نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسنده

Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

چکیده

نانوذرات بدلیل ویژگی‌های منحصربفرد فیزیکوشیمیایی کاربرد گسترده‌ای در زمینه زیست‌فناوری دارند. سیر (Allium sativum) از دیرباز بصورت گسترده بعنوان دارو و ادویه استفاده می‌شود. آلیسین بعنوان مهم‌ترین ماده مؤثره سیر اثرات زیستی بسیار متنوعی دارد. هدف این پروژه، بررسی اثر دو الیسیتور غیرزیستی نانوذرات نقره و نیترات نقره بر رشد و برخی از پارامترهای بیوشیمیایی ریزنمونه‌های سیر می‌باشد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره، وزن تر، میزان آلیسین و پروتئین، فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول پراکسیداز کمتر از گیاهان کنترل اندازه‌گیری شد. در غلظت 25 میلی گرم در لیتر نانوذره نقره افزایش رشد و محتوای آلیسین و پروتئین نمونه‌ها مشاهده شد. میزان آلیسین نمونه‌های تیمار شده با نانوذرات نقره در هر دو غلظت بالاتر از بقیه تیمارها، گیاهان در معرض نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر مشابه کنترل و در غلظت 50 میلی گرم در لیتر از همه تیمارها کمتر بود. بدلیل نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر احتمالاً نانوذرات نقره کاندیدای خوبی برای افزایش میزان آلیسین سیر باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of abiotic elicitor effects on some biochemical parameters of garlic

نویسنده [English]

  • Parisa Fathi Rezaei

Department of Biology, Faculty of Science, University Of Maragheh

چکیده [English]

Nanoparticles due to their unique physicochemical properties, are widely used in biotechnology. Garlic (Allium sativum) is used as spice and drug for many years. Allicin as the best known active compound of garlic has a vast variety of biological effects. In this project effect of two abiotic elicitors including silver nanoparticles (AgNPs) and silver nitrate on growth and some biochemical parameters of garlic explants were studied. On silver nitrate-exposed samples; fresh weight, allicin, protein and cysteine contents, and catalase and guaiacol peroxidase activity was less than control. On AgNPs 25 ppm, growth, allicin, protein and cysteine contents was higher than untreated explants. Allicin content of AgNPs-treated explants was greater than the other treatments, on 25 ppm silver nitrate similar to control group and in 50 ppm-treated explants was the least. In conclusion because of the medicinal effects of allicin probably AgNPs could be a good candidate to increase allicin content.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Allicin
  • antioxidative enzyme
  • biotic elicitor
  • garlic
  • protein

ارزیابی اثر الیسیتور غیرزیستی بر برخی پارامترهای بیوشیمیایی گیاه سیر

پریسا فتحی رضایی*

ایران، مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 8/8/97                  تاریخ پذیرش: 12/5/98

چکیده

نانوذرات به دلیل ویژگیهای منحصربه فرد فیزیکوشیمیایی کاربرد گسترده­ای در زمینه زیست­فناوری دارند. سیر (Allium sativum) از دیرباز به صورت گسترده به عنوان دارو و ادویه استفاده می­شود. آلیسین به عنوان مهم­ترین ماده مؤثره سیر اثرات زیستی بسیار متنوعی دارد. هدف این پروژه، بررسی اثر دو الیسیتور غیرزیستی نانوذرات نقره و نیترات نقره بر رشد و برخی از پارامترهای بیوشیمیایی ریزنمونه­های سیر می­باشد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره، وزن تر، میزان آلیسین و پروتئین، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و گایاکول پراکسیداز کمتر از گیاهان کنترل اندازه­گیری شد. در غلظت 25 میلی گرم در لیتر نانوذره نقره افزایش رشد و محتوای آلیسین و پروتئین نمونه­ها مشاهده شد. میزان آلیسین نمونه­های تیمار شده با نانوذرات نقره در هر دو غلظت بالاتر از بقیه تیمارها، گیاهان در معرض نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر مشابه کنترل و در غلظت 50 میلی گرم در لیتر از همه تیمارها کمتر بود. به دلیل نقش مهم آلیسین در خواص دارویی سیر احتمالاً نانوذرات نقره کاندیدای خوبی برای افزایش میزان آلیسین سیر باشد.

واژه­های کلیدی: آلیسین، آنزیم آنتی اکسیدان، الیسیتور زیستی، پروتئین، سیر

* ﻧﻮﻳﺴﻨﺪه ﻣﺴﺌﻮل، ﺗﻠﻔﻦ: 37273060-041، پست اﻟﻜﺘﺮونیک: [email protected]

مقدمه

 

سیر با نام علمی Allium sativum گیاهی از راسته مارچوبه‌ایها و متعلق به خانواده لیلیاسه است. متابولیت ثانویه در سیر اسید آمینه غیرپروتئینی به نام آلئین است که تحت تأثیر آنزیم آلییناز به ترکیب فرار دی آلیل تیوسولفینات (آلیسین) تبدیل می‌شود (18). آلیسین به عنوان یکی از مهمترین ترکیبات ارگانوسولفوره سیر دارای خواص زیستی و دارویی وسیعی از جمله ضد‌میکروبی، ضد‌سرطانی، ضد‌فشارخون، ضد‌آرتریت، تعدیل‌‌کننده سیستم ایمنی، ضد‌پیری، سم‌زدایی فلزات سنگین و کاهنده قند و چربی خون می­باشد (6).

الیسیتورها ترکیباتی هستند که از طریق القای پاسخهای دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانویه می­شوند. امروزه با پیشرفت فناوری، روشهای متعددی برای تولید متابولیتهای ثانویه وجود دارد شامل استفاده از الیسیتورهای زیستی مانند الیسیتورهای قارچی، باکتریایی و مخمر و الیسیتورهای غیرزیستی مانند پلی ساکاریدها، گلیکوپروتئینها، آنزیمهای غیر فعال شده و نمکهای فلزات سنگین (7). الیسیتورها ممکن است با فعالسازی ژنهای برخی از آنزیمها در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه­اندازی کنند و باعث تشکیل متابولیتهای ثانویه شوند. میزان اثر الیسیتور بر تولید متابولیتهای ثانویه در کشت بافت به غلظت و مدت زمان تیمار وابسته است (25).

نانوذرات نقره (AgNPs) حاوی یونهای نقره هستند و معمولاً دامنه اندازه آنها از 100- 10 نانومتر متغیر است. این نانوذرات، به دلیل اندازه کوچک­شان دارای سطح تماس بالا می­باشند. بنابراین، میزان چسبندگی آنها به سطوح سلولی افزایش یافته و به همین دلیل کارآیی آنها نسبت به سایر ترکیبات بیشتر می­شود (23). بسته به خواص نانو ذرات، این مواد در گیاهان بسیاری از تغییرات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی را اعمال می‌کنند. اثر نانو ذرات به ترکیب شیمیایی، اندازه، پوشش سطح، واکنش­پذیری و از همه مهمتر غلظت نانوذره وابسته بوده و از گیاهی به گیاه دیگر متفاوت است (24).

با این حال، گزارشهای بسیار کمی در ارتباط با تأثیر نانوذرات نقره بر عملکرد و میزان تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی وجود دارد. با بررسیهای انجام شده در پایگاههای اطلاعاتی مختلف تاکنون گزارشی مبنی بر تأثیر نانوذرات نقره بر میزان تولید آلیسین در گیاه سیر وجود ندارد. بر همین اساس، در این تحقیق تأثیر غلظتهای مختلف نیترات نقره (AgNO3) و نانوذرات نقره بر تولید آلیسین گیاه سیر در شرایط کشت درون‌شیشه­ای بررسی شده است.

مواد و روشها

کشت و آماده­سازی نمونه­های گیاهی و اعمال تیمارها: صفحه پایگاهی بوته­های سیر شهرستان آذرشهر (واقع در استان آذربایجان­شرقی) پس از ضدعفونی سطحی با توئین و محلول هیپوکلریت سدیم 50 درصد و الکل اتیلیک 70 درصد به ترتیب به مدت 30 و 10 دقیقه و شستشو با آب مقطر استریل در محیط کشت جامد موراشیگ و اسگوک (MS) کشت شدند. ریزنمونه­ها در محیط کشت MS کشت و پس از 4 هفته به محیطهای کشت تازه حاوی غلظتهای مختلف نانو­ذره نقره (اندازه 5/4 نانومتر و کروی شکل، توسط آقای دکتر رستم­نیا همکار محترم گروه شیمی دانشگاه سنتز شده بود) و نیترات نقره (0، 25 و 50 میلی­گرم در لیتر) منتقل شدند. به مدت یک هفته تمامی ریز­نمونه­ها در داخل فیتوترون با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و دمای 27 درجه سانتی گراد نگهداری، و نمونه­های جمع­آوری شده به منظور انجام آزمایشهای بعدی در فریزر نگهداری شدند.

اندازه­گیری رشد ریزنمونه­های سیر: قبل از جمع­آوری، ویژگیهای مورفولوژیکی نمونه­ها بررسی شد. میزان وزن تر نمونه­ها با استفاده از ترازو ثبت شد.

عصاره­گیری از نمونه­های گیاهی به منظور بررسی محتوی آلیسین: عصاره­گیری از نمونه­های گیاهی و بررسی محتوی آلیسین به روش ایبرل انجام شد (16). بدین منظور، یک گرم از بافت تر گیاهی ساییده، و با افزودن 30 میلی­لیتر آب در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. سپس نمونه­ها در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. در ادامه 400 میکرولیتر از فاز رویی با فاز متحرک به حجم 1 میلی­لیتر رسانده و مجدداً به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. در خاتمه محلول رویی به منظور سنجش میزان آلیسین در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد. بررسی میزان آلیسین نمونه­های سیر با استفاده از دستگاه HPLC و ستون C18 در طول موج 254 نانومتر، سرعت جریان حلال 1 میلی­لیتر بر دقیقه و فاز متحرک شامل متانول، آب و استونیتریل به نسبت 9 : 41 : 50 انجام شد. در نهایت 20 میکرولیتر عصاره گیاهی به دستگاه تزریق شد. محتوای آلیسین در نمونه­های مورد بررسی بر اساس زمان بازداری به دست آمده از ترکیب استاندارد و سطح زیر منحنی پیکهای مربوط به هر نمونه، با استفاده از نمودار استاندارد آلیسین محاسبه شد.

سنجش میزان سیستئین کل: میزان سیستئین محلول کل به روش گایتوند اندازه­گیری شد (12). به این صورت که ابتدا 50 میلی­گرم از نمونه گیاهی با 1 میلی لیتر اسید پرکلریک 5 درصد به مدت 6 دقیقه در سونیکاتور قرار داده شد. سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و با سرعت  10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده، بعد از اتمام زمان مورد نظر، محلول رویی جمع­آوری و برای سنجش مورد استفاده قرار گرفت. برای اندازه­گیری، ابتدا 200 میکرولیتر از عصاره گیاهی با 200 میکرولیتر معرف نین هیدرین و 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال مخلوط و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم 90 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از اتمام زمان مورد نظر، سریعاً به حمام آب سرد انتقال داده و میزان جذب نمونه­ها در طول موج 560 نانومتر به وسیله اسپکتروفتومتر قرائت شد. منحنی استاندارد با استفاده از غلظتهای مختلف سیستئین(15 و 10، 8، 6، 4، 2، 1 میکرو­گرم در میلی لیتر) رسم و در نهایت غلظت سیستئین محلول نمونه­های گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد بر حسب میکروگرم بر گرم بافت­تر گیاهی محاسبه شد.

استخراج و سنجش پروتئین محلول کل از گیاهچه­های سیر: مقدار نیم گرم از بافت تر گیاهی در هاون چینی با افزودن 50 میلی گرم پلی وینیل پیرولیدن (Polyvinylpyrrolidone) و 5/1 میلی لیتر از بافر فسفات پتاسیم (pH=7) ساییده و با دور rpm 15000 در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس فاز رویی در ویالهای کوچکتر تقسیم و ویالها در فریزر 80- درجه سانتی گراد به منظور انجام مطالعات بعدی نگهداری شد. میزان پروتئین محلول کل در این بررسی به روش بردفورد تعیین شد (2).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT, EC: 1.11.1.6) به روش ابی اندازه گیری شد (4). به این ترتیب که 20 میکرولیتر عصاره آنزیمی با بافر فسفات پتاسیم 100میلی مولار (pH=7) آب مقطر استریل و پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7) (750 میکرولیتر) مخلوط شدند. فعالیت آنزیم کاتالاز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازه­گیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی به عنوان بلانک استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تجزیه شدن پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر و با استفاده از معادله (1) محاسبه شد. فعالیت ویژه آنزیم کاتالاز به صورت تعداد میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین گزارش شد.

∆A240 × I× Vt × df

= فعالیت آنزیم (واحد در میلی لیتر)

Vs× t×  l   Ꜫ ×

∆A240: تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع و پایان واکنش

l: ضریب پراکسیدهیدروژن در معادله، Vt: حجم مخلوط واکنش، df: فاکتور رقیق­کننده، t: مدت زمان واکنش، Vs: حجم نمونه،

ε: ضریب خاموشی برابر mM-1cm-1 4/39 و l: طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش.

سنجش فعالیت گایاکول پراکسیداز: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (POX, EC: 1.11.1.7) به روش چانس و مهلی اندازه گیری شد (10). مخلوط واکنش شامل محلولهای بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (PH=7)، گایاکول ده میلی مولار محلول در آب دوبار تقطیر، پراکسید هیدروژن 70 میلی مولار محلول در فسفات پتاسیم 100 میلی مولار (pH=7)، آب دوبار تقطیر استریل و عصاره آنزیمی است. فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر در مدت زمان 180 ثانیه اندازه­گیری شد. از مخلوط بدون عصاره آنزیمی به عنوان بلانک استفاده شد. فعالیت ویژه آنزیم پراکسیداز به صورت تعداد میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین گزارش شد.

∆A270 × I× Vt × df

= فعالیت آنزیم (واحد در میلی لیتر)

Vs× t×  l   Ꜫ ×

∆A270: تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع و پایان واکنش، l: ضریب پراکسیدهیدروژن در معادله، Vt: حجم مخلوط واکنش، df: فاکتور رقیق­کننده، t: مدت زمان واکنش، Vs: حجم نمونه، ε: ضریب خاموشی برابر mM-1cm-1 6/26 و l: طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش.

آنالیز آماری: به منظور مقایسه نتایج به­دست آمده و تعیین اهمیت تفاوتهای مشاهده شده در آزمایشات از نرم افزار SPSS (ویرایش 22) استفاده شد. جهت بررسی تفاوت بین گروههای آزمایشی از آنالیز واریانس یک طرفه (one-way ANOVA) و سپس برای مقایسه میانگین گروهها از آزمون دانکن استفاده شد. نتایج آزمایشها به صورت .Mean±S.D داده­های حاصل از حداقل 3 بار آزمایش مجزا ارائه و نتایج آنالیزهای آماری با مقدار P کوچک­تر از 05/0 معنی­دار در نظر گرفته شد. رسم نمودارها به وسیلهMicrosoft Excel انجام گرفت.

نتایج

پس از اینکه نرمال بودن توزیع اشتباهات آزمایشی توسط آزمون کولموگروف اسمیرنوف تک نمونه­ای و بررسی یکنواختی واریانس گروههای آزمایشی با استفاده از آزمون لون در سطح احتمال 5 درصد، تجزیه واریانس داده­ها بر اساس آزمون فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی انجام پذیرفت که در جدول 1 آمده است.

 

جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در ریزنمونه­های گیاه سیر

(M.S) میانگین مربعات

df

منابع تغییر

وزن تر

آلیسین

سیستئین

پروتئین

کاتالاز

گایاکول پراکسیداز

 

 

019/0 **

432/44 **

381/2523 **

896/32  **

078/0  n.s

276/13  **

1

اندام

031/0 **

073/176 **

37/1872 **

62/2 **

138/0 *

66/3 **

4

تیمار

015/0 *

45/80 **

66/361 **

25/2 **

44/2 **

35/12 **

4

اندام × تیمار

001/0

086/3

616/6

028/0

040/0

045/0

10

خطا

n.s، * و ** به ترتیب غیرمعنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد است.


تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر رشد ریزنمونه­های سیر: اثر اعمال الیسیتورها بر وزن تر گیاه در شکل 1 آمده است.

 

شکل 1- تأثیر نانوذرات نقره و نیترات نقره بر وزن تر ریزنمونه­ها. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند. CTRL: کنترل، AgNPs: نانوذرات نقره و AgNO3: نیترات نقره.

کاهش معنی­دار (در سطح 1 درصد) وزن تر در ریشه­های تیمار شده با نیترات نقره 25 و و50 میلی گرم در لیتر نسبت به کنترل مشاهده شد. در بخش هوایی نمونه­های تیمار شده با نیترات نقره 50، نانونقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر کاهش معنی­دار (در سطح 1 درصد) وزن تر نسبت به کنترل مشاهده شد.

تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان آلیسین ریزنمونه­های سیر: کروماتوگرام آلیسین مورد استفاده برای اندازه­گیری میزان آلیسین بیوسنتز شده در نمونه­های گیاهی در شکل (2-الف) و میزان تولید آلیسین در نمونه­های مختلف گیاهی با استفاده از این کروماتوگرام به صورت نمودار در شکل (2-ب) نشان داده­ شده است. در نمونه­های تیمار شده با نانونقره 25 میلی گرم در لیتر در هر دو بخش ریشه و هوایی میزان آلیسین نسبت به کنترل افزایش نشان داد که افزایش در بخش ریشه معنی­دار (در سطح 1 درصد) بود. میزان آلیسین در نمونه­های تیمار شده با نانونقره 50 میلی گرم در لیتر در بخش ریشه و هوایی افزایش معنی­دار (در سطح 1 درصد) نسبت به کنترل مشاهده شد. در نمونه­های تیمار شده با نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر میزان آلیسین در هر دو بخش هوایی و ریشه تفاوت معنی­دار با نمونه های کنترل مشاهده نشد، در مقابل میزان آلیسین در نمونه­های در معرض 50 میلی گرم در لیتر نیترات نقره میزان آلیسین در هر دو بخش کاهش قابل توجه و معنی­­دار (در سطح 1 درصد) نسبت به کنترل نشان داد.

 

 

شکل 2- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان آلیسین بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونه­های سیر. الف) کروماتوگرامHPLC  آلیسین. ب) میزان محتوای آلیسین تام در ریزنمونه­های سیر تحت تیمار با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3) است. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند.


اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر محتوای سیستئین تام ریزنمونه­های سیر: از آنجائی که اسید آمینه سیستئین پیش­ ماده سنتز آلیسین می­باشد، لذا تغییرات میزان سیستئین نمونه­های سیر در پایان بازه­های زمانی مورد نظر مورد سنجش قرار گرفت که نتایج در شکل 3 آمده است. بر اساس نتایج حاصل از ارزیابی میزان سیستئین تحت تیمار­های مختلف، بیشترین میزان اسید­آمینه سیستئین و تفاوت معنی­دار (در سطح 1 درصد) با تمام گروهها در نمونه­های تیمار شده با نانوذره نقره سنجش شد که در هر دو بخش ریشه و بخش هوایی مربوط به غلظت 50 میلی­گرم در لیتر نانوذره نقره بود. در بخش ریشه و هوایی گیاهان در معرض نیترات نقره کمترین میزان اسیدآمینه سیستئین نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد.

تأثیر نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان پروتئین کل ریزنمونه­های سیر: نتایج حاصل از اندازه­گیری میزان پروتئین کل در نمونه­های گیاهی در شکل 4 نشان داده شده است. میزان پروتئین کل بخش هوایی در نمونه­های تیمار شده و نشده به طور معنی­داری (در سطح 1 درصد) بیشتر از میزان آن در بخش ریشه بود. بیشترین میزان پروتئین در بخش هوایی گیاهان تیمار شده با نانو ذره نقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر مشاهده شد. میزان پروتئین بخش ریشه در نمونه­های تیمار شده با نیترات نقره 50 میلی گرم در لیتر کمتر از سایر تیمارها بود.

تأثیر تیمار نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز ریزنمونه­های سیر: نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در نمونه­های گیاهی در شکل 5 نشان داده شده است.  

 

 

شکل 3- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر محتوای سیستئین تام ریزنمونه­های سیر. الف) منحنی استاندارد سیستئین. ب) میزان محتوای سیستئین تام در ریزنمونه­های سیر تحت تیمار با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3). میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند.

 

 

شکل 4- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر میزان پروتئین کل بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونه­های سیر. الف) نمودار استاندارد پروتئین سرم آلبومین گاوی. ب) میزان پروتئین نمونه­های تیمار شده با نانوذره نقره (AgNPs) و نیترات نقره (AgNO3). میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند.


با توجه به نتایج حاصل، در بخش ریشه گیاهان تیمار شده با نانوذره نقره در هر دو غلظت، فعالیت آنزیم افزایش معنی­دار (در سطح 1 درصد)  نسبت به شاهد، در مقابل در بخش اندام هوایی در هر دو غلظت نانو ذره نقره میزان فعالیت آنزیم کاهش معنی­دار (در سطح 1 درصد) نسبت به شاهد مشاهد شد. در گیاهان تیمار شده با نیترات نقره در هر دو غلظت و در هر دو بخش کاهش معنی­دار (در سطح 1 درصد)  نسبت به کنترل مشاهده شد.

 

شکل 5- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونه­های سیر. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند.

تأثیر تیمار نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم کاتالاز ریزنمونه­های سیر: با توجه به نتایج بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز (شکل 6) فعالیت آنزیم در بخش ریشه گیاهان تیمار شده با نیترات نقره نسبت به کنترل به طور معنی­دار (در سطح 1 درصد) نسبت به شاهد افزایش اما در بخش هوایی نسبت به شاهد کاهش مشاهده شد. در بخش ریشه و هوایی گیاهان تیمار شده با نانوذره نقره تفاوت معنی­دار نسبت به کنترل مشاهده نشد.

 

شکل 6- اثر الیسیتور نانوذره نقره و نیترات نقره بر فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) بخش ریشه و اندام هوایی ریزنمونه­های سیر. میانگینهای با ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﺑﺎﻻی ﻧﻤﻮدارﻫﺎ در هر ستون بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در ﺳﻄﺢ 5 درﺻﺪ اختلاف ﻣﻌﻨﻲ­داری دارند.

بحث

تجمع ﻧﻘﺮه در غلظتهای ﺑﺎﻻ، اﺣﺘﻤﺎل اﺛﺮات ﻛﺸﻨﺪه آن را اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻲدﻫﺪ. ﺳﻤﻴﺖ ﻧﻘﺮه در محیطهای آﺑﻲ ﺑﻪ ﻏﻠﻈﺖ یونهای ﻧﻘﺮه آزاد واﺑﺴﺘﻪ اﺳﺖ و ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻴﺰان دﺳﺘﺮﺳﻲ زﻳﺴﺘﻲ ﺑﻪ ﻳﻮن ﻧﻘﺮه از ﺳﻤﻴﺖ آن ﻣﻲﻛﺎﻫﺪ. ﺑﻪ ﻃﻮر ﻛﻠﻲ در ﻣﻴﺎن ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﻧﻘﺮه­دار، ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﻗﺎﺑﻞ ﺣﻞ ﻣﺎﻧﻨﺪ نیترات ﻧﻘﺮه ﺳﻤﻴﺖ ﺑﻴﺸﺘﺮی ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ اﺷﻜﺎل ﻏﻴﺮﻗﺎﺑﻞ ﺣﻞ ﻧﻘﺮه دارﻧﺪ. ﺣﺴﺎﺳﻴﺖ ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی ﻋﺎﻟﻲ ﺧﺸﻜﻲزی ﮔﻴﺎﻫﻲ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺳﻤﻴﺖ ﻧﺎﺷﻲ از ﻧﻘﺮه ﻣﺘﻨﻮع اﺳﺖ (1).

بر اساس گزارش سیف سهندی و همکاران، پاشش برگی نیترات نقره (0، 10، 20 و 30 میلی مولار) و نانوذره (0، 2/0، 4/0 و 6/0 میلی مولار) بر ویژگیهای رویشی و فیتوشیمیایی گیاه گل گاوزبان در مرحله گل­دهی، به طور معنی­داری ویژگیهای رشدی (مانند تعداد برگ، سبزینگی برگها، وزن خشک گیاه، وزن خشک گل آذین و ریزش گلبرگ) و فیتوشیمیایی (محتوای فنول، تانن و آلکالوئید، درصد موسیلاژ و شاخص تورم) را افزایش داد. که از میان تیمارهای استفاده شده، تیمار 6/0 میلی مولار نانوذرات نقره از بقیه تیمارها کارآیی بیشتری داشت (28). در مطالعه استامپلیس و همکاران، نانوذرات اکسید روی تفاوت معنی­داری در جوانه­زنی بذر گیاه کدو سبز و رشد طول ریشه این گیاه ایجاد نکرد، درحالی که اعمال غلظت مشابه نانوذرات مس و نقره باعث مهار رشد ریشه شد (31). نانوذرات نقره با اندازه متفاوت (80-20 نانومتر) در گیاه شاهی تاله حتی در غلظت بسیار پایین، منجر به کاهش رشد این گیاه در مقایسه با گروه شاهد شد. در این آزمایش افزایش غلظت نانوذرات نقره، همراه با کاهش وزن تر ریشه و طول ریشه بوده­ است که این نتیجه می­تواند به دلیل افزایش سمیت نانوذره بوده باشد (22). خاصیت ضد قارچی و باکتریایی نانوذرات نقره - سیلیکات در گیاهان نشان داده شده ­است. علاوه بر این، این ترکیب بدون عوارض سمی در گیاهان مورد آزمایش، به عنوان عامل کنترل کننده بیماری در گیاه نیز معرفی شده ­است (19).  با افزایش غلظت نانوذرات نقره، رشد ریشه گیاه
Lolium multiflorum کاهش یافت که می­تواند بیانگر افزایش سمیت نانوذرات باشد (34). بر اساس نتایج حاصل از این بررسی، تیمار نانوذره در هر دو غلظت و در هر دو بخش اثر کاهشی معنی­دار بر میزان وزن تر ریزنمونه­های سیر نسبت به شاهد نداشته، در مقابل، هر دو غلظت نیترات نقره در هر دو بخش موجب کاهش معنی­دار میزان وزن تر نمونه­ها نسبت به شاهد شده است که احتمالاً می­تواند ناشی از اثر نیترات نقره باشد.

طی پژوهشهای متعددی، دانشمندان اقدام به اندازه­گیری ترکیبات دارویی موجود در گیاه سیر و موسیر، به ویژه ترکیب دارویی آلیسین نموده­اند و بدین منظور روشهای متعددی نیز پیشنهاد شده ­است. در روش HPLC مقدار آلیسین گزارش شده، بسته به محیط رشد گیاه، شرایط استخراج، روش سنجش، طول موج اندازه­گیری، فاز متحرک و شدت جریان حلال نتایج مختلفی گزارش شده ­است. در عصاره­گیری موسیر با استفاده از اتانول و اتیل­اتر و HPLC با فاز متحرک دی­هیدروژن فسفات، اسید هپتان سولفونیک و استونیتریل، مقدار آلیسین را 78/5 میلی­گرم در لیتر گزارش شده است (13). در حالی که میزان آلیسین در عصاره کلروفرمی موسیر به روش HPLC با فاز موبایل متانول، آب، اسید فرمیک، 1/0 ± 4/3 میلی­گرم در یک گرم وزن خشک تعیین شده است (14).

مقدار آلیسین در عصاره آبی گیاه سیر به روش HPLC با فاز موبایل آب و متانول، 01/0 ± 48/0 میلی­گرم در میلی­لیتر گزارش شده ­است (8). مطالعه24 واریته سیر جمع­آوری شده از نقاط مختلف ایران که با استفاده از اسید فرمیک، متانول و آب عصاره گیری شده بودند، میزان آلیسین به روش HPLC با فاز موبایل متانول و آب در تمام اکوتیپهای بررسی شده، بیشتر از استانداردهای بین­المللی (5/4 میلی­گرم بر گرم وزن تر) گزارش شده ­است (9).

در بررسی سیرهای کشت شده در آرژانتین، چین، ایتالیا و اسپانیا به ترتیب، میزان 6/3، 4/4،7/3، 5/4 میلی­گرم آلیسین در یک گرم وزن­تر گیاه گزارش شده ­است (16). افزایش میزان آلیین در نمونه­های سیر کشت شده در مزرعه تحت تأثیر کود سولفات کلسیم (200 کیلوگرم در هکتار) گزارش شده است (17). برخی از مطالعات نیز تأثیر شرایط محیطی بر محتوای آلیسین را اثبات کرده ­است. برای مثال مشخص شده که میزان آلیسین سیر نگهداری شده در مقایسه با سیر تازه برداشت شده بیشتر است و همچنین مشخص شده که دمای پایین محیط (6-4 درجه سانتی گراد) و رطوبت بالا باعث افزایش چشمگیر میزان آلیسین می­شود. طبق گزارشهای انجام شده، دلیل این افزایش فعالیت حداکثری آنزیم گاما-گلوتامیل ترانس پپتیداز (آنزیم مرحله نهایی تشکیل آلیین) در دمای 4 درجه سانتی گراد است (32). در مرور منابع، گزارشی در مورد اثر نانوذرات بر میزان آلیسین گیاه سیر مشاهده نشد. میزان آلیسین نمونه­های در معرض نانونقره در هر دو بخش نسبت به کنترل بیشتر بود، قابل ذکر است که در بخش ریشه و اندام هوایی به ترتیب کاهش و افزایش میزان آلیسین با افزایش غلظت مشاهده شد. در نمونه­های تیمار شده با نیترات نقره 25 میلی گرم در لیتر میزان آلیسین در هر دو بخش نسبت به کنترل تفاوت غیر معنی­دار بود، اما در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کاهش شدید نسبت به کنترل مشاهده شد.

میزان پروتئین کل اندام هوایی در نمونه­های در معرض نانوذرات نقره 25 و 50 میلی گرم در لیتر نسبت به شاهد افزایش معنی­داری نشان داد. در مقابل میزان پروتئین کل هر دو بخش در گیاهان در معرض نیترات نقره کاهش معنی­دار نسبت به کنترل نشان داد که نتایج با نتایج مربوط به سنجش آنزیمی در ارتباط می­باشد. در معرض قرار دادن گیاهان با فلزات سنگین موجب القای پاسخهای زیادی در سطح فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی می­گردد. برخی مطالعات نشان داده­اند که فلزات سنگینی مانند کادمیوم، سرب، نیکل و نقره موجب تغییر در مقدار پروتئین کل گیاهان می­شوند (33).

در مطالعات دیگری مشخص شده که نانوذرات نقره اعمال شده بر گیاه Bacopa monnieriباعث کاهش محتوای پروتئین و از طرفی، باعث افزایش میزان کربوهیدرات کل این گیاه شده است. گزارش شده که این نتایج، نشان دهنده برهمکنش این نانوذرات با پروتئینهای مرتبط با فتوسیستمها، مکانیسمهای سنتز نشاسته و یا انتقال کربوهیدراتها در گیاه بوده ­است (21).

در ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﺶ از ﺣﺪ ﮔﻮﻧﻪ­ﻫﺎی ﻓﻌﺎل اﻛﺴﻴﮋن (Reactive oxygen species, ROS) ﺑﺎﻋﺚ آﺳﻴﺐ ﺑﻪ DNA، ﭘﺮوتئینهای ﺳﺎﺧﺘﺎری و ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ ﻣﻲ­ﺷﻮﻧﺪ و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﻣﻲ­ﺗﻮاﻧﻨﺪ واکنشهای زﻧﺠﻴﺮه­ای غیرقابل ﻛﻨﺘﺮل ﻣﺜﻞ واکنشهای اﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن و ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن را موجب شوند. از ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ ﻋﻮاﻣﻠﻲ ﻛﻪ ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ در ﮔﻴﺎﻫﺎن را اﻟﻘﺎء ﻣﻲ­ﻧﻤﺎﻳﻨﺪ می­توان به ﻓﻠﺰات ﺳﻨﮕﻴﻦ از ﻗﺒﻴﻞ ﻛﺒﺎﻟﺖ، ﻣﺲ، آﻟﻮﻣﻴﻨﻴﻮم، ﻧﻴﻜﻞ و ﻧﻘﺮه اشاره کرد. ﮔﻴﺎﻫﺎن از ﻃﺮﻳﻖ دو ﻣﺴﻴﺮ ﺳﻴﺴﺘﻢ آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪان؛ آﻧﺰﻳﻤﻲ و ﻏﻴﺮآﻧﺰﻳﻤﻲ ﺳﻤﻴﺖ اﻳﻦ رادیکالها را ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻲ­دﻫﻨﺪ. در ﺷﺮاﻳﻂﻛﻨﺘﺮل ﺷﺪه از اﻳﻦﻓﻠﺰات ﻣﻲﺗﻮان ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻣﺤﺮک ﺑﺮای ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﺘﺎﺑﻮلیتهای ﺛﺎﻧﻮیه ﻛﻪ ارزش داروﻳﻲ ﺑﺴﻴﺎری دارﻧﺪ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﻗﺮار داد (3). حفظ سطح مناسب و صحیح گونه­های واکنشگر اکسیژن برای رشد و سیگنالینگ مهم می­باشد، به عنوان مثال، گونه­های واکنشگر اکسیژن در رشد قطبی سلول، مسیر سیگنالیگ اسید آبسیزیک و در پاسخ به پاتوژنها دخالت دارند (11).

در مطالعه یوسفی و همکاران، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﺗﻴﻤﺎر ﺑﺎ ﻏﻠﻈﺖ 25 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه به صورت ﻣﻌﻨﻲدار ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻧﺸﺎن ﻣﻲدﻫﺪ. وﻟﻲ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻏﻠﻈﺖ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر در ﻣﺤﻴﻂ (در تیمار ﺑﺎ غلظتهای 50 و 100ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر) ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲ دار ﻳﺎﻓﺘﻪ اﺳﺖ. ﻛﻤﺘﺮﻳﻦ ﻣﻴﺰان ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر گزارش شد. اما ﻛﺎﻫﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر و اﻓﺰاﻳﺶ ﺟﺰﺋﻲ آن در غلظت 100 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﺧﺘﻼف ﻣﻌﻨﻲ­داری ﺑﺎ ﺷﺎﻫﺪ ﻧﺪاﺷﺖ. در ﻣﻘﺎﺑﻞ، اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻣﺲ ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻨﻈﻢ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ در ﻫﺮ ﺳﻪ ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده ﮔﺮدﻳﺪ ﺑﻪ ﻃﻮریﻛﻪ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻏﻠﻈﺖ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر در ﻣﺤﻴﻂ، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﻛﻠﻴﻪ ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻌﻨﻲ داری ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﺮوه ﺷﺎﻫﺪ نشان داد. ﻏﻠﻈﺖ 50 و 100 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ معنی­دار ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز در ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ و ﺗﻴﻤﺎر با ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر 25 شد. ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ در ﻏﻠﻈﺖ ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر 100 ﻣﺸﺎﻫﺪه ﺷﺪ ﻛﻪ ﺗﻔﺎوت ﻣﻌﻨﻲداری در ﻣﻘﺎﻳﺴﻪ ﺑﺎ ﺳﺎﻳﺮ غلظتها داﺷﺖ. آنها بیان کردند که اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز و ﻛﺎﺗﺎﻻز ﻛﻪ ﻧﻘﺶ ﻣﻜﻤﻞ در ﺟﺎروب ﻛﺮدن و پاﻛﺴﺎزی H2O2 دارﻧﺪ در ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎی ﺗﻴﻤﺎر ﺷﺪه ﺑﺎ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮر ﻧﻘﺮه ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﻴﺎه ﺷﺎﻫﺪ، ﺑﻴﺎﻧﮕﺮ اﻋﻤﺎل ﺗﻨﺶ ﺗﻮﺳﻂ اﻳﻦ ﻋﻨﺼﺮ در ﮔﻴﺎه ﻣﻲ ﺑﺎﺷﺪ. از ﻃﺮف دﻳﮕﺮ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﺤﺘﻮای پروتئینهای ﻣﺤﻠﻮل در ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎی ﺗﻴﻤﺎر ﺷﺪه ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﮔﺮوه ﺷﺎﻫﺪ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺑﻪ دﻟﻴﻞ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻘﺪار آنزیمهای ﺗﻌﺪﻳﻞ ﻛﻨﻨﺪه ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ از ﻗﺒﻴﻞ آنزیمهای آﻧﺘﻲاﻛﺴﻴﺪان و آنزیمهای درﮔﻴﺮ در ﺑﻴﻮﺳﻨﺘﺰ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪاﻧﻲ ﺑﺎﺷﺪ (3).

گزارش شده نانوذرات نقره در دانه­رستهای Brassica juncea موجب کاهش تولید پر اکسیدهیدروژن و افزایش کارآیی واکنشهای ردوکس شدند. همچنین غلظتهای بالای نانونقره موجب افزایش فعالیت آنزیمهای متابولیزه کننده پراکسید هیدروژن ­شد (29).

برگهایBacopa monnieri (Linn.)Wettst.  تحت تأثیر نانوذرات نقره، فعالیت بالای کاتالاز و پراکسیداز، کمترین میزان تولید گونه­های فعال اکسیژن و در نتیجه کمترین میزان سمیت را نشان دادند. کاتالاز و پراکسیداز نقش مهم و اصلی را در حفاظت از گیاهان در معرض نانوذرات نقره در مقابل آسیب اکسیداتیو برعهده دارند. اثبات شده است که کاهش فعالیت توأم آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز موجب افزایش تولید گونه­های واکنشگر اکسیژن درون سلولی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در پراکسیداسیون لیپیدها، پیری و مرگ سلولی گیاهی نقش دارند، می­شود (21).

در این مطالعه در بخش ریشه نمونه­های تیمار شده با نانو نقره 50 میلی گرم در لیتر افزایش قابل توجه فعالیت GPX نسبت به شاهد مشاهده شد که احتمالاً به دلیل تولید ROS و حذف آنها و کاهش سمیت این ترکیبات می­باشد. اما کاهش بسیار قابل توجه فعالیت آنزیم در نمونه­های تیمار شده با نیترات نقره به احتمال به دلیل اثر مهاری این ترکیبات بر تولید پروتئین و در نتیجه آنزیمها می­باشد. شایان ذکر است که کاهش معنی­دار رشد نیز در تیمار نیترات نقره نسبت به شاهد نیز مشاهده شد.

همچنین، اضافه کردن نیترات نقره و نانوذرات نقره به محیط کشت گیاه شابیزک موجب تغییر فعالیت آنزیمهای آنتی­اکسیدان تحت شرایط کشت درون شیشه­ای شده است. فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای نانوذرات نقره افزایش و در بقیه موارد فعالیت آنزیمها با کاهش مواجه شده است. این نتایج بیانگر آن است که کاربرد نانوذرات نقره در گیاه شابیزک، بیان برخی از پروتئینهای خاص را تنظیم می­کند. در تحقیقی که بر روی گیاه آرابیدوپسیس تالیانا انجام شده است، ژنهای زیادی در پاسخ به نانوذرات نقره واکنش نشان دادند. یون نقره موجب افزایش بیان ژنهای دخیل در تنش اکسیداتیو نظیر سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز شده و از طرف دیگر، کاهش بیان ژنهای درگیر در پاسخ به پاتوژنها و هورمونها را به دنبال داشت (20).

تغییر در میزان فعالیت آنزیمهای آنتی­اکسیدانت می­تواند به عنوان سیگنالی برای تنظیم مکانیسمهای پاکسازی کننده گونه­های فعال اکسیژن (ROS) عمل نماید. نفوذپذیری غشایی نانوذرات نقره به مراتب نسبت به نیترات نقره بیشتر است. علت این امر به اندازه بسیار کوچک نانوذرات نقره مربوط است که موجب اتصال بیشتر به بافتهای گیاهی می­گردد. همچنین مطالعات نشان می­دهد که تحرک یونهای نقره در نانوذرات نقره بسیار بالاتر از نیترات نقره و تیوسولفات نقره می­باشد (33).

نانوذره نقره تیمار شده با عصاره آبی برگهای Acalypha indica Linn. در گیاه Bacopa  monnieri  (Linn)Wettst، افزایش فعالیت پراکسیداز و کاتالاز را موجب شد و هیچگونه اثر سمی در مطالعات مورفولوژی مشاهده نشد. علاوه براین، انتقال نقره در ریشه و ساقه B. monnieri (Linn.) Wettstبه وسیله اسپکتروفتومتر جذب اتمی تأیید شد. تیمار نانوذره نقره با عصاره Acalypha indica Linn موجب کاهش قابل توجه اثر سمی نانوذره بر جوانه زنی و رشد گیاه B. monnieriگردید (21).

در گیاهان، نقش آنزیمهای کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز به عنوان تنظیم­کننده میزان پراکسید هیدروژن داخل سلولی بسیار مهم­ است، به طوریکه افزایش فعالیت این آنزیمها در تیمارهای مختلف، نشان­دهنده کارآمدی مهار فعالیت ROS توسط سیستم آنتی اکسیدانی عنوان شده ­است (15).

در مطالعات متعددی عنوان شده که آنزیم گایاکول پراکسیداز در مقایسه با کاتالاز حساسیت کمتری به وضعیت تنش دارد، در بیشتر موارد، سطح پایین پراکسیداز نشان دهنده شروع پاسخ غیر­اختصاصی گیاه به تنش است. نتایج برخی از مطالعات نیز نشان داده ­است که فعالیت پراکسیداز با افزایش غلظت نانوذرات اعمال شده کاهش یافته ­است، کاهش معنی­دار فعالیت گایاکول پراکسیداز در تیمارهای نانوذرات نقره و نیترات نقره در بخش هوایی ریزنمونه­ها نسبت به شاهد مشاهده شد.این نتایج به احتمال به دلیل غیر فعال شدن مولکولهای پراکسیداز توسط نانوذرات به دلیل جذب و یا سایر فعل و انفعالات شیمیایی و یا کاهش تولید آنزیم مربوط می­شود (30).

در مطالعه شبانی و همکاران، ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز ﺗﺤﺖ ﺗﻴﻤﺎر ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه در ﺗﻤﺎم غلظتها ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻌﻨﻲداری نشان داد. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ آﺳﻜﻮرﺑﺎت ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز در ﺗﻴﻤﺎر 01/0 و 1/0 ﻣﻴﻠﻲﻣﻮﻻر ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲداری ﻳﺎﻓﺖ. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﮔﺎﻳﺎﻛﻮل ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز ﺗﻨﻬﺎ در ﺗﻴﻤﺎر 1/0 ﻣﻴﻠﻲ ﻣﻮﻻرﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲ داری ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻧﺸﺎن داد. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﮔﻠﻮﺗﺎﺗﻴﻮن ردوﻛﺘﺎز در ﺗﻴﻤﺎر 01/0 ﻣﻴﻠﻲﻣﻮﻻر اﻓﺰاﻳﺶ و در ﺗﻴﻤﺎر 1/0 میلیﻣﻮﻻر ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻌﻨﻲداری ﻧﺸﺎن داد. آنها بیان کردند اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمهای ﻛﺎﺗﺎﻻز و ﮔﺎﻳﺎﻛﻮل ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز ﺗﻮﺳﻂ ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه ﻧﺸﺎن ﻣﻲدﻫﺪ ﻛﻪ اﻳﻦ آنزیمها ﺑﺎ ﻫﻤﻜﺎری ﻫﻢ در ﺣﺬف ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن ﻋﻤﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ و ﻧﻴﺰ دﻟﻴﻠﻲ ﺑﺮ ﺷﺮوع دﻓﺎع آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪان ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ ﺑﻪ ﻃﻮری ﻛﻪ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻣﺜﺎل ﭘﺎﺳﺦ ﻧﺎﻛﺎﻓﻲ ﻳﻚ آﻧﺰﻳﻢ ﺑﻪ ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه ﺗﻮﺳﻂ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻤﻲ دﻳﮕﺮ ﺟﺒﺮان ﻣﻲﺷﻮد. ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﭘﺮاﻛﺴﻲزوم ﺳﻠﻮلهای ﮔﻴﺎﻫﻲ ﺣﻀﻮر دارد و ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ ﺑﺮای ﺣﺬف ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن اﺳﺖ. اﻳﻦ آﻧﺰﻳﻢ سلولها را از اﺛﺮات ﺳﻤﻲ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺠﺰﻳﻪ آﻧﻬﺎ ﺑﻪ اﻛﺴﻴﮋن ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ و آب، ﺑﺪون ﺗﻮﻟﻴﺪ رادیکالهای آزاد ﺣﻔﺎﻇﺖ ﻣﻲﻛﻨﺪ (1).

ﻃﺒﻖ ﻧﺘﺎﻳﺞ گزارش شده ﺗﻮﺳﻂ  Schutzendubelو ﻫﻤﻜﺎران، افزودن ﻛﺎدﻣﻴﻮم 50 ﻣﻴﻜﺮوﻣﻮﻻر ﺑﻪ ﻛﺸﺖ ﻫﻴﺪروﭘﻮﻧﻴﻚ رﻳﺸﻪﻫﺎیPinus sylvestris  در 6 ﺳﺎﻋﺖ اول ﺑﺎﻋﺚ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻛﺎﺗﺎﻻز، آﺳﻜﻮرﺑﺎت ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاز و ﺳﻮﭘﺮاﻛﺴﻴﺪدﻳﺴﻤﻮﺗﺎز ﻣﻲﺷﻮد، و ﺑﻌﺪ از 12 ﺳﺎﻋﺖ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻲ­ﻳﺎﺑﺪ. در اﻳﻦ ﺗﺤﻘﻴﻖ ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اﻳﻨﻜﻪ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﺎﺗﺎﻻز در ﺗﻤﺎم ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻳﺎﻓﺘﻪ گزارش کردند ﻛﻪ ﺣﺬف اﻛﺴﻴﮋنهای ﻓﻌﺎل ﺑﻴﺸﺘﺮ از ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها ﺑﺮ ﻋﻬﺪه ﻛﺎﺗﺎﻻز ﺑﻮده و ﭘﺎﺳﺦ ﻧﺎﻛﺎﻓﻲ ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها را ﺟﺒﺮان ﻛﺮده اﺳﺖ. ﺳﺎﻳﺮ آنزیمها در ﺗﻤﺎم ﺗﻴﻤﺎرﻫﺎ ﻳﺎ ﺗﻐﻴﻴﺮ ﻣﻌﻨﻲداری ﻧﺪاﺷﺘﻪ ﻳﺎ ﻛﺎﻫﺶ ﻳﺎﻓﺘﻨﺪ (27). ﺗﻐﻴﻴﺮات اﻳﺠﺎد ﺷﺪه در ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمهای آﻧﺘﻲاﻛﺴﻴﺪان ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ در ارﺗﺒﺎط ﺑﺎ ﺗﻨﺶ اﻛﺴﻴﺪاﺗﻴﻮ وارده ﺑﻪ ﮔﻴﺎه در اﺛﺮ ﺗﺠﻤﻊ ROS ﻫﺎ در ﭘﻲ ﺗﻴﻤﺎر ﻓﻠﺰ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﻧﻘﺮه و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﺗﺸﺪﻳﺪ ﻓﺮآﻳﻨﺪ ﭘﺮاﻛﺴﻴﺪاﺳﻴﻮن ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎی ﻫﻤﺴﻮ ﺑﺎ اﻳﻦ ﺗﻨﺶ ﺑﺎﺷﺪ. در ﻛﻞ اﻓﺰاﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آﻧﺰﻳﻤﻲ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺑﺮاﺑﺮ ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﺳﺮﻋﺖ ﺳﻤﻴﺖزداﻳﻲ ROS ﻫﺎ در ﮔﻴﺎه ﺑﺎﺷﺪ. اﺣﺘﻤﺎﻻ ﻋﻠﺖ ﻛﺎﻫﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آنزیمها ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ به دلیل ﺗﺸﺪﻳﺪ اﺛﺮات ﻣﺨﺮب ﻧﻘﺮه و ﻳﺎ ROS ﻫﺎی اﻟﻘﺎء ﺷﺪه ﺑﺮ ﺳﺎﺧﺘﺎر و ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ اﻳﻦ آنزیمها ﺑﺎﺷﺪ. ﻣﺸﺨﺺ ﺷﺪه ﻛﻪ ﻧﻘﺮه ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﺟﺎﻧﺸﻴﻦ ﻓﻠﺰاﺗﻲ ﻛﻪ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﻛﻮﻓﺎﻛﺘﻮر آﻧﺰﻳﻤﻲ در ﺳﺎﺧﺘﺎر آﻧﺰﻳﻢ ﻗﺮار دارﻧﺪ، ﮔﺮدد و ﺑﻪ اﻳﻦ ﺗﺮﺗﻴﺐ ﺑﺮ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ آن اﺛﺮ ﻣﻨﻔﻲ داشته ﺑﺎﺷﺪ (26). بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش نیز  کاتالاز بیش از گایاکول پراکسیداز در حذف تنش حاصل از تیمارها موثر می­باشد.

سیستئین نقش بسیار مهمی در ساختمان فضایی پروتئینها برعهده دارد چرا که عامل تیول سیستئین در یک زنجیره پلی پپتیدی با از دست دادن هیدروژن، پیوند کووالانس تشکیل می­دهند و موجب پایداری واحدهای پروتئین می­گردند. سیستئین یک اسید آمینه تیول­دار در گیاهان می­باشد که در تولید چند ترکیب سلولی مهم از جمله گلوتاتیون، متالوتیونینها، فیتوکلاتینها و هیدروژن سولفید به عنوان مولکول علامت دهنده شرکت دارد. همه این ترکیبات نقش مهمی در افزایش تحمل به تنشها ایفاء می­کنند. غلظت سیستئین آزاد در گیاهان پایین بوده ولی فرآورده­های حاصل از متابولیسم آن در گیاه متعدد است که ناشی از تقاضای بالا برای این فرآورده­ها در شرایط عادی و تنش می­باشد. با بررسی غلظتهای مختلف مس بر روی دو رقم ذرت گزارش دادند که تنش ایجاد شده موجب تجمع فلز در قسمت اندام هوایی بوده و تفاوتهایی در مرحله جوانه­زنی مشاهده شده است. با بررسی برخی پارامترهای بیوشیمیایی سطح گلوتاتیون، سیستئین و پراکسیداسیون لیپیدی با افزایش غلظت تنش مس افزایش یافت(5).

در بررسی حاضر نیز میزان سیستئین در هر دو بخش با اعمال نانوذره نقره افزایش و در مورد تیمار نیترات نقره در هر دو بخش کاهش قابل توجه نسبت به کنترل مشاهده شد.

به طور کلی رفته می­توان گفت ریزنمونه­های سیر به تیمار ﻧﺎﻧﻮذرات نقره و نیترات نقره ﺣﺴﺎس اﺳﺖ و ﻣﻴﺰان ﺣﺴﺎﺳﻴﺖ به نیترات نقره بیشتر از نانوذرات نقره است. الیسیتور نیترات نقره بر خلاف نانوذره نقره در غلظتهای مشابه اعمال شده در زمان تیمار اثر منفی بر گیاه دارد که با کاهش معنی­دار رشد، میزان آلیسین و سیستئین قابل مشاهده است. براساس نتایج، نانوذره نقره به دلیل نداشتن اثر سمی بر رشد و همچنین میزان پروتئین کل ریزنمونه­های سیر در غلظتهای به کار رفته در این بررسی و القاء افزایش میزان تولید آلیسین می­تواند محرک خوبی برای افزایش تولید آلیسین با خواص ارزشمند دارویی باشد.

قدردانی و تشکر

این مقاله از طرح پژوهشی خاتمه یافته (به شماره 1478/د/94) از محل اعتبارات پژوهشی دانشگاه مراغه مستخرج شده است. همچنین نویسنده از دانشگاه مراغه به دلیل حمایت مالی به منظور انجام این پروژه تشکر و قدردانی می‌نمایند.

1- ﺷﺒﺎﻧﻲ، ل و ﺻﻐﻴﺮزاده، ب. 1396. ﺑﺮرﺳﻲ ﭘﺎﺳﺦﻫﺎی دﻓﺎع  آﻧﺘﻲ اﻛﺴﻴﺪاﻧﻲ در ﻛﺸﺖ ﺳﺎﻗﻪ  L. Artemisia annua ﺗﺤﺖ ﺗﻨﺶ ﻧﻴﺘﺮات ﻧﻘﺮه. ﻣﺠﻠﻪ ﭘﮋوﻫﺸﻬﺎی ﮔﻴﺎﻫﻲ (ﻣﺠﻠﻪ زﻳﺴﺖ ﺷﻨﺎﺳﻲ اﻳﺮان) ﺷﻤﺎره 1 ، ﺟﻠﺪ 30، صفحه 131-119.
2- فتحی رضایی، پ و راکعی، ا. 1396. بررسی اثر ساکارز بر میزان تولید تروپان آلکالوئیدها و چندین پارامتر بیوشیمیایی گیاه تاتوره در شرایط کشت درون شیشه‌ای. دوره 30، شماره 4 زمستان، صفحه 571-558.
3- ﻳﻮﺳﻔﻲ، ک.، رﻳﺎﺣﻲ ﻣﺪوار، ع و ﺑﺎﻗﻲزاده، ا. 1394. ﺑﺮرﺳﻲ ﺗﺄﺛﻴﺮ اﻟﻴﺴﻴﺘﻮرﻫﺎی ﻧﻘﺮه و ﻣﺲ ﺑﺮ ﺑﻴﺎن ژن ﻓﻼون ﺳﻴﻨﺘﺎز و ﺑﺮﺧﻲ ﭘﺎراﻣﺘﺮﻫﺎی ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪ ﻫﺎی زﻳﺮه ﺳﺒﺰ (cyminum L. Cuminum) ﺑﻮﻣﻲ ایران. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)،  جلد 28، شماره 1، صفحه 223-210.
 
4-Aebi H. 1984. Catalase in vitro. Methods in enzymology. 105:121-6.
5-Aly, A. A., and Mohamed, A. A. 2012. The impact of copper ion on growth, thiol compounds and lipid peroxidation in two maize cultivars (Zea mays L.) grown in vitro, Australian Journal of Crop Science, 6(3), 541.
6-Amagas, H. 2006. Clarifying the real bioactive constituents of garlic, Journal of Nutrition, 136, 716S-725S.
7-Angelova, Z., Georgiev, S., Roos, W. 2006. Elicitation of plants. Biotechnology & Biotechnology Equipment, 20(2), 72-83.
8-Arzanlou, M., and Bohlooli, Sh. 2010. Introducing of green garlic plant as a new source of allicin, Food Chemistry, 120, 179–183.
9-Baghalian, K., Ziai, S.A., Naghavi, M.R., Khalighi, A.  2005. Evaluation of allicin content and botanical traits in Iranian garlic (Allium sativum L.) ecotypes, Scientia Horticulturae, 103(2), 155-166.
10-Chance B, Maehly A. 1955. Assay of catalases and peroxidases. Methods in enzymology, 2:764-75
11-Colville, L., and Smirnoff, N. 2008. Antioxidant status, peroxidase activity, and PR protein transcript levels in ascorbate-deficientArabidopsis thaliana vtcmutants, Journal of  xperimental Botany, 59(14), 3857–3868. 
12-Gaitonde, M. 1967. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids. Biochemical Journal 104(2): 627.
13-Ghani, M. 2010. Determination of alliin and allicin in different types garlic using high performance liquid chromatography, Journal of University of Anbar for Pure Science, 4(2).
14-Ghodrati Azadi, H., Ghaffari, S.M., Riazi, G.H., Ahmadian, S., Azadi, F.A. 2008. Antiproliferative activity of chloroformic extract of Persian Shallot, Allium hirtifolium, on tumor cell lines, Cytotechnology, 56(3), 179-185.
15-Hosseini, Z. and L. Poorakbar. 2013. Zinc toxicity on antioxidative response in (Zea mays L.) at two different pH, Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 9(1), 66-73.
16-Iberl, B., Winkler, G. and Knobloch, K. 1990. Products of allicin transformation: ajoenes and dithiins, characterization and their determination by HPLC. Planta Medica 56(02): 202-211.
17-Ilić, D. P., Nikolić, V. D., Nikolić, L. B., Stanković, M. Z., Stanojević, L. P. 2010. Thermal degradation, antioxidant and antimicrobial activity of the synthesized allicin and allicin incorporated in gel, Hemijska Industrija, 64(2), 85-91.
18-Jones, M. G., Hughes, J., Tregova, A., Milne, J., Tomsett, A. B., & Collin, H. A. 2004. Biosynthesis of the flavour precursors of onion and garlic, Journal of Experimental Botany, 55(404), 1903-1918.
19-Jun, P.K., Sung-Ho, K., Hwa-Jung, K., Choi, S.H. 2006. New Composition of Nanosized Silica-Silver for Control of Various Plant, Plant Pathology Journal, 22(3), 295.

20-Kaveh, R., Li, Y.S., Ranjbar, S., Tehrani, R., Brueck, C.L., Aken, B.V. 2013. Changes in Arabidopsis thaliana gene expression in response to silver nanoparticles and silver ions, Environmental Science and Technology, 47(18), 10637-44.

21-Krishnar, C., Jagan, E.G., Ramachandran, R., Abirami, S.M., Mohan, N., Kalaichelvan, P.T. 2012. Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri (Linn.) Wettst. plant growth metabolism, Process Biochemistry, 47(4), 651-658.
22-Ma, X., Geiser-Lee, G., Deng, Y., Kolmakov, A. 2010. Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and plants: phytotoxicity, uptake and accumulation, Science of the Total Environment, 408(16), 3053-3061.
23-Mahna, N., Zununi Vahed, S., and Khani, S. 2013. Plant in vitro culture goes nano: nanosilver-mediated decontamination of ex vitro explants, Nanomedicine & Nanotechnology, 4 (2), 1-4.
24-Nair, R. 2010. Nanoparticulate material delivery to plants. Plant Science, 179(3), 154-163.
25-Namdeo, A.G. 2007. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review, Pharmacognosy Reviews, 1 (1), 69-79.
26-Rotilio, G., Rossi, L., De Martino, A., Da Costa Ferreira, A. M. and Ciriolo, M. R. 1995. Free radicals, metal ions and oxidative stress: chemical mechanisms of damage and protection in living systems. Journal of The Brazilian Chemical Society, 6(3), 221-227.
27-Schutzendubel, A., Schwanz, P., Teichmann, T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold, D. L. and Polle, A. 2001. Cadmium-induced changes in antioxidative systems, hydrogenperoxide content, and differentiation in Scots pine roots. Plant Physiology, 127(3), 887-898.
28-Seifsahandi, M., and Sorooshzadeh, A. 2013. Comparison between the influences of silver nanoparticles and silver nitrate on the growth and phytochemical properties of borage (Borago officinalis L.), Current Nanoscience, 9, 241-247.
29-Sharma, P., Bhatt, D., Zaidi, M.G.H., Saradhi, P., Khanna, P.K., Arora, S. 2012. Silver nanoparticle-mediated enhancement in growth and antioxidant status of Brassica juncea, Applied Biochemistry and Biotechnology, 167(8), 2225-2233.
30-Smirnova, E., Gusev, A., Zaytseva, O., Sheina, O., Tkachev, A., Kuznetsova, E., Lazareva, E., Onishchenko, G., Feofanov, A., Kirpichnikov, A. 2012. Uptake and accumulation of multiwalled carbon nanotubes change the morphometric and biochemical characteristics of Onobrychis arenaria seedlings, Frontiers of Chemical Science and Engineering, 6(2), 132-138.
31-Stampoulis, D., Sinha, S.K., and White, J.C. 2009. Assay-dependent phytotoxicity of nanoparticles to plants, Environmental Science & Technology, 43(24), 9473-9479.
32-Sukkaew, P., and Tira-umphon, A. 2012. Effects of storage conditions on allicin content in garlic (Allium sativum), Acta Horticulturae, 969, 209-212.
33-Tabatabaee, Z., Razavizadeh, R., Rostami, F. 2014. Changes occurring in canola (Brassiac napus L) in response silver nanoparticles treatment under in vitro conditions, Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 4 (S3), 797-807.

34-Yin, L., Cheng, Y., Espinasse, B., Colman, BP., Auffan. M., et. al. 2011. More than the ions: the effects of silver nanoparticles on Lolium multiflorum, Environmental Science and Technology, 45(6), 2360-7.