جابجایی می‌تواند به‌صورت انتقال بذور از منطقه‌ای به منطقه دیگر توسط انسان‌ها و حیوانات صورت گیرد. در مطالعه Aliyev و همکاران (3) تنوع ژنتیکی در بین گونه‌های دیپلوئید و تتراپلوئید جنس Triticum را با استفاده از نشانگر RAPD مورد بررسی قرار  گرفت و بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای گونه‎‌ها تجزیه خوشه‌ای باتوجه به الگوی باندی نشانگر مورد استفاده انجام دادند و در نهایت گونه‌ها را به دو گروه اصلی تقسیم کردند. در بررسی Ranjbar و همکاران (25) تنوع ژنتیکی 73 نمونه تترا پلوئید و 7 نمونه هگزاپلوئید از گونه Ae. crassa را با استفاده از 21 جفت آغازگر SSR مورد ارزیابی قرار داده و گزارش کردند که گونه­ها با توجه به این نشانگر مولکولی بر اساس سطح پلوئیدی یا پراکنش جغرافیایی از همدیگر تفکیک نشدند.

نتایج شاخص‏های درصد چندشکلی (P%)، هتروژنتیکی مورد انتظار نا اریب (Uhe)، هتروژنتیکی مورد انتظار (He) و شاخص شانون (I) نشان داد که بیشترین تنوع درون جمعیتی و تنوع ژنی مربوط گونه Ae. tauschii بود و این نشان دهنده این موضوع است که جمعیت‌های دارای ژنوم D بیشترین مقدار و در نتیجه بیشترین تنوع درون گونه‌ای را داشتند. همچنین Fereydouni و همکاران (8) در بررسی روابط بین ژنوم­هایD ، S و U جنس گندم نیای وحشی (Aegilops) با ژنوم A گندم با استفاده از نشانگر مولکولی  ISSRبیان داشتند که ژنوم D برای آغازگرهای مورد استفاده تنوع بالاتری درون جمعیت­های خود نشان داد و به عبارتی در مناطق تکثیر شده توسط آغازگرهای مورد استفاده در بین جمعیت­های دارای ژنوم D تغییرات بیشتری مشاهده شد.