بررسی تاثیر مشتقات 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون بر روی ساختار و عملکرد آنزیم کاتالاز

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی جانوری، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

2 مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

چکیده

کاتالاز، به عنوان یک آنزیم آنتی اکسیدان مهم، سلول‌ها را در مقابل اثرات مخرب پراکسید هیدروژن محافظت می‌کند. 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون یکی از مشتقات نفتوکوئینون‌هاست که دارای فعالیت‌های بیولوژیکی و دارویی گسترده از جمله اثرات ضد سرطانی و ضد باکتریایی می‌باشد. در این مطالعه، تاثیر مشتقات 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون ( ANQو BNQ) بر روی ساختار و عملکرد آنزیم کاتالاز کبد گاوی، به صورت تجربی و تئوری با استفاده از اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش، فلورسانس، طیف سنجی مادون قرمز و شبیه سازی مولکولی مطالعه شد. داده های سینتیکی و پارامترهای ترمودینامیکی نشان دادند که غلظت‌های افزایشی این ترکیبات به ترتیب از طریق مهار مخلوط و رقابتی باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز می‌شوند. نتایج مطالعات فلورسانس در حضور غلظت‌های مختلف ANQ و BNQ در دو دمای مختلف نشان داد که فلورسانس ذاتی آنزیم در حضور این ترکیبات با مکانیسم استاتیک خاموش می‌شود. مطالعات شبیه سازی مولکولی در تایید یافته های تئوری نشان داد که تنها یک جایگاه اتصال برای ترکیبات مورد نظر بر روی آنزیم کاتالاز وجود دارد. با توجه به اهمیت بیولوژیکی و نقش دوگانه‌ی آنزیم کاتالاز، مطالعه‌ی تاثیر ترکیبات مختلف بر روی فعالیت و ساختار آنزیم کاتالاز می تواند حائز اهمیت باشد. چرا که استفاده‌ی بیش از حد این ترکیبات در داروهای مختلف می تواند باعث ایجاد اثرات جانبی شده و تهدید کننده ی سلامت انسان باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of 2-hydroxy-1-4-naphthoquinone derivatives on the structure and activity of catalase

نویسندگان [English]

  • simin khataee 1
  • Gholamreza Dehghan 1
  • samaneh Rashtbari 1
  • Mehrdad Iranshahi 2

1 Department of Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran

2 Biotechnology Research Center, School of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

چکیده [English]

Catalase as an important antioxidative enzyme protects cells from the toxic effects of hydrogen peroxide. 2-hydroxy-1,4-naphtoquinone, as a naphthoquinone derivative, has been found to have a broad biological and pharmacological activities, including anti-cancer and anti-bacterial effects. In this study, the effect of two different derivatives of 2-hydroxy-1,4-naphtoquinone derivatives (BNQ and ANQ) on the structure and function of bovine liver catalase (BLC), was studied using different spectroscopic and computational methods such as UV-vis spectrometry, fluorescence and FTIR spectroscopy, and molecular docking studies. Kinetic studies and thermodynamic parameters showed that by adding gradual concentrations of BNQ and ANQ, catalase activity was significantly decreased through mixed and competitive inhibition mechanisms, respectively. The fluorescence spectroscopic results at different temperatures indicated that BNQ and ANQ can quench the intrinsic fluorescence emission of BLC through static quenching mechanism. Molecular docking data in agreement with experimental results, confirmed that there is only one binding site on the BLC structure for BNQ and ANQ. Study on effect of different compounds on the activity and structure of the catalase as a bilateral actions and principal biological enzyme could be important. Because excessive utilization of these compounds in various drugs can cause side effects and may threaten human health.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bovine liver catalase
  • naphtoquinone
  • mixed inhibition
  • competitive inhibition

بررسی تأثیر مشتقات 2-هیدروکسی 1و4- نفتوکوئینون بر روی ساختار و عملکرد آنزیم کاتالاز

سیمین خطایی1، غلامرضا دهقان1*، سمانه رشتبری1 و مهرداد ایرانشاهی2

1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی جانوری

2 ایران، مشهد، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده داروسازی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 07/02/1398          تاریخ پذیرش: 12/05/1398

چکیده

کاتالاز، به عنوان یک آنزیم آنتی اکسیدان مهم، سلولها را در مقابل اثرات مخرب پراکسید هیدروژن محافظت می­کند. 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون یکی از مشتقات نفتوکوئینون­هاست که دارای فعالیتهای بیولوژیکی و دارویی گسترده از جمله اثرات ضد سرطانی و ضد باکتریایی می­باشد. در این مطالعه، میانکنش مشتقات 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون ( ANQو BNQ) با آنزیم کاتالاز کبد گاوی، به صورت تجربی و تئوری مورد بررسی قرار گرفت و اثرات این ترکیبات در ساختار و عملکرد آنزیم کاتالاز با استفاده از اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش، فلورسانس، طیف سنجی مادون قرمز و شبیه سازی مولکولی مطالعه شد. داده­های سینتیکی و پارامترهای ترمودینامیکی نشان دادند که این ترکیبات از طریق مهار مخلوط و رقابتی باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز می­شوند. نتایج مطالعات فلورسانس آنزیم در حضور غلظتهای مختلف ترکیبات نشان داد که فلورسانس ذاتی آنزیم در حضور این ترکیبات با مکانیسم استاتیک خاموش می­شود. همچنین مطالعات شبیه سازی مولکولی در تأیید یافته­های تئوری نشان داد که تنها یک جایگاه اتصال برای ترکیبات مورد نظر بر روی آنزیم کاتالاز وجود دارد. با توجه به اهمیت بیولوژیکی و نقش دوگانه آنزیم کاتالاز، مطالعه تأثیر ترکیبات مختلف بر روی فعالیت و ساختار آنزیم کاتالاز می­تواند حائز اهمیت باشد. چرا که استفاده بیش از حد این ترکیبات در داروهای مختلف می­تواند باعث ایجاد اثرات جانبی شده و تهدیدکننده سلامت انسان باشد.

واژ­های کلیدی: کاتالاز کبد گاوی؛ نفتوکوئینون؛ مهار مخلوط؛ مهار رقابتی

* نویسنده مسئول، تلفن: 04133392716 ، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

کاتالاز به عنوان مهم­ترین آنزیم آنتی­اکسیدانی نقش اساسی در کنترل غلظت هیدروژن پراکسید و دیگر مشتقات سمی اکسیژن دارد. این آنزیم به عنوان فاکتور مهم در پروسه‍های مختلف از جمله التهاب و جهش زایی نقش اساسی ایفاء می­کند و کمبود آن منجر به بروز بیماریهایی چون دیابت، آلزایمرو بیماریهای مجاری ادراری می­شود. در برخی از سرطانها مانند سرطان کبد کاهش آنزیم کاتالاز مشاهده می­شود در حالی­که در برخی دیگر، از جمله سرطان پستان، سلولهای سرطانی با افزایش بیان آنزیم کاتالاز از القای آپوپتوز در سلولهای بنیادی سرطان جلوگیری می­کنند که بیانگر نقش دوگانه کاتالاز در این بیماری می­باشد. مطالعات مختلف در رابطه با نقش آنزیم کاتالاز در سرطانهای مختلف بیانگر این می­باشد که استفاده از مهارکننده­های مختلف این آنزیم در درمان سرطانهای مختلف با افزایش سطح گونه­های فعال اکسیژن­دار در سلولهای سرطانی و القای آپوپتوز در آنها از اهمیت بالایی برخوردار است (10). بنابراین معرفی ترکیباتی که تأثیر مهاری بر روی این آنزیم دارند در درمان این بیماریها می­توانند اهمیت داشته باشند. کبد به عنوان یک اندام بسیار مهم در بدن نقش بحرانی در سم­زدایی و متابولیزه کردن ترکیبات مختلف دارد. لذا مطالعه تأثیر ترکیبات و داروهای مختلف بر روی ساختار و عملکرد فراوان­ترین آنزیم این عضو، حائز اهمیت می­باشد (10 و 13). کاتالاز کبد گاوی، به عنوان یک مدل آنتی­اکسیدانی، در اکثر مطالعات برای بررسی تأثیر داروها و ترکیبات مختلف استفاده می­شود.

هیدروکسی نفتو کوئینون مشتقی از خانواده نفتوکوئینون­هاست که با توجه به موقعیت گروه هیدروکسیل، ایزومرهای متفاوتی از جمله 2-هیدروکسی 1و4-نفتوکوئینون ایجاد می­شود. این ترکیبات دارای خاصیت آنتی اکسیدانی، ضد قارچی و ضد باکتریایی می­باشد و لذا در درمان بعضی بیماریها مورد استفاده قرار می گیرد (3 و 5). با تغییر گروههای عاملی مشتقات مختلفی از این ترکیبات شناسایی و سنتز شده­اند. در مطالعه حاضر تأثیر دو مشتق سنتزی 3,3΄((4 hydroxyphenyl)methylene bis( 2hydroxynaphthalene-1,4dion) و ((2,3 dihydrobenzo[1,4]dioxon-6)amino)naphthalene-1,4-dion که به ترتیب بیس نفتوکوئینونBNQ)) و آمینو نفتوکوئینون (ANQ) خوانده می شوند (11) بر روی فعالیت و ساختار آنزیم کاتالاز مورد بررسی قرار گرفتند. شکل 1 (الف و ب) ساختار شیمیایی BNQ و ANQ را نشان می­دهند.

 

شکل 1- ساختار شیمیایی (الف) BNQ و (ب) ANQ

با توجه به اینکه این ترکیبات در صنایع مختلف از جمله صنایع دارویی و غذایی دارای کاربردهای متنوعی می­باشد، لذا مطالعه تأثیر این ترکیبات بر روی ماکرومولکولهای زیستی مهم مثل آنزیم کاتالاز که نقش کلیدی در فرآیندهای زیستی موجودات دارد، می­تواند مفید باشد.

مواد و روشها

مطالعات سینتیک آنزیم: به منظور سنجش فعالیت کاتالاز از روش اسپکتروفوتومتری مرئی-فرابنفش استفاده شد. در این روش از طریق ثبت تغییرات جذب سوبسترا (H2O2) در واحد زمان، میزان فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد. سرعت شکسته شدن و کاهش جذب H2O2 در طول موج 240 نانومتر در واحد زمان به عنوان واحد فعالیت آنزیم کاتالاز در نظر گرفته شد (12). آزمایش در کووتهایی با حجم 3 میلی لیتر در حضور آنزیم کاتالاز کبد گاوی با غلظت 4 نانومولار و غلظتهای افزایشی H2O2 انجام شد. تمامی سنجشهای مربوط در مطالعه حاضر در حضور بافر فسفات 50 میلی مولار با 7 pH اندازه­گیری شدند. برای مطالعه تأثیر ترکیبات مورد نظر بر روی فعالیت کاتالاز، غلظت بهینه آنزیم (nM4)  با غلظتهای مختلف از این ترکیبات، BNQ (0- 3/7 میکرومولار) و ANQ (0- 8/10 میکرومولار) به صورت جداگانه برای مدت سه دقیقه انکوبه شد. برای شروع واکنش، غلظت بهینه پراکسید هیدروژن (mM 5/55) مورد استفاده قرار گرفت. در این مرحله با توجه به کاهش فعالیت آنزیم در حضور غلظتهای مختلف ترکیبات، مقدارIC50  برای هر سه ترکیب از روی معادله خط حاصل، محاسبه شد (27).

مطالعه تغییرات ساختار آنزیم: برای بررسی تأثیر ترکیبات مورد نظر بر روی حداکثر نشر ذاتی و ساختار آنزیم کاتالاز از طیف سنجی فلوئورسانس در طول موج تحریکی 280 نانومتر استفاده شد و تغییرات نشر آنزیم در دو دمای مختلف 25 و 37 درجه­ی سانتی­گراد در حضور غلظتهای مختلف ترکیبات در محدوده 300 تا 500 نانومتر بررسی شد (26).

طیف سنجی مادون قرمز ((ATR-FTIR بر اساس جذب تابش و بررسی جهشهای ارتعاشی مولکولها صورت می­گیرد (7). برای مطالعه تأثیر BNQ و ANQ بر روی ساختار دوم آنزیم کاتالاز کبد گاوی و ویژگی تعامل پروتئین-لیگاند ، طیف ATR-FTIR آنزیم در حضور و عدم حضور این ترکیبات در محدوده  cm-1 1200-1800 ثبت شد و تغییرات مربوط به پیوندهای آمیدی بررسی شد.

مطالعات تئوری: شبیه سازی داکینگ مولکولی با استفاده از نرم افزار Autodock 4.2 جهت تعیین محل دقیق اتصال ترکیبات بر روی آنزیم کاتالاز کبد گاوی استفاده شد. برای این منظور ابتدا ساختار ورودی داکینگ شامل ساختار کریستالی آنزیم از بانک اطلاعاتی پروتئین RCSB PDB - 1TGU)) دانلود و ذخیره شد. ساختار لیگاندها با استفاده از نرم افزار GaussView 3.0 رسم شد و بهینه سازی انرژی لیگاند انجام گرفت. داکینگ مولکولی با تمرکز بر روی محل اتصال اصلی، با Grid box و spacing مناسب، انجام گرفت. کمپلکسی که دارای کمترین انرژی اتصالی بود، برای مراحل بعدی شبیه سازی و مطالعه با نرم افزار Chimera انتخاب شد (6، 12 و 14).

نتایج

مطالعات سینتیکی: فعالیت آنزیم کاتالاز (4 نانومولار) با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر و بر اساس کاهش جذب پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر اندازه­گیری شد و سرعت فعالیت آنزیم از روی شیب خط مماس بر منحنی تغییرات جذب سوبسترا در مقابل زمان محاسبه شد (19). سپس نمودارهای میکائیلیس-منتن و لاینویور-برک رسم شد. نتایج نشان داد که به تدریج با افزایش غلظت سوبسترا، از غلظت 5 تا 5/55 میلی مولار، فعالیت آنزیم کاتالاز به صورت خطی افزایش می­یابد. اما در غلظتهای بالاتر از 5/55 میلی مولار، روند کاهشی برای فعالیت آنزیم مشاهده شدکه توجیه کننده پدیده مهار آنزیم توسط سوبسترا است (12 و 18). مطالعات نشان داده­اند که پراکسید هیدروژن در غلظتهای بالا باعث مهار آنزیم از طریق تشکیل کمپلکس II (فرم غیر فعال کاتالاز) می­شود (14 و 26). به منظور تعیین مقدار دقیق پارامترهای سینتیکی (Km و Vmax)، از معادله­ (1) و منحنی لاینویور-برک استفاده شد (19). 

(1)                            

مقادیر Km، Vmax و برای آنزیم آزاد، به ترتیب mM 9/35 و mM-1.S 4/2 محاسبه شد. برای بررسی تأثیر BNQ و ANQ، بر روی فعالیت آنزیم کاتالاز، ابتدا فعالیت آنزیم در حضور غلظتهای مختلف از این ترکیبات و غلظت بهینه­ی پراکسید هیدروژن (5/55 میلی مولار) سنجش شد. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت ترکیبات، یک روند کاهشی در میزان فعالیت کاتالاز اتفاق می­افتد و در نهایت باعث مهار فعالیت آنزیم می­شود. با توجه به معادله خط حاصل از این نمودارها، مقادیر  IC50 مربوط به آنزیم کاتالاز در حضور BNQ و ANQ به ترتیب µM04/5­ و µM45/8 به دست آمد. IC50 غلظتی از مهارکننده می­باشد که باعث مهار 50 درصد از فعالیت آنزیم می­شود. مهار برگشت پذیر به انواع رقابتی، نارقابتی، غیررقابتی و مخلوط تقسیم بندی می­شود (18). برای  بررسی مکانیسم مهار آنزیم کاتالاز توسط BNQ و ANQ، نمودار لاینویور -برک فعالیت آنزیم در حضور غلظتهای ثابت این ترکیبات یعنی IC502/1، IC50 و IC502 و غلظتهای افزایشی سوبسترا، رسم شد (شکل 2الف و ب) و پارامترهای سینتیکی برای هر ترکیب تعیین گردید. مقایسه مقادیر پارامترهای سینتیکی آنزیم تیمار نشده با پارامترهای سینتیکی به دست آمده از آنزیم در حضور ترکیبات مورد نظر،  نوع مهار تعیین شد. با توجه به کاهش Vmax و افزایش Km  در حضور غلظتهای افزایشی BNQ، این ترکیب به عنوان مهارکننده مخلوط آنزیم کاتالاز عمل می­کند و می­تواند به جایگاهی مجزا از جایگاه اتصال سوبسترا، به آنزیم آزاد و یا به کمپلکس آنزیم سوبسترا متصل شود (17). ترکیب ANQ به عنوان مهار کننده رقابتی آنزیم کاتالاز عمل می­کند چرا که Vmax آنزیم در حضور این ترکیب ثابت و Km آن افزایش می­یابد. لذا اتصال هرکدام از ترکیبات هیدروژن پراکسید و یا ANQ از اتصال دیگری جلوگیری خواهد کرد. ANQ برای مهار رقابتی کاتالاز باید به جایگاه اتصال سوبسترا یا جایگاهی نزدیک به جایگاه فعال آنزیم متصل شود و از اتصال سوبسترا به جایگاه فعال آنزیم جلوگیری کند (14).

 

شکل 2- (الف) نمودار لاینوویور-بورک کاتالاز درغیاب و حضور غلظتهای مختلف BNQ (0، 52/2، 04/5 و 08/10 میکرومولار) و (ب) غلظتهای مختلف ANQ (0، 22/4، 45/8 و 9/16 میکرومولار)

 

مطالعات ساختاری: تکنیک فلوئورسانس روشی رایج جهت بررسی تغییرات ساختار سوم پروتئینها در اثر اتصال به یک لیگاند می­باشد. به دلیل وجود اسیدآمینه­های آروماتیک در ساختار پروتئینها، این ترکیبات دارای فلوئورسانس ذاتی هستند (4). در مطالعه حاضر، برای بررسی تغییرات در طیف نشری کاتالاز در حضور غلظتهای مختلف ترکیبات، از طول موج تحریکی 280 نانومتر استفاده شد. نتایج نشان داد که این ترکیبات با آنزیم میانکنش دارند و با افزایش غلظت هر دو ترکیب مورد نظر خاموش سازی فلوئورسانس اتفاق می­افتد. فرآیند خاموش­سازی از طریق دو مکانیسم استاتیک و یا دینامیک انجام می­گیرد (20 و 21). خاموش سازی استاتیک با افزایش دما کارایی خود را از دست می­دهد و ثابت خاموش سازی استاتیک کاهش می­یابد، در حالی که در خاموش سازی دینامیک افزایش دما باعث  افزایش برخوردهای خاموش ساز و فلوروفور می­شود (8 و 28). با استفاده از  معادله و منحنی استرن-ولمرمقادیر Ksv و Kq محاسبه شد(جدول 1) و از روی تغییرات آن نوع خاموش سازی مشخص شد. با توجه به کاهش مقادیر Ksv یا Kq با افزایش دما، مکانسیم خاموش سازی آنزیم توسط ترکیبات از نوع استاتیک تعیین شد (19).

طیف مادون قرمز پروتئینها با مشاهده پیکهای مربوط به گروههای آمیدی خصوصاً باند آمید I مطالعه می­شود که معمولاً در محدودهcm−1 1600 تا 1700 cm−1  ظاهر می­شود. باند آمید I با 80 درصد ارتعاشات کششی C=O که متصل به N-H خمشی داخل صفحه­ای و کششی C-N می­باشد، شناسایی می­شود. پیک آمید II که 60 درصد آن از گروههای خمشی N-H و 40 درصد دیگر آن از گروههای کششی C-N تشکیل شده است و در ناحیه cm−11500 تا cm−1 1600 قرار می­گیرد، با ساختمان دوم پروتئینها ارتباط دارد (7). تغییر در پیک مربوط به آمید I در محدوده­های عدد موجی  cm-1 1645-1620،  cm-1 1645-1652 ، cm-1 1652-1662 و  cm-1 1662-1690 به ترتیب نشان­دهنده تغییرات صفحات بتا، پیچه­های نامنظم، مارپیچ آلفا و دوربرگردان (turn) می­باشد (8). بررسی طیف مادون قرمز آنزیم نشان داد که ساختار دوم آنزیم کاتالاز در حضور این ترکیبات تغییر می­کند. همان طور که در شکل 3 الف قابل مشاهده است، حضور BNQ (5 میکرومولار) باعث می­شود پیک FTIR آنزیم از ناحیه cm−1  5/1637 به عدد موج cm−1 6/1660 منتقل شود. این نتایج حاکی از آن است که در حضور BNQ تغییرات ساختاری آنزیم به صورتی است که بیشتر ساختار مارپیچ آلفا را تحت تأثیر قرار می­دهد. از طرفی BNQ باعث ایجاد تغییراتی در آمید II نیز می­شود. ترکیب ANQ بیشترین تأثیر را بر روی ساختار صفحات بتا دارد. چرا که پیک FTIR کاتالاز از ناحیه cm−1 5/1637 به ناحیه cm−1 01/1624 منتقل می­شود. با توجه به شکل 3ب، ANQ نیز همانند BNQ در طیف ناحیه مربوط به آمید II تغییراتی ایجاد می­کند. این نتایج نشان می­دهد که BNQ و ANQ ، نه تنها ارتعاشات کششی گروه C=O در تنه اصلی پروتئین، بلکه ارتعاشات کششی N-C و ارتعاشات خمشی H- N را نیز تغییر می­دهند (7 و 9 و 29).  

 

شکل 3- طیف FTIR کاتالاز (الف) در حضور غلظتهای افزایشی ANQ، (ب) در حضور غلظتهای افزایشی ANQ

 

در مطالعات ترمودینامیکی برای محاسبه پارامترهای اتصال از جمله تعداد جایگاههای اتصال (n) و ثابت اتصال (K)، از معادله (2) استفاده گردید (16).

(2)                   

در این معادله نمودار log  در مقابل log [Q] یک نمودار خطی می­باشد که شیب آن نشان­ دهنده­ی n (تعداد جایگاه اتصال) و عرض از مبدأ نیز نشان­دهنده log Ka می­باشد که از روی آن می­توان  K، ثابت اتصال را محاسبه نمود (26).

به­طور­کلی نیرو­های برهمکنش ازجمله پیوند هیدروژنی، واندروالسی، تعاملات الکترواستاتیک و برهمکنشهای آب­گریز ممکن است بین لیگاند­های کوچک و ماکرومولکولهای زیستی وجود داشته باشد. پارامترهای ترمودینامیکی از جمله تغییرات آنتالپی H)Δ) ، تغییرات آنتروپی (ΔS) و تغییرات انرژی آزاد گیبس (ΔG) نقش مهمی در تعیین روشهای مختلف اتصال دارند. مقادیر این پارامترها با استفاده از فرمولهای 3، 4، 5 قابل محاسبه می­باشد (4 و 15).

(3)                           

(4)                                        

(5)                                      

در این معادله­ها K ثابت اتصال در دمای مربوطه و R ثابت عمومی گازها می­باشد. نوع برهمکنش بین ماکرومولکول و لیگاند، با استفاده از علامت و مقدار پارامترهای ترودینامیکی مشخص می­شود. به طوری که اگر 0H > Δ و 0S > Δ باشند، برهمکنشهای آبگریز نقش عمده­ای در واکنش اتصال دارند، اگر 0H < Δ و 0S < Δ باشند، برهمکنشهای واندروالسی و پیوند­های هیدرو‍ژنی در میانکنش بین ماکرومولکول و لیگاند غالب خواهند بود و همچنین 0H < Δ و 0S >Δ نشان­ دهنده غالب بودن برهمکنشهای الکترواستاتیک می­باشد (21). نتایج (جدول 1) نشان می­دهد BNQ و ANQ تنها یک جایگاه اتصال بر روی آنزیم کاتالاز دارند. مقادیرK و n برای کمپلکس آنزیم-BNQ با افزایش دما کاهش می­یابند، که نشان می­دهد در دماهای بالا کمپلکس ناپایداری تشکیل می­شود که ممکن است به صورت جزئی از هم پاشیده شوند. با توجه به اینکه علامت ΔH و ΔS در حضور BNQ منفی می­باشد، بنابراین در تشکیل کمپلکسهای آنزیم-BNQ برهمکنشهای واندروالسی و پیوندهای هیدروژنی بیشترین تأثیر را دارند (18 و 19). مطالعات ترمودینامیکی مربوط به کمپلکس ANQ-کاتالاز نشان داد که با افزایش دما مقادیر n و K نیز افزایش می­یابد لذا با افزایش دما کمپلکس پایدار از آنزیم و ANQ تشکیل می­شود. پارامترهای ترمودینامیکی (جدول 1) نشان داند که برهمکنشهای آبگریز نقش عمده­ای در تشکیل کمپلکس آنزیم-ANQ ایفاء می­کند، چرا که علامت ΔH و ΔS هر دو مثبت می­باشند. منفی بودن علامت GΔ نشان می­دهد که تشکیل کمپلکس بین آنزیم-ANQ همانندBNQ  خودخودی می­باشد (16). مثبت بودن علامت ΔH حاکی از گرماگیر بودن واکنش می­باشد (18).

 

 

جدول 1- پارامترهای ترمودینامیکی و ثابتهای اتصال کمپلکس BNQ -کاتالاز  و ANQ -کاتالاز در دو دمای مختلف.

ΔS

(JK-1mol-1)

ΔH

(kJmol-1)

ΔG

(kJmol-1)

K

(×104M-1)

Kq

(×1013M-1 s-1)

KSV

(×105M-1)

N

دما(ºC)

ترکیب

2/439-

4/162-  

52/31-

6/33

8/3

8/3

1

25

BNQ-CAT

 

 

25/26-

6/2

1/3

1/3

8/0

37

 

59/378+

23/87+

59/25-

3

3/2

3/2

8/0

25

ANQ-CAT

 

 

14/30-

12

9/1

9/1

9/0

37

 

                   

 

 

مطالعات تئوری: شبیه سازی داکینگ مولکولی با پیش­بینی اتمهای درگیر در برهمکنش و موقعیت اتصال لیگاند به ماکرومولکول، اطلاعاتی درباره مکانیسم اتصال ترکیبات مختلف فراهم می­کند و از این رو می­تواند نتایج به دست آمده از کارهای آزمایشگاهی را تأیید کند. شبیه سازی داکینگ مولکولی بر مبنای انرژی آزاد اتصال بین گیرنده و لیگاند انجام می­شود و اتصالی که کمترین انرژی آزاد اتصال را داشته باشد به عنوان بهترین محل اتصال در نظر گرفته می­شود (26). نتایج به دست آمده از این روش برای کمپلکس آنزیم-BNQ نشان داند که تنها یک جایگاه فعال برای این ترکیب بر روی آنزیم کاتالاز وجود دارد. این اتصال در محلی تقریبا دورتر از جایگاه فعال و در حفره­ای بین دومین آلفا هلیکس و دومین بسته بندی کننده قرار دارد(شکل 4الف). بنابراین BNQ به محلی غیر از جایگاه اتصال سوبسترا متصل می­شود که تأیید کننده مکانیسم مهار از نوع مخلوط می­باشد. با توجه به نتایج به دست ­آمده، پیوندهای مابین آنزیم و BNQ از نوع هیدروژنی و برهمکنشهای واندروالس می­باشد. در این اتصال آمینواسیدهای Ala 157، Ala 356، Asp 359، Thr 360، Pro 161 و Val 72 درگیر هستند. نتایج مربوط به داکینگ مولکولی کمپلکس آنزیم-ANQ ، در تأیید نتایج تجربی، نشان داد که تنها یک جایگاه اتصال برای ANQ بر روی آنزیم کاتالاز در مجاورت گروه و جایگاه فعال آنزیم وجود دارد. (شکل 4ب) که نشان می­دهد آنزیم و سوبسترا برای اتصال به جایگاه فعال آنزیم با هم رقابت می­کنند. اتصال بین آنزیم و ANQ در حفره ای مابین دومین مارپیچ آلفا، صفحات بتا و لوپ بسته بندی کننده و توسط برهمکنشهای آبگریز انجام می­شود. در این اتصال آمینواسیدهای Ala 157، Ala 356، Leu 158، Ile 164، Pro 161 و Val 72 درگیر هستند. با توجه به اینکه آمینواسیدهای درگیر در پیوند بیشتر از نوع آبگریز هستند، بنابراین نتایج حاصل از مطالعات ترمودینامیکی در رابطه با غالب بودن پیوندهای هیدروفوب قابل تأیید می­باشد (12 و 18).

شکل 4- مدل داکینگ مولکولی برای اتصال الف) BNQ به آنزیم کاتالاز، (ب) ANQ به آنزیم کاتالاز.

بحث

در مطالعه حاضر،  تأثیر غلظتهای مختلف BNQ و ANQ  بر روی آنزیم کاتالاز کبد گاوی، به روشهای مختلف تجربی و تئوری مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات سینتیکی نشان دادند که دو ترکیب BNQ و ANQ به ترتیب با مکانیسم­ مخلوط و رقابتی باعث مهارکاتالاز می­شوند. نتایج حاصل از مطالعه برهمکنش آنزیم کاتالاز با سایمتیدین، به عنوان داروی مرتبط با دستگاه گوارشی، نشان داد که این ترکیب مهارکننده مخلوط آنزیم کاتالاز می­باشد. با توجه به نتایج این مطالعه، مهارکننده مخلوط آنزیم، باعث کاهش Vmax و افزایش Km  آنزیم می­شود. بنابراین نتایج بررسی­ مکانیسم مهاری آنزیم کاتالاز در حضور BNQ، توسط این مطالعه قابل تأیید می­باشد (25). همچنین تأثیر ترکیب دفراسیروکس بر روی آنزیم کاتالاز به عنوان مهار کننده رقابتی تأیید کننده مطالعات حاضر می­باشد (14). مقادیر IC50 محاسبه شده برای این ترکیبات نشان داد که قدرت مهار کنندگی   BNQ بیشتر از ANQ می­باشد. نتایج بررسیهای ساختاری نشان دادند که هر دو ترکیب ضمن برهمکنش با آنزیم کاتالاز، باعث ایجاد تغییراتی در ساختار دوم و سوم آن می­شوند. نتایج مطالعات طیف سنجی مادون قرمز حاکی ازتغییرات ساختار دوم آنزیم کاتالاز در حضور ترکیبات مورد نظر می­باشد. مطالعات ترمودینامیکی انجام شده بر روی برهمکنش کاتالاز با 2 مرکاپتوبنزیمیدازول، با یافته­های حاصل از برهمکنش آنزیم-BNQ همخوانی دارد. در این مطالعه نشان داده شده است که مقادیر منفی پارامترهای ترمودینامیکی حاکی از نقش اساسی پیوندهای هیدروژنی و برهمکنشهای واندروالس در ایجاد کمپلکس بین آنزیم-لیگاند می­باشد (23). مطالعات انجام شده بر روی برهمکنش آنزیم کاتالاز و کرستین نیز تأیید کننده برهمکنش آنزیم-ANQ می­باشد. با توجه به اینکه علامت  ΔH و ΔS در این مطالعات منفی به دست آمد، لذا پیوندهای هیدروفوبیک نقش اساسی را در تشکیل کمپلکس کاتالاز-کرستین ایفاء می­کند (18). مطالعات شبیه سازی مولکولی بهترین محل اتصال ترکیبات مورد نظر را بر روی آنزیم کاتالاز تعیین کرد. این نتایج، با نتایج به دست آمده از بررسیهای تجربی همپوشانی دارد (1 و 2). باتوجه به نقش حیاتی آنزیم کاتالاز در سم زدایی بدن، می­توان نتیجه گرفت که استفاده بیش از حد این ترکیبات در داروهای ضدمیکروبی می­تواند عوارض جانبی به دنبال داشته باشد. نقص در فعالیت کاتالاز می­تواند باعث به هم خوردن تعادل میان تولید رادیکالهای آزاد و سیستم دفاع آنتی اکسیدانی بدن ­شود (22 و 24). در سلولهای سرطانی نیز به علت بالا بودن سوخت و ساز گونه­های واکنش­گر اکسیژن در سطح بالایی وجود دارند. برخی از مطالعات گزارش کرده­اند که گونه­های واکنش­گر اکسیژن می­توانند باعث القای مرگ در سلولهای سرطانی از طریق آسیبهای ناشی از این گونه­ها و نیز با القای مرگ برنامه­ریزی شده سلولی از طریق مسیرهای پیام­رسانی مرگ می­شوند (13 و 24). لذا اثرات ضد سرطانی مشتقات نفتوکوئینون ها از جمله BNQ و ANQ از این جهت قابل توجیه است که این ترکیبات با مهار فعالیت آنزیم کاتالاز باعث می­شوند که غلظت گونه­های واکنش­گر افزایش یابد و با القای آپوپتوز باعث مرگ سلولهای سرطانی شود.

1- جواهری مقدم  مصطفی، آریاپور حسن، دهنوخلجی علی اکبر (1394). طراحی ترکیبات کرومنی جدید با فعالیت ضد سرطانی و بررسی چگونگی میانکنش آنها با توبولین به روش داکینگ مولکولی. مجله­ی پژوهش­های سلولی مولکولی. 190-178.
2- داوری کامبیز، نوروزی جمیله، حسینی فرزانه ، اخوان سپهی عباس، میرزائی ساکو (1398). کشف مهارکننده علیه بتا لاکتاماز CTX-M-9 باکتری E.coli استفاده از مطالعات داکینگ ملکولی، MM/PBSA و دینامیک ملکولی. مجله­ی پژوهش­های سلولی مولکولی. 46-33.
 
3- Babula P, Adam V, Havel L, Kizek R. 2007. Naphthoquinones and their pharmacological properties. Ceska a Slovenska farmacie. casopis Ceske farmaceuticke spolecnosti a Slovenske farmaceuticke spolecnosti .56(3):114-20.
4- Bhogale A, Patel N, Mariam J, Dongre P, Miotello A, Kothari D. 2014. Comprehensive studies on the interaction of copper nanoparticles with bovine serum albumin using various spectroscopies. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 113:276-84.
5- de Carvalho da Silva F, Francisco Ferreira V. 2016. Natural naphthoquinones with great importance in medicinal chemistry. Current Organic Synthesis.13(3):334-71.
6- Dong S, Li Z, Shi L, Huang G, Chen S, Huang T. 2014. The interaction of plant-growth regulators with serum albumin: Molecular modeling and spectroscopic methods. Food and chemical toxicology. 67:123-30.
7- Gallagher W. 2009. FTIR analysis of protein structure. Course manual Chem. 455.
8- Gholamian A, Divsalar A, Saiedifar M, Ghalandari B, Saboury AA, Koohshekan B. 2017. Generation of reactive oxygen species via inhibition of liver catalase by oxalli-palladium: A spectroscopic and docking study. Process Biochemistry. 52:165-73.
9- Glassford SE, Byrne B, Kazarian SG. 2013. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834(12):2849-58.
10- Glorieux C, Zamocky M, Sandoval JM, Verrax J, Calderon PB. 2015. Regulation of catalase expression in healthy and cancerous cells. Free Radical Biology and Medicine. 87:84-97.
11- Janeczko M, Demchuk OM, Strzelecka D, Kubiński K, Masłyk M. 2016. New family of antimicrobial agents derived from 1, 4-naphthoquinone. European journal of medicinal chemistry. 124:25-1019.
12- Koohshekan, B, A Divsalar, M Saiedifar, AA Saboury, B Ghalandari, A Gholamian, and A Seyedarabi. 2016. 'Protective effects of aspirin on the function of bovine liver catalase: A spectroscopy and molecular docking study', Journal of Molecular Liquids, 218: 8-15.
13- Kurutas EB. 2015. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state', Nutrition journal. 15(1):71.
14- Moradi M, Divsalar A, Saboury A, Ghalandari B, Harifi A. 2015. Inhibitory effects of deferasirox on the structure and function of bovine liver catalase: a spectroscopic and theoretical study. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 33(10):2255-66.
15- Nair MS. 2015. Spectroscopic study on the interaction of resveratrol and pterostilbene with human serum albumin. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 149:67-58.
16- Nan Z, Hao C, Ye X, Feng Y, Sun R. 2019. Interaction of graphene oxide with bovine serum albumin: A fluorescence quenching study. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 210:348-54.
17- Park Y-D, Kim S-y, Lyou Y-J, Lee J-Y, Yang J-M. 2005. A new type of uncompetitive inhibition of tyrosinase induced by Cl–binding. Biochimie. 87(11):931-7.
18- Rashtbari S, Dehghan G, Yekta R, Jouyban A. 2017a. Investigation of the binding mechanism and inhibition of bovine liver catalase by quercetin: Multi-spectroscopic and computational study. Bioimpacts. BI.;7(3):147.
19- Rashtbari S, Dehghan G, Yekta R, Jouyban A, Iranshahi M. 2017b. Effects of Resveratrol on the Structure and Catalytic Function of Bovine Liver catalase (BLC): Spectroscopic and Theoretical Studies. Advanced pharmaceutical bulletin. 7(3):349.
20- Riahi MA, Ghaseminesab A. 2017. Study of the CuO nanoparticles interaction with human serum albumin using fluorescence technique.  journal of molecular and cellular research (Iranian journal of biology)
21- Shu Y, Xue W, Xu X, Jia Z, Yao X, Liu S, Liu L. 2015. Interaction of erucic acid with bovine serum albumin using a multi-spectroscopic method and molecular docking technique. Food chemistry. 173:31-7.
22- Sies H. 2015. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox biology.4:180-3.
23- Teng Y, Zou L, Huang M, Zong W. 2014. Molecular interaction of 2-mercaptobenzimidazole with catalase reveals a potentially toxic mechanism of the inhibitor. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 141:241-6.
24- Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. 2007. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. international journal of biochemistry & cell biology.;39(1):44-84.
25- Yazdi F, Minai-Tehrani D, Jahngirvand M, Almasirad A, Mousavi Z, Masoud M, et al. 2015. Functional and structural changes of human erythrocyte catalase induced by cimetidine: proposed model of binding', Molecular and cellular biochemistry. 404(1-2):97-102.
26- Yekta R, Dehghan G, Rashtbari S, Sheibani N, Moosavi‐Movahedi AA. 2017. Activation of catalase by pioglitazone: Multiple spectroscopic methods combined with molecular docking studies. Journal of Molecular Recognition. 30(12).
27- Yekta R, Dehghan G, Rashtbari S, Ghadari R, Moosavi-Movahedi AA. 2018. The inhibitory effect of farnesiferol C against catalase; Kinetics, interaction mechanism and molecular docking simulation. International journal of biological macromolecules.113:1258-65.
28- Yue Y, Liu J, Liu R, Sun Y, Li X, Fan J. 2014. The binding affinity of phthalate plasticizers-protein revealed by spectroscopic techniques and molecular modeling. Food and chemical toxicology. 71:244-53.
29- Zhang C, Luo S, Chen W. 2013. Activity of catalase adsorbed to carbon nanotubes: effects of carbon nanotube surface properties. Talanta. 113:142-7.
 
دوره 34، شماره 2
تیر 1400
صفحه 276-287
  • تاریخ دریافت: 07 اردیبهشت 1398
  • تاریخ بازنگری: 06 تیر 1398
  • تاریخ پذیرش: 12 مرداد 1398
  • تاریخ اولین انتشار: 01 تیر 1400