توسعه برنامه­ای برای بررسی خودکار سمیت ترکیبات زیست فعال با استفاده از آزمون Artemia spp.  

فاطمه سلیمی^1*، علی متین نژاد²، هلیا فرخ نیا³ و مینا نصرت زاده³

¹ایران، دامغان، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست شناسی، گروه زیست شناسی سلولی-مولکولی

²ایران، تهران، دانشگاه علم و صنعت ایران، دانشکده مهندسی کامپیوتر

³ ایران، تهران، مرکز ملی توسعه استعدادهای درخشان

تاریخ دریافت: 17/04/1398          تاریخ پذیرش: 19/09/1398

چکیده

ترکیبات مورد استفاده در صنایع دارویی، غذایی و آرایشی-بهداشتی بایستی غیرسمی باشند. یکی از آزمونهای تعیین سمیت، با استفاده از لاروهای Artemia spp. به عنوان موجود حساس به سموم مختلف صورت می­گیرد. در این آزمونها ویژگیهای مختلف این لاروها بررسی می­شود. یکی از پرکاربرد­ترین این فاکتورها بررسی بقاء و مرگ لاروهاست. تشخیص لاروهای زنده و مرده بر اساس حرکت یا عدم حرکت آنها صورت می­گیرد. اگرچه حرکت سریع لاروها شمارش آنها را مشکل می­سازد و قابلیت اطمینان آزمون کاهش می­یابد. مطالعه حاضر با هدف توسعه برنامه‌ای برای تمایز خودکار لاروهای زنده و مرده و شمارش آنها در زمانی کوتاه و با دقتی بالا انجام شده است. در این راستا برنامه­ای در محیط MATLAB با روشهایImage Analysis به منظور تشخیص لاروها توسعه داده شد. حرکت لاروهای زنده با روش Image Subtraction  تشخیص داده شد. برنامه، تصاویر ارسالی را از دوربین در دو بازه زمانی 20 ثانیه­ای در انتهای دوره مجاورت لاروها در حضور ماده مورد بررسی دریافت و پردازش می‌کند. در هر بازه تصویر زمینه برای همان بازه محاسبه می‌شود. این کار موجب می‌شود لاروهایی که تاکنون مرده‌اند به تصویر زمینه اضافه گردند و در تشخیص لاروهای زنده شمارش نشوند. برنامه طراحی شده توانست با دقت بالا لاروهای زنده و مرده را شمارش کند. یافته­های به دست آمده از برنامه با یافته­های ارائه شده توسط کاربر متخصص به لحاظ آماری اختلاف معنا داری نداشتند (P>0.05). مزایای این آزمون­ بهبود داده شده با برنامه نویسی عدم نیاز به شرایط آسپتیک، مواد و تجهیزات پرهزینه، حضور کاربر و خطای کاهش یافته است.

واژه های کلیدی:  Artemia spp، آزمونهای سمیت حاد، درصد بقاء و مرگ، Image analysis، MATLAB

* نویسنده مسئول، تلفن: 02335220223، پست الکترونیکی: f.salimi@du.ac.ir

مقدمه

آزمونهای ارزیابی سمیت حاد، نخستین مرحله برای تعیین خطر ترکیبات شیمیایی جدید است. در این راستا، سمیت این ترکیبات شیمیایی بایستی توسط آزمونهای سمیت در شیشه (In vitro) با استفاده از گلبولهای قرمز خون، رده­های مختلف سلولهای یوکاریوتی و حتی مخمر Saccharomyces cerevisiae با به کار­گیری معرفهای مختلفی همانند متیل تیازول ﺗﺘﺮازوﻟﯿﻮم و تریپان بلو و همچنین آزمونهای سمیت در زیوه (In vivo) با استفاده از حیوانات آزمایشگاهی نظیر موش، موش صحرایی و خرگوش مورد ارزیابی قرار گیرد. علاوه بر این طیف وسیعی از ماهیها، پرندگان و دوزیستان به منظور ارزیابی اثر سمیت ترکیبات مورد استفاده در صنایع مختلف نظیر کشاورزی در آزمونهای سمیت مورد استفاده قرار می­گیرند(9).  

به منظور پیاده سازی قوانین بین المللی در مورد ارزیابی و محدودسازی اثرات سوء مواد شیمیایی، اطلاعات سم شناسی گسترده در مورد این مواد شیمیایی مورد نیاز است، در این راستا استفاده محدودتر از مهره داران در آزمونهای سمیت و به کار گرفتن راهکارهای جایگزین با استفاده از بی­مهرگان، گیاهان و نیز کشت بافت و سلول مورد تشویق قرار گرفته است (11).

در طول 50 سال گذشته، بی­مهرگان زیادی برای ارزیابی حساسیت آنها به بسیاری از ترکیبات شیمیایی و زیستی با هدف استفاده احتمالی آنها به عنوان مدلهای پیش غربالگری یا غربالگری سمیت، مورد ارزیابی قرار گرفته­اند. یکی از این بی­مهرگان بین المللی که رایج ترین گونه مورد استفاده در آزمونهای سمیت حاد است، خرچنگ­ آب شور،Artemia spp.  ، است که به عنوان میمون دریایی شناخته می­شود(36).   این خرچنگ آب شور متعلق به فرمانروی جانوران، شاخه بندپایان، زیرشاخه سخت پوستان، رده آبشش پایان، راسته پری میگوها، تیره آرتمیایان است و یک تاکسون اصلی در زیستگاههای آب شور در سراسر جهان می باشد (34). آنها اهمیت اقتصادی بالایی در صنایع آبزی پروری و آکواریومی دارند(33).

سیستها پس از قرار گرفتن در آب دریا برای 20-15 ساعت، موجوداتی به نام لارو یا ناپلی تولید می­کنند  جهت انجام این آزمون از لارو یا ناپلی در مرحله دوم و سوم استفاده می­شود. این جانداران صرفاً در این دو مرحله به سموم حساسیت دارند.  علاوه بر این، لاروها در این مراحل نیاز به تغذیه نداشته و از ذخیره کیسه زرده خود استفاده می­نمایند (24).

مزیتهای اصلی استفاده از خرچنگهای آب شور در آزمونهای سمیت حاد شامل سرعت بالای پاسخ دهی آزمون، مقرون به صرفه بودن آن، قابلیت دسترسی بالا به لاروهای تفرج شده از سیستهای پایدار، دسترسی به دانش کافی در مورد زیست شناسی و بوم شناسی Artemia spp.، تفرج و نگهداری آسان سیستها، اندازه کوچک بدن لارو­ها که امکان اجرای آزمون سمیت حاد را در میکروپلیتها فراهم می­سازد و سازگاری بالا به شرایط متنوع آزمون می­شود (17 و 23).

لاروها برای بررسی سمیت حاد طیف گسترده ای از مواد شیمیایی همانند فلزات سنگین از جمله آرسنیک(5)، کادمیوم، کروم(18)، کبالت(15)، مس(4)، جیوه(18)، نیکل(16)، روی(14)، پتاسیم پرمنگنات، پتاسیم دی کرومات، نقره نیترات (3 و 35)، آنتی­بیوتیکها (25)، نانومواد مهندسی شده(7)، پلی استیرن در ابعاد نانو (2)، پنبه نسوز (32)، ترکیبات فنلی(14)، اتانول آمینها (19) علف کشها، حشره کشها و آفت کشها (37)، عصاره­های گیاهی(6)، میکربی(31)، توکسینها (1)، پسابها و آب دریاها به کار گرفته شده است(20). به طور معمول آزمونهای متنوع ارزیابی سمیت با Artemia spp. در دسترس هستند که شامل روشهای کوتاه مدت از جمله بررسی نشانگر­های زیستی آنها ( شامل استیل کولین استراز، گلوتاتیون-پراکسیداز، گلوتاتیون S-ترنسفراز، گلوتاتیون ردوکتاز، آلدهید دهیدروژناز و آدنیل پیروفسفاتاز)، درصد تفرج (شامل بررسی زیتوده خشک، اختلالات شکلی و اندازه­ای)، رفتاری (سرعت شنا کردن و طول مسیر شنا) و بلند مدت که بر روی رشد، تکثیر، بقاء و مرگ از مرحله لاروی تا بلوغ متمرکز می­گردد، می­شود (21 و 22). آزمونهای سمیت کوتاه مدت بیشتر به کار گرفته می­شوند. البته این آزمون علی رغم مزیتهای ذکر شده محدودیتهایی از جمله حساسیت کم به علت خطای احتمالی کاربر دارد.

تحرک و سرعت شنا پرکاربردترین آزمون رفتارشناسی جهت ارزیابی سمیت ترکیبات بر فیزیولوژی ارگانیسمهای آبزی همانند Artemia spp. است. تحرک، همانند شنا کردن، به عنوان شاخص استرس در چندین مطالعه سم شناسی اکولوژیکی به کار گرفته شده است و مقیاسی حساس از استرس ناشی از حضور سم را برای طیف وسیعی از آلاینده­های محیطی ارائه داده است. در طی ده سال اخیر، رفتار شنا کردن به عنوان پاسخ بی­مهرگان همانند Artemia spp. به واسطه قرارگیری در معرض آلاینده­های آلی یا غیرآلی مطالعه شده است(12). اگرچه هنوز هم فقدان اساسی حسگرهای زیست سازگار اتوماتیک و الگوریتمها جهت ارزیابی و آنالیز داده­های رفتاری Artemia spp. برای مطالعات سم شناسی وجود دارد. به عبارتی در تمامی مطالعات در زمینه بررسی سمیت حاد ترکیبات آلی و غیر آلی نتایج به صورت دستی بررسی می­شوند و کوچک بودن و حرکت سریع این ارگانیسم می­تواند منجر به افزایش خطای آزمون و در نتیجه مانع غربالگری سمیت با کارایی بالا جهت بررسی سمیت تعداد وسیعی از ترکیبات در زمان کوتاه شود. از این رو قابلیت اطمینان این آزمون به طور عمده­ای وابسته به تجربه کاربر در تمایز لاروهای زنده و مرده و همچنین دقت در شمارش لاروهای مرده است. علاوه بر این در اکثریت مطالعات تعداد لاروهای مرده و زنده پس از گذشت 24 ساعت مورد شمارش قرار می گیرد، در حالی که با استفاده از این نرم افزار بدون نیاز به حضور کاربر می توان تعداد لاروهای مرده و زنده را در فواصل زمانی کوتاه تر مورد بررسی قرار داد و به این وسیله به نتایج دقیق تری دست یافت.

درحال حاضر بسیاری از روشهای قدیمی علوم آزمایشگاهی به واسطه‌ وجود تجهیزات پیشرفته و مدرن با روشهای رایانه‌ای و خودکار جایگزین شده‌اند و درنتیجه‌ آن، دو عامل خطا و زمان در انجام آزمایشات بسیار کاهش یافته‌اند. در مطالعه حاضر تلاش شد تا با استفاده از امکانات تصویربرداری و Image Analysis، نرم‌افزاری توسعه داده شود که بدون نیاز به دخالت کاربر اثرات آزمون را در مقاطع زمانی تعیین شده گزارش کند. این نرم‌افزار در محیط MATLAB توسعه داده شده است و برای اجرا تنها به یک رایانه و یک دوربین تصویربرداری ساده نیاز دارد.

مواد و روشها

تهیه عصاره مایع تخمیر باکتری Nocardia sp. UTMC 751 : به منظور تهیه عصاره مایع تخمیر باکتری Nocardia sp. UTMC 751، این باکتری در ارلن مایر ml250 دارای ml50 محیط پیش کشت FA (نشاسته g/L 10، عصاره مخمر g/L 4 و پپتون g/L 2) استریل شده با اتوکلاو (دمای 121 درجه سانتی گراد، به مدت 20 دقیقه) تلقیح شد. ارلن تلقیح شده در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه و دور rpm 180 به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. پس از طی اتمام گرماگذاری و اطمینان از عدم آلودگی کشت، به میزان 5 درصد حجمی-حجمی از محیط پیش کشت به محیط تخمیر (FA) تلقیح انجام شد. سپس فلاسک تخمیر در دمای 28 درجه به مدت 7 روز در شیکر انکوباتور با دور rpm 180 گرماگذاری شد. در پایان دوره گرماگذاری زیتوده با استفاده از سانتریفیوژ با دور g 2500 به مدت 10 دقیقه جداسازی شد. به منظور استخراج ترکیبات زیست فعال، معادل با حجم سوپرناتانت به دست آمده، اتیل استات تقطیر شده به فاز آبی اضافه گردید و در ادامه ارلن دارای این مخلوط به مدت 90 دقیقه روی همزن قرار داده شد تا دو فاز در این مدت با همدیگر مخلوط شوند. در پایان فاز آلی که دارای متابولیتهای استخراج شده می­باشد از فاز آبی به تدریج جدا شده و روی آن قرار می­گیرد. در پایان این مرحله برای بازیافت حلال و تغلیظ متابولیتها، فاز آلی به دستگاه تبخیرگر دوار منتقل شده تا در دمای 38 درجه و دور rpm70 حلال از نمونه جدا شده و عصاره خام تغلیظ شده به دست آید که نهایتاً حلال اضافی باقی مانده در عصاره به کمک گاز ازت تبخیر گردید تا عصاره در وضیت کاملاً خشک در فریز 20- نگهداری شود (30).

تفرج سیستهای Artemia salina : جهت انجام این آزمون ابتدا سیستهای Artemia salina در آب مصنوعی دریا (جدول1) تحت هوادهی و نور مصنوعی طی 24 ساعت تفرج شدند. سپس تعداد 10 تا 20 عدد از لاروها به کمک سمپلر به هر یک از چاهکهای پلیت 48 خانه منتقل شدند و به چاهکها عصاره اتیل استاتی باکتری Nocardia sp. UTMC 751 با غلظتهای نهایی g/mlµ 1، g/mlµ 5، و g/mlµ 10 (گروههای آزمون) یا بافر فسفات (گروه شاهد) در سه تکرار افزوده شد. لاروها با استفاده از استرئومیکروسکوپ مشاهده شدند و با کمک دوربین فیلم برداری از لاروها به مدت 24 ساعت انجام شد. سپس فیلمهای تهیه شده برای طراحی و پیاده­سازی الگوریتمی کارا به منظور تشخیص و شمارش خودکار لاروهای زنده و مرده بر اساس تحرک یا عدم تحرک آنها مورد استفاده قرار گرفتند.

جدول1- نمکهای استفاده شده جهت تهیه آب دریای مصنوعی (10)

تشخیص لاروهای زنده با روش Image Subtraction  : همان طور که پیش­تر توضیح داده شد، مطالعه حاضر با هدف توسعه نرم‌افزاری برای شمارش تعداد لاروهای زنده و مرده در فواصل زمانی معین انجام گرفته است. روش استفاده شده برای تفکیک لاروهای زنده از مرده برمبنای تشخیص تحرک لاروهای زنده است. به عبارتی اگر یک لارو طی چند فریم متوالی (در فیلم تهیه­شده) در جای خود ثابت مانده باشد آن لارو در شمارش به حساب نمی‌آید، زیرا برنامه فقط لاروهایی که حرکت داشته‌اند را تشخیص می‌دهد.

تشخیص حرکت یک لارو بین دو فریم با محاسبه تفاضل آن دو فریم امکان پذیر است. منظور از Image Subtraction  تفریق شدت نور پیکسلهای متناظر در دو تصویر (فریم) است. از آنجاکه در تصویر شدت نور منفی معنا ندارد، هر تفریقی به عددی منفی برسد حاصل آن صفر در نظر گرفته خواهد شد. برای این کار ابتدا لازم است تصویر رنگی (RGB) به تصویر تک‌رنگ (Monochrome) تبدیل شود. در تصویر تک‌رنگ هر پیکسل مقداری عددی بین 0 الی 255 خواهد داشت که مشخص‌کننده‌ شدت نور در آن نقطه است. پیکسلی با مقدار 0 کاملاً سیاه و با مقدار 255 کاملاً سفید خواهد بود.

وقتی دو تصویر مشابه از یکدیگر تفریق شوند نتیجه تصویری کاملاً سیاه خواهد بود. زیرا عدد هر پیکسل از خودش کم می‌شود و حاصل تفریق در تمام نقاط صفر خواهد بود. اما اگر در ناحیه‌ای تغییرات رخ داده باشد حاصل تفریق در آن نقاط دیگر صفر نخواهد بود و در تصویر حاصل رنگ خاکستری خواهد داشت. به این ترتیب می‌توان نواحی دارای تغییرات (ناشی از تحرک لاروها) بین دو فریم را تشخیص داد (شکل 1).

افزایش دقت تشخیص با محاسبه تصویر زمینه: تشخیص حرکت لاروها به کمک روش Image Subtraction  هرچند روشی ساده و ظاهراً کارآمد است اما ممکن است گاهی دچار خطا شود، زیرا این روش صرفاً بر مبنای تغییرات عددی پیکسلها عمل می‌کند. به طور مثال اگر در یک ناحیه یک لارو زنده قرار داشته باشد و جا به جا شود و به طور اتفاقی لارو زنده‌ دیگری در همان ناحیه قرار گیرد آن ناحیه تغییر شدت نور نداشته و در شمارش به حساب نمی‌آید. این مشکل خصوصا در اوایل آزمایش که تعداد لاروهای زنده زیاد است نمود بیشتری دارد.

روش پیشنهادی برای حل این مشکل تفریق فریم از یک تصویر ثابت خالی از لارو زنده می‌باشد. به این معنا که برای تشخیص لاروهای زنده‌ درون یک فریم، تفاضل آن با تصویر زمینه‌ چاهک محاسبه گردد.

شکل 1- تفریق دو فریم با فاصله زمانی 138 میلی ثانیه

اما تصویر زمینه‌ چاهک نباید خالی از لاروهای مرده باشد. زیرا در این صورت هنگام محاسبه تفاضل، لاروهای مرده نیز در شمارش محاسبه می‌شوند. درنتیجه لازم است تصویر زمینه چاهک شامل لاروهای مرده اما خالی از لاروهای زنده باشد. پس باید به جای داشتن یک تصویر زمینه ثابت در طول آزمایش، در هر مقطع زمانی تصویر زمینه‌ای متناسب با آن مقطع محاسبه و استفاده شود. برای به دست آوردن چنین تصویری از روش میانگین‌گیری استفاده شده است. در این روش تمامی فریمهای ویدیو در یک بازه‌ زمانی (مثلا 5 ثانیه) با هم جمع شده و میانگین آنها محاسبه می‌شود. به این ترتیب در تصویر حاصل لاروهای مرده حضور دارند اما اثر لاروهای زنده از بین می‌رود (شکل 2).

شکل 2- تصویر زمینه محاسبه‌شده با حضور دو لارو مرده

شمارش لاروهای زنده و مرده: در بخشهای قبلی تصاویری به دست آمدند که درواقع تفاضلی از دو تصویر مشخص بودند. در تفاضل مهم است که آیا یک پیکسل در ماتریس تفاضل به صفر نزدیک است یا از صفر دور است. اگر مقدار یک پیکسل در ماتریس تفاضل به صفر نزدیک باشد یعنی آن پیکسل در هر دو تصویر یکسان بوده است. به همین ترتیب اگر مقدار یک پیکسل در ماتریس تفاضل از صفر دور باشد، می­توان نتیجه گرفت آن پیکسل در دو تصویر دست­خوش تغییر شده است. در اینجا باید حدآستانه مناسبی انتخاب کرد تا به کمک آن بتوان این شباهت یا عدم شباهت پیکسلها در دو تصویر را به درستی تشخیص داد. این حدآستانه از طریق مشاهده نمونه­های تهیه شده و با آزمون و خطا مشخص می شود.

در ادامه از حد آستانه تعیین شده، جهت تعیین ایجاد تغییر یا عدم ایجاد تغییر در تصاویر مورد بررسی استفاده شد. به این معنی که در این تصاویر پیکسلهای کمتر از حد آستانه کاملاً سیاه و پیکسلهای بیشتر از حد آستانه کاملاً سفید قرار داده شد. این کار کمک می‌کند ماتریس حاصل تنها شامل اعداد 0 و 1 باشد و پردازش آن ساده‌تر شود. اما تصویر فعلی هنوز آماده شمارش نیست. مسائلی همچون تغییرات نور محیط، ریزذره‌های درون چاهک و درهم رفتگی لاروها باعث ایجاد نویز و پیوستگیهای نا به جا در تصویر می‌شود که امر شمارش را با خطا مواجه می‌کند. لذا لازم است  پیش از شمارش لاروها چند مرحله عملیات مورفولوژی بر روی تصویر اعمال شود. این مراحل در بخش نتایج عنوان شده‌اند.

پس از اعمال فیلترهای مورفولوژی و حذف اجزای اضافی تصویر آماده شمارش می‌شود. در تصویر نهایی رنگ زمینه کاملاً سیاه بوده و فقط توده‌هایی سفید رنگ در برخی نواحی به چشم می‌خورد که نشان‌دهنده لاروهای زنده هستند. برای شمارش این توده‌ها برنامه تصویر را پیمایش می‌کند تا به پیکسلی سفید برسد. با پیداشدن یک پیکسل سفید تمامی پیکسلهای سفید متصل به آن (همسایگی 8) به روش بازگشتی پیدا شده و سیاه می‌شوند. درنتیجه هرگاه یک توده سفید در تصویر پیدا شود ابتدا شمارش شده و سپس به طور کامل حذف می‌گردد و برنامه به پیمایش خود ادامه می‌دهد. به این ترتیب در پایان تعداد کل توده‌های سفید شمارش شده‌اند و به عنوان تعداد لاروهای زنده در آن مقطع گزارش می‌شوند (شکل 3).

عملیات مورفولوژی به مجموعه عملیاتی گفته می شود که بر روی تصاویر باینری اعمال شده و هدف از آن ایجاد تغییرات هندسی در اجزای داخل تصویر است.

در یک ساختار ماتریسی هر خانه با دو خانه مجاورت عمودی (بالا و پایین)، با دو خانه مجاورت افقی (چپ و راست)، و با چهار خانه مجاورت مورب (بالا راست، بالا چپ، پایین راست و پایین چپ) دارد. منظور از همسایگی 4 خانه‌هایی است که با مرکز مجاورت عمودی و افقی دارند. منظور از همسایگی 8 تمامی هشت خانه‌ای است که با مرکز مجاورت عمودی و افقی و مورب دارند.

شکل 3- تصویر لاروهای زنده پیش(چپ) و پس(راست) از عملیات مورفولوژی

نتایج

تفرج لاروهای Artemia salina : تعداد زیادی از سیستهای افزوده شده به آب مصنوعی دریا تحت شرایط ذکر شده تفرج شدند (95 درصد) و بر این اساس تعداد زیادی از لاروهای موجود در مرحله اول و دوم لاروی جهت ادامه مطالعه در دسترس بودند.

تمایز لاروهای زنده با روش Image Subtraction : اساس برنامه طراحی شده در مطالعه حاضر تشخیص ایجاد تغییر یا عدم تغییر در پیکسلهای تصاویر متوالی حاصل شده از فیلم تهیه شده بود. به منظور تشخیص لاروهای زنده و مرده بر اساس قابلیت تحرک لاروهای زنده، برای پیکسلهایی که در دو فریم متوالی تغییری نداشته­اند، دارای لارو مرده، حاصل برابر با صفر خواهد شد. پس می­توان نتیجه گرفت طی این دو فریم در آن نقطه تغییر صورت نگرفته است. به همین ترتیب اگر در ماتریس Image Subtraction  مقادیر غیرصفر وجود داشت می­توان گفت در آن پیکسلها جا به جایی به واسطه حضور لاروهای زنده رخ داده است.

افزایش دقت تشخیص با محاسبه تصویر زمینه و شمارش لاروهای زنده و مرده: تصویر زمینه نیز با میانگین گیری میان چند تصویر متوالی حاصل شد و از آن جهت تشخیص صحیح لاروها از سایر اجزای موجود در محیط به طور موفقیت آمیزی انجام گردید. با استفاده از تعیین حد آستانه لاروهای موجود در تصویر تشخیص داده شد و استفاده از کدهای مورفولوژی منجر به پردازش تصویر و اصلاح از طریق حذف نویزها شد. در نهایت تصویر پردازش شده برای شمارش نهایی تعداد لاروهای مرده و زنده پیمایش می‌شود. مراحل عملیات مورفولوژی از جمله پر کردن حفره‌ها برای جلوگیری از شکست و تجزیه یک لارو (شکل 4-ب)، حذف نویز برای از بین بردن اجزای اضافی (شکل 4-ج)، باریک کردن اجزا به منظور تفکیک لاروهای به هم چسبیده (شکل 4-د) و حذف نویز برای از بین بردن نقاط جدا افتاده (شکل 4-ه) در شکل 4 نشان داده شده است.

بررسی اختلاف میانگین نتایج تفسیر شده توسط کاربر و برنامه طراحی شده: به علت عدم پیروی داده از توزیع طبیعی نرمال (P<0.05)، اختلاف میانگین داده­های بررسی سمیت حاد عصاره اتیل استاتی به دست آمده از باکتری Nocardia sp. UTMC 751 توسط برنامه طراحی شده و کاربر (3 تکرار) با استفاده از آزمون Mann-Whitney U در نرم افزار آماری SPSS نسخه 21 بررسی شد، نتایج نشان دهنده عدم اختلاف معنادار میانگین دو گروه مورد بررسی بود (P>0.05) (جدول 2) (31).

جدول 2- مقایسه آماری نتایج به دست آمده از دو آزمون سمیت انجام شده توسط کاربر و برنامه طراحی شده

بحث

تعداد زیاد ترکیبات شیمیایی جدید در صنعت داروسازی انسانی و دامی، صنایع کشاورزی و غذایی منجر به تقاضای افزایش یافته برای غربالگریهای ایمنی به منظور اطمینان یافتن از توسعه موفق آمیز دارو شده است. بخشی از این فرآیند غربالگری شامل تعیین سمی بودن این ترکیبات جدید با به کار گیری آزمونهای معتبر بین الملی سم شناسی در شیشه (In vitro) و در زیوه (In vivo) می­شود. از این رو آزمونهای سم شناسی ضروری هستند. آزمونهای سم شناسی می­توانند در برخی تحقیقات پایه ای  اطلاعاتی را فراهم نماید که در نهایت منجر به توقیف ترکیبات شیمیایی ویژه ای به واسطه سمیت اثبات شده آنها در این آزمونها شوند(5).

شکل 4- (الف)تصویر پردازش‌نشده. (ب)پر کردن حفره‌ها برای جلوگیری از شکست و تجزیه یک لارو. (ج) حذف نویز برای از بین بردن اجزای اضافی. (د)باریک کردن اجزا به منظور تفکیک لاروهای به هم چسبیده. (ه)حذف نویز برای از بین بردن نقاط جدا افتاده.

رت­، موش، همستر، خوک، خوکچه، خرگوش، مرغ، سگ و میمون از جمله حیواناتی هستند که در آزمونهای سم شناسی در زیوه با اهداف مختلف تا کنون مورد استفاده قرار گرفته اند. قوانین حمایت از حیوانات در حال حاضر در اغلب کشور­ها برای جلوگیری از سوء استفاده از حیوانات در آزمایشهای سم شناسی قابل اجراست (5).

مدلهای سلولی در مقایسه با مدلهای حیوانی نسبتاً مقرون به صرفه تر و به آسانی قابل نگهداری و دستورزی هستند. مدلهای در شیشه مطالعه تأثیرات مستقیم سموم را بر روی انواع سلولها و بافتهای ویژه در یک محیط کنترل شده امکان پذیر می­سازد. معایب عمده سیستمهای در شیشه نسبت به سیستمهای در زیوه، فقدان اثرات سراسری، سیستم متابولیسم بیگانه‌زیستها و حذف سموم است. اگرچه این معایب می­تواند با استفاده از سیستمهای فعال کننده متابولیکی همانند معرفی نیکوتین آدنین دی نوکلئوتید فسفات هیدروژن فعال کننده میکروزومها یا روی یک رده سلولی کبدی تا حدودی برطرف شود، اما هر کدام از این عوامل هزینه بر خواهند بود و هزینه تمام شده آزمون سمیت را تا حد قابل ملاحظه ای افزایش خواهند داد و امر این آزمونها را برای غربالگری اولیه تعداد زیادی از ترکیبات نامناسب می­سازد. محدودیت دیگر کشت سلول این است که بسیاری از سیستمهای سلولی فاقد پیچیدگی میانکنش­های سلول-سلول در بافت هستند، این محدودیت می­تواند تا حدودی با استفاده از سیستمهای کشت همزمان یا کشت بافت برطرف شود، که این امر نیاز به تخصص بالای کاربر در این زمینه دارد(5).

همچنین همه کشتهای سلول بایستی به منظور کاهش آلودگی میکربی تحت شرایط استریل تهیه و نگهداری شوند. سلولها بایستی تحت شرایط تعریف شده­ای از رطوبت، pH و دما نگهداری شوند. آنها بایستی در محیط کشتی ویژه که ممکن است دارای تعدادی از اجزا مکمل همانند آنتی بیوتیکها، گلوتامین، سرم و غیره باشد، رشد داده شوند(5).

آزمون متداول استفاده شده در بررسی اثرات سمی یا سایتوتوکسیک ترکیبات طبیعی، سنتزی و نیمه سنتزی آزمون سمیت با استفاده از معرف تترازولیوم است (8 و 28).

در مطالعه ای رجبی و همکاران از Artemia salina  به عنوان ارگانیسم مدل در بررسی سمیت نانوذرات استفاده و نتایج حاصله را با آزمون بررسی سمیت با استفاده از متابولیسم تنفسی سلولها با کمک رنگهای حیاتی مانند مشتقات نمک تترازولیوم مقایسه نمودند. نتایج نشان داد که داده­های حاصل از هر دو آزمون اختلاف معناداری با یکدیگر ندارند (P<0.05) و بنابراین می­توان از Artemia salina برای تسریع و کاهش هزینه­های مربوط به آزمونهای سمیت حاد استفاده نمود (29). (27 و 29)

همان طور که ذکر شد، به علت عدم نیاز به شرایط سترون، عدم نیاز به فاکتورهای رشد پرهزینه همانند سرم جنین گاوی در آزمون سمیت سلول بنیان به استفاده از Artemia spp. در آزمونهای سم شناسی وجود دارد. این آزمون در ابتدا توسط میشل و همکاران در سال 1959 پیشنهاد شد و بعدها به وسیله بسیاری از تکنسینها به عنوان یک روش جهت ارزیابی اولیه سمیت بهینه سازی شد(26).

با توجه به موارد مذکور، Artemia salina یکی از انواع مهم و نسبتا گسترده سخت پوستان در آبهای لب شور تا شور ارگانیسمی مناسب جهت ارزیابی سمیت ترکیبات مختلف به عنوان غربالگری اولیه محسوب می­شود. سیستهای Artemia salina دارای یک پوسته و پوشش غشایی اطراف جنین است و به طور معمول دارای 6 تا 10 درصد رطوبت و قابلیت بقا تا 50 سال هستند.

در این راستا مطالعات اخیر ویژگیهای مختلف این لاروها را با استفاده از الگوریتمهای متفاوت جهت افزایش سهولت استفاده از آنها در آزمونهای سمیت، بررسی نموده اند. در این میان می­توان به مطالعه Kokkali و همکاران اشاره نمود که در راستای بررسی سمیت فلزات سنگین از جمله یونهای مس، کادمیوم، آهن در غلظتهای مختلف با استفاده از آزمون خرچنگ آب شور از آنها فیلم برداری نمودند و فیلم گرفته شده را با استفاده از الگوریتم کاوشگر تحرک که قابلیت حرکت لاروها را مورد بررسی قرار می داد، پردازش نمودند. علی رغم تعداد کم لاروهای به کار برده شده، این سیستم حساسیت بالایی در بررسی تحرک لاروها داشت. علاوه بر این مقادیر بسیار کم از ترکیبات سمی قابل ردیابی با این برنامه بودند(9).

در مطالعه Kim و همکاران  نرخ تفرج Artemia به وسیله شمارش خودکار سیستها بر اساس اطلاعات رنگی به دست آمده از آنها طی آزمایشهای تفرج شدن با به کارگیری روش پردازش تصویر اندازه گیری شد. نرخ تفرج با استفاده از اطلاعات تصویری به دست آمده تحت شرایط آزمایشگاهی مختلف در طیف 48-34 درصد برآورد شد. اختلاف 9/10 درصد درصدی میان نتایج به دست آمده از شمارش خودکار و شمارش دستی توسط کاربر مشاهده شد(15).

 در مطالعه Garaventa و همکاران  احتمال بهبود آزمون سمیت با برآورد ویژگی رفتاری (تغییر در سرعت شنا کردن) لاروهای خرچنگ آب شور Artemia sp. و روتیفر Brachionus plicatilis در مطالعات سم شناسی مورد ارزیابی قرار دادند. نخستین آزمایش به منظور آنالیز سرعت شنا کردن دو ارگانیسم مذکور به منظور تأیید کارایی سیستم ردیابی ویدیویی انجام شد. آزمایش دوم با قرار گیری ارگانیسمها در برابر ترکیبات سمی انجام شد. تغییر سرعت شنا کردن همزمان با نرخ مرگ و میر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون نخست نشان داد که ثبت رفتار شنا کردن ابزاری مناسب برای اندازه گیری سرعت شنا کردن دو ارگانیسم است. نتایج آزمون سمیت نشان داد که سرعت شنا کردن و یک شاخص حساس برای شناسایی تنش مواد سمی در غلظتهای ناچیز است(13).

مطالعه حاضر کارایی آزمون ارزیابی سمیت با استفاده از Artemia salina را به کمک نرم افزار توسعه داده شده، به طور قابل ملاحظه ای افزایش داد. در این روش نیازی به حضور کاربر جهت بررسی تعداد لاروهای مرده و زنده در بازه­های زمانی مختلف نیست و برنامه با دقت بالایی تعداد لاروهای زنده و مرده را که شاخص مستقیمی از سمیت ترکیب مورد بررسی است، ارزیابی می­نماید. برنامه توسعه داده شده می­تواند نرخ مرگ لاروهای Artemia salina  را در گذر زمان مشخص سازد و لذا بین دو ماده با میزان مرگ و میر مشابه در انتهای یک دوره زمانی مشخص اما با سرعت کشندگی مختلف تمایز قائله شود، لذا در مطالعه حاضر می­تواند اهمیت و کاربرد بالایی در بررسی همزمان سمیت تعداد زیادی از ترکیبات مختلف در بازه­های زمانی مختلف داشته باشد.