اثر تغییرات مقدار ملاس و سلنیوم بر رشد مخمر ساکارومایسس سروزیه و میزان بیو‌اتانول تولیدی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 .دانش آموخته کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی- گرایش میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه‌، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز ، ایران

2 گروه پاتوبیولوژی‌، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران

3 . گروه مهندسی شیمی ، دانشگاه صنعتی سهند، تبریز، ایران

چکیده

بیواتانول به عنوان سوخت جایگزین برای کاهش وابستگی به سوخت‌های فسیلی استفاده می‌شود، امنیت انرژی را تضمین می‌کند و تاثیر منفی مصرف سوخت‌های فسیلی را به اقتصاد و محیط زیست کاهش می‌دهد. ملاس به دلیل محتوای قندهای قابل اشتعال که می‌تواند به طور مستقیم برای تخمیر بدون هیچ تغییری مورد استفاده قرار گیرد ماده بسیار خوبی برای تولید بیواتانول محسوب می‌شود. همچنین مخمر یک حامل مناسب برای بیوترانسفورماسیون سلنیوم می‌باشد و ازاین رو یکی از اقتصادی‌ترین منایع سلنیوم آلی، مخمر رشد یافته در محیط کشت غنی شده با سلنیوم می‌باشد. لذا هدف اصلی تحقیق حاضر بررسی اثر سلنیوم بر عملکرد تولید بیواتانول و به دست آوردن بیواتانول با بالاترین غلظت با استفاده از مخمر ساکارومایسس‌سروزیه بود. سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس‌سروزیه (‌SFO6) با استفاده از بریکس‌های متفاوت ملاس به عنوان سوبسترا و کود‌ اوره با غلظت ppm۲۵۰ و کود سوپر‌فسفات تری‌پل با غلظت ppm‌۵۰۰ به عنوان مواد مغذی تامین‌کننده منبع فسفر و نیتروژن و نیز با اضافه کردن مقادیر مختلف سلنیوم (2‌، 4‌‌، 6‌، 8‌، 10‌، 15‌، 20 و 25 میکرو‌گرم در میلی‌لیتر) کشت داده شد. پس از گرمخانه‌گذاری لازم، تاثیر مقادیر مختلف سلنیوم و ملاس بر رشد مخمر مذکور براساس میزان بیواتانول تولیدی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده نشان داد که حداکثر غلظت بیواتانول تولید شده (‌80گرم در لیتر) با استفاده از بریکس 25‌درصد ملاس چغندر قند و مقدار 20 میکروگرم سلنیوم به دست می‌آید. سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس‌سروزیه گزینه مناسبی برای افزایش راندمان تولید بیواتانول از ملاس چغندر‌قند غنی-شده با سلنیوم می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

effect of selenium and molasses on the growth of Saccharomyces cerevisiae and yield of bioethanol production

نویسندگان [English]

  • sara faramarzi 1
  • younes anzabi 2
  • hoda Jafarizadeh-Malmiri 3

1 . Department of Microbiology, Faculty of Basic Science, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran

2 . Department of Pathobiology, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran

3 Faculty of Chemical Engineering, Sahand University of Technology, Tabriz, Iran

چکیده [English]

Bioethanol is used as substitute fuel to reduce dependency on fossil fuels, ensure energy security and reduce the negative impact of fossil fuel consumption to the economy and the environment sugar beet Malass are very good raw materials for ethanol production due to their content of fermentable sugars, which can be directly used for fermentation without any modification. Previous studies have shown that Selenium enriched yeast (Se-yeast) is a good carrier for selenium biotransformation. Therefore one of the most economical sources of organic selenium is yeast grown in a selenium-enriched culture medium.
The main objectives of the present study were to evaluate the effect of selenium on the yield of bioethanol production and achieve the bioethanol with highest concentration, and compare the concentration of produced bioethanol, using S. cerevisiae, at obtained optimum condition with and without using selenium. For preparation of the growth media molasses was sterilized. After addition of the 0.3 g of the S. cerevisiae strain, SFO6 for the nutrition in molasses as fermentation media was enriched by addition of 500 and 250 ppm of (NH4)2HPO4 and urea, respectively and different amount of selenium (0, 5, 10, 15, 20 and 25 μg).The effect of different amounts of selenium and molasses on bioethanol yield was investigated. Obtained results revealed that maximum bioethanol concentration (80g/L) was achieved using 20‌μg selenium and molasses with 25°Bx. S. cerevisiae is a good option for increasing bioethanol production efficiency from selenium-enriched sugar beet molasses

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioethanol
  • molasses
  • Saccharomyces cerevisiae
  • Selenium

اثر تغییرات در مقدار ملاس و سلنیوم  بر رشد مخمر ساکارومایسس سروزیه و میزان بیو­اتانول تولیدی

سارا فرامرزی1، یونس انزابی2،3* و هدا جعفری­زاده مالمیری4

1 ایران، تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی- گرایش میکروبیولوژی

2 ایران، تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، گروه پاتوبیولوژی

3 ایران، تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی

4 ایران، تبریز، دانشگاه صنعتی سهند، گروه مهندسی شیمی

تاریخ دریافت: 9/6/1398              تاریخ پذیرش: 24/2/1399

چکیده

امروزه بیواتانول به عنوان سوخت جایگزین برای کاهش وابستگی به سوخت­های فسیلی استفاده شده و امنیت انرژی را تضمین و تاثیرات منفی مصرف سوخت­های فسیلی را به اقتصاد و محیط زیست کاهش می­دهد. ملاس هم که به دلیل محتوای قندهای قابل اشتعال می­تواند بدون هیچ تغییری به طور مستقیم برای عمل تخمیر مورد استفاده قرار­گیرد، ماده بسیار خوبی برای تولید بیواتانول محسوب می­شود. مخمر یک حامل مناسب برای بیوترانسفورماسیون سلنیوم بوده و یکی از اقتصادی­ترین منایع سلنیوم آلی هم، مخمر رشد یافته در محیط کشت غنی شده با سلنیوم می­باشد. لذا هدف اصلی تحقیق حاضر بررسی اثر سلنیوم بر عملکرد تولید بیواتانول با بالاترین غلظت با استفاده از مخمر ساکارومایسس­سروزیه و ملاس بود. بدین منظور سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس­سروزیه (­SFO6) با استفاده از بریکس­های متفاوت ملاس به عنوان سوبسترا و کود­ اوره با غلظت ppm۲۵۰ و کود سوپر­فسفات تری­پل با غلظت ppm­۵۰۰ به عنوان مواد مغذی تامین­کننده منبع فسفر و نیتروژن و نیز با اضافه کردن مقادیر مختلف سلنیوم (2­، 4­­، 6­، 8­، 10­، 15­، 20 و 25 میکرو­گرم در میلی­لیتر) کشت داده شد. پس از گرمخانه­گذاری لازم، تاثیر مقادیر مختلف سلنیوم و ملاس بر رشد مخمر مذکور براساس میزان بیواتانول تولیدی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده نشان داد که حداکثر غلظت بیواتانول تولید شده (­80گرم در لیتر) با استفاده از بریکس 25­درصد ملاس چغندر قند و  مقدار 20 میکروگرم سلنیوم به دست می­آید.  لذا به نظر می­رسد که سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس­سروزیه گزینه مناسبی برای افزایش راندمان تولید بیواتانول از ملاس چغندر­قند غنی­شده با سلنیوم می­باشد. 

واژه­های کلیدی: بیواتانول، ملاس، ساکارومایسس سروزیه، سلنیوم

* نویسنده مسئول، تلفن: 04133313413، پست الکترونیکی: anzabi@iaut.ac.ir

مقدمه

 

با توجه به کاهش منابع سوخت فسیلی، نیاز به منابع انرژی تجدیدپذیر که دارای قیمت مناسب بوده و فاقد آلودگی باشند، احساس می­شود. اتانول مهمترین سوخت زیستی است که در برخی از کشورها آن را به عنوان سوخت سبز می­شناسند. این الکل به دلیل عدد اکتان بالا می­تواند به تنهایی به عنوان سوخت و یا به جای MTBE  (Methyl Tert-Butyl Ether ) در بنزین و همچنین به عنوان حامل اکسیژن در گازوئیل به کار رود که سبب اکسیداسیون بهتر هیدروکربن­ها و کاهش مقدار آلودگی گازهای رها شده به اتمسفر می­شود (۹و۱۴). اتانول می­تواند از ملاس نیشکر و چغندر­قند و هیدرولیز اسیدی نشاسته برخی از حبوبات از قبیل ذرت به دست آید که البته استفاده از ملاس کارخانجات چغندر قند به دلیل داشتن خاکستر و قند اینورت کمتر دارای مزیت نسبت به ملاس نیشکر می­باشد(۷). با توجه به این­که ملاس تولیدی در جهان به بیش از ۳۵ میلیون تن و در ایران هم به بیش از ۳۲۰ هزار تن در سال می­رسد، به همین دلیل این ماده که یکی از فراوان­ترین پسماندها در صنایع تولید قند می­باشد، در حال حاضر یکی از ارزان­ترین منابع قندی محسوب می­شود (۶).

در چند دهه گذشته، تولید اتانول با استفاده از فرایند میکروبی مورد توجه قرار­گرفته است (۱۱). میکروارگانیسم­های مختلفی نظیر ساکارومایسس­سروزیه، گونه­های کاندیدا و کلستریدیوم و نیز زایموموناس­موبیلیس، مناسب برای تبدیل میکروبی سلولز از راه تخمیر­ و تولید اتانول هستند. دمای بهینه برای رشد و تولید اتانول در مورد مخمر ساکارومایسس­سروزیه­، ۳۰­درجه­سلسیوس می­باشد در­حالی که دماهای با­لاتر از ۳۵-۳۸ ­درجه سلسیوس نیز برای این مخمر قابل تحمل می­باشد. اهمیت این امر زمانی بیشتر نمایان می­شود که توجه گردد که دماهای با­لا، سرعت رشد، بازده اتانول و سرعت مرگ و میر مخمرها را تاثیر قرار می­دهد (۱۹). همچنین در شرایط هوازی هم مخمر ساکارومایسس سروزیه به خوبی رشد می­کند ولی مقدار کمتری الکل تولید می­شود درحالی­که تحت شرایط بی­هوازی رشد این مخمر آهسته­ شده و پیروات موجود در مسیر کاتابولیکی توسط آنزیم پیروات دکربوکسیلاز به استالدئید و CO2 تبدیل شده­ و در نهایت هم استالدئید به کمک NADH2 احیا و به اتانول تبدیل می­شود. لازم به ذکر است که رشد این مخمر و تولید اتانول توسط آن، در محلول­های با فشار اسمزی بالا متوقف می­شود که این عمل توقف رشد، در غلظت­های با­لای اتانول نیز صورت می­پذیرد (۱۱و۱۰).

سلنیوم یکی از عناصر شیمیایی شبه­فلزی است که خصوصیات فلزها و غیر­فلزها را با هم دارد و همین موضوع در بحث سلامت و تغذیه انسان اهمیت خاصی را به این عنصر می‌دهد . شکل بیولوژیکی فعال سلنیوم، سلنوپروتئینی بنام گلوتاتیون­پراکسیداز می­باشد که آنزیمی است که در تجزیه هیدروپراکسیدهای آلی و آب اکسیژنه دخالت می‌نماید. امروزه تقاضای روز افزون برای استفاده از مکمل­های سلنیوم به ویژه سلنیوم آلی وجود دارد به­طوری­که با الگوبرداری از طبیعت در ساختار آمینواسیدهای گوگرددار پیکره مخمرها، سلنیوم جایگزین گوگرد می­شود. از طرف دیگر تحقیقات مختلف نشان داده که برخی از میکروارگانیسم­ها مخصوصا مخمرها می­توانند با  بهره­گیری از قندهای محلول و اسیدهای آلی، توده سلولی با محتوای بالای پروتئینی تولید­کنند. در ضمن این موجودات می­توانند سلنیوم معدنی را که دسترسی زیستی کمتری دارد و نیز بالقوه سمی است را به فرم آلی آن که ایمن­تر بوده و از نظر زیستی نیز  فعال­تر است، تبدیل کنند. بنابراین مخمرها به عنوان یک حامل مناسب برای بیوترانسفورماسیون سلنیوم نیز محسوب می­شوند(۸و۱۳).

با توجه به اهمیت روز افزون تولید بیولوژیکی بیواتانول و نیز مزایای ذکر شده از سلنیوم­، در تحقیق حاضر به منظور افزایش راندمان تولید بیواتانول، بر­ آن شدیم که محیط کشت سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس­سروزیه را با استفاده از مقادیر مختلف سلنیوم غنی­سازی کرده و شرایط بهینه تولید بیواتانول با غلظت بالا را ایجاد کنیم­.

مواد و روشها

مخمر و ترکیبات استفاده شده در تحقیق: برای انجام تحقیق حاضر از سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس سروزیه (سویه SFO6­) استفاده شد که از شرکت ایران مایه (تهران-ایران) تهیه شده­بود، استفاده گردید. همچنین به منظور غنی­سازی محیط کشت مخمر مذکور از نمک سلنیت­سدیم (مرک- آلمان) استفاده­شد. کود­های اوره و فسفات لازم برای محیط کشت مذکور نیز از کارخانه الکل­سازی بیدستان قزوین (قزوین-ایران) تهیه ­شد. ملاس چغندر قند مورد نیاز هم به عنوان محیط رشد مخمر، به مقدار لازم از کارخانه قند خوی خریداری گردید. همچنین برای تنظیم میزان pH محیط کشت مذکور از اسیدسولفوریک­۳۰­درصد (مرک- آلمان) استفاده شد. دمای گرمخانه­گذاری محیط کشت نیز ۳۰­درجه سلسیوس در نظر گرفته شد. لازم به ذکر است که تمامی آزمایشات انجام گرفته در تحقیق حاضر در دما و pH اپتی­مم برای سویه صنعتی مخمر ساکارومایسس سروزیه انجام شده­است.

خصوصیات فیزیکی ملاس استفاده شده در تحقیق حاضر در جدول­ شماره1 ارائه شده­است.

جدول 1 – خصوصیات فیزیکی ملاس استفاده شده در فرآیند تخمیر در تحقیق حاضر

 

آزمون بررسی زمان رشد مخمر: هدف از انجام این آزمون، دست یافتن به زمان ورود مخمر مورد آزمایش به فاز لگاریتمی رشد بود که در این صورت حداقل زمان لازم برای تهیه مایه تلقیح مورد نیاز برای افزودن به محیط کشت به دست می­آمد. در واقع سنجش میزان کدورت محیط کشت مخمر مورد آزمایش به منظور تعیین فاز رشد لگاریتمی آن در دو  بریکس 10 و 15 ملاس انجام یافت تا در زمان انتقال مایه تلقیح به سوبسترا، مخمر در فاز رشد خود قرار داشته باشد. لازم به ذکر است که برای بررسی تاثیر سلنیوم بر رشد مخمر، این آزمون یک بار بدون استفاده از سلنیوم و بار دیگر هم با استفاده از سلنیوم انجام پذیرفت. بدین منظور ابتدا ۱۰۰ میلی­لیتر از آب ملاس مورد نظر به وسیله دستگاه اتوکلاو (RT-1­, REYHAN TEB) در دمای ۱۲۱­درجه سلسیوس و فشار ­5/1­بار به مدت ۱۵ دقیقه استریل گردید. سپس بریکس آن توسط دستگاه رفراکتومتر (Instrument Index Ltd.، Kissimmee، FL، USA) برای دو مقدار ۱۰ و ۱۵ به طور جداگانه تنظیم شد. همچنین ­pH محلول­ها نیز با استفاده از اسید سولفوریک به میزان 2/4 تنظیم شد. سپس مقدار 3/0 گرم از پودر مخمر مورد آزمایش به فلاکس حاوی آب ملاس مذکور اضافه شد. همچنین همزمان کود­های اوره و آمونیوم تری­پل فسفات  نیز به ترتیب به میزان ۵۰۰ و ۲۵۰ ppm اضافه گردید. در ادامه مخلوط حاصله درون گرمخانه شیکردار با  دمای ۳۰ درجه سلسیوس به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت. همزمان با رشد مخمر، میزان جذب نوری آب ملاس در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر (Jenway- UV- Vis- Spectrophotometer 6705, Staffordshire,UK) در بازه­های زمانی یک ساعته اندازه­گیری شد. این آزمون در سه تکرار انجام و نمودار مربوطه ترسیم شد. در مرحله بعد میزان رشد مخمر در حضور سلنیوم  بررسی شد که بدین منظور آب ملاس با بریکس ۱۵ را به میزان ۱۰۰ میلی­لیتر تهیه کرده و ­pH آن نیز با استفاده از اسید سولفوریک به میزان 2/4 تنظیم گردید. سپس مقدار 3/0 گرم از پودر مخمر مورد نظر وزن شده و به فلاکس حاوی آب ملاس مذکور اضافه شد.  همچنین همزمان کود­های اوره و آمونیوم تری­پل فسفات  نیز به ترتیب به میزان ۵۰۰ و ۲۵۰ ppm و نیز سلنیوم با مقادیر 0-۲-۴-۶-۸-۱۰-۱۵-۲۰-۲۵-۳۰ میکروگرم به فلاکس­­ها اضافه گردیده و درون گرمخانه ­شیکردار با دمای ۳۰ درجه­سلسیوس به مدت 24 ساعت قرار داده­شدند. میزان جذب این نمونه­ها نیز با دستگاه اسپکتوفتومتر مذکور در بازه­های زمانی یک ساعته اندازه گیری شده و نمودار مربوطه آن­ها نیز ترسیم شد.

محاسبه مقدار بهینه میزان سلنیوم موجود در محیط کشت برای تولید بیو­اتانول توسط مخمر: این آزمایش با هدف یافتن مقدار بهینه سلنیوم برای تولید بیو­اتانول انجام پذیرفت.  برای انجام این عمل۶۰ میلی­لیتر از محیط کشت مخمر ­(شامل ملاس با بریکس ۱۵ و مقادیر مشخص از کود­ها­ی اوره و آمونیوم تری پل فسفات که در قسمت قبل توضیح داده­شده­) با استفاده از استوانه مدرج برداشته شده و به فلاکس حاوی ۱۴۰ میلی­لیتر آب ملاس با بریکس­۱۰ انتقال داده شد. سپس مخلوط مذکور به گرمخانه با دمای ۳۰ درجه سلسیوس انتقال داده شد. بعد از ۲۴ ساعت، هوادهی متوقف شده و شرایط بی هوازی برای مخمر آماده شد. به این صورت فلاکس­های تخمیر با حجم ۲۰۰ میلی­لیتر آماده شد به طوری­که ۱۴۰ میلی­لیتر از آن مربوط به آب ملاس و ۶۰ میلی­لیتر  آن­هم مربوط به محیط کشت با مقادیر متفاوت سلنیوم (۰-۵-۱۰-۱۵-۲۰-۲۵ میکرو­گرم) بود. برای سنجش الکل تولیدی  به روش هیدرومتری هم ابتدا 200­میلی­لیتر از نمونه تخمیرشده را برداشته و  به بالن تقطیر انتقال دادیم. سپس چند عدد سنگ جوش (برای توزیع دما به طور یکنواخت) درون محلول ریخته شد. الکل درون محلول بر اساس اختلاف دمای جوش آب و الکل تقطیر شده و درون بالن ژوژه با حجم 100­میلی­لیتر منتقل گردید. سپس الکل به دست آمده، در درون بالن ژوژه به حجم 200 میلی­لیتر رسانده شد. در ادامه محلول مذکور به درون استوانه مدرج ریخته­شده و به دمای 20 درجه سلسیوس رسانده­شد. (لازم به ذکر است که محدوده دمایی عملکرد الکل­متر برای نشان دادن میزان الکل تولید شده، 20 درجه سلسیوس می­باشد). در نهایت هم میزان الکل موجود در محلول مذکور، توسط دستگاه الکل­متر معین گردید.(1۸)

بررسی تاثیر بریکس بر تولید بیو­اتانول توسط مخمر: بعد از انجام آزمایشات مربوط به تعیین میزان بهینه سلنیوم و با علم به تاثیر این ماده بر رشد مخمر و تولید بیو­اتانول، مقدار ۲۰ میکرو­گرم از سلنیوم انتخاب شد و ادامه آزمایشات برای تعیین میزان بهینه بریکس، با استفاده از آن انجام گرفت. در این مرحله آب ملاس را با بریکس­های­۱۰-۱۵-۲۰-۲۵-۳۰ (­از هر کدام به میزان ۱۰۰­میلی­لیتر) تهیه کرده و ­pH آن­ها را نیز با استفاده از اسید سولفوریک به میزان 2/4 تنظیم کردیم. سپس مقدار 3/0 گرم از پودر مخمر مورد نظر وزن شده و به فلاکس حاوی آب ملاس مذکور اضافه شد. همچنین همزمان کود­های اوره و آمونیوم تری­پل فسفات  نیز به ترتیب به میزان ۵۰۰ و ۲۵۰ و همین طور سلنیوم با مقدار بهینه ۲۰­میکرو­گرم، به مجموعه اضافه شد. سپس به منظور آماده سازی نمونه­ها برای تخمیر، همانند مرحله قبل به نسبت ۳۰ به ۷۰ از محیط کشت و نمونه استفاده شد. در ادامه نمونه­های مذکور به گرمخانه ­شیکردار با دمای ۳۰ درجه سلسیوس ­انتقال داده شدند که بعد از ۲۴ ساعت هوادهی، این عمل متوقف شده و در فلاسک­های فوق شرایط بی­هوازی مهیا گشت. بعد از گذشت یک هفته از شرایط بی­هوازی ایجاد شده، میزان الکل تولید شده در هر یک از نمونه­ها( آب ملاس با بریکس­های مختلف)­، براساس همان روش ذکر شده در قسمت قبل، سنجیده شد­.

نتایج

میزان رشد مخمر ساکارومایسس سروزیه در غلظت­های مختلف ملاس: با توجه به این­که مطابق نتایج ارائه شده در نمودار شماره­1 تحقیق حاضر مشخص گردید که مخمر مورد آزمایش، حداکثر طی 14­ساعت وارد فاز لگاریتمی شده­است لذا این زمان برای تزریق مایه تلقیح انتخاب شد.

نمودار زیر روند تغییرات رشد سلولی در زمان سپری شده را نمایش می­دهد. همانطور که در این نمودار مشخص شده در زمان­های پایین اختلاف آماری معنی­دار نبوده (­p­>­0.05­) اما در زمان­های بالا اختلاف مذکور معنی­دار می­باشد (­p­<­0.05­).

 

نمودار 1 – روند تغییرات رشد مخمر در بریکس­های 10و 15 ملاس

همانطور که در بخش روش کار عنوان شده­است، برای تعیین فاز رشد لگاریتمی مخمر مورد آزمایش، بررسی رشد مخمر با نمونه­های فاقد سلنیوم انجام گرفت اما در مرحله دوم کار، مشابه همان آزمایش ولی با حضور سلنیوم در محیط، رشد مخمر مورد بررسی قرار گرفت که نتایج تاثیرات این ماده بر روی رشد مخمر در نمودار شماره­2 تحقیق حاضر مشاهده می­شود. همانطور­که در این نمودار هم مشاهده می­شود در زمان­های پایین اختلاف آماری مشاهده شده معنی­دار می­باشد(­p­<­0.05­) در­حالی­که در زمان­های بالا اختلاف مذکور معنی دار نمی­باشد(­p­>­0.05­). در واقع براساس نتایج ارائه شده در نمودار مذکور به نظر می­رسد که ممکن است سلنیوم حالت بازدارنده­ای بر روی رشد مخمر در قسمتی از مرحله رشد آن داشته است اما تاثیر مثبتی بر افزایش بیواتانول تولیدی دارد.

 

 

نمودار 2 - بررسی میزان رشد مخمر در حضور مقادیر مختلف سلنیوم در محیط کشت

 

لازم به ذکر است که علی­رغم این­که نمودار­های 1و2 نشان می­دهند که مخمر مورد آزمایش حتی قبل از طی شدن 14­ساعت وارد فاز لگاریتمی شده­است اما برای اطمینان بیشتر در طول این تحقیق زمان رشد لگاریتمی مخمر 14­ساعت در نظر گرفته­شد. همچنین با توجه به نتایج به دست آمده از آزمایشات مذکور مشخص گردید که سلنیوم تاثیر منفی بر روی رشد مخمر نداشته و زمان 14 ساعت برای ورود به فاز رشد در این قسمت نیز مشاهده گردید.

از طرف دیگر یافته­های پژوهش حاضر مطابق نتایج ثبت شده در جدول شماره 2 مشخص کرد که افزایش میزان کدورت با گذشت زمان هوادهی نشان از رشد مخمر دارد.

 

جدول 2 – نتایج کدورت­سنجی مربوط به رشد مخمر ساکارومایسس سروزیه در حضور مقادیر مختلف سلنیوم در محیط

 

OD = 625nm

Time

Se=0

Se=5

Se=10

Se=15

Se=20

Se=25

6

0/46

0/31

0/38

0/36

0/37

0/41

7

0/611

0/491

0/532

0/494

0/515

0/528

8

1/21

1/095

1/14

1/068

1/142

1/148

9

1/078

0/988

1/014

0/982

1/011

1/008

10

1/358

1/357

1/405

1/36

1/429

1/373

11

1/67

1/552

1/559

1/513

1/54

1/527

12

1/539

1/406

1/494

1/453

1/498

1/423

13

1/872

1/707

1/756

1/721

1/704

1/717

14

1/762

1/618

1/667

1/61

1/608

1/606

 

 

نتایج مربوط به روند تولید الکل در قبال حضور مقادیر مختلف سلنیوم در محیط: نمودار شماره 3 نتایج تحقیق حاضر، حاکی از آن است که نمونه فاقد سلنیوم میزان ۲۹ گرم بر لیتر الکل اتیلیک (بیواتانول) تولید کرده­است که در مقایسه با میزان الکل تولیدی در مورد نمونه­های حاوی ۵،۱۰،۱۵،۲۰،۲۵ میکروگرم بر لیتر سلنیوم در بریکس ۱5­ملاس (به ترتیب ­۳۱،۳۲،۳۱،۳۴،۳۵ ­گرم بر­لیتر)­، میزان کمتری ­می­باشد که این یافته مهم نشانگر اختلاف آماری معنی­دار بوده (­p­>­0.05­) و نشان می­دهد که وجود سلنیوم تاثیر مثبتی در رشد سویه صنعتی آزمایش شده مخمر ساکارومایسس­سرویزیه داشته و همچنین در بهبود روند تولید الکل نیز موثر بوده­است. در واقع نتایج به دست آمده نشان داد که با افزایش مقدار سلنیوم، میزان الکل تولیدی هم به طور معنی­داری افزایش یافت(­p­>­0.05­).

 

نمودار3- منحنی تغییرات تولید بیواتانول(گرم در­لیتر) در قبال مقادیر مختلف سلنیوم(میکروگرم بر لیتر)

روند تولید الکل در قبال استفاده از درصد­های مختلف ملاس: بر اساس فرمول استکیومتریک تبدیل گلوکز به اتانول درفرآیند تخمیر، یک مول گلوکز به 2 مول دی­اکسید­کربن (که از سیستم خارج می­شود) و 2 مول اتانول تبدیل می­شود: C6H12O6 →2C2H5OH+2CO2 که این پدیده کاهش وزن را به دنبال دارد ولی می­تواند میزان تولید اتانول را افزایش دهد. هر گرم از گلوکز به صورت تئوریک می­تواند 51/0 گرم اتانول تولید کند بنابراین 50درصد از گلوکز به اتانول و 50درصد از آن به دی­اکسیدکربن تبدیل می­شود. در تحقیق حاضر برای رسیدن به نقطه بهینه بریکس، مقادیر مختلف آن با درصد­های ۵،۱۰،۱۵،۲۰،۲۵ مورد آزمون قرار گرفت که با توجه به نتایجی که در نمودار شماره 4 ارائه شده، مشخص­گردید که با افزایش غلظت ملاس، میزان تولید اتانول نیز افزایش چشمگیری داشته­است به طوری میزان الکل تولیدی به ترتیب برای نمونه­های ذکر شده ۳۴،۳0،۴۰،۵۹،۸۰ ثبت گردید. در واقع هماهنگی بین کاهش غلظت قند­ کل با تولید بیشتر الکل بیانگر مصرف قند توسط مخمر و تولید بیواتانول می­باشد. در واقع نتایج به دست آمده نشان داد که با افزایش میزان بریکس ملاس، الکل تولیدی هم به طور معنی­داری افزایش یافته­است(­p­>­0.05­).

 

نمودار4- منحنی تغییرات تولید بیواتانول در قبال استفاده از درصد­های مختلف ملاس

بحث و نتیجه­گیری

شقاقی و همکاران در سال 1397 به بررسی قابلیت تولید الکل توسط 5 نوع مخمر تجاری با استفاده از غلظت­های مختلف ملاس به عنوان سوبسترا و کود اوره و دی آمونیوم فسفات به عنوان مواد ریز مغذی پرداختند که طبق نتایج بدست آمده دو سویه مخمر 4109 NCYC با میزان تولید الکلg/L­14/59 و SFO6 با میزان تولید الکلg/L­67/58 مخمر­های برتری از لحاظ تولید الکل معرفی شدند(۱۸). نتایج بدست آمده در پژوهش حاضر هم در راستای تحقیق مذکور می­باشد که نشان داد مخمر ساکارومایسس­سروزیه سویه ­SFO6 راندمان تولید بیواتانول بالا یعنی برابر با g/L­55 دارد که میزان قابل توجهی می­باشد. حسنی و همکاران نیز در سال 1395 مطالعه­ای را تحت عنوان مقایسه تولید اتانول از ملاس بوسیله زایموموناس­موبیلیس و ساکارومایسس­سرویزیه انجام دادند. در این تحقیق، باکتری زایموموناس موبیلیس از کشت عصاره تخمیر شده انگور بر روی محیط کشت ­حاوی 1­درصد نیستاتین در شرایط هوازی و دمای­30 درجه سلسیوس جداسازی و با استفاده از رنگ آمیزی گرم، آزمایشات بیوشیمیایی و رشد در حضور 7درصد اتانول و نهایتاً ریبوتایپینگ شناسایی شد. همچنین برای بررسی میزان اتانول تولیدی از محیط ملاس 10درصد استفاده گردید. میزان اتانول تولیدی در زمان­های 24، 48، 96، 120 و 144 ساعت در محیط مذکور، برای Zymomonas mobilis subsp. mobilis ATCC 10988­، Zymomonas mobili subsp. mobilis IRMH52  و ساکارومایسیس­سرویزیه به ترتیب برابر با 45/1، 4/3 و05/5 درصد بود (2) که نتایج تحقیق مذکور ضمن داشتن همخوانی با نتایج پژوهش حاضر، همچنین حاکی از صحت انتخاب میکروارگانیسم مناسب در این پژوهش می­باشد. همچنین قربانی و همکاران در سال 1388 سنتز زیستی اتانول توسط مخمر Saccharomyces cerevisiae(­PTCC5010) را با استفاده از ملاس نیشکر به عنوان سوبسترا، با روش ناپیوسته بررسی کردند .در این تحقیق، تخمیر در دمای محیط (25درجه سلسیوس) و در pH 5/4 انجام یافت. همچنین از غلظت­های 10، 20، 30، 40 و 50  گرم بر لیتر ملاس به عنوان منبع کربن جهت تخمیر استفاده گردید. نتایج نشان داد که میزان بیواتانول تولیدشده با افزایش غلظت ملاس افزایش یافته و بیشترین مقدار آن در فرآیند تخمیر پس از 36 ساعت و با مصرف 27/93درصد از قند­کل موجود در ملاس 50  گرم بر لیتر به میزان 3/9 گرم بر لیتر ملاس و همچنین بیشترین میزان بازده تولید اتانول، به میزان 24/0 بر­گرم قند­کل بوده­است(۵). یافته­های تحقیق حاضر هم در این خصوص ضمن تطابق کلی با نتایج پژوهش مذکور، حتی نتایج بهتری در زمینه بالا بردن راندمان تولید بیواتانول نشان داد که در نمودار شماره 4 مشاهده می­گردد.

 درویشی و همکاران در سال ۱۳۹۷ تحقیقی با عنوان جداسازی سویه صنعتی ساکارومایسس سرویزیه با قابلیت تحمل بالا به اتانول از کارخانه های الکل سازی ایران انجام دادند که در آن با آزمایشهای ریختشناسی، بیوشیمیایی و مولکولی تایید کردند که سویه صنعتی مخمر جدا شده با ویژگیهای مناسب از لحاظ تولید و تحمل به اتانول میتواند برای مطالعات بعدی و افزایش تولید با روشهای بهینه سازی در سطح ارلن و بیوراکتور بکار رود (۳).  این نتایج همگام با تحقیق حاضر بوده و نشان می دهد که مخمر ساکارومایسیس­سرویزیه گونه مناسبی برای تولید بیواتانول می باشد.

زاهد و همکاران در  سال ۱۳۹۴ در تحقیقی با عنوان بهینه سازی منبع ازت و میزان اکسیژن محلول برای تولید همزمان اتانول و زایلیتول در کشت همزمان دو مخمر ساکارومایسس سرویزیه و کاندیدا تروپیکالیس با بدست آوردن این نتایج که سویه منتخب S. cerevisiae در محیط کشت حاوی قند گلوکز (140 گرم در لیتر)، توانایی تولید 66 گرم در لیتر اتانول با بازدهی ۴۷/۰ (گرم اتانول تولید شده نسبت به گرم گلوکز استفاده شده) را دارد و سویه منتخب C. tropicalis  نیز در محیط کشت حاوی (20 گرم در لیتر زایلوز) قابلیت تولید حدود 10 گرم در لیتر زایلیتول با بازدهی ۴۹/۰ (گرم زایلیتول تولید شده نسبت به گرم زایلوز استفاده شده) را دارد(۴). نتایج این تحقیق ضمن تطابق با تحقیق حاضر انتخاب صحیح مخمر ساکارومایسس­سرویزیه  را به عنوان گزینه مطلوب برای تولید بیواتانول نشان می د هد.

در سال ۲۰۰۸ کارپ و همکاران هم با هدف گسترش فرایند اقتصادی تولید بیواتانول از ملاس ­سویا، پژوهشی را در سطوح آزمایشگاهی و صنعتی انجام دادند. نامبردگان با انتخاب سویه­ای از مخمر ساکارومایسس­سرویزیه و سوبسترای ملاس سویا با غلظت مواد جامد حل شدنی ۳۰­درصد(w/v) و بدون تنظیم اولیهpH  و فراهم­کردن مواد مغذی معدنی برای محیط کشت، پارامترهای سینتیکی تولید بیواتانول را بررسی کردند. نتایج این پژوهش نشان داد که میزان بهره‌وری تولید بیواتانول(g/Lh) 08/8 و میزان بازده محصول تولیدی به قند مصرفی ۴۵ درصد و میزان بازده بیومس تولیدی به قند مصرفی ۸۱۵/0درصد در سطح آزمایشگاهی می­باشد(۱۷). نتایج این تحقیق هم ضمن این­که انتخاب میکروارگانیسم مناسب برای تولید بیو­اتانول در تحقیق حاضر را تایید می­کند، همچنین نشان می­دهد که منطبق با یافته­های پژوهش حاضر، بهینه­سازی دما و pH  و میزان سوبسترای مصرفی باعث بالاتر رفتن میزان تولید بیواتانول می­گردد. لایس و همکاران نیز در سال ۲۰۰۹ با انجام پژوهشی به منظور بهینه سازی فرایند تولید بیواتانول برای کم کردن زمان تخمیر و رسیدن به غلظت بالائی از محصول فوق، اثر متغیرهای دما، غلظت مایه تلقیح و غلظت اولیه ساکاروز محیط کشت را با طراحی آزمایش به روش طراحی مرکب مرکزی بررسی کردند. با انجام این آزمایش مقادیر بهینه به­دست آمده از مدل برای متغیرها، میزان ۲۰۰ گرم بر لیتر غلظت اولیه ساکاروز و مقدار ۴۰ گرم بر لیتر از میزان اولیه مایه تلقیح و دمای ۳۰ درجه سلسیوس را نشان داد. نامبردگان با استفاده از این مقادیر در پژوهش خود به میزان بیشینه بیو­اتانول به مقدار­۸۰ گرم بر لیتر رسیدند که همخوانی با صحت مدل تحقیق حاضر را نشان می­دهد(۱۲). همچنین نوفمل و همکاران در تحقیقی که در سال ۲۰۱۲ انجام دادند، بهبود میزان تولید اتانول توسط مخمر ساکارومایسس­سرویزیه را با بکارگیری آزمایشی به منظور پیدا کردن میزان بهینه مخمر هیدرولیز شده و اوره به عنوان منبع مغذی ­بررسی کردند. نامبردگان در طرح آزمایش انجام گرفته به این نتیجه رسیدند که میزان بهینه تولید بیواتانول در دمای ۳۵­درجه سلسیوس و با غلظت مخمر هیدرولیز شده ۵ گرم بر­لیتر و اوره به میزان ۳ گرم بر­لیتر، حداکثر به مقدار(m/v) ۷ تا ۸ درصد با بهره‌وری 3/76 ­درصد خواهد رسید(۱۶). نتایج تحقیق حاضر هم حاکی از آن است که افزودن کودهای اوره و فسفات به عنوان ریز مغذی به محیط کشت مخمر، تاثیر مثبتی در رشد آن و نهایتا تولید بیواتانول داشته است به­طوری که میزان بیواتانول تولیدی به بیش از 55 گرم درلیتر افزایش پیدا کرد.

موزدیاک و همکاران در سال 2017 درباره استفاده از مخمرها و دیگر میکروارگانیسم­ها برای سنتز نانو­ذرات­سلنیوم، پژوهشی مروری را انجام دادند که طی این تحقیق مشخص گردیدکه اکثر مطالعات در این زمینه بر روی سویه­های مختلف مخمر ساکارومایسس­سروزیه بوده­است چرا که این مخمر توانایی و ظرفیت جمع آوری مقادیر بالای سلنیوم در طی مرحله رشد را داراست(۱۵). اسمعیلی و همکاران نیز در سال 1395 مطالعه­ای تحت عنوان غنی­سازی مواد غذایی با مخمر غنی­شده با سلنیوم انجام دادند. نامبردگان در تحقیق مذکور با بررسی یافته­های مقالاتی از سال 1975 تا 2016 بیان کردند که مخمرها حامل مناسبی برای بیوترانسفورماسیون سلنیوم می­باشند(1). با توجه به پژوهش­های ذکر شده و مقایسه یافته­های آن­ها با نتایج به دست آمده از آزمایشات انجام شده در پژوهش حاضر، همخوانی بالائی مشاهده می­شود چرا که مخمر غنی­شده با سلنیوم نه تنها اثر منفی بر رشد مخمر ساکارومایسس­سروزیه نداشت(نمودار3) بلکه باعث افزایش راندمان تولید نیز شد. نتیجه به دست آمده در تحقیق حاضر در خصوص اثرات حضور عنصر سلنیوم در محیط رشد مخمر ساکارومایسس­سروزیه می­تواند با این واقعیت توضیح داده­شود که گلوتامات موجود در مخمر، با تغییر ساختار میتوکندری تاثیر منفی بر روی میتوکندری می­گذارد و میزان تولید انرژی و میزان تخمیر را کاهش می­دهد. در واقع به نظر می­رسد که مخمر  مذکور با تبدیل سلنیوم به سلنوسیستئین، از این سلنو­آمینو­اسید برای جلوگیری از اثر گلوتامات استفاده می­کند و لذا از این نظر این مخمر می­تواند یک حامل مناسب برای بیوترانسفورماسیون سلنیوم ­باشد.

نتیجه نهائی از یافته­های تحقیق حاضر که درطی آن اثرات دو پارامتر دخیل در تخمیر، یعنی میزان سلنیوم 5تا25 میکروگرم و بریکس سوبسترائی­10­تا25­، بر­غلظت گرم درلیتر بیواتانول تولید شده مورد بررسی قرار گرفت، حاکی از آن است که حداکثر غلظت بیواتانول (بالاتر از ­80 گرم بر لیتر) با استفاده از 20 میکروگرم سلنیوم و نیز ملاس با بریکس 25 درصد، به­دست آمد. علاوه بر­این، یافته­های مذکور نشان داد که بدون استفاده از سلنیوم در فرایند تخمیر بهینه شده، بیواتانول با غلظت 29 گرم در­لیتر تولید شد که بسیار پایین­تر از موارد استفاده شده از محیط­های حاوی سلنیوم بود. ­لذا به نظر می­رسد که طرح پیشنهادی انجام گرفته در پژوهش حاضر، باعث افزایش راندمان تولید بیواتانول گردیده­است.

سپاسگزاری

با توجه با این­که یافته­های مقاله حاضر برگرفته از بخشی از نتایج پایاننامه کارشناسی ارشد موصوب دانشگاه ­آزاد اسلامی واحد تبریز در رشته زیست­شناسی گرایش میکروبیولوژی می­باشد لذا بدینوسیله نویسندگان از حمایت­های مادی و معنوی مسئولین این دانشگاه قدردانی می­نمایند.

  • اسمعیلی، س. داودی، ح . فردوسی، ر.، 1395، غنی سازی مواد غذایی با مخمر غنی شده با سلنیوم، فصلنامه علمی پژوهشی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شهید بهشتی، (3)40، 109 –
  • حسنی، م . مقبلی، م .، 1395، مقایسه تولید اتانول از ملاس بوسیله زایموموناس موبیلیس و ساکارومایسس سرویزیه، زیست فناوری دانشگاه تربیت مدرس،(1) 7، 15-23.
  • درویشی ف، ابوالحسن مقدمی ن، ۱۳۹۷، جداسازی سویه صنعتی ساکارومایسس سرویزیه با قابلیت تحمل بالا به اتانول از کارخانه های الکل سازی ایران ، پژوهشهای سلولی و مولکولی، ۳۱، ۵۹۲۳۳- ۵۸۲.
  • زاهد ا، صالحی جوزانی غ، خداییان ف، 1394، بهینه سازی منبع ازت و میزان اکسیژن محلول برای تولید همزمان اتانول و زایلیتول در کشت همزمان دو مخمر ساکارومایسس سرویزیه و کاندیدا تروپیکالیس، پژوهشهای سلولی و مولکولی، 28، 249- 238.
  • قربانی، ف. یونسی، ح. اسماعیلی، ع.،1388، تولید سوخت اتانول با مخمر ساکارومایسس سرویزیه از ملاس پسماند کارخانه های قند در سیستم تخمیر ناپیوسته ، مجله علوم و تکنولوژی محیط زیست ، 11(4)، 140-148.
  • موسوی نسب، م. فرقانی ، ز. سیدی ، آ . ،1392، ملاس و کاربردهای آن در صنایع تخمیری ، بیست و یکمین کنگره ملی علوم و صنایع غذایی، 1-6.

 

7- Baptista C. M. S. G., Coias J. M. A., Oliveria A. C. M., Oliveria N. M. C., Rocha J. M. S., Dempsey M. J., Lannigan K. C., Benson P. S. (2006) Natural immobilisation of microorganisms for continuous ethanol production." Enzyme Microb. Technol. 40(1): 127-131.

8- Bjelakovic, G.  Nikolova, D. Gluud, L. L. ,2015, Antioxidant supplements for prevention of mortality in healthy participants and patients with various diseases, Cochrane Database of Systematic Reviews, 133(2), 71-76.

9- Cardona Alzate C. A., Sánchez Toro O. J. (2006) Energy consumption analysis of integrated flowsheets for production of fuel ethanol from lignocellulosic biomass. Energy 31(13): 2447-2459.

10- Caspetaa, L., Caro-Bermúdez M. A., (2014), “Enzymatic hydrolysis at high-solids loadings for the conversion of agave bagasse to fuel ethanol”, 113 (64), pp 277–286.

11- Hahn-Hägerdal B., Galbe M., Gorwa-Grauslund M.F., (2006), Lidén G., “Bio-ethanol the fuel of tomorrow from the residues of today” 24 (12), pp 549–556.

12- Jayus, N. Mayzuhroh, A .Arindhania, S. Caroencha, C.,2016, Studies on Bioethanol Production of Commercial Baker's and Alcohol Yeast under Aerated Culture Using Sugarcane Molasses as the Media , Agriculture and Agricultural Science Procedia, 9 , 493-499.

13- Kieliszek, M. zejak, S. Bzducha-Wróbel, A.,2015, Influence of selenium content in the culture medium on protein profile of yeast cells Candida utilis ATCC 9950. Oxid, Med. Cell. Longev, 1–6.

14- Montesinos, T. and J. M. Navarro (2000) Production of alcohol from raw wheat flour by Amyloglucosidase and Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb. Technol. 27(6):362-370.

15- Mozdziak, P. Shoeib, S. Golkar-Narenji, A.,2017, Biogenesis of Selenium Nanoparticles Using Green Chemistry, Topics in Current Chemistry , 375-388.

16- Nofemele, Z. Shukla, P. Trussler, A.,2012, Improvement of ethanol production from sugarcane molasses through enhanced nutrient supplementation using Saccharomyces cerevisiae, Journal of Brewing and Distilling, 3(2), 29-35.

17- Paula, F. SiqueiraaSusan, A. Karpa, G.,2008, Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales , Bioresource Technology, 99(17), 8156-8163.

18- Shaghaghi-Moghadam R., Jafarizadeh-Malmiri H., Mehdikhani P., Jalalian S., Alijanianzadeh R.,2018 , Screening of the five different wild, traditional and industrial Saccharomyces cerevisiae strains to overproduce bioethanol in the batch submerged fermentation. Z. Naturforsch., 73, 361-366.

19- Zhanying Z., Wongb H. H., Albertsonb P. L., Harrison M. D., (2015), “Effects of glycerol on enzymatic hydrolysis and ethanol production using sugarcane bagasse pretreated by acidified glycerol solution”, 192 (10), pp 367–373.

دوره 33، شماره 4
دی 1399
صفحه 626-639
  • تاریخ دریافت: 09 شهریور 1398
  • تاریخ پذیرش: 24 اردیبهشت 1399
  • تاریخ اولین انتشار: 01 دی 1399