تولید اسید سیتریک از ضایعات کشاورزی با استفاده از Aspergillus niger به روش تخمیردر بستر جامد و بهینه سازی فرآیند تولید

فرنگیس آتش نور و معصومه انوری^*

ایران، رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد رشت، دانشکده علوم پایه، گروه میکروبیولوژی

تاریخ دریافت: 21/07/1398          تاریخ پذیرش: 17/10/1398

چکیده

اسید سیتریک یکی از اسید­های آلی پر­کاربرد است ­­که به صورت گسترده در صنایع غذایی و دارویی مورد استفاده قرار می­گیرد. این اسیدآلی معمولا توسط فرآیند تخمیر غوطه­ور یا تخمیر سطحی و از طریق آسپرژیلوس نایجر تولید می­شود. تحقیقات اخیر نشان دهنده موفقیت­آمیز بودن تولید اسید سیتریک از طریق روش تخمیر در بستر جامد می­باشد. در شرایط آزمایشگاهی چهار فاکتور مهم در تولید اسید سیتریک، در چهار سطح؛ شامل: نوع سوبسترا (کاه گندم، کاه برنج، سبوس برنج و پوست بادام زمینی)، (4،5،6،7 pH)، دمای تیمارسوبسترا (شامل 45،60،75،90 درجه سانتی گراد) و زمان تیمار سوبسترا (30،60،90،120 دقیقه) در تولید اسید سیتریک توسط قارچ آسپرژیلوس نایجر مورد بررسی قرار گرفت. طبق نتایج این پژوهش حداکثر تولید اسید سیتریک درpH برابر با 5، زمان تیمارسوبسترا 60 دقیقه، دمای تیمارسوبسترا 60 درجه سانتی گراد و با استفاده از کاه گندم به عنوان بهترین سوبسترا به دست آمد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که قارچ آسپرژیلوس نایجر یک میکروارگانیسم مناسب جهت تولید اسید سیتریک می باشد؛ همچنین کاه گندم با توجه قیمت ارزان آن بستر مناسبی جهت تولید اقتصادی اسید سیتریک محسوب می شود. تمام چهار فاکتور مورد مطالعه در این پژوهش اثر معنی داری در تولید اسید سیتریک داشتند ) 05/0P<).

واژه­های کلیدی: اسید سیتریک ، ضایعات کشاورزی، آسپرژیلوس نایجر، بهینه سازی، تخمیر در بستر جامد

* نویسنده مسئول، تلفن: 09112323482 ، پست الکترونیکی: anvari@iaurasht.ac.ir

مقدمه

اسید سیتریک یک ترکیب شیمیایی تجاری است که به عنوان یکی از پر مصرف ترین فرآورده­های تخمیری می­باشد. بر اساس آمار موجود سالانه بالغ بر 700 هزار تن اسید سیتریک از طریق فرآیند تخمیر در سطح جهان تولید می­شود (32). این اسید آلی به دلیل ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی و گروههای عاملی در ساختار خود به وسیله سازمان بهداشت و خواروبار جهانی برای استفاده درصنایع غذایی، دارویی و بهداشتی تأیید شده است (4) . امروزه از قارچ آسپرژیلوس نایجر جهت تولید تجاری و موفق اسید سیتریک استفاده می شود (23). از آنجایی که ویژگیهای ریخت شناسی قارچ در محیط تخمیر، در تولید اسید سیتریک اثر بسیار مهمی دارد؛ بنابراین شناسایی و انتخاب سویه مورد نظر از اهمیت بسیار بالایی برخوردار می­باشد (24). به طور کلی تکنیک تخمیر بر بازده اسید سیتریک تولید شده تأثیر گذار می­باشد. به عنوان مثال یک سویه ممکن است در تخمیر غوطه­ور عملکرد خوبی داشته باشد اما در فرآیند تخمیردر بسترجامد عملکرد ضعیفی داشته باشد. بنابراین سویه­های تولید شده باید به وسیله روشهای مختلف تخمیر و درسوبستراهای صنعتی مورد آزمایش قرار گیرند تا بهترین روش تخمیر برای تولید انتخاب شود (25). روش تخمیر سطحی امروزه اگر چه با وجود روش کشت غوطه ور اهمیت خود را ازدست داده است، اما هنوز هم در مقیاس کوچک و متوسط استفاده می­شود. این نوع تخمیر برای هوادهی و اختلاط نیاز به انرژی ندارد، اما نسبت به تغییر در واسطه­ها حساس است و احتمال ایجاد آلودگی در محیط را زیاد می­کند. روش تخمیر در بسترجامد برای فرآیندهایی به کار می­رود که در آنها میکرو ارگانیسم­ها از مواد نامحلول در آب و در شرایط بدون حضور آب آزاد استفاده می­کنند. این نوع تخمیر نیاز به آب و هزینه عملیاتی کمی دارد و از طرفی سازگاری بهتری با محیط زیست دارد. پس از طی چند دهه روش تخمیر در بستر جامد برای تولید اسید سیتریک به دلیل امکان استفاده از ضایعات فراوان و ارزان کشاورزی به عنوان سوبسترا رواج یافته است. با توجه به افزایش قیمت هیدروکربنها و عدم دسترسی آسان به این منابع طرحهایی بر پایه سوبستراهای هیدروکربنی جای خود را به طرحهایی بر پایه ضایعات کشاورزی داده است (10). یکی از مهمترین مباحث کلیدی در سطح اقتصاد جهانی و به ویژه ایران، موضوع ضایعات می­باشد و این امر به دلیل آن است که سطح تأثیر ضایعات در تولید ناخالص داخلی و درآمد ملّی بسیار نگران کننده است. در سالهای اخیر شاهد افزایش ضایعات کشاورزی بوده به طوری که 30 درصد محصولات کشاورزی در ایران به ضایعات تبدیل می­شود. کاهش ضایعات کشاورزی افزایش عرضه را در بر دارد و لذا از عوامل تولید اضافی صرفن نظر می گردد. با اعمال این سیاست در بهره برداری از منابع طبیعی نیز صرفه جویی شده و منابع غیر قابل تجدید که در معرض تخریب قرار می­گیرند، جهت استفاده نسلهای آینده استمرار می یابند؛ همچنین این امر دربردارنده توسعه پایدار کشور خواهد شد (3). در تولید اسید سیتریک می­توان با استفاده از ضایعات کشاورزی هم انرژی را مدیریت کرد و هم با توجه به قیمت نسبتاً ارزان ضایعات کشاورزی به مدیریت اقتصادی فرآیند و تولید پرداخت. وجود انواع ضایعات جامد در کشور که سوزانده و یا به عنوان غذای دام مصرف می­­شوند می­تواند به عنوان منبع ارزان جهت تولید انواع مواد بیولوژیکی با ارزش، مورد استفاده قرار گیرند. حجم تجارت جهانی اسید سیتریک و مشتقات آن بیش از 300 هزار تن در سال است و با وجود تحقیقات بسیار وسیع که در خارج از کشور بر روی تولید و استخراج اسید سیتریک انجام شده است، متأسفانه در ایران هنوز این ماده با ارزش جزء مواد وارداتی محسوب می­شود (3). تمام موارد بیان شده اهمیت اسید سیتریک را نشان می­دهد، از این رو یک طراحی معین و مناسب جهت انجام آزمایشهای بهینه­سازی فرآیند تخمیر، مهم و ضروری است. زمانیکه پارامترهای متعددی در سطوح مختلف در یک آزمایش دخیل باشند، آن گاه طراحی یک طرح تجربی مؤثر و کارا برای رسیدن به نتیجه بهینه بسیار حائز اهمیت می­باشد. در طراحی آزمایش به روش تاگوچی دو موضوع تعیین تعداد آزمایشهای موردنیاز و تعیین شرایط هرآزمایش، حائز اهمیت می باشد؛ برای این منظور از یک سری آرایه های خاص برای طراحی آزمایش استفاده شد. در مطالعاتی که به روش تاگوچی انجام شد از تجزیه واریانس(آنووا) جهت شناسایی پارامترهایی که بر پاسخ اثر می­گذارند استفاده­ شد. برای این منظور نمودارهای میانگین در مورد هر یک از پارامترها رسم شد­، و از روی نمودارها پارامترهایی که دارای بیشترین تأثیر بودند و مقادیر بهینه آنها، تعیین شد (13). این تحقیق با هدف تولید ماده ارزشمند اسید سیتریک از ضایعات کشاورزی توسط آسپرژیلوس نایجر و بهینه سازی فرآیند تولید به روش طراحی آزمایشی تاگوچی انجام شد.

مواد و روشها

میکروارگانیسم مورد استفاده: سویه تهیه شده از مرکز کلکسیون باکتریها و قارچهای سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، قارچ آسپرژیلوس نایجر PTCC5010 بود.

آماده سازی سوبستراهای مورد استفاده: در این پژوهش از ­چهار سوبسترای­ کاه ­گندم، کاه برنج، سبوس برنج و پوست سخت بادام زمینی استفاده شد. سوبستراهای مورد استفاده به قطعات ریز هم اندازه (5 میلی متر) تقسیم شدند و جهت اطمینان، از غربالهای با منافذ یکسان عبور داده شدند. مقدار 5 گرم از هرکدام از سوبستراها به ارلنهای 100 سی سی اضافه شدند. برای شکستن حصار لیگنین بافت چوبی سوبستراها، آزاد سازی سلولز و استفاده بهتر میکروارگانیسم، سوبسترا ها تحت تیمار اسیدی-  حرارتی قرار داده شدند (18، 19 و 27). جهت تیمار اسیدی، اسید سولفوریک01/0درصد به اندازه ای که تمام سطح سوبسترا را بپوشاند به بسترهای درون ارلن اضافه شد. در ادامه سوبسترا ها با توجه به زمان تیمار و دمای تیمار متناسب درج شده در جدول 1 درون حمام آب گرم قرار داده شدند. پس از تیماراسیدی- حرارتی، سوبسترا ها با آب فراوان شستشو داده شدند. پس از خشک شدن، سوبستراهای تیمار شده جهت بهره برداری و تلقیح محلول قارچ آماده شدند.

روش تهیه بافرمورد استفاده: برای تهیه بافر از 05/0گرم مونو پتاسیم فسفات (KH₂PO₄)، 02/0گرم نیترات آمونیوم (NH₄NO₃)، 02/0گرم منیزیم سولفات (Mg S0₄ .7H₂0)، 2/0 میلی لیتر متانول، 5گرم گلوکز و 8/9میلی لیتر آب مقطر استفاده شد (5، 11 و 17). 10 میلی لیتر از بافر تهیه شده به صورت قطره قطره در تمام سطح هریک از سوبستراهای تیمار شده پخش شد. تمامی نیازهای اولیه میکروارگانیسم مورد نظر جهت رشد توسط بافر تأمین شد. pH محلول بافرطبق جدول1 در چهار سطح (4,5,6,7) به وسیله محلول اسید سولفوریک 2 نرمال و محلول سود (سدیم هیدروکسید) تنظیم شد.

ترکیب و تهیه محیط پیش کشت: جهت آماده سازی محیط کشت از 5/2 گرم گلوکز، 005/0 گرم منیزیم سولفات 7آبه (Mg S0₄ .7H₂0)، 005/0 گرم دی پتاسیم فسفات (K₂HPO₄)، 5/0گرم پپتون واتر و 001/0 گرم کلسیم کلرید (CaCl₂) استفاده شد (5 و 17). به منظور تهیه مایع تلقیح قارچ، مواد در 100میلی لیتر آب مقطر حل شد و به مدت 5 دقیقه در اتوکلاو قرار داده شد. پس از خنک شدن محیط در شرایط کاملأ آسپتیک(عاری از آلودگی)، لوپ استریل به اسپور­های آسپرژیلوس نایجر آغشته و در حضور شعله با 10 میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط شده و یک سوسپانسون اسپور درست شد و سپس با روش لام نیوبار تعداد اسپورها به 10⁵اسپور بر میلی لیتر تنظیم شده و به محیط انتقال یافت. سپس در انکوباتور در دمای 35 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت گرم خانه‍گذاری شد (19، 21 و 23).

تهیه محیط کشت اصلی یا محیط تخمیر: 5گرم از هر یک از سوبستراهای تیمار شده درون ارلن 100 سی سی ریخته شد. طبق جدول 1 مقادیرpH درچهارسطح (4,5,6,7) به محلول بافر، درجه حرارت تیمار در چهار سطح (90، 75، 60، 45 درجه سانتی گراد) و زمان تیمار نیز در چهارسطح (120، 90، 60، 30 دقیقه) به سوبستراهای مورد استفاده (کاه گندم، کاه برنج، سبوس برنج و پوست بادام زمینی) اعمال شد. لازم به ذکر است که منبع کربن (گلوکز) و منبع ازت کمکی (نیترات آمونیوم) به صورت ثابت بوده است. برای رساندن بافر به pH هدف از اسید و باز استفاده شد. در ادامه محیط تهیه شده استریل گردید. سپس4میلی لیتر از قارچ کشت شده با پیپت استریل به تمامی سطح محیط تلقیح شد (تعداد اسپور های موجود در هر سی سی از محیط کشت شده به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتردر طول موج560 نانومتر انداره گیری شد). تمامی نمونه ها طی مدت 6 روز در دستگاه انکوباتور در دمای 32 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. پس از طی مدت زمان تعیین شده مقدار 40 میلی لیتر آب مقطر به نمونه ها اضافه شد و ترکیب ایجاد شده به منظور مخلوط شدن آب مقطر و ترکیبات تولید شده به وسیله قارچ بر روی بستر، به مدت 20-10 دقیقه تکان داده شد. سپس محلول رویی نمونه ها به درون لوله های آزمایش مجزا و مخصوص به خود در درون سانتریفیوژ با دور6000 به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. با پایان سانتریفیوژ محلول رویی نمونه ها از فیلترها­ی 45/0 میکرومتر عبور داده شد. به منظور تعیین میزان اسید سیتریک تولید شده، OD محلولهای جدا شده به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 405 نانومتر اندازه گرفته شد (20، 21 و 29). محلول حاوی  بالاترین میزان OD جهت تعیین میزان اسید سیتریک  تولید شده با استفاده از دستگاه HPLC مشخص شد.

جدول 1- آزمایشات 16 گانه طبق روش طراحی آماری تاگوچی به منظورتولید اسید سیتریک (با توجه به pH)

اندازه گیری میزان اسید سیتریک به وسیله روش طیف سنجی نوری: نمونه ها جهت تعیین میزان OD به آزمایشگاه پارک علم وفناوری استان گیلان برده شدند. نوع دستگاه مورد استفاده ازنوع اسپکتروفوتومتری مرئی و ماوراء بنفش ( UV/Vis)، WPA S 2000  ساخت کشورانگلستان بود. در این روش با استفاده ازمیزان جذب نور، غلظت مشخص می­شود. خروجی اسپکتروفتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. جهت تعیین میزان OD محلولهای فیلتر شده، به 1 میلی لیتر از عصاره تهیه شده،3/1 میلی لیتر پیریدین اضافه شد. چند ثانیه محلول مورد نظر جهت انجام واکنش تکان داده شد. در ادامه 7/5 میلی لیتر اسید استیک به ترکیب اضافه شد. ترکیب به دست آمده به مدت نیم ساعت در دمای 32 درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار داده شد. سپس جذب نوری هر یک از محلولها در طول موج 405 نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. لازم به ذکر است که برای صفر کردن دستگاه و تهیه بلانک از آب مقطر استفاده شد (20، 21 و 29).

تهیه محلولهای استاندارد اسید سیتریک: در روش اسپکتروفتومتری برای تعیین میزان اسید سیتریک از محلولهای استاندارد(ppm 100,300,500,1000,3000) استفاده شد. جذب نوری هر یک از محلولهای استاندارد در طول موج 405 نانومتر اندازه گیری شد. نتایج اسپکتروفتومتری محلولهای استاندارد منجر به ایجاد منحنی استاندارد براساس میزان جذب بر غلظت شد. با توجه به خط ایجاد شده از طریق معادله y=ax+b و بر اساس نتایج OD نمونه های استاندارد، غلظت اسید سیتریک تولید شده درهریک از محلول بسترهای اصلی به صورت تقریبی اندازه گیری شد. بهترین نتیجه جهت تعیین میزان اسید سیتریک با استفاده از دستگاه HPLC مشخص گردید.

روش HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا) جهت تعیین مقدار اسید سیتریک تولیدی: نمونه مورد نظرجهت HPLC و اندازه گیری اسید سیتریک تولیدی به آزمایشگاه پارک علم و فناوری استان گیلان برده شد. نوع دستگاه مورد استفاده Variam ساخت کشور امریکا بود. مقدار 20 میلی لیتر از محلول فیلتر شده مورد نظر در طول موج 210 نانومتر جهت تعیین میزان اسید تولیدی آنالیز شد. نوع حلال مورد استفاده آب مقطر با pH برابر با 2 بود.pH  حلال با اسید فسفریک تنظیم شد(28). طراحی آزمایش و آنالیز آماری نتایج بر اساس نرم افزار minitab 16  و روش طراحی آزمایش تاگوچی انجام شد. همچنین جدول آنالیز واریانس حاصل از تحلیل نرم افزار در مقاله به پیوست می­باشد.

نتایج

میکروارگانیسم مورد استفاده: بدین منظور از کپسولهای لیوفیلیزه قارچ آسپرژیلوس نایجر PTCC5010 تهیه شده از بانک میکروبی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران استفاده شد (شکل 1).

شکل 1- تصویر رشد آسپرژیلوس نایجر در محیط کشت جامد

محیط کشت اصلی یا تخمیر: نتایج حاصل از رشد آشپرژیلوس نایجر بر روی سوبستراهای مورد استفاده جهت تولید اسید سیتریک در شکل2 به نمایش گذاشته شده است.

شکل2- تصویر محیط کشت تخمیر

ترسیم منحنی استاندار اسید سیتریک: شکل 3 نتایج اسپکتروفتومتری محلولهای استاندار اسید سیتریک را در قالب  منحنی استاندارد اسید سیتریک نشان می­دهد.

شکل3- منحنی استاندارد اسید سیتریک

نتایج مربوط به بهینه سازی تولید اسید سیتریک به روش طراحی آزمایش تاگوچی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری: پس از انجام آزمایشات، نتایج در بسترهای 16 گانه آزمایشی در جدول2 نشان داده شده است. همان گونه که در جدول مذکور مشاهده می­گردد به استناد روش اسپکتروفتومتری و روش HPLC  بستر شماره 2 در pH برابر5 و دمای تیمار60 درجه سانتی گراد و زمان تیمار60 دقیقه و با وجود استفاده از کاه گندم به عنوان سوبسترا، بهترین بستر جهت تولید اسید سیتریک با مقدارتولید ppm763 می­باشد.

جدول2- نتایج روش تاگوچی برای مقدار اسید سیتریک تولیدی از آسپرژیلوس نایجر

همانطور که اشاره شد بستر شماره 2 کاه گندم طبق نتایج اسپکتروفتومتری با تولیدppm763 اسید سیتریک بهترین بستر جهت تولید اسید سیتریک می­باشد.

نتایج آزمایش HPLC : نتایج حاصل از آنالیز HPLC بر روی بستر شماره 2 در شکل 4 نشان داده شده است.

همانطور که مشاهده می­شود بستر شماره2 کاه گندم به میزان ppm 763 تولید اسیدسیتریک داشته است.

بررسی شرایط بهینه تولید اسید سیتریک توسط  آسپرژیلوس نایجر: شکل5 اثرنوع سوبسترا بر میزان اسید سیتریک تولید شده توسط آسپرژیلوس نایجر را نشان می دهد.

شکل4- آنالیز HPLC مربوط به نمونه شماره 2 کاه گندم

شکل5- نمودار اثر نوع سوبسترا بر میزان تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر

همان گونه که در شکل 5 مشاهده می­شود میزان تولید اسید سیتریک در حضور سوبسترای کاه گندم برابر با ppm 6399 ، در حضور سوبسترای کاه برنج برابر با ppm 5908 ، در حضور سوبسترای سبوس برنج برابر با ppm 5545 و درحضور سوبسترای پوست بادام زمینی برابر با ppm5387 می­باشد. بنابراین مقدار تولید اسید سیتریک در حضور سوبسترای کاه گندم نسبت به سوبستراهای کاه برنج، سبوس برنج و پوست بادام زمینی بیشتر است.

اثر pH : شکل6 اثر pH بر میزان تولید اسید سیتریک توسط  آسپرژیلوس نایجر را نشان می­دهد.

شکل 6- نمودار اثر pH بر میزان تولید اسید سیتریک توسط  آسپرژیلوس نایجر

همان گونه که در تصویر مشاهده می­­شود بالاترین میزان تولید اسیدسیتریک در  pHبرابر با 4 می­باشد. باافزایش یک واحدیpH  تا مقدار برابر 5 میزان تولید اسیدسیتریک با شیب کمی کاهش می­یابد. با افزایش مجدد یک واحدی این پارامتر میزان تولید اسیدسیتریک با شیب بیشتری کاهش می­یابد، به گونه­ای که در pH برابر با 6 کمترین میزان تولید اسید سیتریک مشاهده می شود. با افزایش pH تا مقدار برابر 7، میزان تولید اسید سیتریک افزایش می­یابد.

اثر دمای تیمار در تولید اسید سیتریک: نتایج بررسی اثر دمای تیمار در تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر در شکل7 نشان داده شده است .

شکل7- نمودار اثر دمای تیمار بر تولید اسید سیتریک توسط  آسپرژیلوس نایجر

یافته های به دست آمده از این پژوهش نشان داد که تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر در دمای 60 درجه سانتی گراد بیشترین بازدهی را دارد.

اثر زمان تیمار در تولید اسید سیتریک: نتایج بررسی اثر مدت زمان تیمار اعمال شده بر روی سوبسترا ها در تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر در شکل 8 نشان داده شده است.

شکل 8- نمودار اثر زمان تیمار بر میزان تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر

نتایج به دست آمده از بررسی اثر زمان تیمار بر میزان تولید اسید سیتریک نشان می­دهد که بالاترین میزان تولید اسید مذکور در زمان 90 دقیقه به دست آمده است.

سهم هر یک از فاکتورهای مورد بررسی در تولید اسید سیتریک: در شکل شماره9 سهم هر یک از فاکتورهای مورد بررسی در تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر نشان داده شده است.

شکل9- سهم هریک از فاکتورهای مورد بررسی در تولید اسید سیتریک

نتایج به دست آمده نشان می­دهد که نوع سوبسترای مورد استفاده 28درصد، pH 21 درصد، دمای تیمار23 درصد و زمان تیمار 15درصد را در تولید اسید سیتریک به خود اختصاص داده اند. درصد خطا در تولید اسید سیتریک8درصد می­باشد.

جدول آنالیز واریانس: نتایج حاصل از جدول آنالیز واریانس در جدول 3 نشان داده شده است.

تحلیل داده های به دست آمده از پژوهش با استفاده از نرم افزار Minitab 16 انجام شد. که 4 فاکتور در 4 سطح مورد بررسی قرار گرفتند. تحلیل این داه ها نشان داد که هر 4 فاکتور مورد بررسی در سطح آماری 05/0˂ P معنادار می­باشند. بدین ترتیب که فاکتورهای نوع سوبسترا، pH، دمای تیمار و زمان تیمار که مقدار P آنها به ترتیب 0274/0، 0328/0، 0313/0، 0382/0 می باشد، اثر معنا داری در تولید اسید سیتریک توسط آسپرژیلوس نایجر داشته­اند.

جدول3- تحلیل واریانس داده های نتایج آزمایشات

تطابق بین داده های تجربی و پیشگویی نرم افزار: در شکل 10 تطابق بین داده های تجربی و پیشگویی نرم افزار نشان داده شده است.

شکل 10- تطابق داده های تجربی و پیشگویی نرم افزار

همان­گونه که در شکل 10 ملاحظه می­شود میزان همبستگی وتطابق داده های تجربی و پیشگویی نرم افزار مقدار 94 درصد می باشد، وبه عبارتی میزان صحت داده های به دست آمده 94 درصد می­باشد.

بحث و نتیجه گیری

بررسی پارامترهای مؤثر بر بهینه سازی شرایط تولید اسید سیتریک: اسید سیتریک دارای پتانسیل اقتصادی بالایی می­باشد و کاربرد­های بسیار زیادی در بخش صنعت دارد؛ بنابراین همواره نیاز به بهینه­سازی پارامترهای مؤثر در تولید اسید سیتریک وجود دارد. به طوری که امکان تولید اسید سیتریک بدون توجه به پارامترهای مؤثر در بهینه سازی تولید وجود ندارد. در نهایت مجموعه عوامل مؤثر در تولید اسید سیتریک شرایطی را به وجود می­آورند که میکروارگانیسم را به سمت تولید حداکثری اسید سیتریک پیش می­برد. در حالی که هر یک از عوامل به تنهایی نمی­توانند در به حداکثر رساندن تولید اسید سیتریک نقش داشته باشند. استفاده از قابلیت میکروارگانیسم­ها در تبدیل مواد کم ارزش به مواد با ارزش افزوده از اهداف مهم فرآیندهای زیستی می­باشد(1). امروزه میکروارگانیسم­ها به عنوان زیست واکنشگر قادر به ایجاد ترکیبات شیمیایی از سوبسترا­های به کار گرفته شده می­باشند(1). در زمان تخمیر پیشنهاد یک مدل کلی برای رشد میکروارگانیسم ها در بستر جامد کار چندان ساده ای نیست، چرا که رشد در بستر جامد بیشتر شبیه رشد محیط طبیعی است و مواد مغذی موجود در سوبسترا به طور ایده آل نمی باشد (7). در این پژوهش چهار فاکتور مهم در بهینه سازی تولید اسید سیتریک مورد بررسی قرار گرفتند.

اثر نوع سوبسترا: یکی از پارامترهای بسیار مهم در میزان تولید اسید سیتریک اثر نوع سوبسترای استفاده شده می­باشد. امروزه ضایعات فراوان صنایع کشاورزی و فرآوری میوه به عنوان منابع غنی برای تولید ترکیبات مختلف توسط میکروارگانیسم­ها به کار برده می­شود (30). تاکنون تحقیقات زیادی در داخل وخارج از کشور در زمینه کاربرد انواع مختلفی از ضایعات کشاورزی جهت تولید بهینه اسید سیتریک انجام شده است. تحقیقات سوکسول وهمکارانش در سال 2006 به مثالهایی از این سوبستراها از جمله ملاس، چغندر، نشاسته لوبیا، همی سلولز، روغن کلزا، سویا، روغن زیتون و.... اشاره دارد (35). در پژوهشی ذوقی و همکاران در سال 2013 تولید اسید سیتریک از کاه گندم و باگاس خام نیشکر را با استفاده از  آسپرژیلوس نایجر مورد بررسی قرار دادند، که بیشترین تولید اسیدسیتریک 47 و 5/94 گرم به ازای کیلوگرم کاه گندم و باگاس نیشکر خشک به دست آمد (36). نتایج حاصل از مقالات نشان دهنده مناسب بودن سوبسترای کاه گندم جهت تولید اسید سیتریک می­باشد. در مورد سایر سوبستراها­ی مورد استفاده در این پژوهش تاکنون کارهای تحقیقاتی زیادی انجام نشده است. در این پژوهش از چهار سوبسترای کاه گندم، کاه برنج، سبوس برنج و پوست سخت بادام زمینی استفاده شده است که بیشترین میزان  تولید اسید سیتریک از سوبسترای کاه گندم به مقدار ppm763 می­باشد، که در مقایسه با اسید سیتریک تولید شده توسط ذوقی و همکارانش مقدار قابل توجهی می­باشد. البته باید توجه داشت که این اختلاف می­تواند ناشی از اثر عوامل گوناگون از جمله تفاوت در نوع تیمار باشد. پس از کاه گندم، کاه برنج، سبوس برنج و پوست سخت بادام زمینی به ترتیب جایگاههای بعدی را در تولید اسید سیتریک به خود اختصاص می­دهند. اختلاف در میزان تولید می­تواند ناشی از عوامل مختلفی از جمله تفاوت در ترکیب شیمیایی و میزان لیگنین و پلیمرهای پیچیده موجود در ساختار سوبستراها، تفاوت میزان تأثیرگزاری تیمار بر روی سوبستراها­ی مختلف، متفاوت بودن توانایی رشد آسپرژیلوس نایجر بر روی هر یک از سوبستراها و غیره باشد. تولید اسید سیتریک از دیدگاه بیوشیمیایی امری پیچیده است که ناشی از تأثیر عوامل مختلف تغذیه­ای در محیط می­باشد. تخمیر یک سوبسترا به طور مستقیم با کیفیت و کمیت منبع ارتباط دارد و ماهیت بستر که خود به منبع کربن بستگی دارد، تأثیر مشخصی بر فعالیت متابولیک سویه های میکروبی دارد (34). بنابراین سوبسترای مورد استفاده می­بایست نیازهای تغذیه ای میکروارگانیسم را جهت رشد فراهم کند. با توجه به کاربرد گسترده اسید سیتریک و در راستای استفاده از سوبستراهای بدون آلودگی محیط زیستی و ارزان قیمت با هدف کاهش هزینه تولید اسید سیتریک، استفاده از ضایعات کشاورزی از جمله کاه گندم بسیار مناسب می­باشد (16). از طرفی سالیانه بیش از 15-13 در صد گندم تولید شده در بخش کشاورزی درصنعت تبدیل به کاه گندم می­شود؛ ازطرفی کاه گندم تیمار نشده قابلیت استفاده برای دام را ندارد و به دلیل حجم زیاد، نیاز به فضای زیادی جهت نگهداری دارد، در نتیجه استفاده از این سوبسترا با توجه به مقدار تولید اسید سیتریک از آن بسیار مقرون به صرفه و ضروری می­باشد. امروزه حجم زیادی از کاه گندم در کشور سوزانده می­شود که این امر خود موجب آلودگی محیط زیست نیز می­شود. دیواره سلولزی کاه گندم شامل پلی ساکاریدهای سلولزی و همی سلولزی، پکتین و لیگنین می باشد(3). سبوس برنج و کاه برنج یک محصول از فرآورده­های جانبی آسیاب برنج و کارخانجات شالیکوبی می­باشند که سالیانه 100 تن از این محصول در جهان تولید می شود که 96درصدآن سهم کشورهای در حال توسعه می­باشد. سبوس برنج از نظر تغذیه ای به علت ترکیبات لیپیدی آن مورد توجه می­باشد و غنی از ویتامینهای مختلف است (15). پوست بادام حدود 15-3/1درصد از ضایعات فرآورده بادام را تشکیل می­دهد. پوست بادام از لحاظ میزان سدیم و قند فقیر است ولی از لحاظ فیبر غذایی و کلسیم غنی می باشد(6).

اثرpH : یکی از پارامترهای بسیار مهم در تولید اسید سیتریک pH می­باشد. pH یکی از فاکتورهای بسیار مهم در کشت حالت جامد می باشد. در واقع تنظیمpH   یکی از راههای کنترل فرآیند تخمیر در جهت تولید حداکثری محصول مورد نظر می­باشد (12). آمن هاو وان و همکاران در سال 2013 به بررسی بهینه سازی و تولید اسید سیتریک از نشاسته ذرت با استفاده از قارچ آسپرژیلوس نایجر پرداختند (37). در این پژوهش اثر pH محلول بر روی غلطت اسید سیتریک با استفاده از روش تجزیه و تحلیل پاسخ سطحی مورد بررسی قرار گرفت. طبق نتایج این پژوهش میزان بالای اسید سیتریک در  pH5-8 ثبت شده است که اثر همزمان سه متغیر pH، غلظت سوبسترا و دمای تخمیر منجر به مشاهده بیشترین مقدار اسید سیتریک می باشد. آنها در یافتند میزان pH محلول از دو جهت مهم است در مرحله اول جهت جوانه زنی اسپور و در مرحله دوم زمانی که پروتونها آزاد می­شوند و مواد مغذی حاوی نیتروژن توسط اسپورهای جوانه زنی در طول تخمیر جذب می­شوند که این عمل باعث کاهش pH می­شود. از این رو کاهش pH نشان دهنده پیشرفت تخمیر و تولید اسید سیتریک می­باشد. پازوکی و همکارانش تولید اسید سیتریک با استفاده از نیشکر را در سال 2000 توسط آسپرژیلوس نایجر مورد مطالعه قرار دادند؛ ودریافتند که ماهیت بستر مورد استفاده و تکنیکهای تولید بر میزان pH تأثیر می‍گذارند (38). نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان دهنده تولید حداکثری اسید سیتریک درpH برابر با 4 می­باشد. با توجه به اهمیت  pHاولیه در راندمان تولید اسید سیتریک در این پژوهش pH در چهار سطح (4،5،6،7) در محیط کشت تخمیری سوبستراهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. طبق نتایج این پژوهش  بالاترین میزان تولید اسید سیتریک در pH برابر با 4 از سوبسترای کاه گندم تولید شد، با افزایش این مقدار تا  pHبرابر با 6 میزان تولید اسید سیتریک نیزکاهش می­یابد. از pH 6 تولید اسید سیتریک به صورت نسبی افزایش می­یابد. بنابراین طبق نتایج به دست آمده از محدوده اپتیمم pH به دست آمده (4-5)، pH اولیه 4، بهترین pH برای تولید اسید سیتریک از  آسپرژیلوس نایجر PTCC5010 می­باشد؛ این در حالی است که بهترین بستر تولید کننده اسید سیتریک با بررسی اثر متقابل 4 متغیر مورد بررسی ،  بستر شماره 2 کاه گندم با pH اولیه 5 می­باشد. گستره pH مناسب برای رشد آسپرژیلوس نایجر در بازه 5-4 می­باشد. در تولید اسید سیتریک شرایط محیط کشت نمی­بایست به گونه ای باشد که اجازه رشد سلولی نامحدود را به  آسپرژیلوس نایجر بدهد، زیرا در این شرایط قند محیط صرفاٌ در جهت افزایش مقدار توده سلولی، مصرف شده و اسید سیتریک تولید نخواهد شد (22). رابطه pH با رشد قارچها یک رابطه پیچیده است که علت آن حساسیت بعضی و بالعکس مقاومت تعدادی از آنها نسبت به این نوع فاکتور می باشد(22). نتایج پژوهش حاضر با نتایج کار بسیاری از پژوهشگران از جمله پازوکی (2000)(38)، لودهی (2001)(39)، بانیک(1975) (40)، مطابقت دارد که در تمامی این پژوهشها حداکثر تولید اسید سیتریک در pH برابر با 4 می­باشد. آزمایشات نشان می­دهد، که قارچها در محیط اسیدی نسبت به محیط قلیایی رشد بهتری دارند. همچنین pH محیط بر روی نفوذ پذیری غشاء، سلول وآنزیمها تأثیر می­گذارد؛ در pH اسیدی غشای سلول از یونهای ⁺H اشباع واز نفوذ کاتیونها جلوگیری می­کند (8). pH محیط کشت به دلیل فعالیتهای میکروبی و عمدتاً ترشح اسید­های ارگانیک به صورت ناخواسته تغییر می­کند. ترشح اسید­های ارگانیک مانند اسید سیتریک باعث کاهش pH می­شود(8). کاهش مقدار تولید اسید سیتریک در pH های بالا (محدوده 6-4.5) در این پژوهش ممکن است به علت تجمع اسید­هایی باشد که در کنار اسیدسیتریک به طور ناخواسته تولید می­شوند. از طرفی بعد از تولید اسید سیتریک در pH های پایین به تدریج به دلیل اکسید شدن اسید سیتریک توسط میکروارگانیسم pH بالا می­رود (9). فرآیند تولید اسید سیتریک در آسپرژیلوس نایجر وابسته به فعالیت آنزیمها می­باشد و آنزیمها به عنوان نیرو محرکه عمل می­کنند، از طرفی رشد آسپرژیلوس نایجر در pH پایین، تولید اگزالیک اسید و گلوکونیک اسید را محدود می­کند که این امر خود با افزایش تولیداسید سیتریک همراه می­باشد (26).pH  به عنوان یک عامل تأثیر گذار باعث کاهش تجمع پروتون در محلول تخمیر می­شود (14). فعالیت آنزیم گلوتامین سنتاز با اثرات pH مرتبط است (26). pH ابتدایی یک محیط براساس نوع میکرو ارگانیسم، نوع بستر و تکنیکهای تولید تعیین می­شود و نوع سوبسترا و تکنیکهای تولید بر روی سنتیک pH مؤثر هستند، که همین عوامل خود می توانند از علل عدم تطابق نتیجه پژوهشهای مختلف با یکدیگر باشد.

اثر تیمار سوبسترا: مواد لیگنوسلولزی در برابر حمله آنزیمی میکروارگانیسم­ها از خود مقاومت نشان می­دهند که این مقاومت به عوامل زیر بستگی دارد:1- ساختمان کریستالی سلولز: در ترکیبات سلولزی، سلولز به صورت آمورف یا بدون شکل نسبت به قسمت کریستالی توسط حمله آنزیمی راحت­تر هضم می­شود. لذا با افزایش نسبت به قسمت بدون شکل سرعت هیدرو لیز بیشتر می­شود.2- محدود بودن مکانهای قابل دسترسی برای حمله آنزیمی: که علت این امر این است که اندازه میانگین رشته­های مویینه در ترکیبات لیگنو سلولزی آنقدر کوچک است که اجازه وارد شدن مولکولهای آنزیمی بزرگ را به درون ساختمان نمی­دهند؛ لذا حمله میکروبی به سطح خارجی محدود می­شود.3- لیگنین که سلولز را احاطه کرده است و یک منبع فیزیکی است. مهمترین عامل هضم آنزیمی سلولز، لیگنین می­باشد. حضور یک مانع فیزیکی حمله آنزیمی را مشکل می­کند که با انجام یک پیش تیمار مناسب می­توان در دسترس بودن سلولز و در نتیجه سرعت هیدرولیز را افزایش داد (31). ذوقی و همکاران در سال 1392 میزان تولید اسید سیتریک از کاه گندم تیمار شده را با استفاده از آسپرژیلوس نایجر مورد بررسی قرار دادند (36). آنها با اعمال 90 دقیقه بخار تحت فشار بر روی سوبسترا بیشترین راندمان اسید سیتریک را به دست آوردند. قرار گرفتن سوبسترا در معرض بخار می­تواند به عنوان یک پیش تیمار فیزیکی عمل کند، به همین دلیل موجب افزایش تولید اسید می­شود. در پژوهشی دیگر ابیشک و همکارانش میزان تأثیر تیمار اسیدی و سپس تیمار حرارتی وتیمار با اوره را برباگاس نیشکر در سال 2015 مورد مطالعه قرار دادند (41). نتایج این پژوهش نشان دهنده اثر مثبت این تیمار در افزایش میزان تولید اسید سیتریک می­باشد. در این پژوهش نقش دو پارامتر مهم در تیمار سوبستراها شامل دمای تیمار و زمان تیمار بر روی سوبستراهای مختلف مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت که تا کنون تحقیقات چندانی به صورت گسترده بر روی آنها انجام نشده است. دمای تیمار در 4 سطح (45،60،75،90 سانتی گراد) مورد بررسی قرار گرفت که حداکثر تولید اسید سیتریک تولیدی در دمای 60درجه سانتی گراد به دست آمد. مدت زمان اعمال تیمار بر روی سوبسترا نیز در 4 سطح (30،60،90،120دقیقه) مورد بررسی قرار گرفت، که حداکثر تولید اسید سیتریک در مدت زمان 90 دقیقه به دست آمد که در واقع نتیجه اثر تک فاکتور می­باشد؛ درحالی که با در نظر گرفتن مجموع پارامترهای مهم در تولید اسید سیتریک حداکثر تولید در مدت زمان تیمار 60 دقیقه به دست آمد. در این پژوهش به طور کلی ازسه روش تیمار فیزیکی خرد کردن، تیمار حرارتی به وسیله بخار آب و تیمار اسیدی با استفاده از اسید سولفوریک غلیط (H₂SO₄) استفاده شد. خرد کردن سوبسترا به قطعات ریز مقادیری از لیگنین و سیلیس محتوی آنرا می­شکند. از اثرات مهم خیس کردن کاه، خروج مقادیر متنابهی از اگزالات موجود در آن است (27). تیمار با بخار آب اگر چه در گروه تیمارهای فیزیکی طبقه بندی شده است، اما در حقیقت استفاده از بخار آب یک فرآیند ترموشیمیایی هیدرولیز اسیدی طبیعی می­باشد؛ بخار آب تحت فشار در افزایش میزان کربوهیدرات قابل استفاده موجود در علوفه فیبری و محصولات فرعی آن مؤثر است (21). در درجه حرارت بالا و شرایط اسیدی ایجاد شده اتصالات گروههای استیل و فرمیل همی سلولز وپکتین شکسته می­شوند، علاوه بر این آزاد شدن اسید­های آلی داخلی نیز با عمل کاتالیزوری خود، هیدرولیز فیبر را بالا برده وقابلیت هضم ماده غذایی را افزایش می­دهند (19). پیش تیمارهای شیمیایی به طور گسترده­ای برای حذف لیگنین و املاح ساختمانی ترکیبات لیگنو سلولزی استفاده می­شود (19). به طور کلی نتایج حاصل از پژوهشهای مختلف و همچین نتایج حاصل از این پژوهش نشان دهنده تأثیر معنی دار تیمار بر روی میزان تولید اسید سیتریک می­باشد.

نتیجه گیری

اسید سیتریک به دلیل کاربرد گسترده در صنایع گوناگون با افزایش تقاضا در جهان مواجه است؛ و انتظار می­رود با افزایش تقاضا میزان تولید جهانی بیشتر شود. در حال حاضر آسپرژیلوس نایجر مناسب ترین میکروارگانیسم برای تولید اسید سیتریک محسوب می­شود. در نتیجه می­توان نتیجه گرفت که آسپرژیلوس نایجر PTCC5010 را می­توان به عنوان یک سویه مناسب جهت تولیداسید سیتریک انتخاب نمود. طراحی تاگوچی مکرراً برای متغیرهای مؤثر در یک فرآیند به کار گرفته می­شود. مفید بودن این طراحی به منظور معین کردن تأثیر هر متغیر به طور مستقل روی سیستم می­باشد. حسن استفاده از روش طراحی تاگوچی دقت بالای طراحی و کم شدن تعداد آزمایشات لازم جهت بهینه­سازی و پایین آمدن هزینه و صرفه­جویی در زمان می باشد، علاوه بر این نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان داد که آسپرژیلوس نایجر توانایی تولید اسید سیتریک در سوبسترهای کاه گندم، کاه برنج، سبوس برنج وپوست بادام زمینی را دارد و با توجه به اینکه همه این سوبستراها به عنوان ضایعات کشاورزی و دور ریز صنایع در کشور محسوب می شوند، می توان نتیجه گرفت که تولید اسید سیتریک از این سوبستراها با توجه به بهینه سازی تولید علاوه بر تولید ارزان قیمت اسید سیتریک، پاک سازی محیط زیست را نیز در بر دارند. از طرفی پس از استخراج اسید سیتریک از کشت تخمیر شده و از بین بردن میکروارگانیسم ها، می توان از مواد باقیمانده به عنوان خوراک دام استفاده نمود. در این پژوهش اثر نوع سوبستراها،pH ، دمای تیمار سوبسترا و زمان تیمارسوبسترا بر تولید اسید سیتریک مورد بررسی قرار گرفت که نتایج حاصل از این تحقیق به صورت زیر می باشد:

الف. در بررسی اثر نوع سوبسترا، بیشترین تولید اسید سیتریک با استفاده سوبسترای کاه گندم به دست آمد.

ب. در بررسی اثر pH، بیشترین میزان تولید اسید سیتریک درpH برابر با4 به دست آمد.

ج.  در بررسی اثر دمای تیمارسوبسترا، بیشترین میزان تولید اسید سیتریک در دمای 60 درجه سانتی گراد به دست آمد.

د­. در بررسی اثر زمان تیمارسوبسترا، بیشترین میزان تولید اسید سیتریک در زمان 90 دقیقه به دست آمده وبا توجه به اینکه کاه گندم از نظر قیمت، سوبسترای بسیار مناسبی برای تولید اسید سیتریک می باشد، می توان این فرآیند را به عنوان یک روش مؤثر و اقتصادی در تولید اسید سیتریک مد نظر قرار داد.