پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
اثرات القاء پلیپلوئیدی بر روی خصوصیات موروفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه زنیان (Carum carvi L.)
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، زابل، ایران
2 استادیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشگاه زابل
3 عضو هیئت‌علمی پژوهشکده کشاورزی دانشگاه زابل، زابل، ایران
چکیده
زنیان گیاهی علفی یکساله متعلق به تیره چتریان، دارای اثرات ضد میکروبی و قارچکش بوده که عمده اثرات مربوط به ترکیب تیمول است. القاء پلیپلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روشهای اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار گرفته است. بدین منظور جهت بررسی اثرات القاء پلیپلوئیدی بر زنیان سیستان آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با استفاده از کلشیسین (۲/۰، ۵/۰، ۷۵/۰ و ۱ گرم در لیتر) و مدت زمان اعمال تیمار (۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت) انجام و بعد از به دست آوردن بهترین غلظت و بهترین زمان اعمال تیمار، گیاهان تتراپلوئید به همراه شاهد کشت و برای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بررسی شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که القاء تتراپلوئیدی بر صفات ارتفاع بوته، قطر ساقه، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، وزن تر، کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنیدار بود. نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت ۵/۰ گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان است. تعداد کروموزومهای گیاهان دیپلوئید برابر با ۱۸ عدد و در گیاهان تتراپلوئید برابر با ۳۶ عدد بود بنابراین میتوان بیان کرد که کلشیسین به‌طور مؤثری قابلیت القاء پلیپلوئیدی در گیاه زنیان را دارد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد گیاهان تتراپلوئید شده از نظر صفات کمی مخصوصاً آنتوسیانین، پراکسیداز، کاتالاز، فلاونوئید و پروتئین کل نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effects of polyploidy induction on morphological, physiological and biochemical characteristics of Carum carvi L.
نویسندگان [English]
- Raheleh Akbari 1
- leila fahmideh 2
- Bahman Fazeli-Nasab 3
1 Department of plant Breeding and Biotechnology, University of Zabol, Zabol,
2 Assistant Professor of Department of Plant Breeding and Biotechnology, University of Zabol,
3 Research Dep. Of Agronomy and Plant Breeding, Agricultural Research Institute, University of Zabol, Zabol, Iran.
چکیده [English]
Carum carvi L., an herbaceous plant, one year old, belongs to the Chadian dwarf, has antimicrobial and fungicidal effects, which is mainly due to the effects of thymol composition. The induction of polyploidy using mutagenic chemicals has been used as one of the methods for modifying medicinal plants to increase the production capacity of secondary metabolites. In order to investigate the effects of polyploidy induction on Sistan seedlings, a factorial in a completely randomized format using Colchicine (0.2, 0.5, 0.75 and 1 g/l) and treatment duration (6, 12 and 18 hours) and after obtaining the best concentration and best treatment time, tetraploidy plants and control plants were studied for morphological, physiological and biochemical traits. The results of analysis of variance showed that tetraploid induction was significant on plant height, stem diameter, flower number, number of lateral branches, root diameter, fresh weight, chlorophyll a and b, carotenoid, peroxidase, catalase, total protein and flavonoid. The results of this study showed that 0.5 g/l concentration and 6 hours duration is the best treatment for ploidy induction in the plant. The number of chromosomes of the diploid plants was 18 and in the tetraploid plants was 36 Therefore, it can be argued that colchicine is effective in inducing polyploidy in a plant. In general, the results of this study showed that tetraploidy plants excelled in terms of quantitative traits, especially anthocyanin, peroxidase, catalase, flavonoids and total protein relative to diploid plants.
کلیدواژه‌ها [English]
- Ajowan
- Antioxidant
- Colchicine
- Flavonoid
- Polyploidy
اثرات القاء پلیپلوئیدی بر روی خصوصیات موروفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه زنیان (Carum carvi L.)
راحله اکبری1، لیلا فهمیده1* و بهمن فاضلی نسب2
1ایران، زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
2ایران،زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده کشاورزی، گروه پژوهشی زراعت و اصلاح نباتات
تاریخ دریافت: 13/8/95 تاریخ پذیرش: 11/9/96
چکیده
زنیان گیاهی علفی یکساله متعلق به تیره چتریان، دارای اثرات ضد میکروبی و قارچکش بوده که عمده اثرات مربوط به ترکیب تیمول است. القاء پلیپلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روشهای اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار گرفته است. بدین منظور جهت بررسی اثرات القاء پلیپلوئیدی بر جمعیت زنیان شیراز آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با استفاده از کلشیسین (2/0، 5/0، 75/0 و ۱ گرم در لیتر) و مدت زمان اعمال تیمار (۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت) انجام و بعد از به دست آوردن بهترین غلظت و بهترین زمان اعمال تیمار، گیاهان تتراپلوئید به همراه شاهد کشت و برای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بررسی شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که القاء تتراپلوئیدی بر صفات ارتفاع بوته، قطر ساقه، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، وزن تر، کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنیدار بود. نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت 5/0 گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان است. تعداد کروموزومهای گیاهان دیپلوئید برابر با ۱۸ عدد و در گیاهان تتراپلوئید برابر با ۳۶ عدد بود بنابراین میتوان بیان کرد که کلشیسین به‌طور مؤثری قابلیت القاء پلیپلوئیدی در گیاه زنیان را دارد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد گیاهان تتراپلوئید شده از نظر صفات کمی مخصوصاً آنتوسیانین، پراکسیداز، کاتالاز، فلاونوئید و پروتئین کل نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند.
واژههای کلیدی: آنتی‌اکسیدان، پلیپلوئیدی، زنیان، کلشیسین، فلاونوئید
* نویسنده مسئول، تلفن: 05431232100،پست الکترونیکی: l.fahmideh@uoz.ac.ir
مقدمه
زنیان (Carum copticum L.) متعلق به تیره چتریان (Apiaceae) گیاهی علفی، یکساله و بیکرک به ارتفاع ۳۰ تا ۹۰ سانتیمتر، پر شاخ و برگ (24) که به‌طور عمده در مناطق خشک و نیمه‌خشک شرق هند، بخش شمال غربی، مرکزی و شرقی ایران و همچنین در مصر رشد میکند (44). ارزش دارویی گیاه زنیان وابسته به متابولیتهای ثانویه از جمله تیمول، پاراسیمن، آلفا پینن و کارواکرول است (5) که حدود ۵۰ درصد آن را تیمول تشکیل داده و دارای اثرات ضد میکروبی، ضد اسپاسم و قارچکش است (8). خاصیت ضد میکروبی زنیان مربوط به ترکیب تیمول و خاصیت ضد اسپاسم آن مربوط به اسانس فرار آن است (26).
القاء پلیپلوئیدی با استفاده از مواد شیمیایی جهش‌زا به‌عنوان یکی از روشهای اصلاح گیاهان دارویی به‌منظور افزایش قابلیت تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار میگیرد (12). از میان روشهای اصلاحی مهم‌ترین و کاربردی‌ترین روشها شامل دورگگیری، موتاسیون و پلیپلوئیدی است که روش پلیپلوئیدی به‌عنوان یک روش اصلاحی بیشتر مورد توجه قرار گرفته و در اصلاح گیاهان و قارچ‌ها استفاده شده است (15, 21). یکی از روشهای اصلاح گیاهان دارویی، انگیزش گیاهان تتراپلوئید از گیاهان دیپلوئید و منشأ آنها است که میتواند در رشد و نمو و عملکرد و همچنین کمیت و کیفیت مواد مؤثره گیاهان دارویی تأثیر داشته باشد (20). دورگگیری بین و درون گونهای در گیاهان به بروز صفات مطلوب کمک نموده است، اما ژرم پلاسمهای موجود هنوز نمیتوانند جوابگوی نیاز مصرفکنندگان تنوع‌طلب باشند؛ بنابراین به نژاد گران و محققان همواره به دنبال منابع دیگر ایجاد تنوع هستند (12).
از آنجا که جهشهای خود به خودی به‌ندرت اتفاق می‍افتند، تولید جهش یافتههای القایی راه مناسبی برای ایجاد تنوع در گیاهان محسوب میشود، لذا دست ورزی سطح پلوئیدی امکان برنامههای بهنژادی به‌منظور تولید واریتههای برتر در بسیاری از گونههای گیاهی را موفقیت‌آمیز نموده است (31). گیاهان تتراپلوئید نسبت به انواع دیپلوئید خود به‌طور معمول رشد رویشی بیشتر، ساقههای درشتتر، برگهای کلفتتر، گلهای بزرگ‌تر و پایداری طولانیتر دارند (15). برای این منظور از مواد مختلفی مانند کلشیسین و اوریزالین برای القای پلیپلوئیدی استفاده شده است (22). برای القای پلیپلوئیدی از بخشهای مختلف گیاه مانند بذور در حال جوانهزنی، غنچههای بسیار جوان یا مناطق مریستمی نوک جوانهها میتوان استفاده کرد (1).
کلشیسین یک ترکیب آلکالوئیدی است که از غده گل حسرت پائیزه برای اولین بار توسط Zeisle در سال ۱۸۸۳ استخراج و دارای ساختار سه‌حلقه‌ای با فرمول C22H25O6N است (37, 46) که مانع از تشکیل شدن دوک در هنگام تقسیم سلولی شده و کروموزومها را در مرحله متافاز متوقف میکند و مانع از وقوع آنافاز میشود، در نتیجه باعث دو برابر شدن تعداد کروموزومها در سلول میشود. تیمار با کلشیسین یکی از رایج‌ترین روش‌هایی است که برای القای پلیپلوئیدی در گیاهان از آن استفاده میشود و نسبت به بقیه مواد جهش‌زا تغییرات مورفولوژیک بیشتری ایجاد میکند (44).
در موارد زیادی گزارش شده است که گیاهان تتراپلوئید گوشتیتر بوده و میزان آب بیشتری دارند به همین خاطر وزن تر آنها بیشتر از نمونههای دیپلوئید است(54). برای مثال در بررسی امکان القاء پلوئیدی در بنفشه آفریقایی ارزیابی صفات ظاهری نشان داد گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید از نظر خصوصیات مورفولوژیکی رویشی و صفات زایشی با یکدیگر متفاوت هستند به‌طوری‌که گیاهچههای تیمار شده با مادهی القایی، پا کوتاهتر، برگهای پهنتر و ضخیمتر، دم برگ قطورتر، پر گلتر، پر برگتر و دارای گلهای درشتتر بودند که علت این تفاوتها در مقدار هورمون اکسین که مسئول رشد میباشد است (7). در بررسی کشت بافت و القاء پلیپلوئیدی کالوس گیاه Morinda officinalis بیشترین میزان القاء پلیپلوئیدی از تیمار ۵۰۰ میلیگرم در لیتر کلشیسین به مدت ۵ روز به‌دست‌آمده و در مقایسه با گیاهان پلیپلوئید و دیپلوئید، رشد ریشه در پلیپلوئیدها افزایش یافته است (36). در تحقیقی به‌منظور بررسی تأثیر تیمار کلشیسین بر گیاه شنبلیله گزارش شد که غلظت و مدت زمان تیمار کلشیسین و اثر متقابل آنها به‌صورت معنیداری بر اتو تتراپلوئید شدن شنبلیله تأثیر داشت و غلظت 5/0 گرم در لیتر با مدت تیمار 12 ساعت بهترین نتیجه را داشت همچنین نتایج نشان داد که تغییر سطح پلوئیدی با کلشیسین از دیپلوئیدی به تتراپلوئیدی به‌صورت معنیداری بر کلیه صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی شنبلیله (به‌جز وزن تر و خشک گیاه ) اثر داشت (11).
بر این اساس هدف از تحقیق حاضر مطالعه اثر ماده موتاژن
کلشیسین بر القاء پلیپلوئیدی و خواص سیتوژنتیکی (تعداد کروموزوم)، مورفولوژیکی (ارتفاع بوته، قطر ساقه اصلی و فرعی، تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، قطر ریشه، وزن تر، طول برگ و عرض برگ) و آنتیاکسیدانی (پروتئین کل، کاتالاز، پراکسیداز، فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین، کارتنوئید، کلروفیل) گیاه زنیان در شرایط کشت گلخانه‌ای انجام شد.
مواد و روشها
ﺑﺬر جمعیت شیراز ﮔﻴﺎه زنیان از از ﺷﺮﻛﺖ ﭘﺎﻛﺎن ﺑﺬر اﺻﻔﻬﺎن تهیه و جهت ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ﺳﻴﺘﻮژﻧﺘﻴﻜﻲ در سال 1396 در پژوهشکده زیست‌فناوری دانشگاه زابل مورد ارزیابی قرار گرفت. به‌منظور به دست آوردن ﻣﺮﻳﺴﺘﻢ اﻧﺘﻬﺎﻳﻲ رﻳﺸﻪ، ﺑﺬرﻫﺎ ﺑﻪ ﻇﺮوف ﭘﺘﺮیدﻳﺶ ﺣﺎوی ﻛﺎﻏﺬ ﺻﺎﻓﻲ ﻣﺮﻃﻮب ﻣﻨﺘﻘﻞ و ﭘﺲ از اﻓﺰودن آب ﻣﻘﻄﺮ، در ژرمیناتور تحت شرایط کنترل رطوبت ۳۸ درصد، دمای ۲۴ درجه سانتیگراد و نور ۱۴ ساعت قرار داده شدند. پس از چهار روز بذرهای جوانه زده با ریشههایی به طول 5/1 تا ۲ سانتیمتر آماده تیمار شدن بودند. برای تیمار کردن از محلول کلشیسین با غلظتهای 2/0، 5/0، 75/0 و ۱ گرم در لیتر در سه مدت زمان ۶، ۱۲ و ۱۸ ساعت استفاده شد (6).
به‌منظور مشاهده و شمارش کروموزومها، به ترتیب مراحل پیش تیمار از محلول (002/0 میکرو مولار) ۸- هیدروکسی کینولین به مدت ۵ ساعت، تثبیت (محلول کارنوی-۲ مرکب از اتانول ۹۶ درصد، کلروفرم ۱۰ درصد و اسید استیک ۳۰ درصد به نسبت 1: 3: 6 به مدت ۲۴ ساعت در دمای اتاق، هیدرولیز اسید کلریدریک 1N به مدت ۲۰ دقیقه و سپس رنگآمیزی ریشهها با استو اورسئین برای مشاهدات میکروسکوپی استفاده شد. قسمت انتهایی نوک ریشه با یک قطره اسید استیک ٪۴۵ روی اسلاید گذاشته و لامل روی آن گذاشته میشود تا ضمن خروج رنگهای اضافی سلولهای مریستمی نیز در یک سطح پخش شوند (34).
عکس‌برداری از نمونههای تهیه شده با استفاده از روش تحلیل تصویری با بزرگنمایی ۱۸۷۷ برابر انجام شد، به‌طوری‌که تصاویر کروموزومی از طریق دوربین رنگی که بر روی میکروسکوپ Olympus نصب شده بود به مانیتور منتقل شد و ضبط گردید. تصاویر تهیه شده به برنامه فتوشاپ نسخه 04/1 منتقل شد؛ و سپس برای بررسی صفات مورفولوژی (از قبیل ارتفاع بوته، طول و عرض برگ، قطر ساقه اصلی و فرعی، تعداد شاخه جانبی، قطر ریشه، تعداد گل وزن تر و وزن خشک در هر بوته نسبت به گیاهان دیپلوئید) فیزیولوژیکی و آنتیاکسیدانی (میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کارتنوئید، آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز، محتوای آنتوسیانین، فنل کل، پروتئین کل و فلاونوئید) گیاه زنیان، بذور تیمار شده به گلدانهای حاوی کوکوپیت، خاک‌برگ و خاک معمولی منطقه منتقل شدند. در هر گلدان پنج بذر قرار داده شد. گیاهان با فاصله دو روز آبیاری شدند و در شرایط گلخانه رشد و نمو یافتند.
تهیه بافر Ice–Cold : این محلول شامل؛ 2000 میکرو لیتر محلول بافر پتاسیم فسفات 100 میلی مولار با 7 pH= (برای تهیه محلول پتاسیم فسفات از دو نمک K2HPO4 (جرم حجمی 2/174) و KH2PO4 (جرم حجمی 086/136) استفاده و به این صورت که ابتدا محلول 1 مولار از هر کدام از این نمکها تهیه شد. سپس 10 سیسی از هر کدام برداشته، مخلوط و به حجم 100 سیسی رسانده شد و pH آن روی 7 تنظیم شد.)، 20 میکرو لیتر EDTA 0.1 mM و سپس 1980 میکرو لیتر آب دو بار تقطیر بود (18).
استخراج عصاره آنزیمی: جهت اندازهگیری آنزیمها، 1/0 گرم از بافت سبز برگ برداشت و با 4 سیسی بافر Ice – cold در هاون سرد کاملاً ساییده و به‌صورت همگن درآورده شدند. مخلوط همگن از کاغذ صافی عبور و به مدت 15 دقیقه در 16000 دور با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ یخچال دار سانتریفیوژ شدند. سپس فاز بالایی به‌عنوان عصاره آنزیمی (پروتئینی) برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده گردید (19).
آنزیم کاتالاز: به این منظور مخلوط واکنش شامل 750 میکرو لیتر عصاره آنزیمی و ۱۵۰۰ میکرو لیتر آب دو بار تقطیر به کووت کوارتز اضافه شد و به هنگام اندازهگیری آنزیم، ۷۵۰ میکرو لیتر پراکسید هیدروژن ۷۰ میلیمولار به مخلوط واکنش اضافه گردید. تغییرات جذب در ۲۴۰ نانومتر به مدت ۶۰ ثانیه در ۲۵ درجه سانتیگراد با استفاده از اسپکتروفتومتر قرائت شد. تغییرات جذب به‌دست‌آمده در زمان یک دقیقه، به ضریب خاموشی مولی این واکنش که برابر mM-1cm-136 است تقسیم شد و فعالیت آنزیمی بر حسب واحد در گرم وزن‌تر بیان شد (10, 48).
آنزیم پراکسیداز (PX): جهت اندازهگیری فعالیت آنزیم پراکسیداز، سه میلیلیتر مخلوط واکنش شامل؛ 2390 میکرو لیتر بافر فسفات سدیم ۵۰ میلی مولار (5/6PH=)؛ 240 میکرو لیتر گایاکول 1 درصد و 240 میکرو لیتر پراکسید هیدروژن 3/0% و 130 میکرو لیتر عصاره آنزیمی استفاده شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس میزان اکسید شدن گایاکول در طول‌موج ۴۷۰ نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی mM-1cm-1 26/6 تعیین گردید (45).
اندازهگیری میزان فنل کل و فلاونوئید: 1/0 گرم اندام هوایی در 5 میلیلیتر اتانول 95 درصد سائیده و به مدت 72-24 ساعت در تاریکی به‌منظور سنجش ترکیبات فنلی کل و فلاونوئید کل نگهداری و سپس در 4000 دور به مدت 20 دقیق سانتریفیوژ شدند.
برای سنجش میزان فنل کل به یک میلیلیتر محلول رویی سانتریفیوژ شده، یک میلیلیتر اتانول 95 درصد اضافه گردید و با آب مقطر، حجم محلول به 5 میلیلیتر رسانده شد. سپس 5/0 میلیلیتر معرف فولین 50 درصد و یک میلیلیتر کربنات سدیم 5 درصد به آن اضافه گردید. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در تاریکی نگهداری شد و سپس جذب هر نمونه در طول‌موج 725 نانومتر خوانده شد و با استفاده از منحنی استاندارد گالیک اسید (شکل 1 بخش A)، غلظت ترکیبات فنلی کل برحسب میلیگرم در گرم وزن‌تر محاسبه گردید. رسم منحنی استاندارد فنل کل در غلظتهای 0، 50، 100، 250 و 350 میلیگرم در لیتر صورت گرفت (40).
برای سنجش میزان فلاونوئید کل به 500 میکرو لیتر از هر عصاره 5/1 میلیلیتر متانول (80%)، 100 میکرو لیتر محلول آلومینیوم کلراید (10%)، 100 میکرو لیتر محلول استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلیلیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط بعد از گذشت 40 دقیقه در طول‌موج 415 نانومتر نسبت به بلانک اندازهگیری گردید. بلانک حاوی تمام ترکیبات ذکر شده در بالا بود اما بجای عصاره، همان حجم متانول 80% به آن اضافه‌شده بود. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد (شکل 1 بخش B). میزان فلاونوئید کل عصارهها بر اساس میلیگرم معادل کوئرستین بر گرم وزن خشک گیاه گزارش شد (14).
تهیه معرف بیوره: به‌منظور تهیه معرف بیوره، 1/0 گرم کوماسی بریلیانت بلو G250 در 50 میلیلیتر اتانول 96 درجه به مدت یک ساعت با کمک همزن مغناطیسی (مگنت) در تاریکی به‌خوبی حل گردد. سپس 100 میلیلیتر اسید فسفریک 85 درصد قطره‌قطره به آن افزوده شود. در پایان حجم کل محلول به کمک آب مقطر به یک لیتر رسانده شود محلول حاصل با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف گردد (18).
سنجش پروتئین استاندارد و ارزیابی میزان پروتئین کل: برای ارزیابی و تعیین میزان فعالیت آنزیم، لازم است ارزیابی دقیقی از میزان کل پروتئین موجود در عصاره مورد آزمایش، صورت گیرد. بدین منظور از روش بردفورد (13) به شرح زیر استفاده گردید. یک گرم بافت تر در یک هاون چینی محتوی سه میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار با 2/7 pH سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال دار در g 14000 و دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس مقدار 1/0 میلیلیتر عصاره پروتئینی (محلول رویی) به لوله‌ها‌ی آزمایش منتقل و پنج میلیلیتر معرف بیوره افزوده و سریعاً ورتکس شد. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب آنها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج ۵9۵ نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین گاوی (شکل 1 بخش C) محاسبه و بر حسب میلیگرم بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.
شکل 1- منحنی استاندارد؛ گالیک اسید جهت اندازهگیری مقادیر فنل (A)؛ کوئرستین جهت اندازهگیری مقادیر فلاونوئید (B)؛ آلبومین سرم گاوی جهت اندازهگیری مقادیر پروتئین کل (C)
اندازهگیری آنتوسیانین: جهت اندازهگیری آنتوسیانین 1/0 گرم از بافت برگی تازه را در هاون چینی با ۱۰ میلیلیتر متانول اسیدی (متانول خالص و اسید کلریدریک خالص به نسبت حجمی 1: 9) کاملاً ساییده و عصاره در لوله آزمایش سرپیچدار ریخته شد و به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ و جذب محلول رویی در طول‌موج nm۵۵۰ اندازهگیری شد. غلظت با استفاده از فرمول زیر و با در نظر گرفتن ضریب خاموشی (ε) ۳۳۰۰۰ سانتیمتر بر مول و نتایج بر حسب میکرو مول بر گرم وزن تر ارائه شد (41).
اندازهگیری ﻛﻠﺮوﻓﻴﻞ و کارتنوئید: جهت اندازهگیری ﻛﻠﺮوﻓﻴﻞ و کارتنوئید ﻣﻘـﺪار 125/0 ﮔﺮم از ﺑﺎﻓﺖ ﺗﺮ برگ ﺑﺎ ۵ میلیلیتر اﺳﺘﻮن ۸۰ درﺻﺪ ﺧﺮد ﺷﺪ. ﻣﺨﻠﻮط به‌دست‌آمده ﺑﻪ ﻣﺪت ۱۰ دﻗﻴﻘﻪ در ۶۰۰۰ دور در دﻗﻴﻘﻪ ﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻴﻮژ ﮔﺮدﻳﺪ و در ﻧﻬﺎﻳﺖ، ﻗﺴﻤﺖ ﺑﺎﻻﻳﻲ ﻋﺼﺎره ﺟﺪا و ﺣﺠﻢ آن ﺑﻪ ۸ میلیلیتر رﺳﺎﻧﺪه ﺷﺪ. اندازهگیری ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش اﺳـﭙﻜﺘﺮوﻓﺘﻮﻣﺘﺮی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓﺖ و برای کلروفیل a، b و کارتنوئید به ترتیب در طول‌موج‌های ۶۶۳ و ۶۴۵ و ۴۷۰ نانومتر خوانده شد. جهت تنظیم دستگاه، از استون ۸۰ درصد به‌عنوان کنترل استفاده شد. غلظت رنگیزه با استفاده از رابطههای صفحه بعد محاسبه گردید (33).
V ضخامت کووت میباشد
تجزیه وتحلیل آماری: دادههای حاصله از این تحقیق به‌صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار با استفاده از نرم‌افزارهای SAS (نسخه 1/9) و Excel ارزیابی شدند. دادههای حاصله از بررسیهای کروموزومی، دادههای مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تجزیه آماری شدند و از نرم‌افزار جهت رسم نمودار استفاده شد. با توجه به اینکه اکثر دادههای حاصل از شمارش پلیپلوئیدی به‌دست‌آمده در این تحقیق بر اساس درصد بودند، برای اینکه دادهها دارای توزیع نرمال باشند، از تبدیل داده جذری=X1 استفاده شد. در مواردی هم که صفر وجود داشت از تبدیل=X1 استفاده گردید. مقایسه میانگین نیز بر اساس حداقل تفاوت معنیداری (LSD) انجام شد.
نتایج و بحث
نتایج پلیپلوئیدی حاصل از تیمار با کلشیسین: پس از مطالعه و عکس‌برداری از اسلاید نمونه شاهد، عدد کروموزومی در زنیان ۱۸=n۲ به دست آمد (شکل A2) که مشابه با نتایج تعدادی از محققان میباشد (17, 44). نتایج حاصل از بررسی سطح پلوئیدی گیاه تیمار شده با سطوح مختلف کلشیسین در سه زمان مختلف با استفاده از شمارش کروموزومی بررسی شد (شکل B2).
نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که غلظتهای مختلف کلشیسین و مدت زمان اعمال تیمار بر درصد احتمالی گیاهان تتراپلوئید زنیان شیراز معنیدار بود (جدول ۱). نتایج مقایسه میانگین دادهها نشان داد که بیشترین میزان تتراپلوئیدی برای جمعیت شیراز مورد مطالعه، در غلظت 5/0 گرم بر لیتر در مدت زمان ۶ ساعت مشاهده و سایر غلظتهای پایینتر و بالاتر تأثیر کمتری بر این فاکتور داشتند (شکل 3)در تحقیقی (38) نیز بهترین زمان اعمال تیمار (6 ساعت) و بهترین غلظت کلشیسین (5/0 گرم) جهت القاء پلیپلوئیدی در ریحان ذکر شده است که با تحقیق حاضر مشابهت داشت. همچنین در تحقیق دیگری (11) بهترین غلظت کلشیسین (5/0 گرم در لیتر) به‌صورت معنیداری بر اتو تتراپلوئید شدن شنبلیله تأثیر داشت که با تحقیق حاضر مشابهت داشت. همچنین در سایر تحقیقات نیز غلظت مؤثر برای القای پلوئیدی را در گیاهان مختلف بین 0006/0 تا 3 درصد گزارش کرده‌اند و غلظت مؤثر بسته به نوع گیاه، روش تیمار و مدت زمان تیمار متفاوت میباشد (17). در تحقیقات دیگر نیز غلظت مؤثر برای القای پلوئیدی را در گیاهان مختلف بین 0006/0 تا 3 درصد گزارش کرده‌اند و غلظت مؤثر بسته به نوع گیاه، روش تیمار و مدت زمان تیمار متفاوت میباشد (23).
ارزیابی ویژگیهای مورفولوژیک گیاه زنیان: نتایج حاصل از تجزیه واریانس تحقیق حاضر نشان داد که تأثیر تتراپلوئیدی بر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک گیاه زنیان بررسی و مشخص شد که بر صفات تعداد گل، تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، قطر ریشه و وزن تر و خشک بوته معنیدار اما بر صفات قطر ساقه اصلی و فرعی، طول و عرض برگ بی‌تفاوت بوده است (جدول 2).
مقایسه میانگین دادهها نشان داد که تعداد گل در گیاه تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید کمتر شده است (جدول 3). در گیاه ریحان گزارش شده (28) تعداد گل در گیاهان تتراپلوئیدی که با دو برابر کردن کروموزومهای گیاهان دیپلوئید به‌دست‌آمده بود، کاهش یافته بود که با تحقیق حاضر مشابهت داشت اما در برخی منابع (25) نیز ذکر شده مرحله گلدهی در گیاهان پلیپلوئید در مقایسه با انواع دیپلوئید دیرتر آغاز میشود اما طول مدت گلدهی در آنها بیشتر است که در تحقیق حاضر این موضوع بررسی نشد.
شکل 2- تصاویر کروموزومی قبل و بعد از تیمار با کلشیسین: A؛ دیپلوئید و B؛ تتراپلوئید
جدول ۱- نتایج تجزیه واریانس القاء پلیپلوئیدی در گیاه زنیان پس از تیمار با کلشیسین در زمان‌های مختلف
|
منابع تغییرات |
درصد پلیپلوئیدی |
|
زمان |
**63/23 |
|
غلظت |
**60/17 |
|
زمان×غلظت |
**64/8 |
|
خطا |
1147/0 |
|
ضریب تغییرات |
30/10 |
ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنیدار، اختلاف معنیدار در سطح 5 و 1 درصد
شکل 3- اثر متقابل غلظت و مدت زمان تیمار کلشیسین بر درصد پلیپلوئیدی گیاه زنیان
حروف مشابه برای هر تیمار نشان‌دهنده تفاوت غیر معنیدار بین آن‌هاست
(با توجه به کم بودن برخی اعداد و عدم نمایش آنها در نمودار لذا سعی شد از تمامی اعداد لگاریتم بر مبنای 2 گرفته شود ؛ x همان عدد اصلی میباشد)
مقایسه میانگین دادهها نشان داد که تعداد شاخه جانبی و تعداد برگ در گیاه تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید بیشتر شده است (جدول 3). افزایش تعداد شاخه فرعی در اثر افزایش سطوح پلوئیدی در گیاه Colophospermum mopan (53) و انگیزش پلوئیدی سبب افزایش تعداد برگهای بیشتر، دفرمه، قطور و به رنگ سبز تیره در گیاه دارویی بنگدانه شده است (25).
بر اساس نتایج مقایسه میانگین دادهها، تیمار با کلشیسین روی ارتفاع گیاهتأثیر گذار و با افزایش سطح پلوئیدی ارتفاع گیاه افزایش یافت (جدول 3). تأثیر پلیپلوئیدی بر ارتفاع گیاهان متفاوت است به‌طوری‌که در برخی موارد انگیزش پلیپلوئیدی در گیاهان ارتفاع بوته را افزایش(27)، اما در برخی موارد سبب کاهش ارتفاع گیاهان شده است (30, 38). بررسی اثر کلشیسین روی گیاه مختلف نشان داده که افزایش ارتفاع در گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید میتواند به دلیل افزایش اندازه سلولها باشد که این افزایش ارتفاع بسته به نوع گیاه و رقم نیز متفاوت است (35, 43). در کل القای پلیپلوئیدی ضمن افزایش میزان DNA الگو، با تحریک مکانیسمهایی در سلول، نسخهبرداری و ترجمه را تحت تأثیر قرار داده و با افزایش یا کاهش بیان و یا حتی خاموشی ژنها، بسیاری از صفات فیزیولوژیک و مورفولوژیک گیاه را تغییر میدهد (2).
مقایسه میانگین دادهها نشان داد که برگهای گیاهان زنیان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای طول و عرض بیشتری نسبت به گیاهان زنیان دیپلوئید بودند در حالیکه اختلاف از نظر آماری معنیدار نبود (جدول 3) که با نتایج ارائه‌شده توسط چن و همکاران (16) در گیاه چای مشابهت داشت.
در این پژوهش با افزایش پلیپلوئیدی، وزن‌تر و خشک بوته گیاهان تتراپلوئید در سطح بالاتر از گیاهان دیپلوئید قرار گرفت (جدول 3). افزایش وزن تر و خشک گیاهان تتراپلوئید نسبت به گروه شاهد میتواند به دلیل دو یا سه شاخه بودن درصد بالایی از گیاهان تتراپلوئید، بیشتر بودن میانگین سطح و ضخامت برگها باشد که باعث افزایش مواد ذخیرهای بالاتر در برگها باشد (29). در تحقیقی (30) نیز افزایش سطح پلوئیدی به‌طور معنیداری وزن‌تر و خشک اندام هوایی در گیاه تتراپلوئید پراونش افزایش داده است.
مقایسه میانگین دادهها نشان داد که قطر ریشه و قطر ساقه اصلی گیاهان زنیان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای ضخامت بیشتری نسبت به گیاهان زنیان دیپلوئید بودند در حالیکه اختلاف از نظر آماری معنیدار نبود (جدول 3)، که با نتایج ارائه‌شده برای قطر ساقه اصلی در اثر افزایش سطح پلوئیدی بر گیاهچه پروانه (Colophospermum mopane) (53) و قطر ریشه (36, 49) مشابهت داشت.
جدول ۲- نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گیاه زنیان پس از تیمار با کلشیسین
|
قطر ساقه اصلی |
قطر ریشه |
تعداد برگ |
ارتفاع گیاه |
تعداد شاخه جانبی |
تعداد گل |
df |
منابع تغییر |
|
ns 015/0 |
** 281/0 |
*۲۴ |
**6/640 |
*66/16 |
*1/2360 |
۱ |
تیمار |
|
0083/0 |
011/0 |
3/19 |
16/2 |
16/3 |
1/429 |
۴ |
خطا |
|
35/13 |
07/15 |
6/11 |
01/4 |
26/14 |
1/10 |
- |
ضریب تغییرات |
|
|
وزن خشک |
وزن تر |
عرض برگ |
طول برگ |
قطر ساقه فرعی |
df |
منابع تغییر |
|
|
* 033/0 |
**417/0 |
ns 0816/0 |
ns 135/0 |
ns 006/0 |
۱ |
تیمار |
|
|
007/0 |
010/0 |
288/0 |
37/0 |
0016/0 |
۴ |
خطا |
|
|
91/8 |
07/6 |
02/16 |
61/10 |
42/9 |
- |
ضریب تغییرات |
ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنیدار، اختلاف معنیدار در سطح 5 و 1 درصد
جدول ۳- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید
|
قطر ساقه اصلی (mm) |
قطر ریشه (mm) |
تعداد برگ |
ارتفاع گیاه (mm) |
تعداد شاخه جانبی |
تعداد گل |
غلظت کلشیسین |
|
a011/0±633/0 |
b018/0±5/0 |
b29/2±33/18 |
b58/3±26 |
b42/1±66/5 |
a16/7±67/122 |
شاهد |
|
a013/0±733/0 |
a017/0±93/0 |
a44/3±33/22 |
a66/3±۴۷ |
a84/1±۹ |
b95/6±۸۳ |
5/0 گرم بر لیتر |
|
|
وزن خشک (g) |
وزن تر (g) |
عرض برگ (cm) |
طول برگ (cm) |
قطر ساقه فرعی (mm) |
غلظت کلشیسین |
|
|
b021/0±86/0 |
b21/0±40/1 |
a94/0±23/3 |
a61/0±8/2 |
a09/0±40/0 |
شاهد |
|
|
a028/0±016/1 |
a19/0±92/1 |
a98/0±46/3 |
a62/0±10/3 |
a092/0±46/0 |
5/0 گرم بر لیتر |
حروف مشابه برای هر صفت بین نمونه شاهد و تیمار داده شده نشان‌دهنده تفاوت غیر معنیدار بین آن‌هاست
بررسی اثر تغییر سطح پلوئیدی بر خصوصیات بیوشیمیایی: تأثیر تتراپلوئیدی ناشی از تأثیر غلظتهای مختلف کلشیسین و مدت زمان اعمال تیمار بر صفات فیتوشیمیایی گیاه زنیان بررسی شده و مشخص گردید که بر صفات کلروفیل a و b، کارتنوئید، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید معنیدار اما بر صفات آنتوسیانین و فنل کل غیر معنیدار بوده است (جدول 4).
نتایج مقایسه میانگین دادهها نشان داد (جدول 5) که میزان کلروفیل a در برگ نمونههای تتراپلوئید (02/191 میلیگرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونههای دیپلوئید (1/122 میلیگرم در گرم وزن تر برگ) بیشتر و همچنین میزان کلروفیل b در برگ نمونههای تتراپلوئید (7/243میلیگرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونههای دیپلوئید (5/118میلیگرم در وزن تر برگ) بیشتر بود. ازآنجاکه فرض بر آن است با دو برابر شدن ژنوم فعالیت متابولیکی، سنتز rRNA و نسخهبرداری افزایش مییابد این افزایش میتواند بر میزان تنفس، فعالیت ژنی، تنوع و میزان فعالیت آنزیمها و انتقال الکترون در فتوسنتز تأثیر داشته باشد (25, 32, 42). گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید Acacia mearnsii از نظر میزان کلروفیل a و b با یکدیگر مقایسه شدند، مشاهده شد که میزان کلروفیل در گیاهان تتراپلوئید به‌طور معنیداری بیشتر از گیاهان دیپلوئید بود (32).
بر اساس نتایج حاصله، در گیاه زنیان، افزایش سطح پلوئیدی بر میزان فنل کل گیاهان تیمار شده با کلشیسین نسبت به گیاهان شاهد بی‌معنی اما بر میزان فلاونوئید مؤثر (جدول 5) و مشخص شد که میزان فلاونوئید در برگ نمونههای تتراپلوئید (86/2 میلیگرم در گرم وزن تر برگ) نسبت به نمونههای دیپلوئید (34/1 میلیگرم در گرم وزن تر برگ) بیشتر بود. در گل اطلسی القاء پلیپلوئیدی سبب افزایش دو نوع فلاونول (46) و در گیاهان زرین تیمار شده با کلشیسین میزان فلاونوئید بیشتری نسبت به گیاهان شاهد داشتند(9) و همچنین القاء پلیپلوئیدی در گیاه لیمو ترش (3) تاثیری بر میزان فنل کل نداشته است که با نتایج این آزمایش مشابهت داشت. اما در کل میتوان استدلال کرد که گیاه مورد تیمار و گونه آن در میزان تغییر متابولیتهای ثانویه در اثر القای پلوئیدی مؤثر است. افزایش تعداد کروموزومها و مقدار ژنهای وابسته میتواند در بعضی موارد بیان و غلظت متابولیتهای ثانویه و مواد شیمیایی دفاعی را افزایش دهد، با این حال این مورد در همه گیاهان صادق نیست و ممکن است در بعضی موارد ارتباط مشخصی بین مقدار ژن، خاموش شدن ژن و بیان متابولیتهای ثانویه وجود نداشته باشد (51).
تجزیه‌وتحلیل دادههای حاصل از اثر تیمار با کلشیسین بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی زنیان نشان داد که با افزایش سطح پلوئیدی میزان فعالیت کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافت (جدول 5). گزارش شده که روش دو برابر کردن کروموزومها میتواند با افزایش فعالیت ژنی و در نتیجه افزایش تنوع آنزیمها، افزایش نسبت فتوسنتز، کاهش میزان تعرق و سرعت رشد کمتر گیاه باعث مقاومت بیشتر نسبت به تنشهای تغذیهای و شرایط محیطی گردد (50). در سورگوم آنزیمهای آنتیاکسیدانی در گیاهان تتراپلوئید افزایش معنیداری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشته‌اند (56).
نتایج نشان داد که با افزایش سطح پلوئیدی میزان پروتئین کل (57/1 میلیگرم در گرم ماده تر) در زنیان افزایش اما میزان کارتنوئید کاهش یافته است (جدول 5). افزایش اندازه سلولها در نتیجه افزایش سطح پلوئیدی میتواند به‌عنوان عاملی جهت افزایش مواد ذخیرهای در سلول تلقی شود (42). نتایج تحقیقات انجام شده نشان داد که محتوای پروتئینی در آندوسپرم لاینهای اتوتتراپلوئید برنج خیلی بیشتر از انواع دیپلوئید آن بود (55) که با تحقیق حاضر مشابهت اما ذکر شده که گیاهان تیمار شده با کلشیسین میزان کارتنوئید بیشتری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشتند(52) که با تحقیق حاضر متفاوت و میتواند به این دلیل باشد که کارتنوئید تحت تأثیر عواملی از جمله دما، شدت نور و میزان آب در دسترس در طول فصل رشد قرار میگیرد(4, 47). در تحقیقی (39) گزارش شده کارتنوئید در جلبک سبز تحت تاثیر شوری بوده و همبستگی مثبتی با شوری داشته است.
جدول ۴- نتایج تجزیه واریانس صفات فیزیولوژیک گیاه زنیان پس از تیمار با کلشیسین
|
پراکسیداز |
آنتوسیانین |
کارتنوئید |
کلروفیل b |
کلروفیل a |
df |
منابع تغییر |
|
**4/2 |
ns66/2 |
**6/3441 |
**7/13493 |
**۹9/7113 |
1 |
تیمار |
|
33/1 |
06/5 |
39/13 |
99/7 |
9/36 |
4 |
خطا |
|
64/14 |
13/12 |
31/15 |
۵۶/1 |
۸۷/3 |
- |
ضریب تغییرات |
|
|
فلاونوئید |
پروتئین کل |
فنل کل |
کاتالاز |
df |
منابع تغییر |
|
|
*47/3 |
**23/0 |
ns005/0 |
**66/1 |
1 |
تیمار |
|
|
67/2 |
0023/0 |
0036/0 |
66/6 |
4 |
خطا |
|
|
67/7 |
۳۷/3 |
۴۲/2 |
42/9 |
|
ضریب تغییرات |
ns، * و **: به ترتیب عدم اختلاف معنیدار، اختلاف معنیدار در سطح 5 و 1 درصد
جدول ۵- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژی گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید
|
سطح پلوئیدی |
کلروفیل a (mg/gFW) |
کلروفیل b (mg/gFW) |
کارتنوئید (mg/gFW) |
آنتوسیانین (mg/gFW) |
پراکسیداز (mg/gFW) |
|
۰ (شاهد) |
b52/9±1/122 |
b71/8±5/118 |
a75/2±4/38 |
a000013/0±0008/0 |
b000015/0±00013/0 |
|
5/0گرم بر لیتر |
a66/10±02/191 |
a94/9±7/243 |
b69/2±۴۹/۹ |
a000014/0±0009/0 |
a000017/0±00053/0 |
|
سطح پلوئیدی |
کاتالاز (mg/gFW) |
فنل کل (mg/gFW) |
پروتئین کل (mg/gFW) |
فلاونوئید (mg/gFW) |
|
|
۰ (شاهد) |
b00017/0±0007/0 |
a028/0±475/2 |
b098/0±174/1 |
b083/0±346/1 |
|
|
5/0گرم بر لیتر |
a00018/0±0010/0 |
a027/0±534/2 |
a096/0±572/1 |
a091/0±868/2 |
|
حروف مشابه برای هر صفت بین نمونه شاهد و تیمار داده شده نشان‌دهنده تفاوت غیر معنیدار بین آن‌هاست
نتیجهگیری کلی
نتایج این مطالعه نشان داد با استفاده از محرکهای مختلف از جمله کلشیسین میتوان باعث ایجاد تغییر در تولید متابولیتهای ثانویه شد. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت 5/0 گرم در لیتر و مدت زمان ۶ ساعت، بهترین تیمار جهت القاء پلوئیدی در گیاه زنیان میباشد. همچنین بررسیهای بیشتر و مقایسه بین خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید نشان داد که گیاهان تتراپلوئید از نظر صفات کمی از قبیل تعداد شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، قطر ریشه، وزن تر و وزن خشک گیاه و همچنین کلروفیل a، کلروفیل b، پراکسیداز، کاتالاز، پروتئین کل و فلاونوئید نسبت به گیاهان دیپلوئید برتری داشتند، بنابراین میتوان گفت که پلیپلوئیدی با ایجاد تنوع در صفات مختلف گزینههای جدیدی برای اصلاحگران ایجاد میکند تا بسته به هدف که ممکن است کاربردهای دارویی، زینتی، مقاومتی و غیره باشد، گیاهان مطلوب گزینش شوند.
', './data/cell/coversheet/561558432771.jpg'))
دوره 32، شماره 2
مرداد 1398صفحه 147-160
- تاریخ دریافت: 31 اردیبهشت 1397
- تاریخ بازنگری: 17 مرداد 1397
- تاریخ پذیرش: 25 دی 1397
- تاریخ اولین انتشار: 01 مرداد 1398