بررسی اثر عصاره جَفت بلوط بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و تجمع­زدایی فیبرهای پروتئین لیزوزیمِ سفیده تخم­مرغ

معصومه فرامرزیان و دکتر سیف­اله بهرامی­کیا^*

ایران، خرم آباد، دانشگاه لرستان، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 01/07/1398          تاریخ پذیرش: 24/02/1399

چکیده

در شرایط نرمال فیزیولوژیکی، پروتئین­ها عمدتاً دارای ساختار کروی و محلول در آب هستند. در برخی شرایط پروتئین­ها به ساختارهایی بنام فیبریل­ها یا پلاک­های آمیلوئیدی که نامحلول و بیماری­زا هستند تبدیل می­شوند. در این مطالعه، اثرات عصاره هیدروالکلی جَفت بلوط ایرانی (Quercus brantii) بر شکل­گیری فیبریل های لیزوزیمِ سفیده تخم­مرغ و همچنین اثر این عصاره بر حذف فیبریل­های از پیش شکل­گرفته بررسی شده است. به همین منظور لیزوزیم سفیده تخم­مرغ در حضور و غیاب عصاره هیدروالکلی جَفت بلوط در دمای ˚C60 بمدت 15 روز انکوبه شد. اثر عصاره با استفاده از آزمون­های اتصال CR، طیف سنجی CD و تست فلورسانس THT و ANS و میکروسکوپ FE-SEM مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که عصاره جَفت بلوط در تمامی نسبت­های مورد آزمایش دارای اثر مهاری بر شکل­گیری فیبریل­های آمیلوئید است. همچنین عصاره جَفت اثر تسریع­کننده بر تجمع­زدایی فیبریل­های آمیلوئیدی دارد و بیشترین اثر بر تجمع­زدایی فیبریل­های در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبریل مشاهده می­شود. از نتایج بدست آمده در این مطالعه می­توان نتیجه گرفت که جَفت بلوط حاوی ترکیباتی است که می تواند بعنوان عوامل موثر در تهیه داروها برای حذف پلاک­های آمیلوئیدی در درمان بیماری­های وابسته به آمیلوئید بکار گرفته شود.

واژه های کلیدی: Quercus brantii، عصاره بلوط، فیبریل­های آمیلوئید، بیماری­های آمیلوئیدی، پلاک­های آمیلوئیدی، لیزوزیم سفیده­ تخم­مرغ، HEWL

* نویسنده مسئول، تلفن: 09166614082، پست الکترونیکی:  bahramikia.s@lu.ac.ir

مقدمه

در شرایط بیماری­زا مانند جهش، استرس، تب و افزایش سن؛ پروتئین­های از اشکال طبیعی خود خارج شده و در شکل پلاک­ها (فیبریل­های) آمیلوئیدی تجمع می­یابند. این اشکال نامحلول پروتئینی که غنی از ساختارهای ثانویه صفحات بتا هستند با تجمع در اندام­های مختلف مانند مغز، روده، کلیه و غیره موجب بیماری­های مختلف مانند آلزایمر، آتاکسی مغزی-نخاعی، آنسفالوپاتی اسفنجی و غیره می­شوند (14 و 19).

برای پیشگیری یا درمان بیماری­های آمیلوئیدی رویکردهای متفاوتی در نظر گرفته شده است. از جمله این رویکردها می­توان به مواردی مانند استفاده از مهارکننده­های مولکولی کوچک (18)، استفاده از پپتیدهای مینی­چاپرون مصنوعی (29)، پیوند بافت آسیب دیده (30)، تثبیت ساختار فرم محلول پروتئین، ژن درمانی در مواردی که بیماری آمیلوئیدی منشاء ژنتیکی داشته باشد(16)، مهار تولید پروتئین آمیوئیدوژنیک یا پیش­سازهای آن، مهار شکسته­شدن پروتئین­های پیش­ساز و تبدیل شدن آن­ها به فرم­های آمیلوئیدوژنیک در پروتئین­هایی مثل آمیلوئید بتا (Aβ) و ایمونوتراپی مبتنی بر آنتی­بادی (17) اشاره نمود.

مهارکننده­های مولکولی کوچک عامل­های بالقوه برای درمان مکانیسم­های پایه این بیماری­ها هستند که بر مسیرهای مختلف تشکیل فیبریل­های آمیلوئیدی تاثیر می­گذارند (20). گروهی از ترکیبات مولکولی کوچک، پلی­فنول­ها و فلاونوئیدها هستند که در غلظت­های بالا در گیاهان وجود دارند. فنل­ها عمدتاً نه تنها دارای اثرات ضد آمیلوئیدوژنیک­اند، بلکه اثرات بی­ثبات­کننده­ای بر فیبریل­های آمیلوئید (تبدیل فیبریل به تجمعات بی­شکل) دارند. مکانیسم بی­ثبات نمودن فیبریل­ها احتمالا متفاوت از مکانیسم مهار تشکیل آمیلوئید است (11، 18 و 23).

امروزه علاقه زیادی به استفاده از داروهای طبیعی و گیاهان دارویی بعلت داشتن کمترین عوارض جانبی و تحمل بیشتر در مقایسه با داروهای مصنوعی، وجود دارد. از سوی دیگر همانطور که اشاره شد گیاهان دارای مقادیر بالایی از فنول­ها و فلاونوئیدها هستند. از اینرو در مطالعات بسیاری تاثیر گیاهان دارویی بر درمان بیماری­های وابسته به آمیلوئید مورد بررسی قرار گرفته است که از جمله آنها می­توان به بررسی اثر عصاره گیاهان Cassia tora Linn، Withania somnifera ،Ginkgo biloba ، عصاره سیر و پلی فنولهای موجود در چای سبز اشاره نمود (22،13، 26، 32 33).

درخت بلوط (Quercus) از اعضای خانواده راش (Fagaceae) است (25). یکی از گونه­های درخت بلوط گونه Quercus brantii (بلوط فارسی یا بلوط زاگرس) می­باشد که درختی با ارتفاع تقریبی 20 متر دارای یک تاج بزرگ کروی است. برگ­های این درخت تخم­مرغی شکل با حاشیه­های دندانی­اند. میوه آن بیضوی کشیده است که در کاسه سفید مخروطی شکل قرار دارد (31).

پوسته میوه بلوط ایرانی (جَفت) بعنوان داروهای ضد اسهال در طب سنتی مورد استفاده قرار می­گیرند. عصاره جَفت دارای اثر ضد باکتری و بهبود زخم است. ترکیبات فنولی و آنتی اکسیدانی موجود در قسمت­های مختلف درخت بلوط بر کاهش علائم مربوط به اختلالات عصبی، آلزایمر و دیابت موثر است (8، 15 و 25).

با توجه به جنبه­های بالینی جَفت بلوط و نظر بحضور مقادیر بالای فنول­ها و فلاونوئیدها در گیاهان، در این مطالعه عصاره هیدروالکلی جَفت بلوط بمنظور بررسی اثرات احتمالی آن بر درمان بیماری­های وابسته به آمیلوئید مورد بررسی قرار گرفت و لیزوزیم سفیده­ تخم­مرغ (HEWL: Hen egg-white lysozyme) بعنوان پروتئین مدل استفاده شد.

مواد و روشها

مواد: لیزوزیم سفیده تخم­مرغ (HEWL)، تیوفلاوینT (Thioflavin T:THT)، آنیلینو نفتالن 8- سولفونیک اسید (ANS: Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)، قرمز کنگو (CR: Congo red)، کاتچین و گالیک اسید از شرکت سیگما؛ گلیسین، سدیم فسفات منوبازیک دی هیدرات (NaH₂PO₄*H₂O)، سدیم فسفات دی­بازیک دی هیدرات (Na₂HPO₄*2H₂O)، سدیم آزید (NaN₃)، سدیم کلراید (NaCl)، آلومینیوم کلراید (AlCl₃)، فولین سیوکالتیو (FCR: Folin-Ciocalteu)، اسید هیدروکلریک (HCl)، سدیم نیتریت (NaNO₂) و سدیم هیدروکسید (NaOH) از شرکت مرک؛ الکل اتیلیک طبی 96 درصد حجمی از شرکت الکل نصر

تجهیزات: دستگاه اسپکتروفلوریمتری (Fluorescence Spectrophotometer) مدل Cary-Eclipse ساخت شرکت Agilent، دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی  مدل FE-SEM (Field-emission Scanning Electron Microscope) ساخت شرکت TESCAN کشور چک، دستگاه بن ماری سرولوژی مدل WB ساخت شرکت ایرانی دی تجهیز آریا، دستگاه میکروپلیت ریدر مدل Epoch ساخت شرکت بیوتک (BioTek)، پی اچ متر ساخت شرکت WinLab

تهیه عصاره­ گیاهی: دانه بلوط فارسی از پارک جنگلی شورآب واقع در کوهپایه­های زاگرس شهرستان خرم­آباد در استان لرستان جمع­آوری شد. دانه بلوط در سایه خشک و سپس جَفت آن جدا شد. عصاره هیدروالکلی جَفت طی 4 مرحله (در دو مرحله اول با اتانول 80 درصد و در دو مرحله دوم با اتانول 70 درصد) استخراج گردید. عصاره حاصل بوسیله دستگاه روتاری تغلیظ و در دمای 40 درجه سانتی­گراد در آون خشک شد.

تعیین محتوای فنولی عصاره­ی جَفت: محتوای فنولی عصاره­ با استفاده از معرف فولین سیوکالتیو (FCR) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (27). غلظت 10 تا 100 میکروگرم در میلی­لیتر گالیک­اسید برای طراحی منحنی استاندارد استفاده شد. برای این­منظور، 5/0 میلی­لیتر از عصاره با 5/2 میلی­لیتر FCR (رقیق شده به نسبت 1:10) و سپس با 2 میلی­لیتر کربنات سدیم (7.5 درصد) مخلوط شد. مخلوط نهایی بمدت 90 دقیقه در دمای اتاق، در تاریکی انکوبه گردید. جذب نمونه­ها در 765 نانومتر، با استفاده از میکروپلیت ریدر خوانده شد. این روش هم­زمان برای غلظت­های مختلف گالیک­اسید انجام و نتایج بر حسب میلی­گرم گالیک اسید در هر گرم وزن خشک عصاره بیان شد.

تعیین محتوای فلاونوئیدی عصاره­ی جَفت: محتوای فلاونوئیدی عصاره با استفاده از معرف آلومینیوم کلراید مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (34). غلظت 10 تا 100 میکروگرم در میلی­لیتر کاتچین برای طراحی منحنی استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. برای این­منظور، 5/0 میلی­لیتر از عصاره با 2 میلی­لیتر آب­مقطر و سپس با 15/0 میلی­لیتر محلول NaNO₂  (15 درصد) مخلوط شد. پس از 6 دقیقه، 15/0 میلی­لیتر  محلولAlCl₃  (10 درصد) اضافه شد. بعد از 6 دقیقه، 2 میلی­لیتر محلول NaOH  (4 درصد) اضافه و سپس بلافاصله 200 میکرولیتر آب­مقطر اضافه شد. مخلوط نهایی بمدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. جذب نمونه­ها در 510 نانومتر، با استفاده از میکروپلیت ریدر خوانده شد. این روش هم­زمان برای غلظت­های مختلف کاتچین انجام شد. نتایج بر حسب میلی­گرم کاتچین در هر گرم وزن خشک عصاره بیان شد.

تهیه نمونه­ها: برای مطالعه اثر عصاره بر روند شکل­گیری فیبریل­های آمیلوئیدی، HEWL با استفاده از بافر گلیسین 50 میلی­مولار (pH 2.2) در غلظت 14 میلی­گرم بر میلی­لیتر تهیه شد. سپس میکروتیوپ­های حاوی محلول پروتئین در غیاب و حضور عصاره (نسبت­های  5/0، 1 و 2 عصاره تام به 1 پروتئین)  در داخل حمام آب- بدون همزده شدن محلول- در دمای 60 درجه سانتی­گراد بمدت 15 روز انکوبه گردید. جهت مطالعه اثر عصاره بر روند تجمع­زدایی آمیلوییدی؛ نمونه فیبریله­شده در روز پانزدهم، در غیاب و حضور عصاره (نسبت­های  5/0، 1 و 2 عصاره تام به 1 پروتئین) در دمای 37 درجه سانتی­گراد بمدت سه روز انکوبه شد (7).

روشهای مطالعه فیبریل­های آمیلوئیدی

آزمون اتصال قرمز کنگو (CR): ابتدا استوک غلیظ CR بوسیله بافر فسفات 10 میلی­مولار (NaCl 15/0 میلی­مولار، NaN₃ 02/0 درصد، 4/7 pH) تهیه شد. سپس 5/2 ماکرولیتر از نمونه پروتئین به 200 ماکرولیتر از محلول کاری CR (20 ماکرومولار) افزوده و کاملاً مخلوط شد. محلول حاصل بمدت 30 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه شد. سپس شدت جذب در طول موج 700-400  نانومتر اندازه­گیری شد (24).

تست فلوئورسانس تیوفلاوین T (THT): ابتدا استوک غلیظ THT بوسیله بافر فسفات 10 میلی­مولار (NaCl 15/0 میلی­مولار، NaN₃ 02/0 درصد، 7 pH) تهیه شد. سپس 15 ماکرولیتر از نمونه پروتئین به 2985 ماکرولیتر از محلول کاری THT (15 ماکرومولار) افزوده و کاملاً مخلوط شد. شدت فلوئورسانس  با اسپکتروفلوئورسانس  در excitation  440 و  emission 460-600 و عرض شکاف 5 و10 (بترتیب برایexcitation  و emission) اندازه­گیری شد (24).

تست فلوئورسانس  آنیلینو نفتالن 8- سولفونیک اسید (ANS): ابتدا استوک غلیظ ANS بوسیله بافر فسفات 10 میلی­مولار (NaCl 15/0 میلی­مولار، NaN₃ 02/0 درصد، 7 pH) تهیه شد. سپس 15 ماکرولیتر از نمونه پروتئین به 300 میکرولیتر از محلول کاری ANS (20 ماکرومولار) و 2685 میکرولیتر از بافر گلیسین افزوده و کاملاً مخلوط شد. شدت فلوئورسانس  با اسپکتروفلوئورسانس  در excitation  380 و emission 420-600 و عرض شکاف 5 برایexcitation  و emission  اندازه­گیری شد (9).

بررسی مورفولوژی ساختاری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (FE-SEM): پنج میکرولیتر از هر نمونه رقیق­شده (بوسیله آب­مقطر به میزان 70 برابر) بر روی فویل آلومینیومی قرارداده شد. نمونه­ها پس از خشک شدن در مجاورت هوا بوسیله لایه­ای از طلا پوشانده شد و در ولتاژ Kev 15 با بزرگنماییkx 90 توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی اسکن شدند.

نتایج

محتوی فنولی و فلاونوئیدی عصاره­ی جَفت بلوط: میزان محتوی فنولی و فلاونوئیدی عصاره­ی هیدروالکلی جَفت بلوط در جدول شماره 1 نشان داده شده است.

جدول 1- محتوی فنولی و فلاونوئیدی عصاره­ی هیدروالکلی جَفت بلوط

^* آزمایشات در سه کنترل انجام و نتایج میانگین سه آزمایش مستقل SD ± است، 3=n

مقدار کل ترکیبات فنولی بر اساس میلی­گرم گالیک اسید در هر گرم وزن خشک عصاره بیان شد. مقدار کل ترکیبات فلاونوئیدی بر اساس میلی­گرم کاتچین در هر گرم وزن خشک عصاره بیان شد.

آزمون اتصال قرمز کنگو (CR): فیبریل­های آمیلوئیدی دارای جایگاه­های اتصال جهت مولکول CR هستند. این جایگاه­ ها واقع در سطح صفحات بتای فیبریل­های آمیلوئیدی است. وقتی CR به فیبریل­های آمیلوئیدی متصل می­شود؛ افزایش ماکزیمم جذب در طیف CR مشاهده می­شود و ماکزیمم جذب نوری آن از 490 به 500 نانومتر شیف (red shift) پیدا می­کند (21). در شکل 1 با استفاده از آزمون اتصال قرمز کنگو؛ تاثیر عصاره جَفت بلوط بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و تجمع­زدایی فیبرهای HEWL به تصویر کشیده شده است.

همانطور که در شکل 1- الف مشاهده می­شود؛ طیف جذب نوری قرمز کنگوی HEWL، 15 روز پس از انکوباسیون در دمای 60 درجه سانتی­گراد افزایش می­یابد و ماکزیمم جذب نوری آن از 490 به 500 نانومتر شیف پیدا می­کند. این تغییرات بیانگر فیبریله شدن پروتئین لیزوزیم تحت شرایط اسیدی و حرارت بالاست. در نمونه­هایی که محلول پروتئین حاوی غلظت­های مختلفی از عصاره جفت بلوط است؛ شرایط اسیدی و حرارت بالا صرفاً منجر به افزایش اندک در شدت جذب نوری قرمز کنگو می­شود و تغییر در شانه طیف و شیفت به طول موج­های بالاتر مشاهده نمی­شود. لذا می­توان نتیجه گرفت که عصاره جفت بلوط از فیبریله شدن HEWL ممانعت می­کند و مانع از تکمیل شدن فرآیند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین می­شود.

شکل 1- آزمون اتصال قرمز کنگو در غیاب و حضور غلظت­های مختلف عصاره جَفت بلوط جهت ارزیابی تاثیر عصاره الف) بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL، 15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد ب) بر روند تجمع­زدایی فیبرهای HEWL، سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد

در مقایسه اثرگذاری غلظت­های مختلف عصاره؛ با افزایش غلظت میزان مهار روند شکل­گیری فیبرهای آمیلوئیدی افزایش می­یابد. بنابراین بهترین غلظت تاثیرگذار عصاره در نسبت 2:1 عصاره به پروتئین حاصل می­شود.

همانطور که در شکل 1- ب مشاهده می­شود؛ تحت شرایط برگشت­پذیری روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی (سه روز پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد)، شدت طیف جذب نوری قرمز کنگوی فیبریل­های از پیش شکل گرفته لیزوزیم کاهش می­یابد اما ماکزیمم طیف جذب همچنان در ناحیه­ی 500 نانومتر قرار دارد که نشانگر وجود مقادیر بالای فیبرهای آمیلوئیدی در نمونه کنترل است. تحت این شرایط؛ ماکزیمم جذب نوری نمونه­های انکوبه شده در حضور غلظت­های مختلف عصاره جفت بلوط از 500 به 490 نانومتر شیف (blue shift) پیدا می­کند. این تغییرات بیانگر اثر این عصاره بر تسریع روند تجمع­زدایی فیبرهای پروتئین است. بیشترین میزان تاثیر عصاره بر برگشت­پذیری فیبرهای آمیلوئیدی در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبر است. با افزایش غلظت عصاره؛ تاثیر آن بر روند فیبریل­زدایی کاهش می­یابد.

فلوئورسانس THT: فیبریل­های آمیلوئیدی دارای جایگاه های اتصال جهت پروب فلورسنت THT هستند. این جایگاه­ ها واقع در کانال بین صفحات بتای فیبریل­های آمیلوئیدی است. زمانی که این ترکیب به ساختار صفحات بتای موجود در فیبرهای آمیلوئید متصل می­شود؛ شدت فلوئورسانس  THT افزایش می­یابد (24). در شکل 2 با استفاده از تست فلوئورسانس  THT؛ تاثیر عصاره جَفت بلوط بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و تجمع­دایی فیبرهای HEWL به تصویر کشیده شده است.

شکل 2- اندازه­گیری شدت فلوئورسانس  THT در غیاب و حضور غلظت­های مختلف عصاره جَفت بلوط جهت ارزیابی تاثیر عصاره  الف) بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL ، 15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد ب) بر روند تجمع­زدایی فیبریل­های HEWL، سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37  درجه سانتی­گراد

همانطور که در شکل 2- الف مشاهده می­شود؛ شدت فلوئورسانس  THT پانزده روز پس از انکوباسیون HEWL در دمای 60 درجه سانتی­گراد افزایش می­یابد. این افزایش بیانگر شکل­گیری فیبریل­های آمیلوئید در نمونه انکوبه شده است. در نمونه­های حاوی عصاره جَفت بلوط (در تمامی غلظت­های مورد آزمایش عصاره) افزایش در شدت فلوئورسانس  THT نسبت به پروتئین شاهد ناچیز است که بیانگر اثر مهاری عصاره گیاه بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL است. همانطور که مشاهده می­شود؛ با افزایش غلظت عصاره میزان افزایش فلورسانس کاهش می­یابد. این کاهش بیانگر کاهش در میزان شکل­گیری فیبرهای آمیلوئیدی است. اما اختلاف بین اثر مهاری غلظت­های مختلف عصاره بسیار کم است که این اختلاف اندک می­تواند بدلیل اشباح شدن جایگاه اتصال عوامل موثر عصاره بر روی پروتئین باشد.

در شکل 2- ب روند تجمع­زدایی فیبرهای لیزوزیم به تصویر کشیده شده است. شدت فلوئورسانس  THT نمونه فیبریل­های از پیش شکل گرفته لیزوزیم سه روز پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد از حدود a.u 160 در شکل 2- الف به کمتر از  a.u 60 در شکل 2- ب می­رسد. این تغییرات بیانگر تاثیر دمای پایین بر شروع روند برگشت­پذیری فیبریل­هاست. در حضور عصاره جَفت بلوط (در تمامی غلظت­های مورد آزمایش) کاهش بیشتری در شدت فلوئورسانس  THT نسبت به نمونه شاهد مشاهده می­شود که بیانگر تاثیر عصاره گیاه بر تسریع روند تجمع­زدایی فیبرهاست. در این خصوص نیز بیشترین میزان تاثیر عصاره بر برگشت­پذیری فیبرهای آمیلوئیدی در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبر دیده می­شود و با افزایش غلظت عصاره؛ تاثیر آن بر روند فیبریل­زدایی کاهش می­یابد.

فلوئورسانس ANS: نواحی هیدوفوب در معرض حلال فیبریل­های آمیلوئیدی جایگاه­های اتصال جهت پروب فلورسنت ANS هستند. زمانی که این ترکیب به ساختار صفحات بتای موجود در فیبرهای آمیلوئید متصل می­شود؛ شدت فلوئورسانس آن افزایش می­یابد (12). در شکل 3 با استفاده از تست فلوئورسانس  ANS؛ تاثیر عصاره جَفت بلوط بر هیدروفوبیسیته سطحی طی روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و تجمع­زدایی فیبرهای HEWL به تصویر کشیده شده است.

همانطور که در شکل 3- الف مشاهده می­شود؛ شدت فلوئورسانس  ANS پانزده روز پس از انکوباسیون HEWL در دمای 60 درجه سانتی­گراد افزایش می­یابد. این افزایش بیانگر افزایش هیدروفوبیسیته سطحی HEWL و شکل­گیری فیبریل­های آمیلوئید در نمونه انکوبه شده است. در نمونه­های حاوی عصاره جَفت بلوط (در تمامی غلظت­های مورد آزمایش عصاره) افزایش در شدت فلوئورسانس ANS نسبت به پروتئین شاهد ناچیز است که بیانگر اثر مهاری عصاره گیاه بر در معرض سطح قرارگیری سطوح هیدروفوب پروتئین و در نتیجه مهار شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL است. با افزایش غلظت عصاره؛ میزان هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین کاهش می­یابد. بطوریکه در نسبت 2:1 عصاره به پروتئین HEWL دارای کمترین هیدروفوبیسیته سطحی است. در اینجا نیز اختلاف بین اثر مهاری غلظت های مختلف عصاره بسیار کم است که این اختلاف اندک می­تواند بدلیل اشباح شدن جایگاه اتصال عوامل موثر عصاره بر روی پروتئین باشد.

در شکل 3- ب شدت فلوئورسانس ANS نمونه فیبریل های از پیش شکل گرفته HEWL سه روز پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد از حدود a.u 180 در شکل 3- الف به حدود a.u 70 در شکل 3- ب کاهش می­یابد. این تغییرات بیانگر تاثیر دمای پایین بر شروع روند برگشت­پذیری فیبریل­هاست. در حضور عصاره جَفت بلوط (در تمامی غلظت­های مورد آزمایش) کاهش بیشتری در شدت فلوئورسانس  ANS نسبت به نمونه شاهد مشاهده می­شود که بیانگر تاثیر عصاره گیاه بر کاهش بیشتر سطوح هیدروفوب در معرض سطح پروتئین و تسریع روند تجمع­زدایی فیبرهاست. در این خصوص نیز بیشترین میزان تاثیر عصاره در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبر دیده می­شود.

تصاویر میکروسکوپی (FE-SEM): فیبریل­های آمیلوئیدی بدون توجه به پروتئین منبع آن­ها دارای مورفولوژی ساختاری رشته­ مانند هستند (30). میکروسکوپ الکترونی روبشی (FE-SEM) یک وسیله بسیار عالی برای مشاهده مورفولوژی ساختاری پروتئین­ها است.

شکل 3- اندازه­گیری شدت فلوئورسانس  ANS در غیاب و حضور غلظت­های مختلف عصاره جَفت بلوط جهت ارزیابی تاثیر عصاره الف) بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL، 15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد ب) بر روند تجمع­زدایی فیبریل­های HEWL، سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد

در شکل 4 با استفاده از میکروسکوپ FE-SEM؛ تاثیر عصاره جَفت بلوط (در نسبت  1: 5/0 عصاره به پروتئین) بر مورفولوژی ساختاری پروتئین طی روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و تجمع­زدایی فیبرها به تصویر کشیده شده است.

پروتئین لیزوزیم در حالت نرمال فیزیولوژیکی دارای ساختار کروی است. همان­طور که در شکل 4- الف ملاحظه می­شود در غیاب عصاره جَفت بلوط، مورفولوژی ساختاری لیزوزیم (15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد) و همچنین مورفولوژی ساختاری فیبریل­های لیزوزیم (سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد) دارای ساختار رشته­ای و فیبریلی است. در حضور عصاره جَفت بلوط، پروتئین لیزوزیم در شرایط انکوباسیون در شرایط اسیدی و دمای 60 درجه سانتی­گراد-علیرغم تغییر شکل از حالت کروی- به سمت شکل­گیری ساختارهای فیبریلی و خطی سوق داده نمی­شود. این تصویر بیانگر تاثیر مهاری عصاره جَفت بلوط بر شکل­گیری فیبر­های آمیلوئید است (شکل 4- ب). همچنین در شکل 4- ج مشاهده می­شود که فیبریل­های از پیش تشکیل شده لیزوزیم در حضور عصاره جَفت بلوط از حالت رشته­ای خارج شده­اند که بیانگر تاثیر این عصاره بر تغییر شکل و تجمع­زدایی فیبرهای آمیلوئیدی است.

شکل 4- تصاویر میکروسکوپ FE-SEM در غیاب و حضور غلظت­های مختلف عصاره جَفت بلوط، اندازه­گیری در نوار مقیاسnm 500

الف) مورفولوژی ساختاری لیزوزیم (15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد) و فیبریل­های لیزوزیم (سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد) در غیاب عصاره جَفت بلوط (تصاویر میکروسکوپی هر دو نمونه یکسان است)، ب) مورفولوژی ساختاری HEWL در حضور عصاره جَفت بلوط (15 روز پس از انکوباسیون نمونه­های پروتئین در دمای 60 درجه سانتی­گراد)، ج) مورفولوژی ساختاری تجمعات آمیلوئیدی HEWL در حضور عصاره جَفت بلوط (سه روز پس از انکوباسیون فیبریل­ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد)

بحث و نتیجه­گیری

عصاره­های گیاهی به دلیل داشتن مقادیر بالایی از ترکیبات معدنی و فنولی و اثر احتمالی این ترکیبات بر پیشگیری و درمان بیماری های مختلف توسط محققان مختلف مورد بررسی قرار گرفته­اند (4 و 5). ترکیب شیمیایی میوه و جَفت بلوط شامل مقدار زیادی کربوهیدرات، مقدار متوسطی پروتئین و چربی، و مقدار قابل توجهی از مواد معدنی است (1) همچنین همانطور که در جدول 1 نشان داده شد جَفت بلوط حاوی مقادیر بالایی از ترکیبات حلقوی فنولی و فلاونوئیدی است. ترکیبات مولکولی حاوی حلقه­های آروماتیک می­توانند با آمینواسیدهای آروماتیک موجود در پروتئین­ها برهمکنش نموده و مانع برقراری برهمکنش­های هیدروفوب و استکینگ زنجیره­های جانبی اسیدهای آمینه در پروتئین­های مختلف شوند. در نتیجه فرآیند شکل­گیری فیبریل­های آمیلوئیدی و همچنین استحکام ساختاری فیبریل­ها مختل می­گردد (10). مکانسیم اثر این ترکیبات بر روند شکل­گیری فیبرهای آمیلوئیدی متفاوت از مکانیسم اثر آن­ها بر از بین بردن تجمعات از پیش شکل گرفته شده است (9 و 10). از آنجایی که عصاره جَفت بلوط حاوی مقادیر بالایی از این ترکیبات حلقوی است؛ این عصاره بمنظور بررسی اثرات احتمالی بر شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی و فیبریل­زدایی آمیلوئید مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که از نتیجه آزمایشات مشاهده گردید؛ عصاره جَفت بلوط در تمامی نسبت­های مورد آزمایش دارای اثر مهاری وابسته به دوز بر شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین است. همچنین این عصاره موجب تسریع­ فرآیند تجمع­زدایی فیبرها می­شود. بیشترین اثر عصاره بر روند تجمع­زدایی فیبرها در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبریل مشاهده می­شود.

مطالعات بسیاری برای بررسی اثر عصاره­ها و ترکیبات گیاهی بر فرآیندهای شکل­گیری و حذف فیبریل­های آمیلوئیدی انجام شده است. بعنوان مثال رامشینی و همکاران (2) مشاهده کردند که عصاره برگ گیاه مرزه (Satureia hortensis L.) موجب مهار شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL و تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی می­شود. عصاره جَفت بلوط همانند عصاره برگ گیاه مرزه از شکل­گیری فیبرهای آمیلوئید جلوگیری می­نماید. روند مهاری عصاره جَفت بلوط منجر به کاهش طول فیبریل­ها و سوق­دهی آن­ها به سمت تجمعات بی­شکل می­شود. درحالی­که در حضور عصاره برگ گیاه مرزه بجای شکل­گیری فیبریل­های بالغ اولیگومرهای کوچک غیرسمّی تشکیل می­شوند. این تفاوت بدلیل تاثیر عصاره این دو گیاه بر مراحل مختلف شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین است. عصاره برگ گیاه مرزه بر کلیه مراحل شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی اثر مهاری دارد در حالی­که عصاره جَفت بلوط بر بازشدن پروتئین در مراحل اولیه شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی تاثیری ندارد. رامشینی و همکاران (2) اثر عصاره برگ گیاه مرزه بر مهار شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL را مربوط به حضور مقادیر بالایی از پلی فنول­ها و ترکیبات حلقوی بر می­شمارند.

در مطالعه دیگر اثر عصاره برگ چای سبز بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که عصاره این گیاه بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین دارای اثر مهاری است (3). اثر مهاری عصاره برگ چای سبز بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین لیزوزیم نیز همانند عصاره جَفت بلوط وابسته به دوز است. عصاره برگ چای سبز نسبت به عصاره جَفت بلوط دارای اثر مهاری قوی­تر بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL است بطوریکه در نسبت 1: 5/0 (عصاره برگ چای سبز به HEWL)، این عصاره موجب مهار کامل فرآیند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی می­شود. رامشینی و همکاران (3) اثر مهاری عصاره برگ چای سبز را مربوط به حضور مقادیر بالایی از پلی فنول­ها و ترکیبات حلقوی و ایجاد پیوندهای استکینگ این ترکیبات با اسیدهای آمینه حلقوی موجود در ساختار HEWL می­دانند.

اثر مهاری سیلیمارین (عصاره حاصل از دانه گیاه خار مریم (Silybum Marianum)) بر فرایند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی HEWL بررسی و مشاهده شد که سیلیمارین باعث مهار تشکیل تجمعات آمیلوئیدی می شود (6). سیلیمارین نیز همانند عصاره جَفت بلوط دارای اثر مهاری وابسته به غلظت بر روند شکل­گیری تجمعات آمیلوییدی پروتئین لیزوزیم است اما دارای اثر مهاری کم­تری از اثر عصاره جَفت بلوط است. سیلیمارین همانند عصاره جَفت بلوط موجب شکل­گیری تجمعات بی­شکل می­شود. مهدوی مهر و همکاران (6) اثر مهاری سیلیمارین را وابسته به وجود ترکیبات فلاونولیگنانی و فلاونوئیدی می­دانند که با ایجاد برهمکنش­های آروماتیک و آبگریز با زنجیره­های جانبی پروتئین مانع در معرض سطح قرارگرفتن سطوح هیدروفوب پروتئین و برقراری برهمکنش­های بین زنجیره­های جانبی آن­ها و تشکیل تجمعات آمیلوئیدی می­شوند.

از مقایسه نتایج حاصل از این آزمایش با نتایج حاصل از مطالعات ذکر شده می­توان نتیجه گرفت که حضور مقادیر بالای فنول و فلاونوئید در عصاره جَفت بلوط منجر به مهار فیبریل­زایی و تسریع­ فیبریل­زدایی پروتئین می­شود. نکته قابل تامل در این آزمایش در خصوص بیشترین اثر عصاره بر روند تجمع­زدایی آمیلوییدی است که در نسبت 1: 5/0 عصاره به فیبریل مشاهده می­شود و با افزایش غلظت عصاره میزان تاثیرگذاری کاهش می­یابد. با افزایش غلظت عصاره، میزان حلالیت آن در محلولِ حاوی پروتئین در دمای 37 درجه کاهش یافت. احتمالاً این کاهش حلالیت منجر به کاهش میزان ترکیبات موثره عصاره (ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی) و در نتیجه کاهش تاثیرگذاری آن بر تسریع روند تجمع­زدایی فیبرها باشد.

از داده­های حاصل از این آزمایش­ها می­توان نتیجه گرفت که عصاره جَفت بلوط حاوی ترکیباتی است که قادر به جلوگیری از شکل­گیری فیبرهای آمیلوئید و همچنین حذف فیبرهای ازپیش تشکیل­شده لیزوزیم است. بررسی­های بیشتری برای یافتن این ترکیبات موثر جهت ساخت داروهای مورد نیاز در درمان بیماری­های وابسته به آمیلوئید نیاز است.