نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه آموزشی بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، شهر تهران، کشور ایران
2 دانشگاه تربیت مدرس
چکیده
نانودیسکهای دولایه ساختارهایی هستند که از دولایه غشایی فسفولیپیدی تشکیل شدهاند و بین دولایه محتویات یا مولکولهای آبی وجود ندارد. نانودیسکهای چهارلایه در واقع شبیه سلول طبیعی هستند که از دو طرف بر آن فشار وارد شده است مثل ساختار گلبول قرمز خون که از دوطرف فرورفتگی دارد. ساختار نانودیسک قادر است داروهای محلول در آب را در بخش سطحی آبدوست خود و داروهای محلول در چربی را در داخل دو لایه خود که محیط آبگریز است، پوشش دهد. سنتز نانودیسکها در محیط آزمایشگاهی و تجربی بسیار زمانبر و هزینهبر است. لذا در این تحقیق ساختار نانودیسکی با ترکیبی از مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه (DPSM) و کلسترول (CHOL) طراحی و ساخته شد. که برای انجام این کار از رویکرد شبیهسازی دینامیک مولکولی استفاده شد. بعد از انجام فرایند شبیه سازی، نتایج و آنالیزهای بدست آمده از مطالعه شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان داد که مولکولهای انتخابی ساختار نانودیسکی ایجاد کردند که ناشی از خواص شیمی-فیزیکی فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه و مولکول کلسترول است. لازم به ذکر است که فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه ساختار هندسی مخروطی و همچنین گروه سری بزرگتری نسبت به لیپیدهای دیگر داشته که موجب میشود که تمایل این مولکول به ایجاد ساختار نانودیسکی زیاد شود. مولکول کلسترول در بین فسفولیپیدهای اسفنگومیلین جنین جوجه قرار میگیرد و با آنها میانکنش برقرار میکند. این ویژگی مولکول کلسترول باعث افزایش پایداری ساختار نانودیسک میشود. آنالیزهای انرژی شامل انرژی کل، انرژی میانکنشهای واندروالس و الکترواستاتیک نشان دادند که ساختار نانودیسک ایجاد شده به ثبات و پایداری مناسبی رسیده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
A nanodisc structure design from sphingomyelin of chicken egg phospholipid (DPSM) and cholesterol (CHOL) and its formation study: a coarse-grained molecular dynamics simulation
نویسندگان [English]
1 Department of biophysics, Biological sciences faculty, Tarbiat Modares University, Tehran,Iran
2 Tarbiat Modares University
چکیده [English]
Double-layer nanodiscs are structures made up of phospholipids double-layer membrane and do not exist between the double-layer of any contents or water molecules. Quadruple nanodiscs are actually like a normal cell that pushes on both sides of the body, such as the red blood cell structure that is pushing on both sides. The structure of nanodisc can cover water-soluble drugs in its hydrophilic superficial and fat-soluble drugs within its two layers, which is a hydrophobic environment. Synthesis of nanodiscs in experimental environments is time-consuming and costly. Therefore, in this research, the nanodisc structures from Egg sphingomyelin (DPSM) and Cholesterol (CHOL) molecules were designed and constructed. In order to do this goal, a molecular dynamics simulation approach was used. The results and analyses obtained from the simulations showed that selective molecules created a nanodiscs structure that resulted from the physicochemical properties of the DSPC and cholesterol molecules. It should be noted that the DSPC molecule has a cone-shaped geometric structure as well as a larger group than other lipids, which makes the molecule's tendency increase to create a nanodisc structure. The cholesterol molecule is located in the DPSM phospholipids and interacts with them. This feature of the cholesterol molecule increases the stability of the nanodiscs structures. Energy analyzes including total energy, van der Waals and electrostatic interactions energy showed that the created nanodisc structures, suitably reached to final structural stability.
کلیدواژهها [English]
طراحی ساختار نانودیسک از فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه (DPSM) و کلسترول (CHOL) و مطالعه شکل گیری آن: شبیه سازی دینامیک مولکولی دانه درشت
جلیل پرچکانی چوزکی و مجید تقدیر*
ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک
تاریخ دریافت: 19/12/1397 تاریخ پذیرش: 19/01/1398
چکیده
نانودیسکهای دولایه ساختارهایی هستند که از دولایه غشایی فسفولیپیدی تشکیل شدهاند و بین دولایه محتویات یا مولکولهای آبی وجود ندارد. نانودیسکهای چهارلایه در واقع شبیه سلول طبیعی هستند که از دو طرف بر آن فشار وارد شده است مثل ساختار گلبول قرمز خون که از دوطرف فرورفتگی دارد. ساختار نانودیسک قادر است داروهای محلول در آب را در بخش سطحی آبدوست خود و داروهای محلول در چربی را در داخل دو لایه خود که محیط آبگریز است، پوشش دهد. سنتز نانودیسکها در محیط آزمایشگاهی و تجربی بسیار زمانبر و هزینهبر است. لذا در این تحقیق ساختار نانودیسکی با ترکیبی از مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه (DPSM) و کلسترول (CHOL) طراحی و ساخته شد. که برای انجام این کار از رویکرد شبیهسازی دینامیک مولکولی استفاده شد. بعد از انجام فرآیند شبیه سازی، نتایج و آنالیزهای به دست آمده از مطالعه شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان داد که مولکولهای انتخابی ساختار نانودیسکی ایجاد کردند که ناشی از خواص شیمی-فیزیکی فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه و مولکول کلسترول است. لازم به ذکر است که فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه ساختار هندسی مخروطی و همچنین گروه سری بزرگتری نسبت به لیپیدهای دیگر داشته که موجب میشود که تمایل این مولکول به ایجاد ساختار نانودیسکی زیاد شود. مولکول کلسترول در بین فسفولیپیدهای اسفنگومیلین جنین جوجه قرار میگیرد و با آنها میانکنش برقرار میکند. این ویژگی مولکول کلسترول باعث افزایش پایداری ساختار نانودیسک میشود. آنالیزهای انرژی شامل انرژی کل، انرژی میانکنشهای واندروالس و الکترواستاتیک نشان دادند که ساختار نانودیسک ایجاد شده به ثبات و پایداری مناسبی رسیده است.
واژه های کلیدی: شبیه سازی دینامیک مولکولی، نانودیسک، شکل گیری نانودیسکها، کلسترول، اسفنگومیلین جنین جوجه
* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884717 ، پست الکترونیکی: taghdir@modares.ac.ir
مقدمه
لیپیدها زیست مولکولهای متنوعی هستند که از نظر خواص فیزیکی به ویژه حلالیت با هم مشابهت دارند. خاصیت اصلی آنها نامحلول بودنشان در آب است. این مولکولها در ساختار غشای سلول وجود دارند، در داخل میتوکندریها یافت میشوند، در ساختمان لیپوپروتئینها وجود دارند و حتی وظیفه نقل و انتقال چربیها را به عهده دارند. لیپیدها به انواع مختلفی تقسیم بندی میشوند (1، 2 و 17). فسفولیپیدها گروه ویژه و تخصص یافتهای از چربیها هستند که کارهای متنوعی در سلول انجام می دهند که شامل شرکت در ساختار و کار غشای سلولی، شرکت در انعقاد خون و ایجاد اسید آراشیدونیک که پروستا گلاندینها را می سازد. به طور کلی دو نوع فسفولیپید وجود دارد (50). اگر در ساختار آنها گلیسرول وجود داشته باشد به آنها گلیسروفسفولیپیدها یا فسفوگلیسرید میگویند که مهمترین نوع فسفولیپیدهاست. اگر در ساختار آنها اسفنگوزین باشد به آنها اسفنگوفسفولیپید میگویند. هر دو نوع اجزاء ساختاری غشاها هستند و در تولید سیگنالهای عصبی و داخل سلولی نقش دارند(8). گلیسرو فسفولیپیدها متشکل از یک مولکول گلیسرول و دو اسید چرب و یک گروه فسفات بر روی کربن ۳ می باشد که به این مجموعه اسید فسفاتیدیک یا فسفاتیدیل گویند که پایه ای برای بیوسنتز فسفولیپیدها می باشد. به عبارت دیگر ساده ترین نوع فسفولیپیدها اسید فسفاتیدیک میباشد (45). وقتی فسفولیپیدها در محیط آبی در کنار هم جمع می شوند، می توانند انواع ساختارها مثل ساختارهای دولایهای، لیپوزوم کروی، ساختار میسلی، نانودیسک و ... را ایجاد کنند (39). علاوه بر این برای تشکیل یکسری از این ساختاها مثل میسل نیاز است که لیپیدها ابتدا به یک غلظت خاصی (غلظت بحرانی میسل) برسند تا ساختار تشکیل شود. یکی از ساختارهایی که از تجمع فسفولیپیدها حاصل میشود ساختارهای نانودیسک دایرهای است (12). ساختارهای نانودیسک رفتاری شبیه به غشای سلول دارند. همچنین این ساختارها را میتوان در بحث انتقال دارو و مهندسی طراحی دارو استفاده کرد (10). به طوری که امروزه خیلی از داروها را برروی ساختارهای نانودیسک تثبیت میکنند و آنها را داخل بدن بیمار میفرستند (32). نانودیسکهای کروی را میتوان به دو نوع عمده تقسیم کرد: ۱- نانودیسکهای کروی دولایه ۲-نانودیسکهای کروی چهارلایه غشایی. نانودیسکهای دولایه ساختارهایی هستند که دولایه غشایی فسفولیپیدی برروی هم قرار گرفتهاند و بین دولایه محتویات یا مولکولهای آبی وجود ندارد. نانودیسکهای چهارلایه در واقع شبیه سلول طبیعی هستند که از دو طرف دارای فرورفتگی هستند. مثل ساختار گلبول قرمز خون که از دوطرف فرورفتگی دارد. داخل لومن ساختار نانودیسک چهارلایهای میتواند محتویات یا مولکولهای آب وجود داشته باشد (۴۳، ۴۶ و ۵۱). شکل ۱ ساختار نانودیسک کروی دولایهای و چهارلایهای را نشان میدهد.
شکل ۱- ساختار شماتیک نانودیسک کروی دولایهای و چهارلایهای (۱۱)
نانودیسکها میتوانند از اجزای مختلفی تولید شوند. مهمترین اجزاء تشکیل دهنده ساختار نانودیسکها شامل لیپیدها (به ویژه فسفولیپیدها) و کلسترول است. که معمولاً تعداد یا غلظت فسفولیپیدها بیشتر از تعداد یا غلظت کلسترول در ساختار نانودیسکها مورد استفاده قرار میگیرد. فرمولاسیون نانودیسکها را از نظر محتوای مواد دارویی، پایداری و جذب سلولی میتوان از طریق تغییر پارامترهای فیزیکوشیمیایی بهینه سازی کرد. ساختار نانودیسک قادر است داروهای محلول در آب را در بخش سطحی آبدوست خود و داروهای محلول در چربی را در داخل دو لایه خود که محیط آبگریز است، پوشش دهد. به طور کلی اهمیت نانودیسکها در پزشکی و داروسازی را می توان به دو حیطه درمان و تشخیص بیماریها تقسیم کرد. از نانودیسکها به عنوان یک ابزار، یک مدل و یا یک معرف در مطالعات پایه از قبیل فعل و انفعالات سلول، فرآیندهای شناخت و نحوه عمل مواد خاص استفاده میشود. در تهیه نانودیسکها معمولاً از فسفولیپیدهای با منشاء زیستی استفاده میشود. در فسفولیپیدهای حاصل از منابع طبیعی، زنجیرههای آسیل بسته به منبع استخراج متفاوت است که این امر موجب می شود بتوان که ساختارهای متنوعی را طراحی کرد. به علاوه ذخایر فسفولیپیدی که در ساختار نانودیسکها استفاده میشوند به مرور زمان دچار هیدرولیز استری میشوند، که در طی آن یکی از زنجیره های آسیل از فسفولیپید جدا شده و به لیزوفسفولیپید تبدیل میشود. همچنین اگر در زنجیره های آسیل پیوند غیراشباع وجود داشته باشد پراکسیداسیون رخ میدهد. به دلایلی که در بالا ذکر شد مواد خامی که در ساختار نانودیسکها استفاده میشوند کیفیت بالایی ندارند. همچنین سنتز نانودیسکها در محیط آزمایشگاهی و تجربی بسیار زمانبر و هزینهبر است. علاوه براین اصلیترین مانع در تکنولوژی نانودیسکها به خصوص در استفاده از آنها به عنوان حامل دارو، عدم پایداری آنها به مدت طولانی میباشد. پایداری فیزیکی و شیمیایی نانودیسکها تحت تأثیر عوامل مختلفی است که میتوانند بر روی میزان پایداری نانودیسکها و کارایی نفوذ دارو در آنها اثر بگذارند. به همین خاطر نیاز است که شرایط پایداری نانودیسکها برای مدت طولانی فراهم شود. با محدودیتهایی که در روشهای تجربی وجود دارد و در بالا به آنها اشاره شد، از روشهای تئوری به عنوان روشهای تکمیلی برای مطالعه نانودیسکها میتوان استفاده کرد. در این تحقیق هدف دستیابی به یک ساختار نانودیسک بهینه است. با توجه به اینکه ساختارهای نانودیسک رفتاری شبیه به غشای سلول دارند، از آنها در مهندسی سلولی و زیست فناوری استفاده میشود(۴، ۹، ۴۲ و ۵۴). لذا در این تحقیق از رویکرد شبیه سازی دینامیک مولکولی استفاده شد و ساختارهای نانودیسک طراحی و ایجاد گردیدند. مولکولهایی که در ساختار نانودیسک مورد استفاده قرار گرفتند شامل مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه و کلسترول هستند.
مواد و روشها
شبیه سازی سیستمهای زیستی پیچیده مثل ساختارهای تشکیل شوندهایی چون غشای دولایه، لیپوزوم، میسلها، نانوفیبرها و سایر ساختارهای بزرگ بسیار طولانی و زمانبر است. در این تحقیق نیز چون قرار بود ساختار نانودیسک ایجاد شود و مشکل طولانی بودن زمان شبیهسازی وجود داشت، از رویکرد شبیهسازی دینامیک مولکولی دانه درشت استفاده شد. شبیهسازی دانه درشت این امکان را فراهم میکند که اتمهای مشابه نزدیک هم را به صورت یک کره در نظر گرفت. چالش اولیه در این تحقیق انتخاب فسفولیپیدهایهای مناسب بود. لازم بود که فسفولیپیدهایی انتخاب شوند که گزینه مناسبی برای انجام شبیه سازی دینامیک مولکولی باشند. یعنی فسفولیپیدهایی انتخاب میشدند که دارای میدانهای نیروی مشخص بودند و قابلیت شبیه سازی آنها نیز در نرم افزار گرومکس فراهم میشد. به همین خاطر مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه و کلسترول انتخاب شدند. مختصات داده اولیه این مولکولها به صورت حالت دانه درشت از سایت چارم (http://www.charmm-gui.org) دریافت شد (شکل۲) (11، 13، 14).
شکل ۲- ساختار دانه درشت مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه و کلسترول
مولکول اسفنگومیلین جنین جوجه دارای گروهها یا دانه هایی شامل: NC3 (به رنگ آبی)، PO4 (به رنگ خاکستری)، AM1 و AM2 (به رنگ صورتی)، T1A،C2A ،C3A ،C1B ،C2B ،C3B و C4B (به رنگ فیروزهای) است. مولکول کلسترول هم دارای دانههایی شامل: R4 ، R3، R2، R1،ROH و R5 (به رنگ صورتی)، C1 و C2 (به رنگ فیروزهای) است.
نرم افزار گرومکس نسخه ۵.۰.۱ برای این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا از یک مولکول اسفنگومیلین جنین جوجه برای ساخت جعبه استفاده شد. جعبه شبیه سازی به شکل مکعبی و در ابعاد۲۰*۲۰*۲۰ نانومتر تعریف شد. فاصله ساختار ایجاد شده از کناره های جعبه ۳/0 نانومتر در نظر گرفته شد. همچنین حالت شرایط مرزی دورهای برای سیستم در نظر گرفته شد و مولکولهایی که از یک سمت جعبه خارج میشوند دوباره از سمت دیگر وارد جعبه شبیهسازی میشوند. سپس به ترتیب مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه و کلسترول به داخل جعبه اضافه شدند. تعداد مولکولهای اضافه شده برابر ۸۱۱ مولکول اسفنگومیلین جنین جوجه و ۵۳۹ مولکول کسلترول است. در نهایت مولکولهای آب به تعداد ۵۹۵۶۰ مولکول، به منظور آبپوشی سیستم اضافه شدند. (شکل۳). نوع آب مورد استفاده در این تحقیق آب حالت دانه درشت و قطبی است (۱۵، ۱۶، ۱۷، ۱۸، ۱۹، ۲۱ و ۲۸).
شکل ۳- مراحل تعریف جعبه (مولکول اسفنگومیلین جنین جوجه در وسط جعبه است) ، اضافه کردن مولکولهای لیپید و اضافه کردن مولکولهای آب
در این مطالعه یک فرآیند شبیه سازی دینامیک مولکولی به مدت ۱۰۰۰ نانوثانیه (۱ میکروثانیه) انجام شد. تمام شبیهسازیها با نرم افزار گرومکس نسخه ۵.۰.۱ و میدان نیروی مارتینی انجام شد. مرحله بهینهسازی انرژی،۵۰۰۰ گام و به روش شدیدترین نزول صورت گرفت. تعادلرسانی در حجم ثابت برای تنظیم دما روی ۴۰۰ درجه کلوین و تعادلرسانی در فشار ثابت برای تنظیم فشار روی یک اتمسفر، به مدت ۲ نانوثانیه صورت گرفت. در نهایت مرحله شبیهسازی اصلی (مرحله تولید) به مدت ۱ میکروثانیه انجام شد. ورودیای فایل اصلی mdp نیز تنظیم گردید. مقدار تایم استپ در مرحله تولید و در فایل mdp برروی ۲۰ فمتو ثانیه تنظیم شد. پارامتر nstlist مقدارش ۱۰ در نظر گرفته شد. پارامترهای coulombtype و vdw_type به صورت cut-off تعریف شدند و الگوریتمهای تعریف شده برای پارامترهای tcoupl، pcoupl و cutoff-scheme به ترتیب شامل الگوریتمهای v-rescale ، berendsen و verlet است (۲۲، ۲۳، ۲۴، ۲۵ و ۲۷).
نتایج و بحث
نتایج حاصل از شبیهسازی، با رویکرد بررسی شکل گیری ساختار نانودیسک صورت گرفت. آنالیزها به منظور بررسی شکل گیری ساختار نانودیسک مورد استفاده قرار گرفتند که شامل آنالیزهای شعاع ژیراسیون، خطای جذر میانگین مربعات، تابع توزیع شعاعی، ناحیه سطح در دسترس حلال، انرژی میانکنشهای واندروالسی، انرژی میانکنشهای الکترواستاتیک و انرژی کل میباشند.
امروزه نیاز روزافزون وجود دارد تا ساخت نانودیسکها در آزمایشگاهها پیشرفت داده شود و بهبود یابد. این نیاز باعث شده است که استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی در حیطه طراحی و ساخت نانودیسکها بسیار مهم باشد. شبیه سازی دینامیک مولکولی به عنوان یک ابزار اولیه کمک میکند تا روند شکل گیری نانودیسکها و عوامل مؤثر در پایداری و شکلگیری آنها مورد مطالعه قرار گیرد. با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی میتوان سهم هر کدام از میانکنشهای پیوندی و غیرپیوندی در تشکیل نانودیسکها را به دست آورد و در نهایت با کسب چنین نتایجی میتوان نانودیسکهایی با ساختار و عملکرد بهینه سنتز نمود. که این عامل باعث صرفه جویی در هزینه و زمان میشود.
شکلگیری ساختار نانودیسک: در این مطالعه هدف اصلی طراحی و ساخت ساختار نانودیسک از فسفولیپید اسفنگومیلین و مولکول کلسترول و بررسی شکلگیری آن است. که به این منظور از رویکرد شبیه سازی دینامیک مولکولی دانه درشت استفاده شد. با استفاده از فایلهای حاصل از فایل مسیر شبیه سازی، پارامترهایی در شکلگیری ساختار و همچنین انرژیها استخراج شدند. و نتایج به دست آمده نشان داد که نانودیسک طراحی شده به خوبی در محیط شبیه سازی تشکیل شده است. شکل ۴ ساختار نهایی ایجاد شده بعد از ۱ میکروثانیه شبیه سازی را نشان میدهد. علاوه بر این موقعیت مولکولهای اسفنگومیلین، کلسترول و آب و همچنین ابعاد نانودیسک ایجاد شده در شکل آمده است.
نمای بالایی |
نمای جانبی (برش داده شده) |
۱۵ نانومتر |
۷ نانومتر |
مولکولهای آب (رنگ سبز) |
مولکولهای اسفنگومیلین (رنگ آبی) |
مولکولهای کلسترول (رنگ بنفش) |
شکل ۴- ساختار نهایی نانودیسک ایجاد شده درمحیط شبیهسازی گرومکس
فسفولیپید DPSM چون دارای ساختار هندسی مخروطیشکل است، تمایل به ایجاد ساختارهای نانودیسکی دولایه و غشای دولایه را دارد. همچنین این فسفولیپید به خاطر وجود ریشه اسفنگوزین در گروه سری دارای سر قطبی بزرگ است که از تمایل این لیپید برای ایجاد ساختار لیپوزومی میکاهد. نکته دیگر این است که استفاده کلسترول در ساختار نانودیسک باعث افزایش پایداری میشود. در واقع طبق مقالات ارائه شده، کلسترول موجود در ساختار نانودیسک توانایی این را دارد که با لیپید مجاور خود پیوند هیدروژنی برقرار کند و این عامل باعث افزایش پایداری نانودیسک میشود. وجود کلسترول در ساختار نانودیسک نقش کمتری در شروع شکل گیری ساختاردارد، اما بعد از شکل گیری اولیه نانودیسکها، وجود کلسترول باعث پایداری ساختار میشود (3 و 30).
آنالیز تابع توزیع شعاعی radial distribution function (RDF) برای بررسی شکلگیری و توزیع لیپیدها در ساختار نانودیسک انجام شد (37-33). در این آنالیز اتمهای فسفر در فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه به عنوان اتمهای رفرنس در نظر گرفته شدند (43 - 33). ساختار نانودیسک ایجاد شده دارای ساختار همگن است که موجب میشود RDF این ساختار در یک فاصله خاص (۰.۵ نانومتر یا ۵ آنگستروم) افزایش یافته و بعد از این فاصله مشخص، افت چشمگیری داشته است (۴۰، ۴۱، ۴۴ و ۴۷). آنالیز به خوبی نشان میدهد که نانودیسک شکل گرفته و ساختار نهایی آن به صورت یک نانودیسک دایرهای دولایه است.(52، 53 و 55)(شکل۵).
شکل۵- آنالیز تابع توزیع شعاعی که نشان دهنده شکلگیری ساختار نانودیسک دایرهای دولایه در محیط شبیه سازی است
آنالیز شعاع ژیراسیون نیز به منظور بررسی میزان فشردگی ساختار صورت گرفت. طبق نمودار شعاع ژیراسیون، مقدار شعاع ژیراسیون در طول زمان شبیهسازی تقریباً ثابت است و تغییر چندانی نکرده است. دلیل چنین اتفاقی این است که در شبیهسازی سیستمهای مونتاژ شونده مثل غشاها، لیپوزوم، نانودیسکها و سایر ساختارها، جمع شدگی اصلی ساختار در مرحله تعادلسازی صورت میگیرد و در مرحله شبیه سازی اصلی تغییر چندانی در شعاع ژیراسیون مشاهده نمیشود. در این مرحله تغییرات زیادی در شعاع ژیراسیون دیده نمی شود و شعاع ژیراسیون در یک آستانه تقریباً ثابت است که همین امر تأیید کننده شکلگیری ساختار مورد نظر است (شکل ۶) (20 و 56).
شکل ۶- آنالیز شعاع ژیراسیون که به منظور بررسی شکلگیری و میزان فشردگی ساختار انجام شد و نمودار مقدار ثابتی را از شعاع ژیراسیون نشان میدهد که بیانگر این موضوع است که ساختار نانودیسک ایجاد شده، فشرده شده است.
ناحیه سطح در دسترس حلال Solvent-accessible surface area (SASA) یکی از آنالیزهایی است که برای شکل گیری ساختارهای غشایی و نانودیسکی استفاده میشود. ناحیه سطح در دسترس یا ناحیه سطح در دسترس حلال، سطح یک بیومولکول یا ترکیب شیمیایی است که به حلال دسترسی دارد. اندازه گیری ناحیه سطح در دسترس معمولاً در واحد مربع آنگستروم تعریف میشود (7 و 49). طبق مقالات ارائه شده با شکل گیری نانودیسکها و ساختارهای غشایی از میزان ناحیه سطح در دسترس حلال کاسته میشود. در این تحقیق نیز با نزدیک شدن مولکولهای لیپید در کنار همدیگر از میزان ناحیه سطح در دسترس حلال نسبت به مولکولهای آب کاسته شد و در نتیجه در نمودار مربوطه از میزان ناحیه سطح در دسترس حلال کاسته شد. در شکل ۷ آنالیز ناحیه سطح در دسترس حلال در طول زمان شبیهسازی کاهش یافته است که نشان میدهد که ساختار نانودیسک شکل گرفته است (6 و 48).
انحراف جذر میانگین مربعات (root-mean-square deviation (RMSD)) تفاوت میان مقدار پیشبینی شده توسط مدل یا برآوردگر آماری و مقدار واقعی میباشد. پارامتر RMSD برای بررسی پایداری و ثبات مولکولهای زیستی شبیه سازی شده مورد استفاده قرار میگیرد.
شکل ۷- آنالیز ناحیه سطح در دسترس حلال که با یک روند نزولی آغاز میشود و بیانگر این است که ساختار نانودیسکی در محیط شبیه سازی شکل گرفته است.
این پارامتر مقیاسی است که تفاوتهای بین مقادیر پیشبینیشده توسط یک مدل یا تخمین را نسبت به یک مقدار واقعی برای یک متغیر خاص بیان میکند. RMSD هر ساختار نسبت به ساختار قبل آن در نظر گرفته می شود. شکل ۸ آنالیز این پارامتر را برای نانودیسک ایجاد شده نشان میدهد. همان طور که در شکل ۸ مشخص است این مقدار بعد از حدود ۶۰ نانوثانیه از زمان شبیه سازی پایدار شدهاند و به ثبات ساختاری رسیدهاند. افت و خیزهایی که بعد از زمان ۶۰ نانوثانیه و ثبات سیستم مشاهده میشود به این علت است که سیستمهای تجمعشونده مثل نانودیسکها ساختارهایی بسیار منعطف هستند و موجب تغییر لحظهای نمودار RMSD میشوند. در واقع ساختاری را میتوان دارای پایدار ساختاری مناسب در نظر گرفت که میزان RMSD با انحرافات کمتر داشته باشد (۵ و 31).
شکل ۸- آنالیز پارامتر RMSD برای ساختار نانودیسک ایجاد شده، که بیانگر میزان پایداری و ثبات مناسب برای ساختار است.
آنالیز انرژی میانکنشها در شکلگیری نانودیسک: علاوه بر آنالیزهای بیان شده آنالیزهای انرژی نیز انجام داده شدند تا ثبات و پایداری ساختار ایجاد شده بررسی شود. همه آنالیزهای به دست آمده نشان میدهند که ساختار مورد نظر دارای میزان پایداری نهایی مناسبی است. چون همه آنالیزهای انرژی انجام شده نشان دادند که بعد از سپری شدن ۳۰ نانوثانیه از شبیه سازی سیستم به ثبات رسیده است. ابتدا انرژی میانکنشهای واندروالسی برای هر کدام از جفت لیپیدها به دست آمد تا سهم هر کدام از آنها در شکل گیری ساختار نانودیسک به دست آید. فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه و مولکول کلسترول دارای بخش هیدروفوبیک در ساختار خود هستند. این مولکولها در این مناطق از ساختارهای خود میتوانند میانکنشهای واندروالسی را ایجاد کنند. در واقع زمانی که ساختار نانودیسک ایجاد میشود این مولکولها در کنار یکدیگر قرار میگیرند و چون در فاصله واندروالسی یکدیگر قرار دارند میتوانند میانکنشهای واندروالسی را ایجاد کنند. فاصله واندروالسی میتواند بین ۱ تا ۱۰ آنگستروم باشد. همان طور که در شکل ۹-الف مشخص است در ابتدای شبیه سازی انرژی میانکنشهای واندروالسی کم است ولی بعد از سپری شدن زمان در محیط شبیه سازی، با تشکیل میانکنشهای واندروالسی، به میزان انرژی میانکنشهای واندروالسی افزوده می شود و در نمودار منفیتر می شوند. فسفولیپیدهای DPSM-DPSM در ابتدای شبیهسازی ۲۰۰۰۰ کیلو ژول بر مول و در انتهای شبیه سازی ۹۰۰۰۰ کیلوژول بر مول، جفت لیپیدهای DPSM-CHOL به ترتیب ۳۷۰۰۰ و ۶۵۰۰۰ کیلوژول بر مول و جفت لیپیدهای CHOL-CHOL به ترتیب ۵۰۰۰ و ۲۰۰۰۰ کیلوژول بر مول انرژی در ابتدا و انتهای شبیهسازی دارند. همان طور که در شکل ۹-الف نیز مشخص است جفت فسفولیپیدهای DPSM-DPSM بیشترین میزان میانکنشهای واندروالسی را بین خود برقرار کردهاند و دارای بیشترین انرژی هستند(۹۰۰۰۰ کیلوژول بر مول) و در نتیجه بیشترین نقش را در پایداری نانودیسک در حیطه میانکنشهای واندروالسی دارند. بعد از جفت فسفولیپیدهای DPSM-DPSM ، به ترتیب جفت لیپیدهای DPSM-CHOL (۶۵۰۰۰ کیلوژول بر مول) و جفت لیپیدهای CHOL-CHOL (۲۰۰۰۰ کیلوژول بر مول) بیشترین میزان میانکنشهای واندروالسی را بین همدیگر برقرار میکنند. شکل ۹-ب انرژی میانکنشهای واندروالسی بین مولکولهای DPSM و CHOL و مولکولهای آب را نشان میدهد. که میزان انرژی میانکنشهای واندروالسی مولکول DPSM با مولکولهای آب (DPSM-W) بیشتر از مولکولهای کلسترول (CHOL-W) است (7 و 38).
الف |
ب |
شکل ۹- نمودار مقایسهای انرژی میانکنشهای واندروالسی مولکولهای DPSM و CHOL الف) انرژی میانکنشهای واندروالسی بین لیپیدهای DPSM-DPSM ، DPSM-CHOL وCHOL-CHOL در نانودیسک ساخته شده ب) انرژی میانکنشهای واندروالسی بین مولکولهای DPSM و CHOL و مولکولهای آب
علاوه بر انرژی میانکنشهای واندروالسی انرژی میانکنشهای الکترواستاتیک نیز برای نانودیسک ساخته شده به دست آمد. همان طور که در شکل ۱۰ مشخص است ابتدا انرژی الکترواستاتیک بین جفت فسفولیپیدهای DPSM-DPSM برای ساختار نانودیسک کم و به مقدار ۲۰۰۰ کیلوژول بر مول است. ولی با سپری شدن زمان شبیه سازی، با تشکیل میانکنشهای الکترواستاتیک، به میزان انرژی میانکنشهای الکترواستاتیک افزوده میشود که برابر ۱۷۲۰۰ کیلوژول بر مول شده است. در ساختار نانودیسک ساخته شده میانکنشهای الکترواستاتیک مرتبط با کلسترول به دست نیامد که این امر به خاطر عدم درگیر شدن کلسترول در تشکیل میانکنشهای الکترواستاتیک است و انرژی الکترواستاتیک کلی در ساختار نانودیسک فقط حاصل فسفولیپید DPSM است. در شکل گیری نانودیسکها میانکنشهای الکترواستاتیک بعد از میانکنشهای واندروالسی ایجاد میشوند. شکل ۱۰-الف انرژی میانکنشهای الکترواستاتیک بین جفت فسفولیپیدهای DPSM-DPSM و شکل ۱۰-ب بین فسفولیپیدهای DPSM و مولکولهای آب را نشان میدهد (10، 26 و 29).
الف |
ب |
شکل ۱۰- نمودار انرژی میانکنشهای واندروالسی الف) بین جفت فسفولیپیدهای DPSM-DPSM ب) بین فسفولیپیدهای DPSM و مولکولهای آب
در نهایت آنالیز انرژی کل برای ساختار نانودیسک ساخته شده به دست آمد. همان طور که در شکل ۱۱ مشخص است ساختار نانودیسک بعد از ۲۰ نانوثانیه سپری شدن از زمان شبیهسازی به پایداری مناسبی رسیده است. که بعد از رسیدن به ثبات و پایداری دارای انرژی معادل ۱۰۵۰۰۰۰ کلیوژول بر مول است.
شکل ۱۱- آنالیز انرژی کل ساختار نانودیسک ساخته شده، که نشان میدهد ساختار مورد نظر به پایداری ثابتی رسیده است و شکلگیری تمام شده است.
نتیجهگیری
در این تحقیق ساختار نانودیسک طراحی و ساخته شد. که برای انجام این کار از رویکرد شبیهسازی دینامیک مولکولی استفاده شد. برای انجام شبیهسازی مولکولهای اسفنگومیلین جنین جوجه (DPSM) و کلسترول (CHOL) انتخاب شدند. شبیه سازی به مدت ۱ میکروثانیه با استفاده از نرم افزار گرومکس نسخه ۵.۰.۱ صورت گرفت. نتایج و آنالیزهای به دست آمده از مطالعه شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان داد که مولکولهای لیپیدی انتخابی ساختار نانودیسکی ایجاد کردند. آنالیز شعاع ژیراسیون و تابع توزیع شعاعی به منظور بررسی شکلگیری و توزیع لیپیدها انجام شدند و این آنالیزها به خوبی نشان دادند که ساختار نانودیسکی متراکم و واحدی شکل گرفته است و فسسفولیپدها با توزیع همگنی در کنار یکدیگر تجمع یافتهاند. آنالیز ناحیه سطح در دسترس حلال دارای نمودار با روند نزولی است که بیانگر تجمع فسفولیپیدها در کنار همدیگر و ایجاد ساختار نانودیسک است. آنالیزهای انرژی شامل انرژی کل، انرژی میانکنشهای واندروالس و الکترواستاتیک نشان دادند که ساختار نانودیسک ایجاد شده به ثبات و پایداری مناسبی رسیده است. تشکیل ساختارهای نانودیسک دایرهای ناشی از خواص شیمی-فیزیکی فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه و مولکول کلسترول است. لازم به ذکر است که در ساختار نانودیسک ایجاد شده از فسفولیپید اسفنگومیلین جنین جوجه استفاده گردید که این فسفولیپید ساختار هندسی مخروطیشکل و همچنین گروه سری بزرگتری نسبت به لیپیدهای دیگر داشته که موجب میشود که تمایل این مولکول به ایجاد ساختار نانودیسکی زیاد شود. فسفولیپیدهای اسفنگومیلین جنین جوجه و مولکول کلسترول (حلقههای آروماتیک) که در همسایگی یکدیگر در ساختار نانودیسک هستند، با یکدیگر میانکنشهای واندروالسی برقرار میکنند. همچنین فسفولیپیدهای اسفنگومیلین جنین جوجه با همدیگر نیز میانکنشهای واندروالسی و الکترواستاتیک برقرار میکنند. که این میانکنشهای ایجاد شده، روند شکلگیری ساختار نانودیسک دایرهای را تسهیل مینمایند. هدف در این تحقیق دستیابی به یک ساختار نانودیسک بهینه بود که امروزه در حیطههای مختلف کاربرد دارد. با توجه به اینکه ساختارهای نانودیسک رفتاری شبیه به غشای سلول دارند، از آنها در مهندسی سلولی و زیست فناوری استفاده میشود. همچنین این ساختارها را میتوان در بحث انتقال دارو و مهندسی طراحی دارو استفاده کرد. به طوری که امروزه خیلی از داروها را برروی ساختارهای نانودیسک تثبیت میکنند و آنها را داخل بدن بیمار میفرستند.