نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 دانشکده مهندسی شیمی و نفت، دانشگاه صنعتی شریف، تهران، ایران

3 دانشکده نفت و مهندسی شیمی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

4 مرکز تحقیقات تروما، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران

چکیده

هدف اصلی از این پروژه ساختن یک میکروحامل زیست‌سازگار و زیست تخریب‌پذیر قابل تزریق برای استفاده در دارو رسانی به استخوان و غضروف است. میکروحامل‌های مناسب متشکل از کیتوسان و ژلاتین با استفاده از پمپ سرنگ مجهز به سامانه ولتاژ بالا ساخته شدند. نمونه‌ها با استفاده از سدیم تری پلی‌فسفات (TPP) شبکه‌ای شدند و داروی تیکوپلانین بر روی آن‌ها بارگذاری شد. شبکه‌ای شدن نمونه‌ها با آزمون FTIR تأیید شد. همچنین مورفولوژی و ساختار آن‌ها با استفاده از عکسبرداری میکروسکوپ الکترونی (SEM) بررسی شد. نتایج نشان داد که میکروحامل‌هایی با ساختار تقریباً کروی و اندازه‌ی مناسب برای تزریق در بدن (قطر µm 50±350) با دبی µl/min 300 و ولتاژ KV 5/8 تولید شده‌اند. به منظور کند کردن آهنگ رهایش دارو، یک لایه‌ی نازک پلیمری از جنس کیتوسان روی میکروحامل‌ها پوشانده شد و سپس رهایش دارو مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که نرخ رهایش در نمونه‌های با پوشش پلیمری از 4 روز به 5 روز افزایش یافته است که برای کاربرد مورد نظر میکروحامل‌ها مناسب‌تر است. نتایج تست ضدمیکروبی نیز مشخص ساخت که خاصیت ضد میکروبی داروی تیکوپلانین طی فرآیند ساخت حفظ شده است. در نهایت می‌توان نتیجه گرفت که میکروحامل‌های ساخته شده پتانسیل استفاده در درمان عفونت‌های غضروفی را دارا هستند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Design and fabrication of injectable teicoplanin-loaded polymeric microcarriers

نویسندگان [English]

  • Ata Tavakoli 1
  • Shohreh Mashayekhan 2
  • Hossein Baniasadi 3
  • Zabihollah Hasanzadeh 4

1 Department of Chemical Engineering, University of Tehran, Tehran, Iran

2 Chemical & Petroleum Engineering Department, Sharif University of Technology, Tehran, Iran

3 Faculty of Petroleum and Chemical Engineering, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

4 Trauma Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran

چکیده [English]

The main goal of this research work is to design and fabricate an injectable biocompatible and biodegradable microcarrier (MC) for drug delivery into cartilages and bones. Suitable MCs composed of chitosan and gelatin were fabricated with syringe pump equipped with high voltage system. The MCs were crosslinked with sodium tri-polyphosphate (TPP) and the teicoplanin was loaded onto the samples. The crosslinking of the samples was confirmed using FTIR spectra and their morphology was investigated with SEM images. The results confirmed that the MCs were successfully crosslinked with TPP and spherical shaped samples with desired diameter for injection (35050 m) were achieved with flow rate and voltage of 300 µl/min and 8.5 kV, respectively. A thin layer of chitosan was covered onto the fabricated MCs in order to reduce the drug release rate. The result of release test showed that it was increased from 4 to 5 days for covered samples which is more suitable for the claimed application of fabricated MCs. The antimicrobial test was done on the fabricated teicoplanin-loaded MCs and the obtained results confirmed that the antimicrobial properties of drug were remained even after fabrication process. Overall, the obtained results support that the fabricated MCs have potential for using as drug release devices for treatment of cartilage infections.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chitosan
  • drug delivery
  • Gelatin
  • Microcarrier
  • Teicoplanin

طراحی و ساخت میکروحاملهای پلیمری قابل تزریق بارگذاری شده با داروی تیکوپلانین

عطا توکلی1، شهره مشایخان2*، حسین بنی­اسدی3 و ذبیح الله حسن زاده4

1 ایران، تهران، دانشگاه تهران، دانشکده مهندسی شیمی

2 ایران، تهران، دانشگاه صنعتی شریف، دانشکده مهندسی شیمی و نفت، گروه مهندسی پزشکی

3 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، دانشکده نفت و مهندسی شیمی

4 ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، مرکز تحقیقات تروما

تاریخ دریافت: 26/1/1397            تاریخ پذیرش: 25/10/1397

چکیده

هدف اصلی از این پروژه ساختن یک میکروحامل زیست‌سازگار و زیست تخریب‌پذیر قابل تزریق برای استفاده در دارو رسانی به استخوان و غضروف است. میکروحاملهای مناسب متشکل از کیتوسان و ژلاتین با استفاده از پمپ سرنگ مجهز به سامانه ولتاژ بالا ساخته شدند. نمونه‌ها با استفاده از سدیم تری پلی‌فسفات (TPP) شبکه‌ای شدند و داروی تیکوپلانین بر روی آنها بارگذاری شد. شبکه‌ای شدن نمونه‌ها با آزمون FTIR تأیید شد. همچنین مورفولوژی و ساختار آنها با استفاده از عکسبرداری میکروسکوپ الکترونی (SEM) بررسی شد. نتایج نشان داد که میکروحاملهایی با ساختار تقریباً کروی و اندازه مناسب برای تزریق در بدن (قطر µm 50±350) با دبی µl/min 300 و ولتاژ KV 5/8 تولید شده‌اند. به منظور کند کردن آهنگ رهایش دارو، یک لایه نازک پلیمری از جنس کیتوسان روی میکروحاملها پوشانده شد و سپس رهایش دارو مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که نرخ رهایش در نمونه‌های با پوشش پلیمری از 4 روز به 5 روز افزایش یافته است که برای کاربرد مورد نظر میکروحاملها مناسب‌تر است. نتایج تست ضدمیکروبی نیز مشخص ساخت که خاصیت ضد میکروبی داروی تیکوپلانین طی فرآیند ساخت حفظ شده است. در نهایت می‌توان نتیجه گرفت که میکروحاملهای ساخته شده پتانسیل استفاده در درمان عفونتهای غضروفی را دارا هستند.

واژه های کلیدی: تیکوپلانین، دارورسانی، ژلاتین، کیتوسان، میکروحامل

*  نویسنده مسئول، تلفن: 66166414(21)98+، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

تکنولوژی رهایش دارو پس از پیدایش در دهه 70 میلادی، به سرعت گسترش پیدا کرد. حاملهای دارو مانند لیپوزومها، مایسلها، دندریمرها و اخیراً میکرو و نانو ذرات انقلابی را در سامانه‌های دارو رسانی کنترل شده به وجود آورده­اند (1). از آنجا که بسیاری از داروهای موجود نمی‌توانند هدف اثرگذاریشان را بیابند، بازدهی مناسب و مطلوبی برای درمان بیماری ندارند؛ درنتیجه میزان قابل توجهی از دارو در بین بافتهای سالم بدن پخش می‌شود و اغلب عوارض جانبی شدیدی را ایجاد می‌کند (2). به طور کلی می‌توان گفت سامانه‌های دارورسانی باید مقدار کافی دارو را به محل هدف برسانند، رهایش پیوسته در یک مدت زمان خاص داشته باشند و زیست تخریب پذیر باشند تا احتیاج به عمل جراحی برای خارج کردن آنها نباشد (3و24).

در این پژوهش، تمرکز اصلی روی عفونتهای غضروف مفصل زانو که شمار زیادی از بیماران ارتوپدی درگیر آن می­باشند، است. درمان نامناسب و یا با تأخیر این عفونتها می‌تواند موجب افزایش درد، فقدان عملکرد و گاه منجر به مرگ و میر گردد (4و5). عفونتهای غضروف مفصل اکثراً به دلیل حضور میکروارگانیسمهای گرم مثبت از جمله استافیلوکوک، استرپتوکوک و به‌ویژه استافیلوکوکوس ارئوس ایجاد می‌شوند (5و6). به علت کم بودن رگهای خونی در این مناطق، درمان این نوع عفونتها کاری بسیار مشکل است و معمولاً شامل مصرف طولانی ‌مدت آنتی‌بیوتیک و اغلب همراه با جراحی می‌باشد. امروزه سیمانهای ارتوپدی عموماً از جنس پلی متیل متاکریلات (PMMA) که حاوی آنتی بیوتیک می­باشند برای پیشگیری و درمان این نوع از عفونتها به کار می‌روند. آهنگ رهایش کم، زیست سازگاری ضعیف و نیاز به عمل جراحی دوم برای خارج کردن آنها از معایب سیمانهای PMMA است (5). به عنوان جایگزین برای PMMA، اخیراً مواد قابل جذب مانند پلی­لاکتیک اسید (PLA) و سرامیکها پیشنهاد شده­اند (6). با این وجود تجهیزات ساخته شده از PLA معمولاً حاوی حلالهای آلی باقیمانده از فرآیند ساخت هستند و مواد سرامیکی نیز بسیار شکننده می­باشند و بنابراین استفاده از آنها می‌تواند مشکل ساز باشد (6).

هدف این مطالعه، طراحی و ساخت یک سیستم دارورسانی مناسب جهت درمان و پیشگیری عفونتهای غضروف مفصلی است. تحقیقات بسیاری  نشان می­دهند کیتوسان و ژلاتین هر دو دارای خاصیت ضد میکروبی هستند؛ به طوری­که ترکیب این دو پلیمر برای ساخت حامل دارو، منجر به خاصیت ضد میکروبی محصول حتی بیشتر از هردو ماده به تنهایی شده است (7). همچنین زیست سازگاری و زیست تخریب­پذیری این ترکیب به تنهایی و نیز در کنار هم به خوبی اثبات شده است (8و9). از سوی دیگر مطالعات مشخص ساخته­اند که داروی تیکوپلانین که یک آنتی بیوتیک با طیف وسیعی از فعالیت می­باشد، بسیاری از ارگانیسمهای هوازی و بی­هوازی از جمله استافیلوکوکوس ارئوس مقاوم به متیسیلین که شایع‌ترین میکروارگانیسم برای عفونتهای استخوان است را پوشش می‌دهد (6). به همین منظور در تحقیق حاضر پلیمرهای ژلاتین و کیتوسان برای ساخت میکرو حامل زیست تخریب­پذیر و تیکوپلانین به‌ عنوان آنتی‌بیوتیک انتخاب شده است. جهت ساخت نمونه­ها نیز از روش ژل سازی یونی با استفاده از دستگاه ولتاژ بالا استفاده شده است. با توجه به تأیید زیست سازگاری و زیست تخریب­پذیری ترکیب کیتوسان/ژلاتین در مطالعات قبلی (10-8)، در این تحقیق بیشتر بر روی بررسی رهایش دارو و نیز خواص ضد میکروبی میکروحاملها تمرکز شده است و سعی شده است تا پتانسیل کاربرد این میکروحامل جهت استفاده در درمان عفونتهای غضروف مفصلی تأیید شود.

مواد و روشها

مواد: در این پژوهش کیتوسان با ویسکوزیته پایین و وزن ملکولی متوسط (kD 280) و درجه استیل­زدایی 85-75 درصد، ژلاتین گرید دارویی (نوع A)، محلول  بافر فسفات نمکی (PBS) و سدیم تری پلی فسفات (TPP) 85 درصد، همگی از شرکت سیگما-آلدریچ خریداری و استفاده شدند. همچنین اسید استیک و سدیم هیدروکساید (مرک– آلمان) و داروی تیکوپلانین با نام تجاری تارگوسید (سانوفی– سوییس) مورد استفاده قرار گرفت.

ساخت میکروحاملها: برای ساختن میکروحاملها از محلولهای (w/v) 8 درصد کیتوسان و ژلاتین استفاده شد. به‌منظور دستیابی به محلول (w/v) 8 درصد کیتوسان، مقدار 8/0 گرم کیتوسان داخل 10 میلی‌لیتر اسید استیک 2 درصد ریخته و روی همزن مغناطیسی در دمای اتاق به مدت 48 ساعت همزده شد تا پودر کیتوسان به‌خوبی حل و محلول همگن حاصل شود. برای تهیه محلول (w/v) 8 درصد ژلاتین، مقدار 8/0 گرم پودر ژلاتین درون 10 میلی‌لیتر آب دیونیزه ریخته شد و به مدت 3 ساعت روی همزن مغناطیسی با دمای 50 درجه سانتی گراد حل شد. محلولهای کیتوسان و ژلاتین ساخته شده به نسبت 1 به 1 با یکدیگر مخلوط و در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت روی همزن مغناطیسی همزده شد.

در این تحقیق، برای ساخت میکروحاملها به شیوه ژل­سازی یونی،  ابتدا محلول پلیمری درون سرنگ به کمک پمپ سرنگی به درون محلول شبکه کننده (محلول TPP با غلظت w/v 5 درصد) چکانده شد. میدان مغناطیسی ایجاد شده باعث می‌شود که قطره‌های تشکیل شده از نوک سوزن زودتر جدا شوند و کره‌های کوچک‌تری درون محیط شبکه کننده ریخته شود. تمام مراحل فوق در زیر هود و شرایط استریل انجام گرفت. میکروحاملهای حاصل 3 بار با آب دیونیزه شستشو داده شد تا TPP سطحی روی میکروحاملها به‌طور کامل شسته شود. لازم به ذکر است که برای ساخت میکروحاملها شش حالت مختلف به لحاظ ولتاژ اعمالی و نیز دبی جریان در نظر گرفته شد. چون هدف ساخت میکروحامل برای تزریق درون بدن می­باشد، نمونه­ای مطلوب است که قطر آن در محدوده مناسب (µm 380-150) برای تزریق درون بدن باشد (10). با توجه به پیش آزمایشهای انجام شده، دبی جریان و ولتاژ مناسب به ترتیب µl/min 300 و kV 5/8 انتخاب شد.

بارگذاری دارو: به منظور بارگذاری بهتر دارو داخل میکروحاملها، نسبت سطح به حجم با متخلخل کردن نمونه­ها افزایش داده شد. برای متخلخل کردن میکروحاملها از روش خشک کردن انجمادی (دمای 40- درجه، خلا mbar 1، زمان 24 ساعت) استفاده شد. پس از متخلخل کردن میکروحاملها، نمونه­ها استریل شدند، به این ترتیب که ابتدا میکروحاملهای متخلخل شده به مدت 4 ساعت درون اتانول (v/v) 70 درصد غوطه­ور شدند؛ سپس سه مرتبه با آب دیونیزه شستشو داده شدند و در نهایت در زیر هود استریل به مدت 24 ساعت خشک شدند (8و23). نمونه­های استریل شده درون محلول داروی تیکوپلانین با غلظت mg/ml 80 به مدت 3 ساعت غوطه‌ور شدند تا دارو به مقدار کافی بارگذاری شود (11، 12، 13 و 23). نمونه‌های حاوی دارو دو بار با آب مقطر شستشو داده شدند؛ سپس به مدت 12 ساعت در دمای اتاق و شرایط استریل خشک شدند.

جهت محاسبه میزان داروی بارگذاری شده درون میکروحاملها، مقدار مشخصی نمونه خشک بارگذاری شده با دارو درون محلول PBS غوطه­ور و به مدت 24 ساعت به شدت همزده شد تا میکروحاملها کاملاً تخریب و داروی بارگذاری شده در آنها کاملاً خارج شود. سپس با استفاد از روش جذب، میزان داروی بارگذاری شده محاسبه شد. راندمان بارگذاری دارو در نمونه­ها که از تقسیم میزان داروی بارگذاری شده بر میزان کل داروی موجود در محلول به دست آمد، 6/1 درصد بود که بیانگر بارگذاری کم دارو توسط این روش است.

پوشش­دهی میکروحاملهای حاوی دارو: برای رهایش مطلوب‌تر، لایه نازک پلیمری روی حاملهای حاوی دارو پوشش داده شد. این لایه پلیمری نیز باید زیست سازگار بوده و همچنین نباید از قابلیت تزریق­پذیر بودن نمونه­ها جلوگیری کند. با توجه به این شرایط، محلول رقیق کیتوسان به عنوان لایه پوشش‌دهنده انتخاب شد. برای پوشش دادن میکروحاملهای حاوی دارو با کیتوسان، پس از بارگذاری دارو و خشک شدن، نمونه­ها داخل محلول (w/v) 8/0 درصد کیتوسان خنثی شده با سود به مدت 10 دقیقه با همزدن آرام غوطه‌ور شدند و سپس در دمای اتاق به مدت 12 ساعت خشک شدند (14، 15 و 16).

مطالعات ساختاری: مطالعه روی مورفولوژی میکروحاملهای بهینه بدون دارو و حاوی دارو و دارای پوشش کیتوسان به وسیله عکس­برداری SEM انجام شد. نمونه‌های ساخته شده پس از آماده سازی و پوشش‌دهی توسط طلا، تحت آزمون SEM قرار گرفتند. به منظور مطالعه پیوندهای برقرار شده بین کیتوسان و ژلاتین و همچنین برای بررسی صحت شبکه­ای شدن نمونه‌ها، تست FTIR از کیتوسان خالص، ژلاتین خالص و میکروحامل ساخته شده، گرفته شد.

رهایش دارو در محیط برون تنی: رهایش دارو از میکروحامل کیتوسان-ژلاتین بارگذاری شده با دارو، در محلول PBS مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور هر دو نوع میکروحامل بدون پوشش کیتوسان و پوشش داده شده با  کیتوسان، در محلول PBS غوطه­ور شدند (8 میلی‌گرم میکروحامل در هر میلی لیتر PBS). سپس نمونه­ها درون انکوباتور در دمای 37 درجه قرار گرفتند. به منظور بررسی رهایش در زمانهای 1 ، 6 ، 12 و 24 ساعت در روز اول و پس از آن هر 24 ساعت به مدت 7 روز، 5/0 میلی­لیتر از محیط رهایش برداشته شد و همان مقدار PBS از پیش گرم شده جایگزین شد. سپس توسط اسپکتروفوتومتر UV-Vis در طول موج nm 248 اندازه­گیری شد و با مقایسه با منحنی استاندارد، درصد تجمعی داروی رهایش پیدا کرده در هر زمان با استفاده از معادله 1 محاسبه شد:

(1)       

در رابطه فوق Ci غلظت نمونه برداشته شده از محلول رهایش در زمان i  ، Vs حجم محلول خالص جایگزین شده (ml 5/0)، V0 حجم اولیه محلول رهایش و Cn غلظت نهایی محلول رهایش بعد از اتمام آزمایش می­باشد.

آزمون ضدمیکروبی: برای  اثبات فعالیت داروی رها شده از میکروحاملها و حفظ خاصیت ضدمیکروبی، آزمون ضدمیکروبی با استفاده از دو نوع باکتری سودوموناس آئروژینوزا (گرم منفی) و استافیلوکوکوس آرئوس (گرم مثبت) (17) برای حاملهای پوشش داده شده با کیتوسان با استفاده از روش انتشار چاهک (19و20) انجام شد. برای کشت دادن باکتریها از محیط مولر هینتون آگار استفاده شد؛ به این ترتیب که g 6/5 پودر آگار نوترینت درون ml 200 آب مقطر تحت دما حل شد. محلول به دست آمده درون اتوکلا استریل گردید. محلول استریل آگار درون پلیتهای پلی‌اتیلنی ریخته شد. سپس باکتریها به پلیتهای حاوی محیط آگار اضافه شد. پلیتهای حاوی باکتری به مدت 24 ساعت انکوبه شدند تا باکتری رشد کند و تمام سطح محیط را پوشش دهد. سپس چاهکهایی روی محیط آگار حاوی باکتری ایجاد و µl 200 از محلول حاصل از رهایش دارو (مربوط به پایان روزهای اول و آخر رهایش) درون چاهک ریخته شد. پلیتهای حاوی میکروب و دارو به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند و سپس قطر هاله ایجاد شده دور نمونه‌ها به عنوان معیاری از فعالیت ضدباکتریایی دارو اندازه­گیری شد. برای نمونه‌های کنترل از پودر دارو محلولهایی با غلظتهای به دست آمده از آزمایشها در روزهای مد نظر آزمایش (اول و پنجم)، تهیه شد. از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

مطالعات آماری: هر آزمایش به تعداد سه بار انجام شد و مقادیر میانگین گزارش شد. داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS.18 تجزیه و تحلیل شدند و مقدار P-value کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج و بحث

مطالعه ساختاری و گروههای عاملی در میکروحاملها: همان طور که قبلاً نیز اشاره شد برای تولید میکروحاملها شرایط مختلفی به لحاظ دبی جریان و نیز ولتاژ اعمالی در نظر گرفته شد که در نتیجه، میکروحاملها با قطرهای مختلف تولید شدند. قطر مناسب برای میکروحاملها جهت تزریق در بدن در محدوده mm 380-150 می­باشد (10). بنابراین، دبی پمپ سرنگ و ولتاژ اعمالی به ترتیب µl/min 300 و Kv  5/8 انتخاب شد تا قطر نمونه­های تولید شده در محدوده مناسب برای کاربرد مورد نظر باشند. همچنین، قابلیت تزریق حاملهای ساخته شده با شرایط بهینه تولید، توسط یک آنژیوکت شماره 17 بررسی شد و مشاهده شد که آسیبی به میکروحاملها وارد نشده است. با استفاده از میکروسکوپ نوری از میکروحاملهای ساخته شده با شرایط بهینه عکس­برداری شد تا قطر نمونه­ها مشخص شود (شکل 1). همان طور که مشاهده می­شود قطر میکروحاملهای بهنیه حدود µm 50±350 می­باشد که نشان دهنده قابل تزریق بودن آنهاست.

 

الف

 

ب

 

شکل 1- تصویر میکروسکوپ نوری از حامل­های ساخته شده با شرایط بهینه: الف) تجمع میکروحامل­ها و ب) یک میکروحامل

 

مواد متخلخل به دلیل ویژگیهای مناسبی که دارند از جمله ساختار متخلخل یکنواخت و پایدار، سطح تماس بالا، اندازه حفرات موزون با توزیع باریک و خواص سطحی مناسب، برای رهایش کنترل شده دارو بیشتر مورد توجه قرار دارند (19). میکروحاملهای متخلخل دارای نانوحفرات بسیار زیاد می­باشند که قابلیت نگهداری دارو را افزایش می­دهند. به عبارت دیگر میکروحاملهای متخلخل این توانایی را خواهند داشت که فرآیند جذب و رهایش دارو را به میزان بیشتر و قابل پیش­بینی­تری انجام دهند. بنابراین، به منظور بررسی تخلخل نمونه­های تولید شده از میکروحاملهای متخلخل شده طی فرآیند خشک کردن انجمادی، تصویر SEM تهیه شد (شکل 2).

 

شکل 2- تصویر SEM از میکروحاملهای متخلخل شده توسط فرآیند خشک کردن انجمادی

همان طور که مشاهده می­شود ساختار کاملاً متخلخل ناشی

از خشک کردن انجمادی در میکروحاملها به خوبی ایجاد شده است. بنابراین انتظار می رود که میزان جذب و رهایش داروی تیکوپلانین از میکروحاملهای ساخته شده مقدار قابل توجهی باشد. نکته­ای که باید به آن اشاره شود این است که ساختار تقریباً کروی شکل با قطر حدود mm 50±350 از تصاویر SEM نیز قابل ملاحظه می­باشد. به عبارت دیگر تصاویر SEM یافته­های حاصل از تصویربرداری با میکروسکوپ نوری مبنی بر کروی بودن و قطر مناسب میکروحاملهای ساخته شده را تأیید می­کند.

همان طور که قبلاً نیز اشاره شد برای رهایش مطلوب­تر دارو و جلوگیری از رهایش ناگهانی آن، پوشش نازکی از کیتوسان پیرامون دارو کشیده شد. شکل 3الف تصویر SEM تهیه شده از میکروحامل بارگذاری شده با دارو بعد از پوشش با کیتوسان را نشان می­دهد. همان طور که مشاهده می­شود وجود پوشش بر روی میکروحامل از روی مقایسه با تصاویر میکروحاملهای متخلخل بدون پوشش، قابل اثبات می­باشد؛ همچنین خلل و فرجهای موجود در نمونه به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. بنابراین انتظار می­رود که میزان رهایش دارو در نمونه با پوشش نسبت به نمونه بدون پوشش کیتوسان، کاهش نشان دهد (به این مورد در بخش آزمایش رهایش دارو پرداخته شده است). نکته دیگری که از تصویر SEM قابل دستیابی می­باشد حفظ ساختار کروی و نیز اندازه میکروحامل بعد از بارگذاری و پوشش آن با کیتوسان است. به منظور بررسی تأثیر بارگذاری دارو و نیز پوشش­دهی بر روی ساختار کروی و اندازه میکروحامل، از نمونه بارگذاری شده با دارو که دارای پوشش کیتوسانی است، تصویر میکروسکوپ نوری نیز تهیه شد (شکل 3ب). همان طور که مشاهده می­شود بارگذاری دارو و پوشش­دهی میکروحاملها با کیتوسان باعث شده تا ساختار ظاهری آنها اندکی تغییر کند، اما کماکان حالت کروی حفظ شده است. علاوه بر این اندازه میکروحامل تغییر چشمگیری پیدا نکرده است و همچنان در محدوده مناسب برای تزریق در بدن می­باشد.

 

ب

الف

 

شکل 3- تصاویر تهیه شده از میکروحامل حاوی دارو و پوشش شده با کیتوسان: الف) SEM و ب) میکروسکوپ نوری

 

ژلاتین در محیطهای اسیدی دارای بار مثبت است. کیتوسان نیز دارای بار مثبت می‌باشد. براساس مطالعات گذشته (8) انتظار می‌رود که گروه NH3+ در کیتوسان و ژلاتین با O- در شبکه کننده TPP پیوند برقرار کنند. در شکل 4 نمای کلی واکنش بین کیتوسان، ژلاتین و TPP نشان داده شده است.

 

شکل 4- نمای کلی واکنش بین زنجیره کیتوسان و ژلاتین در حضور شبکه کننده TPP

به منظور بررسی گروههای عاملی در میکروحاملهای اتصال عرضی شده از کیتوسان خالص، ژلاتین خالص و نمونه تولید شده با شرایط بهینه تست FTIR تهیه شد (شکل 5). همان طور که مشاهده می­شود تمامی نمونه‌ها یک پیک قوی در حدود cm-1 3430 نشان می­دهند که مربوط به گروههای آمینو (-NH2) و هیدروکسیل (-OH) می‌باشد (8، 20 و 21). در نمونه کیتوسان خالص یک پیک در محدوده cm-1 3000-2840 مشاهده می‌شود که مربوط به گروههای -CH2 و -CH3 موجود در کیتوسان است (8). همچنین در طیفهای مربوط به کیتوسان خالص یک پیک در cm-1 1641 مشاهده می‌شود که مربوط به خمش پیوند  N-H است (8). در ژلاتین خالص نیز پیک cm-1 1638 مربوط به گروه کربونیل (C=O) می‌باشد. همچنین پیکهای ظاهر شده در محدوده cm-1 1000 مربوط به گروههای مختلف آمین است (22). در طیف مربوط به میکروحامل، ترکیبی از طیفهای کیتوسان و ژلاتین خالص با اندکی تفاوت قابل مشاهده می­باشد. پیکهای مربوط به N-H کیتوسان و C=O در ژلاتین به cm-1 1639  انتقال پیدا کرده است. این انتقال برای هر دو گروه آمین و کربونیل نشان دهنده ایجاد ترکیبی با پیوند هیدروژنی بین کیتوسان و ژلاتین است (21).

گولارت و همکاران (25) در تحقیقی اثبات کردند نمونه‌های شبکه­ای شده کیتوسان با TPP یک پیک جدید را در cm-1 1150 نشان می‌دهند. این پیک به پیوند دوگانه P و O اشاره می‎کند. در طیفهای گرفته شده برای این پژوهش، در مورد نمونه‌های کیتوسان-ژلاتین مشاهده شد که یک پیوند در cm-1 1132 وجود دارد که مربوط به کشش پیوند -P=O در یون فسفات می‌باشد. این امر حضور TPP در محصول نهایی و در نتیجه صحت شبکه‌ای شدن زنجیره‌های کیتوسان و ژلاتین را در حضور شبکه کننده TPP اثبات می‌کند (25و26).

 

 

شکل 5- نمودار FTIR از کیتوسان خالص، ژلاتین خالص و میکروحامل اتصال عرضی شده با TPP

 

رهایش دارو: روند رهایش دارو از میکروحامل حاوی دارو در محیط بافر فسفات و در دمای 37 درجه سانتی گراد مورد بررسی قرار گرفت. نمودار رهایش داروی تیکوپلانین از میکروحامل کیتوسان-ژلاتین با پوشش کیتوسان و بدون پوشش در زمانهای مختلف در شکل 6 نشان داده شده است. همان طور که مشاهده می­شود مقدار داروی رها شده از میکروحامل بدون پوشش و با پوشش کیتوسانی پس از یک ساعت به ترتیب برابر 47 درصد و 32  درصد می­باشد که گویای رهایش ناگهانی دارو در نمونه بدون پوشش و تأثیر مثبت پوشش نازک پلیمری در جلوگیری از رهایش ناگهانی دارو می­باشد. در تحقیقی که توسط موفق و همکارانش (12) بر روی رهایش دارو از میکروحاملهای کیتوسانی انجام شد نیز نشان دهنده رهایش زیاد دارو از میکروحامل در روز اول نسبت به روزهای دیگر بود.

 

شکل 6- نمودار رهایش تجمعی داروی تیکوپلانین از میکروحامل کیتوسان-ژلاتین

در پایان روز اول مقدار داروی تجمعی آزاد شده برای نمونه بدون پوشش برابر 21/58 درصد معادل µg/ml 033/148 و برای نمونه پوشش داده شده با کیتوسان برابر 52/54 معادل µg/ml 650/138 می­باشد. در تحقیقی مشابه جیا و همکارانش (27) ساخت و بررسی حاملهای سولفات کلسیم بارگذاری شده با داروی تیکوپلانین را برای درمان عفونتهای استخوانی در مورد نمونه حیوانی گزارش کردند. آنها نیز مشاهده کردند که رهایش دارو از حامل مذکور بعد از گذشت یک روز 08/49 درصد می­باشد. ژانگ و همکارانش (28) نیز ساخت و بررسی حاملهای کیتوسانی بارگذاری شده با داروی تیکوپلانین را برای درمان عفونتهای استخوانی در نمونه حیوانی گزارش دادند. آنها نیز مشاهده کردند که بعد از گذشت یک روز میزان رهایش دارو 46/47 درصد می­باشد. بنابراین به نظر می­رسد به طور کلی میزان رهایش از حاملهای کیتوسانی بارگذاری شده با داروی تیکوپلانین در روز اول آزمایش زیاد است.

پس از پایان روز اول آهنگ رهایش دارو در هر دو نمونه با پوشش و بدون پوشش کاهش یافته است. در هر دو نمونه میزان رهایش از روز ششم به بعد ثابت باقی مانده است و تا روز سی­ام تغییر قابل توجهی در رهایش دارو مشاهده نشده است. به عبارت دیگر مقدار نهایی رهایش دارو از نمونه­های بدون پوشش و دارای پوشش به ترتیب بر روی اعداد 62 درصد (µg/ml 310/158) و 60 درصد (µg/ml 77/152) ثابت شده است. لازم به ذکر است که به دلیل عدم تغییر قابل توجه در میزان رهایش دارو از میکروحاملهای ساخته شده از روز هفتم به بعد، داده­های رهایش برای روزهای هشتم تا سی­ام در شکل 6 نشان داده نشده است.

نتایج تحقیقات دیگر محققین (13، 26، 27 و 28) در این زمینه نیز نشان می­دهد که رهایش داروی تیکوپلانین از حامل آن حدود یک هفته به طول می­انجامد و پس از آن رهایش قابل توجهی حتی پس از گذشت یک ماه از آزمایش، مشاهده نمی­شود.

نکته دیگری که از شکل 6 قابل مشاهده می­باشد کاهش اختلاف در میزان رهایش دارو بین نمونه­های با پوشش و بدون پوشش بعد از گذشت 24 ساعت از رهایش می­باشد؛ به طوری­که 1 ساعت بعد از رهایش این اختلاف حدود 15 درصد بوده است در حالیکه بعد از پایان روز اول این اختلاف به حدود 4 درصد و در پایان روز هفتم به حدود 2 درصد رسیده است. این پدیده احتمالاً به دلیل از بین رفتن روکش نازک کیتوسانی در ساعات اولیه رهایش در اثر رهایش زیاد دارو می­باشد. به عبارت دیگر در پایان روز اول رهایش مقدار قابل توجهی از پوشش کیتوسان پیرامون میکروحامل در اثر رهایش دارو از بین رفته است و رهایش هر دو نمونه با پوشش و بدون پوشش تقریباً با نرخ یکسانی ادامه یافته است.

با توجه به نتایج به دست آمده از تست رهایش دارو تیکوپلانین از میکروحاملهای ساخته شده در کار تحقیقاتی حاضر و مقایسه آن با نتایج دیگر محققین می­توان نتیجه گرفت میکروحاملها نتایج مناسبی برای رهایش دارو نشان می­دهند.

آزمون ضدمیکروبی: برای بررسی تأثیر فرآیند ساخت میکروحاملها بر روی ماهیت ضدمیکروبی داروی تیکوپلانین از آزمون ضدمیکروبی با استفاده از دو نوع باکتری سودوموناس آئروژینوزا (گرم منفی) و استافیلوکوکوس آرئوس (گرم مثبت)  استفاده شد. غلظت نمونه‌های کنترل به کار گرفته شده در این آزمون  عبارت بودند از µg/ml 138 و µg/ml 152 که به ترتیب معادل غلظت داروی آزاد شده در پایان روزهای اول و پنجم رهایش برای نمونه‌های پوشش داده شده با کیتوسان است. از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

در پایان آزمون مشاهده گردید که هاله‌ای دور چاهکها به وجود آمده است. قطر هاله ایجاد شده در محیط استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا در شکل 7 آورده شده است. همان طور که مشاهده می­شود قطر هاله در محیطهای استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا برای محلولهای حاصل از رهایش دارو در پایان روز اول به ترتیب cm 12/0 ± 1/3 و cm 14/0 ± 5/3 اندازه‌گیری شده است. بیندو و همکارانش (7) بر روی خاصیت ضدمیکروبی ترکیب کیتوسان/ژلاتین با استفاده از این دو نوع باکتری مطالعاتی انجام دادند. آنها نشان دادند که قطر هاله ایجاد شده در محیطهای استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا یک روز بعد از آزمایش به ترتیب  cm06/0 ± 37/1 و cm 04/0 ± 26/1 می­باشد. بنابراین، نتایج حاصل از تحقیق حاضر بیانگر تأثیر مثبت بارگذاری دارو برروی خاصیت ضدمیکروبی ترکیب کیتوسان/ژلاتین است. قطر هاله برای نمونه کنترل در پایان روز اول در محیطهای استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا به ترتیب برابر cm 19/0 ± 2/4 وcm  17/0 ± 9/3 به دست آمد که نشان دهنده کاهش اندک فعالیت داروی بارگذاری شده نسبت به داروی خالص است. کاهش فعالیت داروی بارگذاری شده نسبت به داروی خالص در کارهای تحقیقاتی دیگران نیز مشاهده شده است (28و29).

شکل 7- قطر هاله‌های ایجاد شده دور نمونه‌ها

همان طور که مشاهده می­شود قطر هاله تشکیل شده در هر دو محیط استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا برای محلولهای حاصل از رهایش در پایان روز پنجم نسبت به نمونه­های مشابه در روز اول رهایش افزایش یافته است که نشان دهنده افزایش خاصیت ضدمیکروبی آنها می­باشد. با این وجود همانند روز اول رهایش، در این حالت نیز فعالیت ضدمیکروبی نمونه­های کنترل (داروی خالص با غلظت مشابه) نسبت به میکروحاملها بیشتر بوده است. نتایج حاصل بیانگر این مطلب است که داروی آزاد شده از میکروحاملها در پایان این دو روز به خوبی توانسته است از رشد هر دو نوع باکتری استافیلوکوکوس آرئوس و سودوموناس آئروژینوزا جلوگیری کند. به عبارت دیگر با وجودی که داروی آزاد شده در آزمایشها نسبت به داروی خالص اثر خود را اندکی از دست داده است، اما همچنان تأثیر ضد میکروبی مناسبی را از خود نشان می‌دهد.

نتایج به دست آمده در این کار تحقیقاتی نشان داد که میکروحاملهای متخلخل ساخته شده از ترکیب کیتوسان/ژلاتین که با ماده TPP اتصال عرضی شده­اند توانایی جذب و رهایش کنترل شده داروی تیکوپلانین که در درمان عفونتهای غضروفی کاربرد دارد را به خوبی دارا هستند. با این وجود در ساعات آغازین، رهایش دارو به صورت ناگهانی است و نیاز به بهینه سازیهای بیشتر در این زمینه احساس می­شود؛ با این وجود کماکان خاصیت ضد باکتریایی داروی بارگذاری شده طی فرآیند تولید به میزان قابل قبولی حفظ شده است. بنابراین، می­توان انتظار داشت که میکروحاملهای مذکور پتانسیل تزریق درون بدن جهت درمان عفونتهای غضروفی را دارا باشند.

نتیجه­گیری

در این تحقیق میکروحاملهای متخلخل کیتوسان/ژلاتین با قطری در حدود mm 50±350 با استفاده از دستگاه پمپ تزریق مجهز به سیستم ولتاژ بالا تولید شدند. این حاملها قابلیت تزریق درون بدن را دارا می­باشند. همچنین نتایج رهایش داروی تیکوپلانین از این حاملها مشخص ساخت که نمونه­های تولیدی می­توانند طی مدت 5 روز تا حدود 60 درصد رهایش داشته باشند. همچنین خاصیت ضدمیکروبی داروی تیکوپلانین در حین فرآیند تولید حفظ شد. بنابراین می­توان انتظار داشت که ترکیب اتصال عرضی شده کیتوسان/ژلاتین  حامل مناسبی برای بارگذاری دارو تیکوپلانین باشد و بتوان از این حاملها جهت درمان عفونتهای غضروفی و استخوانی درون بدن استفاده نمود.

1- Aalami Harandi B, 1382, Textbook of orthopedics and Fractures, 1st edition, Tehran University of Medical Science Publications.
2- Adibkia K, Barzegar-Jalali M, Javadzadeh Y, Bayrami R, Mohammadi G, 2012, A review on the porous adsorbents in drug delivery systems, Pharm Sci., 18, 2, 103-118.
3- Ahuja G. Pathak K, 2009, Porous Carriers for Controlled/Modulated Drug Delivery, Indian J Pharm Sci., 71, 6, 599–607.
4- Anal AK, Stevens WF, 2005, Chitosan–alginate multilayer beads for controlled release of ampicillin, Int. J. Pharm., 290, 1, 45-54.
5- Baniasadi H, Ramazani  A, Mashayekhan S, 2015, Fabrication and characterization of conductive chitosan/gelatin-based scaffolds for nerve tissue engineering, Int. J. Biol. Macromol., 74, 360–366.
6- Bindu TVLH., Vidyavathi M, Kavitha K, Sastry TP, 2011, Preparation and evaluation of gentamicin loaded chitosan-gelatin composite films for wound healing activity, Int. J. Appl. Biol. Pharm. Technol., 2, 453-463.
7- Dai T, Tanaka M, Huang YY, Hamblin MR, 2011, Chitosan preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing effects, Expert Rev Anti Infect Ther., 9, 7, 857–879.
8- Darley ESR, McGowan AP, 2004, Antibiotic treatment of gram-positive bone and joint infections, J. Antimicrob. Chemo., 53.6, 928-935.
9- Ding H, Zhao CJ, Cui X, Gu YF, Jia WT, Rahaman MN, Wang Y, Huang WH, Zhang CQ, 2014, A Novel Injectable Borate Bioactive Glass Cement as an Antibiotic Delivery Vehicle for Treating Osteomyelitis, PloS one, 9.1, 85472.
10- Hajiabbas M, Mashayekhan S, Nazaripouya A, Naji M, Hunkeler D, Rajabi Zeleti S, Sharifiaghdas F, 2014, Chitosan-gelatin sheets as scaffolds for muscle tissue engineering, Artif. Cells Nanomed. Biotechnol., 43, 124.
11- Jia WT, Luo SH, Zhang CQ, Wang JQ, 2010, In vitro and in vivo efficacies of teicoplanin-loaded calcium sulfate for treatment of chronic methicillin-resistant Staphylococcus aureus osteomyelitis, Antimicrob. Agents Chemo., 54.1, 170-176.
12- Jia  WT , Zhang  X, Luo SH, Liu X, Huang WH, Rahaman MN, Day DE, Zhang CO, Xie ZP, Wang JO, 2010, Novel borate glass/chitosan composite as a delivery vehicle for teicoplanin in the treatment of chronic osteomyelitis, Acta biomaterialia, 6.3, 812-819.
13- Karimian M, Mashayekhan S, Baniasadi H, 2016, Fabrication of porous gelatin-chitosan microcarriers and modeling of process parameters via the RSM method, Int J Biol Macromol, 88, 288-95.
14- Magdalena GD, Czubenko JO, 2010, The effect of ionic crosslinking on thermal properties of hydrogel chitosan membranes, Progress on Chemistry and Application of Chitin and its Derivatives, Polish Chitin Society Lodz, 25-32.
15- Malinowska Panczyk E, Staroszczyk H, Gottfried K, Kolodziejska I, Wojtasz-Paj A, 2015, Antimicrobial properties of chitosan solutions, chitosan films and gelatin-chitosan films, Polimery, 60, 11, 735-741.
16- Mansor BA, Lim JJ, Shameli K, Ibrahim NA, Tay MY, 2011, Synthesis of silver nanoparticles in chitosan, gelatin and chitosan/gelatin bionanocomposites by a chemical reducing agent and their characterization, Molecules, 16, 9, 7237-7248.
17- Movaffagh J, Ghodsi A, Fazly Bazzaz BBS, Sajadi Tabassi SA, Ghodrati Azadi H, 2013, The Use of Natural Biopolymer of Chitosan as Biodegradable Beads for Local Antibiotic Delivery: Release Studies, Jundishapur J. Nat. Pharm. Prod., 8.1, 27.
18- Nagarajan M, Benjakul S, Prodpran T, Songtipya P, Kishimura H, 2012, Characteristics and functional properties of gelatin from splendid squid (Loligo formosana) skin as affected by extraction temperatures, Food Hydrocolloids, 29, 2, 389-397.
19- Park JH, Saravanakumar G, Kim K, Kwon IC, 2010, Targeted delivery of low molecular drugs using chitosan and its derivatives, Adv. Drug Deliv. Rev., 62, 1, 28-41.
20- Pasparakis G, Bouropoulos N, 2006, Swelling studies and in vitro release of verapamil from calcium alginate and calcium alginate–chitosan beads, Int. J. Pharm., 323, 1, 34-42.
21- Pierog M, Druzynska MG, Czubenko JO, 2009, Effect of ionic crosslinking agents on swelling behavior of chitosan hydrogel membranes, Progress on Chemistry and Application of Chitin and Its Derivatives, 14, 75-82.
22- Ribeiro AJ, Neufeld R J, Arnaud P, Chaumeil JC, 1999, Microencapsulation of lipophilic drugs in chitosan-coated alginate microspheres, Int. J. Pharm., 187, 1, 115-123.
23- Sriamornsak P, Nunthanid J, Cheewatanakornkool K, Manchun S, 2010, Effect of Drug Loading Method on Drug Content and Drug Release from Calcium Pectinate Gel Beads, AAPS Pharm Sci Tech, 11, 3, 1315-1319.
24- Suna L, Chen Y, Zhou Y, Guo D, Fana Y, Guo F, Zheng Y, Chen W, Preparation of 5-fluorouracil-loaded chitosan nanoparticles and study of the sustained release in vitro and in vivo, 2017, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 12, 5, 418-423.
25- Ueng SWN, Lin SS, Wang IC, Yang CY, Cheng RC, Liu SJ, Chan EC, Lai CF, Yuan LJ, Chan SC, 1999, In vitro elution of vancomycin from biodegradable beads, J. Biomed. Mater. Res., 48, 5, 613-620.
26- Vasconcellos FC, Goulart GAS, Beppu MM, 2011, Production and characterization of chitosan microparticles containing papain for controlled release applications, Powder Technol., 205, 1, 65-70.
27- Wichelhaus TA, Dingeldein E, Rauschmann M, Kluge S, Dieterich R, Schafer V, Brade V, 2001, Elution characteristics of vancomycin, teicoplanin, gentamicin and clindamycin from calcium sulphate beads, J. Antimicrob. Chemo., 48.1, 117-119.
28- Yenice I, Cali S, Kas H, Ozalp M, Ekizoglu M, Hincal A, 2002, Biodegradable implantable teicoplanin beads for the treatment of bone infections, Int. J. Pharm., (242.1, 271-275.
29- Zhang X, Jia W, Gu Y, Xiao W, Liu X, Wang D, Zhang C, Huang W, Rahaman,MN, Day DE, Zhou N, 2010, Teicoplanin-loaded borate bioactive glass implants for treating chronic bone infection in a rabbit tibia osteomyelitis model, Biomaterials, 31.22, 5865-5874.