نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران

2 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی/ دانشکده کشاورزی/ دانشگاه زابل/ زابل/ ایران

3 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، ایران

چکیده

انگور یاقوتی یک میوه مهم در ایران است. انگور یاقوتی سیستان به دلیل زودرسی و فرار از تنش های محیطی منطقه از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت می باشد. این رقم زودرس ترین انگور کشور بوده و هفته اول خرداد قابل برداشت است. بنابراین بررسی عوامل زودرسی این انگور اهمیت ویژه ای دارد. در این پژوهش ابتدا ژن های مرتبط با انتقال سیگنال در فرآیند رسیدگی انگور مورد بررسی قرار گرفتند. سپس دو ژنSTE20 و MYBA مربوط به رسیدگی و ژن GAPDH به عنوان ژن رفرنس انتخاب شد. تفاوت بیانMYBA در یاقوتی قرمز با تحقیقات پیشین بودکه از نتایج جالب توجه این تحقیق به شمار می رود. بیان STE20در ارقام زودرس و دیررس متفاوت بود. این ژن در ارقام زورس در مرحله حبه پرکنی بیان شد؛ درحالی که بیان این ژن در ارقام دیررس در مرحله رسیدگی اتفاق افتاده است. به نظر می رسد بیان STE20 در ارقام زودرس به دلیل تولید اتیلن و در ارقام دیررس به دلیل مواجه با تنش های محیطی باشد. ژن MYBA در رقم یاقوتی قرمز بیان متفاوتی در مقایسه با سایر ارقام این پژوهش و پژوهش های پیشین داشت. به نظر می رسد MYBA یکی از ژن های کاندید در زودرسی رقم یاقوتی قرمز باشد. به دلیل اثرگذاری MYBA در دوره های تنش به نظر می رسد علاوه بر رسیدگی، وجود تنشهای محیطی از دیگر دلایل بیان MYBA در رقم چشم گاوی باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Studying of STE20 & MYBA Genes Expression Related to Signal Transduction of Early-ripening in Yaghouti Grape of Sistan

نویسندگان [English]

  • sajjad noroozi 1
  • Abbasali Emamjomeh 2
  • Mahmood Solouki 3
  • Forouzan Heidari 3

1 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran

2 Department of Plant Breeding and Biotechnology/ Faculty of Agriculture/ University of Zabol/ Zabol/ Iran

3 Department of Plant Breeding and Biotechnology, University of Zabol, Zabol, Iran

چکیده [English]

Yaghouti grape of Sistan is an important fruit in Iran. Therefore, it is necessary some studies to evaluate different aspects related to early ripening in grape. This fruit can be harvested since first week of June. In this study, the genes related to signal transduction in early ripening were investigated, firstly; then two genes, MYBA and STE20, and GAPDH (as reference genes) were selected to more study. The expression of these genes were evaluated in different phenological growth stages and different early and late ripening genotypes of Sistan grape. The results indicated that expression of STE20 has been up-regulated highly in late-ripened genotypes (Fakhri and Cheshm-Gavi) during ripening stage. Also, there was significant difference between ripening and berry filling phenological growth stages as expression of STE20. On the other hand, this gene was down-regulated in early ripened Red-Yaghouti and White-Yaghouti genotypes. Also, the results indicated that expression of MYBA has up-regulated in early ripened Red-Yaghouti genotype of berry filling stage, while the expression of this gene was increased significantly in the late-ripened Chesm-Gavi genotype of ripening stage.

کلیدواژه‌ها [English]

  • RNA
  • vitis vinifera
  • Early Ripening
  • Signaling Pathway
  • Polymerase Chain Reaction in Real Time

بررسی بیان ژن های STE20 و MYBA مرتبط با انتقال سیگنال در زودرسی انگور یاقوتی سیستان

سجاد نوروزی، عباسعلی امام­جمعه*، محمود سلوکی و فروزان حیدری

ایران، زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 12/12/97              تاریخ پذیرش: 4/6/98

چکیده

انگور یاقوتی یک میوه مهم در ایران است. انگور یاقوتی سیستان بدلیل زودرسی و فرار از تنش­های محیطی منطقه از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت می­باشد. این رقم زودرس ترین انگور کشور بوده و هفته اول خرداد قابل برداشت است. بنابراین بررسی عوامل زودرسی این انگور اهمیت ویژه­ای دارد. در این پژوهش ابتدا ژن های مرتبط با انتقال سیگنال در فرآیند رسیدگی انگور مورد بررسی قرار گرفتند. سپس دو ژنSTE20 و MYBA مربوط به رسیدگی و ژن GAPDH بعنوان ژن رفرنس انتخاب شد. تفاوت بیانMYBA  در یاقوتی قرمز با تحقیقات پیشین بودکه از نتایج جالب توجه این تحقیق بشمار می­رود. بیان  STE20در ارقام زودرس و دیررس متفاوت بود. این ژن در ارقام زورس در مرحله حبه پرکنی بیان شد؛ درحالی که بیان این ژن در ارقام دیررس در مرحله رسیدگی اتفاق افتاده است. بنظر می­رسد بیان STE20  در ارقام زودرس بدلیل تولید اتیلن و در ارقام دیررس بدلیل مواجه با تنش­های محیطی باشد. ژن MYBA در رقم یاقوتی قرمز بیان متفاوتی در مقایسه با سایر ارقام این پژوهش و پژوهش­های پیشین داشت. بنظر می­رسد MYBA یکی از ژن های کاندید در زودرسی رقم یاقوتی قرمز باشد. بدلیل اثرگذاری MYBA در دوره­های تنش بنظر می­رسد علاوه بر رسیدگی، وجود تنش­های محیطی از دیگر دلایل بیان MYBA در رقم چشم گاوی باشد.

واژگان کلیدی: آر ان آ، انگور ، زودرسی، مسیر سیگنالی، واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی

* نویسنده مسئول، تلفن: 05431232162 ، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

ﺍﻧﮕﻮﺭ ﻳﻜﻲ ﺍﺯ ﻣﺤﺼﻮﻻﺕ ﺑﺎﻏﻲ ﻣﻬﻢ ﺩﺭ ﺍﻳﺮﺍﻥ ﻭ ﺩﻧﻴﺎ ﺑﻪ ﺷﻤﺎﺭ می‌آید. اﯾﺮان از ﻟﺤﺎظ ﺗﻮﻟﯿﺪ اﻧﮕـﻮر در ﻣﺮﺗﺒـﻪ ﻫﻔﺘﻢ قرار دارد. در حال حاضر انگور وسیع‌ترین دامنه گسترش در بین درختان خزان‌دار دنیا را دارد (1). ﺑﺮﺍﺑﺮ ﺁﻣﺎﺭ ﺳﺎﺯﻣﺎﻥ ﻛﺸﺎﻭﺭﺯﻱ ﺍﺳﺘﺎﻥ سیستان و بلوچستان ﺳﻄﺢ ﺯﻳﺮ ﻛﺸﺖ ﺍﻧﮕﻮﺭ ﺍﺳﺘﺎﻥ 5/3037 ﻫﻜﺘﺎﺭ ﺑﻮﺩﻩ ﻛﻪ یک درصد ﺣﺪﻭﺩ ﺳﻄﺢ ﺯﻳﺮ ﻛﺸﺖ ﺍﻧﮕﻮﺭﻛﺎﺭﻱ ﻛﺸﻮﺭ ﺭﺍ ﺑﻪ ﺧﻮﺩ ﺍﺧﺘﺼﺎﺹ ﺩﺍﺩﻩ ﺍﺳﺖ. حدود 70 درصد باغات انگور سیستان شامل رقم یاقوتی و بقیه از ارقام فخری، لعل، بی­دانه، چشم گاوی و سنگی می‌شود. ﺳﺎﺑﻘﺔ ﻛﺸﺖ ﺍﻧﮕﻮﺭ ﺩﺭ ﺍﻳﻦ ﻣﻨﻄﻘﻪ ﺑﻪ ﺣﺪﻭﺩ ٥٠ ﺳﺎﻝ می‌رسد. ﺩﺭ ﻃﻲ ﺍﻳﻦ سال‌ها ﻛﺸﺎﻭﺭﺯﺍﻥ ﺍﻗﺪﺍﻡ ﺑﻪ ﻛﺸﺖ ﺍﺭﻗﺎﻡ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺁﻥ نموده‌اند ﻛﻪ ﺩﺭ ﺑﻴﺴﺖ ﺳﺎﻝ ﺍﺧﻴﺮ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺍﻧﮕﻮﺭ بخصوص ﺍﻧﮕﻮﺭ ﻳﺎﻗﻮﺗﻲ رشد ﭼﺸﻤﮕﻴﺮﻱ ﺩﺍﺷﺘﻪ بطوریکه ﺩﺭ ﺣﺎﻝ ﺣﺎﺿﺮ ﻋﻤﺪﺓ ﺳﻄﺢ ﺯﻳﺮ ﻛﺸﺖ ﺍﻳﻦ ﻣﺤﺼﻮﻝ ﺭﺍ ﺑﻪ ﺧﻮﺩ ﺍﺧﺘﺼﺎﺹ ﺩﺍﺩﻩ ﻭ ﺍﺯ ﻋﻮﺍﻣﻞ ﻣﻬﻢ ﺗﻮﺳﻌﺔ ﺍﻳﻦ ﺭﻗﻢ، ﺯﻭﺩﺭﺳﻲ ﻭ ﻗﻴﻤﺖ ﺧﻮﺏ ﺁﻥ ﺩﺭ ﺑﺎﺯﺍﺭ ﻣﺼﺮﻑ می‌باشد (23). انگور یاقوتی قرمز متعلق به گروه انگورهای بی‌دانه است که به بیماری‌ها و شرایط رشد در آب ‌و هوای سیستان (بادهای گرم و خاک شور) مقاوم است (4). این رقم زود­رس­ترین انگور کشور بوده و حدود هفته اول خرداد قابل‌برداشت می‌باشد (1). پس از لحاظ اقتصادی برای مردم سیستان حائز اهمیت است. خوشه‌های این انگور فشرده و دارای حبه‌های کوچک است (19) (4). در تعریف کلاسیک رسیدن میوه به دو صورت کلیماکتریک (climateric) و غیر کلیماکتریک (Non-climateric) تعریف شده است. میوه کلیماکتریک افزایش ناگهانی تنفس را در شروع رسیدن نشان می‌دهد که معمولاً با افزایش هورمون گازی اتیلن همراه است. در میوه غیر کلیماکتریک تنفس در طول رسیدن افزایش نمی‌یابد و اغلب برای تکمیل بلوغ نیاز به اتیلن ندارد (18). انگور (Vitis vinifera L. ) یک میوه غیر کلیماکتریک می­باشد که بعنوان یک میوه رسمی، کشمش خشکیده، برای وینیفیکاسیون (Vionification) و عصاره­گیری استفاده می‌شود. رشد انگور از یک منحنی سیگموئیدی دو­گانه (Double sigmoid curve) پیروی می­کند. ‌طوریکه در مرحله اول اندازه حبه افزایشی سریع دارد. مرحله دوم فاز تأخیری (Lag phase) و مرحله سوم افزایش سریع دیگری در اندازه است، که همراه با تجمع قند­ها، کاهش میزان اسید، رنگ­پذیری و رسیدن حبه­ها می­باشد. گسترش سلول­های پری­کارپ در فاز رسیدگی که دومین مرحله از منحنی رشدی انگور است رخ می­دهد. در فاز رسیدگی انگور تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مختلفی رخ می­دهد. در شروع فاز رسیدگی یا وراسیون (Veraison) افزایش تجمع قند، نرم شدن بافت حبه، ساخت آنتوسیانین، متابولیسم اسید­های آلی، تجمع ترکیبات عطر و طعم رخ می­دهد ( 11).

انتقال سیگنال (Signal transdution) فرآیندی است که طی آن یک سیگنال فیزیکی یا شیمیایی در سلول بوسیله یک سری وقایع مولکولی انتقال داده می‌شود. آبشار سیگنال یک زنجیره از وقایع بیوشیمیایی در امتداد یک مسیر سیگنال­دهی است. هنگامی مسیرهای سیگنال دهی با یکدیگر ارتباط برقرار می‌کنند، شبکه‌هایی را ایجاد می‌کنند که اغلب بوسیله وقایع سیگنال دهی ترکیبی پاسخ سلولی ایجاد می‌کنند (31). در سطح سلول مولکولی چنین پاسخ‌هایی شامل تغییر در رونویسی یا ترجمه ژن‌ها، تغییرات پس از ترجمه و سازگاری پروتئین‌ها و همچنین تغییر در موقعیت آن‌ها است. این وقایع مولکولی مکانیسم اساسی کنترل رشد سلول، تکثیر، متابولیسم و بسیاری از فرآیندهای دیگر است (26). بیوسنتز آنتوسیانین در گیاهانی مانند اطلسی و ذرت توسط عوامل رونویسی  MYC و MYB کنترل می‌شود. درواقع یک عامل رونویسی این خانواده یعنی MYBA برای تنظیم بیان UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase (UFGT) بسیار ضروری است(45). والکر و همکاران (2007) نشان دادند که دو ایزوفرم از MYBA یعنی MYBA1 و MYBA2 در تجمع آنتوسیانین در انگور نقش دارند (42). آنتوسیانین­ها از گروه فنیل پروپانئید­ها هستند. ژن‌های کنترل‌کننده فنیل پروپانوئید­ها عمدتاً با تغییر در رونویسی تنظیم می‌شوند(9). در تمام گونه‌های مورد مطالعه تا به امروز این تنظیمات از طریق مجموعه‌ای شامل MYB transcription factors،transcription factors basic helix-loop-helix (bHLH) و WD-repeat proteins انجام می­شود. این کمپلکسMYB-bHLH-WD40 ‘MBW’ نامیده می‌شود (5). اعضای تشکیل‌دهنده مجموعه MYB اغلب بعنوان عامل تعیین‌کننده‌ای در تغییرات رنگ‌دانه آنتوسیانین شناخته می‌شوند (5، 9). فاکتور رونویسی MYB  یکی از بزرگ‌ترین خانواده‌های ژنی از دسته فاکتورهای رونویسی در گیاهان است. تنها در آرابیدوپسیس 126 نوع از ژن R2R3 MYB شناخته شده است (40). آن دسته از توالی‌هایی که اثر تنظیمی مثبت در مسیر سنتز رنگ‌دانه آنتوسیانین دارند از زیرمجموعه‌های ژن PAP1  (AtMYB75, At1g56650) هستند (7).

ژن STE20 یکی از مجموعه ژن‌هایی است که گروه بزرگی از پروتئین کینازها را کد می‌کند. در گیاهان فسفریلاسیون پروتئین در پاسخ به بسیاری از سیگنال‌ها از جمله نور، حمله پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، تنش دما، و محرومیت از مواد غذایی انجام می‌شود. ژن STE20 در تنظیم گروهی از کینازها بنام پروتئین کیناز فعال­شده با میتوژن (mitogen-activated protein kinase (MAPK)) (MAPK) نقش دارد. این کینازها در پاسخ به محرک‌های خارجی اثراتی مانند رشد سلولی، توقف چرخه سلولی، آپوپتوسیس و تغییرات سیتو­اسکلتی دارند (21). MAPK ها دارای اجزای فعالی هستند که در مسیر انتقال سیگنال مؤثر بوده و نقش مهمی در رشد و نمو دارند. اگرچه اعضای این خانواده در تعدادی از گیاهان شناخته شده‌اند، اما اطلاعات کمی در مورد نقش آن‌ها در میوه‌ها در دسترس است. مطالعات انجام‌شده روی میوه موز توسط حسن اسیف و همکاران نشان می‌دهد که وجود MAPK در مسیر سیگنال­دهی اتیلن در طی رسیدن میوه موز ضروری است (6). نتایج تحقیقات Ouaked و همکاران (2003) نشان‌دهنده این موضوع است که MAPK  ها در تنظیم سیگنال­دهی اتیلن در گیاه و درنتیجه رسیدگی نقش دارند (30).

رقم یاقوتی سیستان زودرس­ ترین انگور کشور بوده و هفته اول خرداد قابل برداشت است. بنابراین بررسی عوامل زودرسی این انگور اهمیت ویژه­ای دارد. در این پژوهش ابتدا ژن‌های انتقال سیگنال موثر در رسیدگی انگور مورد بررسی قرار گرفتند،  مراحل فیزیولوژیکی مختلف و در نمونه‌های برگی ارقام زودرس (یاقوتی قرمز و سفید) و دیررس (فخری و چشم گاوی) انگور منطقه سیستان بررسی شد. رقم یاقوتی سیستان زودرس­ ترین انگور کشور بوده و هفته اول خرداد قابل برداشت است. بنابراین بررسی عوامل زودرسی این انگور اهمیت ویژه­ای دارد.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی: در این تحقیق، از بوته‌های انگور موجود در مرکز تحقیقات کشاورزی زهک استفاده شد. انتخاب نمونه از برگ، براساس تجربیات پیشین انجام شد (8) (14) (43) (44). نمونه برداری از برگ پنج رقم شامل: ارقام زودرس یاقوتی قرمز و سفید، رقم متوسط رس سنگی و ارقام دیررس فخری و چشم‌گاوی در دو مرحله نموی، حبه پرکنی و رسیدگی انجام شد. در هر مرحله نمونه‌های برگی در 3 تکرار بیولوژیکی و از گره‌های مختلف روی شاخه‌های انگور جمع‌آوری شد.

استخراج RNA و تعیین کیفیت و کمیت:  RNAبرای بررسی بیان ژن نیاز به استخراج RNA از نمونه‌های گیاهی داریم. استخراج Total RNA از نمونه‌های برگی گیاهان نامبرده با استفاده از کیت خریداری شده از شرکت دنا زیست آسیا و با اسفاده از روش پیشنهادی این شرکت انجام گردید. بمنظور تعیین کیفیت RNA استخراج‌شده از روش الکتروفورز ژل آگارز بر اساس روش سامبروک و همکاران (1989) انجام شد(شکل 1) (34). نسبت جذب Total RNA استخراج‌شده در طول موج 260 به 280 نانومتر برای نمونه‌های مورد بررسی، حداقل و حداکثر برابر با 81/1 - 97/1 توسط اسپکتروفتومتری رویت گردید. برای محاسبه غلظت RNA استخراج شده برحسب نانوگرم بر میکرولیتر از حاصلضرب میزان جذب نور در طول موج 260 نانومتر در عدد 50 استفاده گردید.

 

شکل 1- RNA استخراج شده: 1- Ladder 2-یاقوتی قرمز 3-یاقوتی سفید 4-چشم گاوی 5-فخری 6-سنگی

طراحی آغازگرها: با مراجعه به پایگاه داده‌های NCBI توالی نوکلئوتیدی ژن‌های مورد نظر جستجو شد. پس از جستجوی توالی نوکلئوتیدی ژن‌های مذکور، با استفاده از نرم‌افزار primer3 (26) و در نظر گرفتن خصوصیات مطلوب برای استفاده در روش qRT-PCR آغازگرها طراحی گردیدند (جدول 1). بمنظور سنتز آغازگرها، توالی‌ها به شرکت دنازیست آسیا فرستاده شدند.

 

جدول 1-  اطلاعات توالی آغازگرهای پیشرو و پسرو

نام ژن

نوع

توالی آغازگر

درصدGC

دمای اتصال(c°)

MYBA

پیشرو

GAGCAGGGTTGAATAGAT

89/38

3/49

 

پسرو

ATCAAGGACCATCTGTTC

0/30

2/50

STE20

پیشرو

GGTGTATGCCAATGTATA

56/55

1/56

 

پسرو

TATGAGTCTCCACTGTAA

44/44

6/51

GAPDH

پیشرو

TCAAGGAGGAGTCAGAGG

56/55

1/56

 

پسرو

AAGATGCTGGACCTGTTG

0/50

9/53

 


تهیه و آماده سازیcDNA جهت انجام Real Time PCR:  تهیه cDNA با استفاده از کیت خریداری شده از شرکت REXu کشور کره جنوبی و طبق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده انجام شد. در زمان اجرای آزمایش‌ها بمنظور جلوگیری از بروز خطا و نیز برای راحتی و سرعت عمل بیشتر، محلول پایه برای هر جفت آغازگر بصورت مجزا مطابق با جدول 2 تهیه شد. با توجه به این که حجم کلی مخلوط برای واکنش برای یک نمونه 20 میکرولیتر بود، میزان cDNA برای هر نمونه یک میکرولیتر و محلول پایه آغازگر 19 در نظر گرفته شد. سپس تیوب‌ها در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفتند. برنامه چرخه دمایی دستگاه مطابق با جدول 3 برنامه‌ریزی شد.

 

جدول2- مواد موردنیاز برای Real Time PCR

مقدار ( 15خ¼"> l)

غلظت پایه

مواد مورد نیاز

4

5X

Eva Green qPCR Mix-Rox

5/0

10  Pmol/𝞵l

آغازگر رفت

5/0

10 Pmol/𝞵l

آغازگر برگشت

1

-

cDNA

14

-

آب مقطر دوبار استریل

20

 

حجم نهایی

 

جدول 3- برنامه دستگاه Real Time PCR

دما و زمان مورد استفاده

مرحله

95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه

فعال سازی ابتدایی آنزیم

95درجه سانتی‌گراد به مدت 92 ثانیه

واسرشت شدن

5/57درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه

اتصال آغازگرها

72 درجه سانتی‌گراد به مدت 92 ثانیه

بسط ترکیبی

افزایش دما از 33 درجه تا 52 درجه هر 5 ثانیه 1درجه

منحنی ذوب

 


تجزیه و تحلیل داده‌های بیان ژن: تجزیه و تحلیل نتایج با شروع واکنش منحنی تکثیر رسم شده توسط دستگاه آغاز گردید. برای تجزیه داده‌‌ها از روش ∆Ct استفاده شد(28). دراین روش بین مقادیر Ct  مربوط به ژن کنترل داخلی و ژن مورد نظر تفاوت وجود دارد. بنابراین این تفاوت را در مقادیر Ctمربوط به ژن مورد نظر و ژن کنترل، اعمال کردیم و داده‌ها که مقادیر  Ctهستند را نرمال نمودیم. برای نرمال کردن داده ها Ct ژن مورد بررسی را در تک تک نمونه ها از Ct ژن کنترل داخلی همان نمونه کسر کردیم. از آن‌جایی که داده‌های نرمال برای هر نمونه از تفریق Ct ژن مورد نظر از Ct ژن کنترل داخلی بدست آمده است، داده نرمال شده را دلتا Ct (∆Ct) می نامیم.

(ژن کنترل داخلی) Ct - (ژن مورد نظر)∆Ct=Ct

∆Ct از نوع لگاریتمی برپایه ۲ می باشد (زیرا در real time هر سیکل محصول ما ۲ برابر می شود). بنابراین باید مقادیر  ∆Ct را بجای تقسیم کردن از هم تفریق نمود. پارامتر جدید را که از تفریق ∆Ct نمونه مورد نظر از ∆Ct نمونه شاهد به دست آمده است دلتا دلتا Ct (∆∆Ct) می نامیم.

∆∆Ct= ∆Ct (نمونه مورد نظر) - ∆Ct (نمونه شاهد)

Ct، ∆Ct  و ∆∆Ct بر اساس لگاریتم بر پایه ۲ هستند بنابراین آن‌ها را بحالت خطی درآوردیم، پس ^(-∆∆Ct)  2بیانگر سطح بیان نسبی ژن بود.

The Relative gene expression (RGE) = 2^(-∆∆Ct)

در پایان تجزیه واریانس داده‌‌های بدست آمده نرم افزار SAS نسخه4/9 انجام شد. مقایسه میانگین داده‌‌ها نیز به روش دانکن در سطح احتمال 1 درصد و 5 درصد انجام ‌‌گرفت.

نتایج و بحث

بیان MYBA در انگور: طبق نتایج حاصل از تجزیه واریانس برای ژن MYBA (جدول 4) اثرات ساده ارقام مختلف انگور و سطوح متفاوت مراحل نموی و اثرات متقابل، تفاوت معنی‌داری را در سطح احتمال یک درصد از خود نشان دادند. ارقام یاقوتی قرمز در مرحله حبه­پرکنی و چشم­گاوی در مرحله رسیدگی بیان بالایی از ژن MYBA داشتند (شکل2). در مطالعه‌ای کاستنتینی و همکاران (2017) روی رونویسی انگور موسکاتو بیانکو (Moscato Bianco) انجام شد، بیان ژن‌های انگور در 5 مرحله از مراحل نموی انگور در دو سال 2006 و 2016 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که ژن MYB در مراحل پس از وراسیون یعنی رسیدگی بیان بالایی داشته و بیان آن پس از تغییر رنگ تا رسیدگی کامل سیر صعودی داشته است. در مرحله حبه پرکنی اما ژن MYB در انگور موسکاتوبیانکو شدت بیان پایینی داشت (12). تحقیقات رومرو و همکارانش (2013) روی سه رقم از انگور کشور پرتغال بنام‌های ترینکادیرا (Trincadeira)، آراگونس (Aragoneˆs) و تریگه نشنال (Touriga Nacional) نشان می‌دهد که بیان ژن MYBA در دو مرحله وراسیون و رسیدگی کامل بالا بوده، ولی در مرحله حبه پرکنی بیان این ژن پایین بوده است (2). بررسی رونویسی انگور ترینکادیرا در مراحل مختلف رسیدگی توسط فرتس و همکاران (2011) نیز بر این موضوع تأکید دارد که بیان MYB در مراحل وراسیون به بعد بالا و پیش از وراسیون کم بوده است (16). مطالعه شان­گوان و همکارانش (2017) روی انگور فوجی­مینوری (Fujiminori) که یکی ارقام معروف چین است، در سه مرحله حبه پرکنی، وراسیون و رسیدگی انجام شده است. نتایج این مطالعه بیانگر بیان شدید MYBA در مرحله وراسیون و رسیدگی است، درحالی‌که این ژن در مرحله حبه پرکنی بسختی بیان‌شده است (36).

MYBA در انگور یاقوتی قرمز در مرحله حبه پرکنی بیان بالایی از خود نشان داد درحالی‌که بیان این ژن در مرحله رسیدگی سرکوب شده است. همان‌طور که در (شکل 2) ملاحظه می‌کنید نتایج ما در مورد انگور یاقوتی با انگورهای موسکاتوبیانکو، ترینکادیرا، آراگونس، تریگه نشنال، فوجی­مینوری و چشم‌گاوی متفاوت است. درواقع بیان MYB در یاقوتی قرمز زودتر شروع شده و زودتر پایان می‌یابد. با توجه به زودرس بودن یاقوتی قرمز و بیان متفاوت آن با سایر انگورها احتمال این مسئله وجود دارد که MYB در زودرسی یاقوتی قرمز دخیل باشد.

MYBA از طریق بیان UFGT در تنظیم آنتوسیانین نقش دارد (25). آنتوسیانین­ها ازجمله رنگ‌دانه‌های گیاهی هستند که موجب تشکیل رنگ‌های قرمز، بنفش و سیاه در میوه و سایر اندام‌های گیاهی می‌شوند (24). آنتوسیانین­ها در برابر اشعه ماوراءبنفش نقش محافظت از گیاه را بر عهده ‌دارند (20). ژن‌های خانواده MYB در تنظیم فرایندهایی از قبیل نمو، متابولیسم و پاسخ به تنش‌های محیطی ایفای نقش می‌کنند. این ژن‌ها نقش حیاتی در پاسخ به تنش‌های محیطی مختلف از طریق اثرگذاری بر رونویسی، سطوح پسا­رونویسی و کنترل پروتئین و همچنین تنظیم سیگنال‌های پایین‌دست مرتبط با تنش­های محیطی دارند (27). همچنین دانشمندان دریافتند که در ارقام انگور Kyoho، ژن های VvmybA1، VvmybA2 و VvmybA3 بیان می شوند که در این میان در ارقام سیاه رنگ، این ژن‌ها از بیان بیشتری نسبت به سایر ارقام برخوردار بودند (15). علاوه بر این، تجمع آنتوسیانین با بیان ژن MYBA همبستگی داشت (32).

 

جدول 4 - تجزیه واریانس برای ژن‌ MYBA

میانگین مربعات

مجموع مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

**300/28

901/84

3

رقم (A)

061/0

494/0

8

خطای رقم ( 15Ea"> )

**080/26

080/26

1

مراحل نموی (B)

**487/37

461/112

3

مرحله نموی × رقم (A×B)

055/0

110/0

2

تکرار × مرحله نموی

062/0

376/0

6

تکرار × مرحله نموی  × رقم

 

425/224

23

کل

 

 

213/16

ضریب تغییرات

** تفاوت معنی داری در سطح احتمال 1 درصد می‌باشد.

 

همان‌طور که در (شکل 2) مشاهده شد، بیان MYB در انگور چشم‌گاوی مرحله رسیدگی بشدت بالا بوده و در مرحله حبه پرکنی بیان نشده است. در مورد چشم‌گاوی نتایج ما با نتایج تحقیقات پیشین روی انگورهای مختلف مطابقت داشت. MYB در چشم‌گاوی بیشترین بیان را در بین ارقام بررسی شده داشت. با توجه به رنگ قرمز رقم چشم‌گاوی و رسیدن آن در شرایط تنش‌های محیطی تابستان سیستان این شدت بیان قابل توجیه است. همان‌طور که قبلاً ذکر شد MYB در مقابله با تنش‌های محیطی، اشعه ماوراءبنفش و سنتز آنتوسیانین نقش دارد. در مورد یاقوتی سفید و فخری با توجه به رنگ سفید حبه‌ها و عدم وجود آنتوسیانین در آن‌ها بیان نشدن MYB در این ارقام قابل پیش‌بینی بود.

بیان STE20 در انگور: طبق نتایج حاصل از تجزیه واریانس برای ژن STE20 (جدول 5) اثرات ساده ارقام مختلف انگور و اثر متقابل ارقام در مراحل مختلف، تفاوت معنی‌داری را در سطح احتمال یک درصد از خود نشان دادند، اما در سطوح مراحل نموی تفاوت معنی داری مشاهده نشد. STE20 در ارقام زودرس (یاقوتی قرمز و یاقوتی سفید) در مرحله حبه پرکنی و در ارقام دیررس (فخری و چشم­گاوی) در مرحله رسیدگی بیان بالایی داشت (شکل 3). ژن  STE20 از طریق MAPK در سیگنال دهی مسیر اتیلن نقش دارد. اتیلن از هورمون‌های مهم در رسیدگی می‌باشد. تحقیقات انجام شده روی موز نیز بیانگر این موضوع است (6، 29). انگور، یک میوه غیر‌کلیماکتریک، به اتیلن بسیار حساس نیست؛ بااین‌حال، معمولاً اتیلن برای رسیدن میوه ضروری است (41). افزایش اتیلن در فرآیند رسیدن در ارقام کلیماکتریک، پس از سوختن CO2 اتفاق می‌افتد (17). در گوجه‌فرنگی، درزمانی که میوه‌ها سبز هستند این اتفاق می‌افتد. در این مرحله، میوه‌های گوجه‌فرنگی به اتیلن حساس می‌شوند و با تولید اتیلن شروع به رسیدگی می‌کنند (13). در میوه‌های غیرکلیماکتریک، هیچ انسداد تنفسی برای CO2 وجود ندارد و بنظر می‌رسد در فرآیند رسیدگی مصرف اتیلن مهم نباشد (17). بااین‌حال، اخیراً مشخص شده است که برخی از میوه‌های غیرکلیماکتریک مانند توت‌فرنگی (29)، فلفل قرمز (3) و انگور (10) مقدار کمی هورمون اتیلن تولید می‌کنند و بنظر می‌رسد در مراحل مشخصی به اتیلن پاسخ داده باشند. در مطالعه انگور، این هورمون دقیقاً قبل از شروع veraison مشاهده شد، و پس‌ از آن کاهش غلظت اتیلن برای چند هفته پس ‌از آن مشاهده شد (13). تحقیقات شان گوان و همکاران روی انگور فوجی مینوری نشان‌دهنده بیان بالای STE20 در مرحله حبه پرکنی است، اما بیان این ژن در مرحله رسیدگی کاهش‌یافته است (37). نتایج ما در مورد دو رقم یاقوتی سفید و یاقوتی قرمز نیز با نتایج شان گوان مطابقت دارد. بنظر می رسد بیان بالای STE20 در مرحله حبه پرکنی و یا پیش وراسیون بدلیل اثر آن در سنتز اتیلن است و برای رسیدگی انگور مهم است.

 

 

شکل2-میزان بیان نسبی ژن MYBA در دو مرحله نموی حبه پرکنی و رسیدگی کامل

جدول 5 - تجزیه واریانس برای ژن STE20

میانگین مربعات

مجموع مربعات

درجه آزادی

منابع تغییرات

**780/38

341/116

3

رقم (A)

409/0

274/3

8

خطای رقم ( 15EA"> )

042/0

042/0

1

مراحل نموی (B)

**845/140

535/442

3

مرحله نموی × رقم (A×B)

527/0

054/1

2

تکرار × مرحله نموی

375/0

144/2

6

تکرار × مرحله نموی × رقم

 

393/545

23

کل

 

 

106/15

ضریب تغییرات

** تفاوت معنی داری در سطح احتمال 1 درصد می‌باشد

 

پروتئین کیناز­ها در فسفریلاسیون پروتئین­ها نقش دارند. در گیاهان فسفریلاسیون پروتئین در پاسخ به بسیاری از سیگنال‌ها ازجمله نور، حمله پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، تنش دما، و محرومیت از مواد غذایی انجام می‌شود (39). ژن STE20 از طریق تنظیم گروهی از پروتئین کینازها بنام MAPK به تنش‌های زیستی و غیر زیستی پاسخ می‌دهد (38، 33). نتایج تحقیقات فرتس و همکاران (2011) روی انگور ترینکادیرا نشان می‌دهد که ژن STE20 در مرحله حبه پرکنی بیان پایینی داشته و بیان این ژن در مرحله رسیدگی بالا بوده است (15). نتایج ما در مورد دو رقم دیر­رس فخری و چشم‌گاوی با نتایج فرتس و همکارن (2011) تشابه داشت. در مورد ژن STE20 ارقام دیررس در مرحله رسیدگی بیان بالایی داشتند. این موضوع در ارقام زودرس با ارقام دیررس متفاوت است، بطوری‌که در مرحله حبه پرکنی بیان بالایی در ارقام زودرس مشاهده شد و در مرحله رسیدگی بیان STE20 کاهش یافته است. با توجه به اثرگذاری پروتئین کینازها در شرایط تنش، بنظر می‌رسد بیان STE20 بیشتر بدلیل وجود تنش‌های تابستان سیستان باشد. هرچند همان‌طور که قبلاً اشاره کردیم، این ژن بدلیل دخالت در بیوسنتز اتیلن در رسیدگی انگور هم مؤثر است.

 

 

شکل 3- میزان بیان نسبی ژن‌‌ STE20 ­در دو مرحله نموی حبه پرکنی و رسیدگی کامل


نتیجه­گیری کلی

در این پژوهش ابتدا ژن‌های انتقال سیگنال موثر در رسیدگی انگور مورد بررسی قرار گرفتند، سپس دو ژن MYBA و STE20 مربوط به رسیدگی و ژن GAPDH بعنوان ژن رفرنس انتخاب شد و بیان این ژن‌ها در مراحل فیزیولوژیکی مختلف و در نمونه‌های برگی ارقام زودرس (یاقوتی قرمز و سفید) و دیررس (فخری و چشم گاوی) انگور منطقه سیستان بررسی شد. نتایج حاصل از تجزیه واریانس اثر متقابل ارقام در مراحل مختلف رسیدگی انگور در هر دو ژن MYBA و STE20 معنی دار بود. ژن MYBA در دو رقم یاقوتی قرمز و چشم­گاوی بیان بالایی داشت. در رقم یاقوتی قرمز بیان این ژن در مرحله حبه پرکنی و در چشم گاوی مربوط به مرحله رسیدگی است. بیان MYBA در انگور چشم گاوی با مطالعات پیشین انجام شده روی سایر ارقام انگور مطابقت داشت. بدلیل اثرگذاری MYBA در دوره­های تنش بنظر می­رسد علاوه بر رسیدگی، وجود تنش­های محیطی از دیگر دلایل بیان MYBA در رقم چشم گاوی باشد.موضوع دیگر تفاوت بیانMYBA  در یاقوتی قرمز با تحقیقات پیشین بودکه از نتایج جالب توجه این تحقیق بشمار می­رود. بیان  STE20در ارقام زود رس و دیررس متفاوت بود.این ژن در ارقام زورس در مرحله حبه پرکنی بیان شده، درحالی که بیان این ژن در ارقام دیررس در مرحله رسیدگی اتفاق افتاده است. بنظر می­رسد بیان STE20  در ارقام زودرس بدلیل تولید اتیلن و در ارقام دیررس بدلیل مواجه با تنش­های محیطی باشد.

با توجه به این که دو ژن مهم مربوط به انتقال سیگنال در انگور در این پژوهش بررسی شدند پیشنهاد می­شود سایر ژن‌های مربوط به مسیرهای انتقال سیگنال مورد مطالعه قرار گیرد و با ژن‌های مطالعه شده در این مقاله مقایسه شده و نتایج کامل تری حاصل شود. بررسی برهم کنش های موجود در سطح ژن، پروتئین و متابولوم می تواند اطلاعات بسیار مفیدی را در این زمینه فراهم آورد که راهگشای به نژادی این گیاه در آینده خواهد بود(22و 35).

سپاسگزاری

این پژوهش با استفاده از گرانت معاونت پژوهشی دانشگاه زابل با شماره  UOZ-GR-9618-9 انجام شده است.

1- Afrooze, F., Torkamani, J., Najafi, B. and Moosavinik, S. 2009. Economic research on the production and marketing of Yaghouti grape in the Sistan region. Sixth Iranian Agriculture Economics Conference, karaj, Iranian Agricultural Economics Association, Agriculture Pardis.
2- Agudelo-Romero, P., Erban, A., Sousa, L., Pais, M.S., Kopka, J. and Fortes, A.M. 2013. Search for transcriptional and metabolic markers of grape pre-ripening and ripening and insights into specific aroma development in three Portuguese cultivars. PLoS One, 8(4): p.e60422.
3- Aizat, W.M., Able, J.A., Stangoulis, J.C., and Able, A.J. 2013. Proteomic analysis during capsicum ripening reveals differential expression of ACC oxidase isoform 4 and other candidates. Functional plant biology, 40: 1115-1128.
4- Allahdou, M., Nouri Sadegh, A. and Kouhkan, S. 2012. Breeding of Sistan Yaghouti Grape using Clonal Selection. Journal Biotechnol Biomaterial, 13: 2-6.
5- Allan, A. C., Hellens, R. P., and Laing, W. A. 2008. MYB transcription factors that colour our fruit. Trends in plant science, 13(3): 99-102.
6- Asif, M.H., Lakhwani, D., Pathak, S., Bhambhani, S., Bag, S.K. and Trivedi, P.K. 2014. Genome-wide identification and expression analysis of the mitogen-activated protein kinase gene family from banana suggest involvement of specific members in different stages of fruit ripening. Functional & integrative genomics, 14(1): pp.161-175.
7- Borevitz, J. O., Xia, Y., Blount, J., Dixon, R. A., and Lamb, C. 2000. Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis. The Plant Cell, 12(12): 2383-2393.
8- Boss, P. K., Davies, C. & Robinson, S. P. 1996. Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L. cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation. Plant Physiology, 111, 1059-1066.
9- Chagné, D., Gasic, K., Crowhurst, R.N., Han, Y., Bassett, H.C., Bowatte, D.R., Lawrence, T.J., Rikkerink, E.H., Gardiner, S.E. and Korban, S.S. 2008. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple. Genomics, 92(5): pp.353-358.
10- Chervin, C., El-Kereamy, A., Roustan, J.-P., Latché, A., Lamon, J., and Bouzayen, M. 2004. Ethylene seems required for the berry development and ripening in grape, a non-climacteric fruit. Plant Science, 167: 1301-1305.
11- Coombe, B. 1992. Research on development and ripening of the grape berry. American Journal of Enology and Viticulture 43: 101-110.
12- Costantini, L., Kappel, C.D., Trenti, M., Battilana, J., Emanuelli, F., Sordo, M., Moretto, M., Camps, C., Larcher, R., Delrot, S. and Grando, M.S. 2017. Drawing links from transcriptome to metabolites: the evolution of aroma in the ripening berry of Moscato Bianco (Vitis vinifera L.). Frontiers in plant science, 8: p.780-788.
13- Cramer, G.R., Ghan, R., Schlauch, K.A., Tillett, R.L., Heymann, H., Ferrarini, A., Delledonne, M., Zenoni, S., Fasoli, M., and Pezzotti, M. 2014. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC plant biology, 14: 370-376.
14- Degu, A., Hochberg, U., Wong, D. C., Alberti, G., Lazarovitch, N., Peterlunger, E., ... & Fait, A. 2019. Swift metabolite changes and leaf shedding are milestones in the acclimation process of grapevine under prolonged water stress. BMC plant biology, 19(1), 69-78.‏
15- Fan, X., Zhao, R., Wang, Q., Liu, C., & Fang, J. 2018. Anthocyanin Composition and  MybA-related Genotype in Kyoho Grape and Its Derivatives. HortScience, 53(12), 1766-1771.
16- Fortes, A.M., Agudelo-Romero, P., Silva, M.S., Ali, K., Sousa, L., Maltese, F., Choi, Y.H., Grimplet, J., Martinez-Zapater, J.M., Verpoorte, R. and Pais, M.S. 2011. Transcript and metabolite analysis in Trincadeira cultivar reveals novel information regarding the dynamics of grape ripening. BMC plant biology, 11(1):p.149-158.
17- Gapper, N.E., McQuinn, R.P., and Giovannoni, J.J. 2013. Molecular and genetic regulation of fruit ripening. Plant Molecular Biology, 82: 575-591.
18- Giovannoni, J.J. 2007. Fruit ripening mutants yield insights into ripening control. Current opinion in plant biology 10, 283-289.
19- Halimi, M., Moosavinik, S. and  Asgharipoor, M. 2013. Research of Energy Efficiency and Economic Indicators in Grape production Systems in Sistan. Master of Science Thesis, University of Zabol, p: 32
20- Holton, T.A. and Cornish, E.C. 1995. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. The Plant Cell, 7(7): 1071-79.
21- Johnston, A.M., Naselli, G., Gonez, L.J., Martin, R.M., Harrison, L.C. and DeAizpurua, H.J. 2000. SPAK, a STE20/SPS1-related kinase that activates the p38 pathway. Oncogene, 19(37): 4290-97.
22- Kalirad, A. 2018. Green systems biology: From genome, proteome and metablome to research in bioms and biotechnology. Iranian Journal of Biology (Biological Science Promotion), 1 (2): 35-41.
23- Karimkoshte, M., Rafiei, B. and Ashkani, A. 2002. efficiency Marketing of Grapes And ways to improve it in Sistan and Baluchestan. commercial Research journal, 23:139-164.
24- Kevin, M.D. 2004. Plant Pigments and Their Manipulation. Wiley-Blackwell. 6-12.
25- Kobayashi, S., Ishimaru, M., Hiraoka, K. and Honda, C. 2002. Myb-related genes of the Kyoho grape (Vitis labruscana) regulate anthocyanin biosynthesis. Planta, 215(6):924-933.
26- Koressaar, T. and Remm, M. 2007. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics, 23(10): 1289-1291.
27- Li, C., Ng, C.K.Y. and Fan, L.M. 2015. MYB transcription factors, active players in abiotic stress signaling. Environmental and Experimental Botany, 114:80-91.
28- Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method. methods, 25(4):402-408.
29- Merchante, C., Vallarino, J.G., Osorio, S., Aragüez, I., Villarreal, N., Ariza, M.T., Martínez, G.A., Medina-Escobar, N., Civello, M.P., and Fernie, A.R. 2013. Ethylene is involved in strawberry fruit ripening in an organ-specific manner. Journal of experimental botany, 64: 4421-4439.
30- Ouaked, F., Rozhon, W., Lecourieux, D. and Hirt, H. 2003. A MAPK pathway mediates ethylene signaling in plants. The EMBO Journal, 22(6):1282-1288.
31- Papin, J.A., Hunter, T., Palsson, B.O. and Subramaniam, S. 2005. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology, 6(2): 99-108.
32- Plunkett, B. J., Espley, R. V., Dare, A. P., Warren, B. A., Grierson, E. R., Cordiner, S., ... & Schwinn, K. E. 2018. MYBA From Blueberry (Vaccinium Section Cyanococcus) Is a Subgroup 6 Type R2R3MYB Transcription Factor That Activates Anthocyanin Production. Frontiers in plant science, 9-16.
33- Rao, K.P., Richa, T.A.M.B.I., Kumar, K.U.N.D.A.N., Raghuram, B.A.D.M.I. and Sinha, A.K. 2010. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family in rice. DNA research, 17(3):139-153.
34- Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual (Cold spring harbor laboratory press).
35- Sardari, M and Rezayof, A. 2019. The Role of Brain  Nervous Transferor Systems In Oblivion Induced by Stress. Iranian Journal of Biology (Biological Science Promotion), 2 (1&2): 81-92.
36- Schwinn, K., Venail, J., Shang, Y., Mackay, S., Alm, V., Butelli, E. and Martin, C. 2006. A small family of MYB-regulatory genes controls floral pigmentation intensity and patterning in the genus Antirrhinum. The Plant Cell, 18(4): 831-851.
37- Shangguan, L., Mu, Q., Fang, X., Zhang, K., Jia, H., Li, X., Bao, Y. and Fang, J. 2017. RNA-sequencing reveals biological networks during table grapevine (‘Fujiminori’) fruit development. PloS one, 12(1): 0170571-79.
38- Sinha, A.K., Jaggi, M., Raghuram, B. and Tuteja, N. 2011. Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress. Plant signaling & behavior, 6(2): 196-203.
39- Stone, J.M. and Walker, J.C. 1995. Plant protein kinase families and signal transduction. Plant Physiology, 108(2):451-457.
40- Stracke, R., Werber, M. and Weisshaar, B. 2001. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Current opinion in plant biology, 4(5): 447-456.
41- Tesniere, C., Pradal, M., El-Kereamy, A., Torregrosa, L., Chatelet, P., Roustan, J.-P., and Chervin, C. 2004. Involvement of ethylene signalling in a non-climacteric fruit: new elements regarding the regulation of ADH expression in grapevine. Journal of experimental botany, 55: 2235-2240.
42- Walker, A. R., Lee, E., Bogs, J., McDavid, D. A., Thomas, M. R., & Robinson, S. P. 2007. White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes. The Plant Journal, 49(5): 772-785.
43- Wu, Y., Fu, T., Wang, Z., Jiao, C., Yang, Z., Ali, B. & Zhou, W. 2015. Differential gene expression analysis of early-ripening mutants of grape (Vitis vinifera L.). Scientia Horticulturae, 194: 7-17.
44- Xu, Y., Gao, Z., Tao, J., Jiang, W., Zhang, S., Wang, Q. & Qu, S. 2016. Genome-Wide Detection of SNP and SV Variations to Reveal Early Ripening-Related Genes in Grape. PloS one, 11: e0147749-55.
45- Yakushiji, H., Kobayashi, S., Goto-Yamamoto, N., Jeong, S. T., Sueta, T., Mitani, N., and Azuma, A. 2006. A skin color mutation of grapevine, from black-skinned Pinot Noir to white-skinned Pinot Blanc, is caused by deletion of the functional VvmybA1 allele. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 70(6): 1506-1508.