نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسنده

عضو هیات علمی گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور

چکیده

پنیرک از قدیمی‌ترین گیاهان دارویی می‌باشد که در طب کاربرد فراوان دارد. استخراج DNAبه روش CTAB برای 19 ژنوتیپ پنیرک از مناطق جغرافیایی مختلف ایران انجام گرفت و با استفاده از 15 نشانگر مولکولی SCoT تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. نشانگر SCoT در بین ژنوتیپ‌‌ها چندشکلی مطلوبی نشان داد و اکثر آغازگرها برای بررسی‌های این گونه مناسب بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 باند تولید کنند، که 76 باند چند شکل مشاهده شد. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 بود که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15 کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. نتایج نشان داد که بیشترین تشابه را ژنوتیپ‌های 18G و 19G و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G با ژنوتیپ 3G داشتند. گروه‌بندی حاصل از تجزیه خوشه‌ای نشان داد که ژنوتیپ‌ها در سه گروه قرار گرفته و تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. نتایج حاصل از گروه‌بندی تجزیه خوشه-ای با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) تایید گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Genetic variation among Iranian genotypes of Malva (Malva neglecta) using Start codon targeted (SCoT)

نویسنده [English]

  • MEHDI NOORIAN

Department of Biology, Payame Noor University, Iran

چکیده [English]

Malva is one of the well-known medicinal and aromatic plants. The juice is one of the oldest herbs that is widely used in medicine. DNA extraction was carried out using CTAB method for 19 genotypes of different regions of Iran. Using SCoT molecular markers, genetic diversity was investigated. The SCoT marker showed favorable polymorphism among genotypes and most primers were suitable for this species. SCoT primers were able to produce 83 strips in total, with 76 multidimensional bands. The average number of bars produced by each primer for 19 genotypes was 4.36, with SC36, SC11 and SC5 primers having the highest number of bands (8), and the SC26 and SC15 primers showed the least number of bands (3). The results showed that the most similarities were genotypes G18 and G19 and the least similarity was genotypes G15 with G3 genotype. The cluster analysis showed that the genotypes were classified into three groups and genetic variation was not consistent with geographical variation. The results of cluster analysis were grouped using molecular variance analysis (AMOVA).

کلیدواژه‌ها [English]

  • medicinal plants
  • Cluster analysis
  • coordinate analysis
  • Genetic variation
  • molecular marker

بررسی تنوع ژنتیکی در بین ژنوتیپهای ایرانی گیاه پنیرک (Malva neglecta) با استفاده از کدونهای آغاز هدف واقع شده (SCoT)

عبدالمهدی نوریان*

ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 5/12/96        تاریخ پذیرش: 25/2/97

چکیده

پنیرک از قدیمی­ترین گیاهان دارویی می­باشد که در طب کاربرد فراوان دارد. استخراج  DNAبه روش CTAB   برای 19 ژنوتیپ پنیرک از مناطق جغرافیایی مختلف ایران انجام گرفت و با استفاده از 15 نشانگر مولکولی SCoT تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. نشانگر SCoT در بین ژنوتیپها چندشکلی مطلوبی نشان داد و اکثر آغازگرها برای بررسیهای این گونه مناسب بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 باند تولید کنند، که 76 باند چند شکل مشاهده شد. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 بود که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15  کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. نتایج نشان داد که بیشترین تشابه را ژنوتیپهای 18G و 19G و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G با ژنوتیپ 3G داشتند. گروه­بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای نشان داد که ژنوتیپها در سه گروه قرار گرفته و تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. نتایج حاصل از گروه­بندی تجزیه خوشه­ای با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) تأیید گردید.

واژه های کلیدی: گیاه دارویی، تجزیه خوشه­ای، تجزیه به مختصات اصلی، تنوع ژنتیکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09184630902، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

طی سالیان متمادی داروهای طبیعی خصوصاً گیاهان دارویی، در برخی موارد تنها راه درمان محسوب می­شد و در عین حال مواد اولیه در آنها در صنعت دارو­سازی مورد استفاده قرار می­گرفت. توجه به گیاهان دارویی که بخش عمده­ای از طب سنتی ایران را تشکیل می­دهد و ارائه اطلاعات درست و علمی درباره پرورش، نگهداری و استفاده از آنها بر پایه یافته­های جدید روز به روز اهمیت ویژه­ای می­یابد (21). پنیرک (Malva) گیاهی علفی یک ساله، دوساله یا پایا با خواص شناخته شده دارویی است. گونـه­هـای مختلـف پنیـرک هماننـد M. neglecta در کشـــورهای مختلف دنیا کشت می­گردد یا به طور خودرو رشد می­کند (4). خـواص آنتـی اکسیدانی گونه­های مختلف پنیرک در نقاط دیگر دنیا توسـط برخـی محققین گزارش شده است (19). نتایج مطالعات انجام شده بر روی خواص ضد میکروبی پنیرک حاکی از آن است که این گیاه دارای فعالیت ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی علیه بسیاری از پاتوژنهای انسان است (22). تنوع گونه­های گیاهی در یک محیط موجب پایداری و افزایش قابلیت تولید آن اکوسیستم می­گردد، اما تنوع داخل گونه­ها می‍تواند نقش مهمی را در میزان تولید یک اکوسیستم ایفاء کند (15). آگاهی از سطح تنوع ژنتیکی و برآورد دقیق آن در ژرم­پلاسمهای گیاهی و تعیین روابط ژنتیکی بین مواد اصلاحی، پایه و اساس بسیاری از برنامه­های اصلاحی است. اهمیت تنوع ژنتیکی در گیاهان از دو دیدگاه مورد توجه­است: نخست تنوع ژنتیکی شرط لازم برای رسیدن به محصول بیشتر و پایداری عملکرد است. از سوی دیگر تنوع ژنتیکی، منابع ژنتیکی مفید برای برنامه­های اصلاحی را شناسایی کرده و باعث حفظ آنها می­شود (7). انواع مختلفی از نشانگرها در عرصه علوم ژنتیک، رده­بندی و به­نژادی به کار رفته­اند که اصولاً کاربرد آنها تفاوت چندانی با یکدیگر ندارد ولی هر کدام از این نشانگرها دارای مزایا و معایب خاص خود می­باشند، مطالعات در سطح جمعیتها نشان می­دهد که نشانگر DNA کارآیی بالایی در تشخیص تنوع دارد (23). نشانگر­های مولکولی ابزار­های بسیار مفید و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه­های مختلف می­باشد. نشانگر­های مولکولی وابسته به DNA تحت تأثیر شرایط محیط قرار نمی­گیرند و تعداد زیادی از این نشانگر­ها را می­توان به راحتی در کل ژنوم جستجو نمود (13). نشانگر مولکولی SCoT یا در ترجمه فارسی، کدونهای آغاز هدف واقع شده، روشی است که در آن پرایمرها بر اساس توالیهای آغاز (ATG) طراحی شده و نواحی بین کدونهای آغاز طی واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر، و تفاوتها آشکار می­شود. پرایمرهای SCoT معمولاً 24-18 نوکلئوتیدی هستند و محتوای C و G آنها 50 تا 72 درصد است (12). مبنای عملکرد این نشانگر غالبیت است. دو پرایمر تک رشته­ای در واکنش زنجیره­ای پلیمراز به رشته­های مخالف DNA الگو، در جهت عکس هم متصل می­شوند. چنانچه جهشهای حذف یا اضافه در محل اتصال پرایمر رخ دهد، عدم اتصال پرایمر و عدم سنتز قطعهDNA  به وجود خواهد آمد (6). طول پرایمرها در تکرارپذیری این نشانگر اثر مستقیم دارد. هو و وییک (11) با مقایسه پرایمرهای 12 و 18 نوکلئوتیدی و بررسی قابلیت تکرارپذیری آنها به این نتیجه رسیدند که پرایمرهای 18 نوکلئوتیدی قابلیت تکرارپذیری بالایی دارند. از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (Jatropha curcas) و کاکوتی (Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع بیشتری را نشان داده است (16 و 24). از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان می­دهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونه­های با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات می­تواند مفید باشد، در نهایت می­توان از این اطلاعات نیز جهت حفاظت در محل رویشگاه نمونه­ها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم استفاده نمود.

مواد و روشها

در تحقیق انجام شده بذرهای 19 ژنوتیپ از گیاه دارویی پنیرک به‎منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT از بانک ژن مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد ژنوتیپ و محل دریافت یا جمع­آوری در جدول 1 نشان داده شده است.

استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (9) برای هر ژنوتیپ انجام گرفت. برای بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از ژل آگارز ۸/۰ درصد و روش اسپکتروفوتومتری استفاده شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز طبق اطلاعات جدول ۲ انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد، به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه، زمان و دمای واسرشت­سازی به ترتیب ۳۰  ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود.

 

 

جدول 1- مشخصات ژنوتیپهای مورد استفاده در این تحقیق

کد بانک ژن

شهرستان

استان

ژنوتیپ

کد بانک ژن

شهرستان

استان

ژنوتیپ

22521

بندر عباس

هرمزگان

G11

10534

یزد

یزد

G1

22900

قشم

هرمزگان

G12

12926

گنبد

گستان

G2

22903

میناب

هرمزگان

G13

14342

نهاوند

همدان

G3

26408

کرمان

کرمان

G14

15504

شاهدیه

یزد

G4

30789

دامغان

سمنان

G15

15843

تفت

یزد

G5

33487

طبس

یزد

G16

15922

صدوق

یزد

G6

34327

دهلران

ایلام

G17

20011

هریس

آذربایجان شرقی

G7

34338

دهلران

ایلام

G18

21113

صدوق

یزد

G8

34808

بندر عباس

هرمزگان

G19

21122

بافق

یزد

G9

 

 

 

 

21601

سمنان

سمنان

G10

 

 

جدول ۲- اجزای مخلوط واکنش SCoTبهینه سازی شده

اجزا یک نمونه

جهت تهیه ۲۰میکرولیتر

آب دوبار تقطیر

3/۱۲ میکرولیتر

بافر PCR (10x)

۲ میکرولیتر

MgCl2 (50 میلی­مولار )

۵/۱ میکرولیتر

مخلوط نوکلئوتیدی (10 میلی­مولار)

۴/۰ میکرولیتر

آغازگر (10 میکرو­مولار)

5/۱ میکرولیترهر یک

Taq پلیمراز (5 واحد در میکرولیتر)

۳/۰ میکرولیتر

DNA (ng 10)

۲ میکرولیتر

جمع

۲۰ میکرولیتر

همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور بارگذاری نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به DNA­های تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگذاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت. پس از حرکت ژل، جهت رنگ­آمیزی آن را در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت مشاهده نوارهای DNA استفاده گردید. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) از طریق فرمول محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه ژنوتیپها است (10). در پایان نیز با استفاده از نرم افزارهای Ntsys، DARwin 6 و GenAlEx 6.2 ماتریس تشابه، تجزیه خوشه­ای، تجزیه به مختصات اصلی و تجزیه واریانس مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای پنیرک مورد مطالعه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت. شکل 1 الگوی باندی ژنوتیپها با استفاده از آغازگر SC28 را برای 19 ژنوتیپ نشان می­دهد. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 83 مکان را تکثیر کنند که از این تعداد 7 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند، که آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 بیشترین تعداد باند (8) و آغازگرهای SC26 و SC15 کمترین تعداد باند (3) را نشان دادند. میانگین درصد چند شکلی برابر 78/92 درصد بود که کمترین میزان درصد چند شکلی را آغازگرهای SC40 (67/66 درصد) و SC36، SC11 و SC13 (75 درصد) داشتند و درصد چند شکلی برای سایر آغازگرها 100 درصد می­باشد. همچنین متوسط تعداد باندهای تولید شده توسط هر آغازگر برای 19 ژنوتیپ برابر 36/4 به دست آمد. بیشترین میزان محتوای اطلاعات چند­شکلی (PIC) مربوط به آغازگرهای SC11، SC40 و SC44 بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگرها توانستند فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کنند. آغازگر SC26  و SC15 با کمترین میزان محتوای اطلاعات چند­شکلی (PIC) توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشتند نتایج به دست آمده برای آغازگرهای استفاده شده در جدول 3 نشان داده شده است.

 

  1    2    3     4     5     6    7    8     9    10   11  12   13   14   15  16   17   18   19   L

شکل 1-  الگوی باندی 19 ژنوتیپ پنیرک با استفاده از آغازگر SC28 و ژل آگارز 2 درصد با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید

جدول 3- درصد چند شکلی، تعداد کل باند و محتوای اطلاعات چند شکلی در آغازگرهای مورد استفاده

کد آغازگر

توالی آغازگر

دما

درصدG  و C

تعداد مکان­های تکثیر شده

تعداد مکا­ن­های چند شکل

درصد چند شکلی

PIC

منبع

SC36

5'-GCAACAATGGCTACCAC-3'

52

94/52%

8

6

75

31/0

Collard and Mackill (2009) (5)

SC35

5'-CATGGCTACCACCGGCC-3'

58

58/70%

5

5

100

42/0

SC40

5'-CAATGGCTACCACTACAG-3'

54

50%

6

4

67/66

45/0

SC59

5'-ACAATGGCTACCACCATC-3'

54

50%

7

7

100

36/0

SC44

5'-CAATGGCTACCATTAGCC-3'

54

50%

4

4

100

48/0

SC63

5'-ACCATGGCTACCACGGG-3'

56

70/64%

6

6

100

34/0

SC28

5'-CCATGGCTACCACCGCC-3'

58

58/70%

6

6

100

39/0

SC26

5'-CACCATGGCTACCACCAT-3'

56

70/64%

3

3

100

27/0

SC20

5'-ACCATGGCTACCACCGC-3'

54

70/64%

5

5

100

35/0

SC15

5'-CCATGGCTACCACCGGC-3'

58

58/70%

3

3

100

22/0

SC11

5'-AAGCAATGGCTACCACCA-3'

54

50%

8

6

75/0

47/0

SC5

5'-AAGCAATGGCTACCACCA-3'

54

50%

8

8

100

33/0

SC13

5'-ACGACATGGCGACCATC-3'

58

58/70%

4

3

75/0

36/0

SC21

5'-AACCATGGCTACCACCG-3'

54

70/64%

5

5

100

30/0

SC10

5'-CAACAATGGCTACCAGC-3'

52

94/52%

5

5

100

33/0

میانگین

 

 

 

53/5

07/5

78/92

36/0

 


ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه جاکارد از 685/0 تا 97/0 متغیر بود، میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 820/0 بود. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای 18G و 19G از گروه 3 و کمترین تشابه را ژنوتیپ 15G از گروه 2 و ژنوتیپ 3G از گروه 3 داشتند (جدول 5).

 

گروه اول

گروه دوم

گروه سوم

شکل 2- دندروگرام حاصل از داده­های نشانگر SCoT برای ژنوتیپهای مورد مطالعه


تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروه­بندی تجزیه خوشه­ای انجام شد (جدول 4)، که ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار وجود داشت به عبارت دیگر گروه­بندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در میان گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها می­باشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 82 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 18 درصد مشاهده گردید.

 

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروه­بندی ژنوتیپها با استفاده از نشانگر SCoT

منابع تغییرات

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

واریانس برآورد شده

درصد از واریانس

PhiPT

بین گروه

2

521/22

261/11

104/1

18%

*185/0

درون گروه

16

900/17

869/4

869/4

82%

 

کل

18

421/100

 

973/5

100%

 

*  اختلاف در سطح 5% معنی­دار


تجزیه خوشه­ای: نمودار خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد در شکل 2 آمده است. که بر اساس آن ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای 3G، 5G، 8G و 17G بود. میانگین تشابه ژنوتیپهای این گروه برابر 801/0 می­باشد که در بین ژنوتیپهای این گروه، ژنوتیپهای 8G و 17G دارای بیشترین تشابه بودند. در گروه دوم ژنوتیپهای 1G، 4G، 10G، 11G و 14G قرار گرفتند. میانگین تشابه این گروه 865/0، که ژنوتیپهای11G و 14G بیشترین تشابه را با یکدیگر داشتند. گروه سوم شامل ژنوتیپهای 5G، 2G، 7G، 9G، 12G، 13G، 15G، 16G، 18G و 19G است. میانگین تشابه در این گروه 875/0 بود که ژنوتیپهای 19G و 18G دارای بیشترین تشابه می­باشند.

 

 

جدول 5- ماتریس تشابه ژنوتیپها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب جاکارد

ژنوتیپ

G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

G13

G14

G15

G16

G17

G18

G19

G1

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G2

872/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G3

851/0

846/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G4

863/0

916/0

857/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G5

816/0

851/0

826/0

857/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G6

785/0

885/0

754/0

851/0

779/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G7

792/0

931/0

840/0

851/0

807/0

843/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G8

863/0

833/0

761/0

818/0

857/0

851/0

808/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G9

836/0

900/0

769/0

851/0

736/0

857/0

806/0

808/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G10

888/0

897/0

744/0

844/0

739/0

823/0

846/0

800/0

880/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

G11

867/0

862/0

760/0

888/0

807/0

857/0

838/0

844/0

806/0

880/0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

G12

807/0

877/0

816/0

833/0

745/0

827/0

909/0

833/0

842/0

857/0

800/0

1

 

 

 

 

 

 

 

G13

763/0

866/0

769/0

826/0

807/0

906/0

870/0

782/0

838/0

857/0

870/0

842/0

1

 

 

 

 

 

 

G14

869/0

920/0

772/0

869/0

816/0

851/0

909/0

826/0

830/0

901/0

943/0

880/0

846/0

1

 

 

 

 

 

G15

705/0

821/0

685/0

714/0

800/0

807/0

851/0

761/0

821/0

790/0

778/0

754/0

857/0

818/0

1

 

 

 

 

G16

821/0

950/0

792/0

875/0

813/0

909/0

906/0

875/0

857/0

846/0

875/0

862/0

875/0

909/0

877/0

1

 

 

 

G17

823/0

821/0

750/0

809/0

777/0

852/0

745/0

904/0

881/0

739/0

779/0

716/0

779/0

734/0

769/0

852/0

1

 

 

G18

857/0

943/0

808/0

857/0

784/0

928/0

912/0

857/0

945/0

867/0

872/0

943/0

888/0

892/0

851/0

947/0

862/0

1

 

G19

857/0

943/0

808/0

857/0

807/0

912/0

931/0

857/0

928/0

851/0

892/0

943/0

872/0

912/0

851/0

931/0

846/0

970/0

1

 

 

شکل 3- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر SCoT بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم


تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس داده­های حاصل از آغازگر­های مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 23/21 و 15/17 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 38/38 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 3)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای مطابقت نداشت.

بحث و نتیجه­گیری

با استفاده از آغازگر­های SCoT همان طور که مشاهده گردید تنوع قابل ملاحظه­ای در بین ژنوتیپهای پنیرک وجود داشت و چند شکلی مطلوبی بر اساس نشانگر  SCoT در بین ژنوتیپها مشاهده شد. در بررسی Shabanian و همکاران (20) که بر روی جمعیتهای بلوط ایرانی با استفاده از 10 آغازگر SCoT انجام گردید گزارش شد که این آغازگرها تنوع ژنتیکی بالایی را آشکار کردند. از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (Jatropha curcas) و کاکوتی (Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع بیشتری را نشان داده است (16 و 24). در مطالعه­ای که توسط Hasani و همکاران (8) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی در گیاه دارویی رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی انجام شد، نتایج به دست آمده نشان دادند که نشانگرهای مولکولی دارای توانایی بالایی در بررسی تنوع ژنتیکی می­باشند. محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) در نشانگرهای غالب از صفر تا نیم متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر فراوانی بیشتر چند شکلی برای آن جایگاه در ژنوتیپهای تحت بررسی می­باشد با توجه به نتایج به دست آمده پیشنهاد می­گردد از آغازگرهای SC36، SC11 و SC5 که شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) درصد چندشکلی بالایی را نشان دادند، برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای پنیرک در تحقیقات بعدی استفاده گردد. نتایج حاصل از این بررسی با مطالعات دیگری که با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT بر روی انبه (Mangifera indica) و رمی (Boehmeria nivea) انجام گردیده شباهت داشت (14 و 18).  میانگین تشابه بین ژنوتیپها برابر 820/0 بود که نشان­دهنده وجود تنوع پایین در بین ژنوتیپهای پنیرک بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. این موضوع می­تواند به سبب طول بلند آغازگرهای SCoT و تکثیر انتخابی­تر این نشانگر باشد. با توجه به نتایج، هیبریداسیون بین ژنوتیپها با فاصله ژنتیکی زیاد می­تواند یک روش مناسب برای برنامه­های اصلاحی در پنیرک باشد. از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان می­دهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونه­های با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات می­تواند بسیار مؤثر باشد. با توجه به تنوع ژنتیکی پایین درون ژنوتیپهای پنیرک کشور، حفاظت در محل رویشگاه نمونه­ها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روشهای تکثیر مناسب این گیاه توصیه می­شود. همچنین پیشنهاد می­گردد از ژنوتیپهایی مانند  15G و 3G که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مورد استفاده داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامه­های اصلاحی استفاده شود. فرشادفر و همکاران (3) در مطالعه تنوع ژنتیکی توده­هایی از رازیانه با استفاده از نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی SCoT بر اساس نتایج حاصل از ماتریس تشابه نشانگر مولکولی گزارش کردند که تنوع قابل قبول در بین توده­های رازیانه بر اساس آغازگر­های مورد استفاده وجود دارد و پیشنهاد کردند از توده­هایی که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مورد استفاده را داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامه­های اصلاحی استفاده شود. بر اساس تجزیه خوشه­ای ژنوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند از روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای گروه­بندی توده­ها استفاده گردید چون این ضریب نسبت به ضریبهای تطابق ساده و دایس ضریب کوفنتیک (86 درصد) بالاتری داشت. نتایج حاصل از تجزیه به مختصات اصلی با نتایج تجزیه خوشه­ای مطابقت نداشت و تنها 38/38 درصد از واریانس با دو محور بیان گردید، این موضوع به نوبه خود مـی­تــواند نشان دهنـده پراکــنش گستــرده آغــازگــرهای مختـلف بـــر روی ســطح ژنــوم و همه کروموزومهای پنیرک باشد. همچنین نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطبیق ندارد که ممکن است علت این موضوع جدایی منشاء جغرافیایی ژنوتیپها یا ایجاد و تجمع جهشهای ژنتیکی مجزا در سطح ژنوم باشد که باعث ایجاد تنوع در آنها  نسبت به یکدیگر شده است. در حالی که در تعداد دیگری از ژنوتیپها چنین تطابقی دیده نشده که این امر می­تواند به دلیل منشاء مشترک، مهاجرت و انتقال باشد. نیککردار و همکارن (17) در بررسی تنوع ژنتیکی توده­های ایرانی رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT از روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای گروه­بندی توده­ها استفاده کردند و گزارش نمودند که این ضریب نسبت به ضریبهای تطابق ساده و دایس ضریب کوفنتیک (91 درصد) بالاتری دارد. اسماعیلی و همکاران (1) با استفاده از نشانگرهای مولکولی نیمه تصادفی اقدام به گروه بندی گندم دیم نمودند که در تجزیه خوشه‌ای ضرایب تشابه جاکارد و روش اتصال کامل و قطع دندروگرام ارقام و لاینهای گندم را در 7 گروه قرار دادند، همچنین تجزیه هماهنگ اصلی نیز توانست ژنوتیپهای گندم مورد مطالعه را به خوبی بر اساس فاصله فضائی گروه‌بندی کند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی گروه­بندی تجزیه خوشه­ای را تأیید نمود به نحوی که بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار وجود داشت به عبارت دیگر گروه­بندی به صورت صحیح انجام گرفته است. از کاربردهای تجزیه واریانس مولکولی می­توان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشه­ای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک جمعیت و ژنوتیپها درون آن به عنوان افراد جمعیت در نظر گرفته می­شود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام گیرد. نقطه­ای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. زمانی و همکارن (2) در ارزیابی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای گیاه خارمریم با استفاده از نشانگر‌ مولکولی SCoT گزارش کردند که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیتها (89 درصد) تعلق داشت، درحالی که تنها 11 درصد تنوع در بین جمعیتها مشاهده شد. در نهایت نتایج نشان‌دهنده تنوع زیاد در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از نشانگر SCoT بود.

1- اسماعیلی، ا.، نظریان فیروزآبادی، ف.، سمیعی، ک.، دریکوند، ر.، 1396. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گندم دیم با استفاده ازآغازگرهای نیمه تصادفی اینترونی-اگزونی. مجله پژوهش های سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران).30 (2): 117-126.
2- زمانی، ن.،  میرزایی، خ.،  زمانی، خ.، 1396. ارزیابی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای گیاه خارمریم با استفاده از نشانگر‌ مولکولی. مجله پژوهش های سلولی مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). انتشار آنلاین از تاریخ 23 خرداد 1396.
3- فرشادفر، م.، مرادزاده، ن.، فرشادفر، ع.، شیروانی، ه.، 1396. بررسی تنوع ژنتیکی اکسشن‏هایی از رازیانه (Foeniculum vulgare Mill) براساس صفات ریخت‌شناختی و نشانگر مولکولی SCoT. تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران. 25(2): 212-231.
 
4- Azimova, S.S., Glushenkova A.I. (Eds.), (2012). Lipids, Lipophilic Components and Essential Oils from Plant Sources. Springer, Tashkent, Republic of Uzbekistan, 609-633.  
5- Collard, B.C.Y., Mackill, D.J. (2009). Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants. Plant Molecular Biology Reporter, 27:86–93.
6- Davis,TM., Haigis, YUH., Mc Gowan, PJ. (1995). Template mixing: a method of enhancingdetection and interpretation of codominant RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics 91: 582-8.
7- Gepts, P., Papa, R. (2003). possible effects of (Trans) gene flow from crops on the genetic diversity from landraces and wild relatives. Environmental Biosafety Research 2: 89-103.
8- Hasani, M.H., Torabi S., Omidi, M., Etminan, A.R., Dastmalchi T. (2011). The study of genetic variation Foeniculum vulgar Mill. Using AFLP molecular marker. Iranian Journal of Field Crop Science, 42(3):597-604 (In Persian).
9- Hosseinzadeh Colagar, A., Saadati, M., Zarea, M., Ahmadi Talei S.. (2010). "Genetic variation of the iranian Sclerotinia sclerotiorum isolates by standardizing DNA polymorphic fragments". Biotechnology (-Pakistan). 9(1): 67-72.
10- Hou, Y., Yan, Z., Wei, Y. (2005). Genetic diversity in barely from west China based on RAPD and ISSR analysis Barely. Genetics Newsletter 35:9-22.
11- Hu, J., Vick, BA. 2003. Target region amplification polymorphism: a novel marker technique forplant genotyping. Plant Molecular Biology Reporter 21: 289-94.
12- Kalendar, R. (2007). FastPCR: a PCR primer design and repeat sequence searching software with additional tools for the manipulation and analysis of DNA and protein. Available at www.biocenter.helsinki.fi/programs/fastpcr.htm; 2007
13- Kochaki. A., Nasiri, M., Najafi, F. (2004). The agro biodiversity of medical and aromatic plants in Iran. 2(2): 209-214.  
14- Luo, C., He, X. H., Chen, H., Hu, Y., Ou, S.-J. (2012). Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L.: revealed through SCoT analysis. Genetic Resources and Crop Evolution, 59:1505-1515.
15- Michaud, R,, Tremblay, GF., Belanger, G., Michaud, J. (1991). Agriculture and Agri-Food Canada, Soils and Crops Research and Development Center, 2560 Hochelaga blvd, Sainte-Foy, Quebec, Canada, G1V 213.
16- Mulpuri, S., Muddanuru, T., Francis, G. (2013). Start codon targeted (SCoT) polymorphism in toxic and non-toxic accessions of Jatropha curcas L. and development of a codominant SCAR marker. Plant Science, 207:117-127.   
17- Nikkerdar, F., Farshadfar, M., Ebrahimi, M A., and Shirvani H. (2018) Genetic Diversity among Fennel (Fueniculum Vulgare Mill.) Landrace using SCoT Markers. jcb. 9 (24) :95-102.
18- Pratik, S., Maya, K., Sourav, J., Sabyasachi, M., Amit, S.,  Karmakar, P.G., Ray, D.P. (2015). Start codon targeted (SCoT) polymorphism reveals genetic diversity in wild and domesticated populations of ramie (Boehmeria nivea L. Gaudich.), a premium textile fiber producing species. Meta Gene, 3:62-70.
19- Samavati, V., Manoochehrizade, A. (2013), Polysaccharide extraction from Malva sylvestris and its anti -oxidant activity.International Journal of Biological Macromolecules 60, 427–436. 
20- Shabanian, N., Alikhani, L. and Rahmani, M.S. (2015). Phenotypic and genotypic diversity in rant oak (Quercus brantii) populations of declining north-Zagros forests using biochemical characteristics and molecular SCoT marker. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 23(1): 23-29. (In Persian)
21- Shahoedi, A. (2005). Medicinal Plants Eastern Iran's Zagros. Farabi Publications. Pp117 (In Persian).
22- Shale, TL., Stirk, WA., van Staden, J. (2005). Variation in .antibacterial and anti .inflammatory activity of different growth forms of Malva parviflora and.evidence for synergism of the anti-inflammatory compounds. J Ethnopharmacol.:96(1-2):325-30 (Persian).
23- Zahid, N. Y., Abbasi, N. A., Hafiz, I. A., Ahmad, Z. (2009) Genetic diversity of indigenous fennel, (Foeniculum vulgare. Germplasm in Pakistan assessed By RAPD markers. Pakistan Journal of Botany 41(4): 1759-1767.
24- Zamani, N., Zamani, W., Mirzaei, K. (2016). Genetic diversity analysis of Ziziphor a tenuior L. using SCoT markers. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 24 (2): 176-189. (In Persian).