نویسندگان

دانشگاه گلستان

چکیده

ترهالوز دی ساکاریدی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند 1و1- آلفا و آلفا تشکیل شده است. این قند نقش‌های بسیار مهمی در رشد و نمو و مقاومت به تنش در گیاهان بازی می‌کند. NADP+- تیوردوکسین ردکتاز C ((NTRC پروتیینی است که در کنترل چندین واکنش مهم کلروپلاستی نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر ترهالوز بر فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانت گیاه است. به این منظور بذر آرابیدوپسیس تالیانا و گیاه جهش یافته ntrc (به عنوان گیاه حساس به تنش اکسیداتیو) به مدت 14 روز بر محیط کشت MS حاوی غلظت‌های 0 و 100 میلی‌مولار ساکارز و یا ترهالوز کشت داده شدند. نتایج نشان داد که تیمار ترهالوز سبب افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، و پلی فنل اکسیداز در گیاهچه وحشی و جهش یافته در مقایسه با تیمار شاهد و ساکارز شده است. همچنین میزان فعالیت این آنزیم‌ها در تیمار ترهالوز در گیاهچه وحشی بالاتر از گیاهچه جهش‌یافته بود. تیمار ترهالوز سبب کاهش میزان پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدهید و افزایش فنل و آنتوسیانین در گیاهچه وحشی در مقایسه با تیمار شاهد شده است. همچنین نتایج نشان داد که در تیمار ترهالوز مقدار پراکسیدهیدروژن گیاهچه‌های وحشی کمتر از لاین‌های جهش‌یافته بود. این نتایج نشان می‌دهد که ترهالوز با فعال کردن سیستم آنتی‌اکسیدانت سبب پالایش رادیکال‌های آزاد می‌شود. نتایج حاضر می‌تواند در درک چگونگی نقش ترهالوز در مقاومت به تنش در گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The effect of trehalose feeding on antioxidant system of Arabidopsis thaliana ntrc mutant

نویسندگان [English]

  • mahnaz Aghdasi
  • Aniseh Norozipoor
  • Hamid reza Sadeghipour

چکیده [English]

Trehalose is the alpha, alpha-1,1-linked glucose disaccharide which plays pivotal roles in plants growth, development and resistance to stress. The NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC) acts as redox regulatory factor and involved in different chloroplastic processes. The aim of present study was to gain further insight into the effect of trehalose on plant antioxidant system activity. For this purpose, the seeds of Arabidopsis thaliana (WT) and ntrc mutant plants (as sensitive plants to stress) were grown on MS medium with or without 100 mM sucrose and/or trehalose for 14 days. The results showed that trehalose treatment induced peroxidase, ascorbate peroxidase and polyphenol oxidase in both mutant lines and WT seedlings, compared to control and sucrose treatment. Meanwhile these enzyme activities were higher in WT seedlings than that of ntrc mutants. Trehalose treatment decreased hydrogen peroxide and malon dialdehyde content in WT seedlings but increased phenol and anthocyanin content, compared to control. Also, the amount of hydrogen peroxide in WT seedlings was lower than mutant seedlings by trehalose feeding. The results revealed that trehalose eliminates reactive oxygen species by inducing plant antioxidant system. The obtained data can be useful to understand the role of trehalose in plant stress resistance.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Trehalose
  • thioredoxin
  • mutant
  • ntrc
  • antioxidant

تأثیر ترهالوز بر سیستم آنتی­اکسیدانت جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana)

انیسه نوروزی پور، مهناز اقدسی* و حمیدرضا­صادقی پور

ایران، گرگان،دانشگاهگلستان،دانشکدهعلوم،گروهزیستشناسی

تاریخ دریافت: 23/10/96              تاریخ پذیرش: 8/12/96

چکیده

ترهالوز دی ساکاریدی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند 1و1- آلفا و آلفا تشکیل شده است. این قند نقشهای بسیار مهمی در رشد و نمو و مقاومت به تنش در گیاهان بازی می­کند. NADP+- تیوردوکسین ردکتاز C ((NTRC پروتئینی است که در کنترل چندین واکنش مهم کلروپلاستی نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر ترهالوز بر فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانت گیاه است. به این منظور بذر آرابیدوپسیس تالیانا و گیاه جهش یافته ntrc (به عنوان گیاه حساس به تنش اکسیداتیو) به مدت 14 روز بر محیط کشت MS حاوی غلظتهای 0 و 100 میلی­مولار ساکارز و یا ترهالوز کشت داده شدند. نتایج نشان داد که تیمار ترهالوز سبب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیمهای پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، و پلی فنول اکسیداز در گیاهچه وحشی و جهش یافته در مقایسه با تیمار شاهد و ساکارز شده است. همچنین میزان فعالیت این آنزیمها در تیمار ترهالوز در گیاهچه وحشی بالاتر از گیاهچه جهش­یافته بود. تیمار ترهالوز سبب کاهش میزان پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدهید و افزایش فنول و آنتوسیانین در گیاهچه وحشی در مقایسه با تیمار شاهد شده است.  همچنین نتایج نشان داد که در تیمار ترهالوز مقدار پراکسیدهیدروژن گیاهچه­های وحشی کمتر از لاینهای جهش­یافته بود. این نتایج نشان می­دهد که ترهالوز با فعال کردن سیستم آنتی­اکسیدانت سبب پالایش رادیکالهای آزاد می­شود. نتایج حاضر می­تواند در درک چگونگی نقش ترهالوز در مقاومت به تنش در گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: ترهالوز، تیوردوکسین، جهش­یافته، ntrc، آنتی اکسیدانت

* نویسنده مسئول، تلفن: 01732548159، پست الکترونیکی: [email protected]، [email protected]

مقدمه

 

در شرایط عادی، گونه­های فعال اکسیژن به­صورت محصولات جانبی در متابولیسم سلولی گیاهان (مانند فتوسنتر، تنفس و غیره) تولید می­شوند و عنوان مولکولهای پیام­رسان در انتقال پیام ردوکس عمل می­کنند (2، 17 و 18). اما از طرف دیگر برای متابولیسم سلولی گیاه مضر می­باشند. گونه­های فعال اکسیژن در تنشهای زیستی و غیرزیستی، به عنوان یک پاسخ عمومی گیاهان به شرایط محیطی نامطلوب، تولید می­شوند (30). زمانی­که گونه­های فعال اکسیژن به میزان زیادی در سلولهای گیاه تولید شوند، شرایطی را به وجود می­آورند که به آن تنش اکسیداتیو گفته می­شود. تنش اکسیداتیو می­تواند باعث تخریب و آسیب اجزای سلولی مانند DNA، پروتئین­ها، و غشاهای لیپیدی شود (3 و 32). در گیاهان آنزیمهای آنتی­اکسیدانت می­توانند گیاه را از تنش اکسیداتیو محافظت کنند (33). سیستمهای آنتی­اکسیداتیو شامل مولکولهای آنتی­اکسیدانت مثل اسید آسکوربیک، گلوتاتیون، آلفا توکوفرول و کاروتنوئیدها، و آنزیمهای آنتی­اکسیدانت مثل آسکوربات پراکسیدازها (APXs)، کاتالازها (CATs)، گلوتاتیون ردوکتاز (GLRs)، پراکسیدازها (PODs) و سوپراکسیددیسموتازها (SODs) می­باشند (3 و 38).

تیوردوکسین‌ها پروتئینهای کوچک با وزن مولکولی 14-12 کیلودالتون بوده که در تنظیم ردوکس بسیاری از فرآیندهای سلولی دخالت دارند (2، 13 و 48). در گیاهان نوعی تیوردوکسین به نام NTRC (NADPH-dependent thioredoxin reductase C)وجود دارد که حاوی قلمرو C – ترمینال تیوردوکسینی بوده و در کلروپلاست جای دارد (50). پروتئین NTRC قادر است با استفاده از NADPH، آنتی اکسیدانتهای کلروپلاستی از جمله آنزیم2-سیستئین پراکسی­ردوکسین (2-Cys-Prxs) را احیاء و فعال کند و سمیت پراکسیدهیدروژن (H2O2) را خنثی نماید (34، 42 و 43). همچنین NTRCدر تنظیم آنزیمهای سنتز کلروفیل (44 و 48) و نشاسته (33) نیز نقش دارد.

پاسخ موجودات زنده به انواع تنشها، انباشتگی قندها و دیگر محلولهای سازگار مشترک است (29). این ترکیبات به عنوان محافظت­کننده­های اسمزی عمل کرده و در برخی موارد مولکولهای زیستی را پایدار می­کنند (22 و 53). یکی از این ترکیبات ترهالوز است. ترهالوز دی­ساکاریدی غیراحیایی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند آلفا 1 و 1 ساخته شده است (16). این قند در مراحل مختلف رشد و نمو گیاهان نقشهای مهمی را بازی می­کند. به عنوان مثال می­توان به نقش آن در رشد و نمو، گلدهی، مصرف کربن و متابولیسم کربوهیدرات، فتوسنتز و مقاومت به تنش اشاره کرد (12، 40، 47 و 52). نقش ترهالوز در تحمل تنش غیرزیستی برای اولین بار در گیاهان رستاخیزی، مانند گونه­های مختلف علف­خوک به اثبات رسیده است. این گیاهان در فصول گرم یا تنش­ خشکی می­توانند تقریباً به طور کامل بی­آب شوند و به محض دریافت مجدد آب دوباره احیا شده و زندگی را از سر گیرند (14 و 27). تجمع ترهالوز در تنشهای غیرزیستی تنها محدود به گیاهان رستاخیزی نبوده  و بسیاری از گیاهان در هنگام تنش، ترهالوز را در اندام خاصی انباشته می­کنند (15 و 20). به عنوان مثال چنانچه گیاه آرابیدوپسیس تالیانا به مدت 4 ساعت تحت تنش گرما (40 درجه سانتی­گراد) قرار گیرد، مقدار ترهالوز در آن تا  دو برابر افزایش می یابد و چنانچه به مدت 4 روز در دمای  4 درجه سانتی­گراد قرار گیرد میزان این قند تا 8 برابر افزایش می­یابد (28). تیمار گیاه برنج با قند ترهالوز به طور معنی­داری آسیب ناشی از تنش شوری را کاهش می­دهد (19).

بررسیها نشان داده است که بسیاری از ژنهای درگیر در متابولیسم ترهالوز در آرابیدوپسیس تالیانا به طیف وسیعی از تنشهای غیرزیستی مانند سرما، شوری و UV پاسخ می­دهند (23). همچنین تیمار گیاهچه­های آرابیدوپسیس با غلظت 100 میلی­مولار ترهالوز، سبب تحریک بیان ژنهای پراکسیداز، پراکسیداز 42 (PER42)، پرولین اکسیداز (POX)، L- آسکوربات پراکسیداز تیلاکوییدی (tAPX)، و ژنهای مرتبط با متابولیسم ثانویه می­شود (1).

نقش ترهالوز در محافظت در برابر رادیکالهای آزاد اکسیژن به اثبات رسیده است (37). این ویژگی در میکروارگانیسمها و گیاهانی که ترهالوز را به مقدار زیاد انباشته می­کنند، اهمیت ویژه­ای دارد (35). شواهد نشان داده است که قند ترهالوز به عنوان یک آنتی­اکسیدانت عمل می­کند. به عنوان مثال زمانی­که مخمر در معرض پراکسید هیدروژن قرار گیرد مقدار قابل توجهی ترهالوز در درون سلولهای خود انباشته می­کند که با محافظت از پروتئینها، از آسیب اکسیداتیو جلوگیری خواهد کرد. از طرفی دیگر چنانچه سلولهای مخمر با محلول 10 درصد ترهالوز تیمار شوند، نسبت به H2O2 مقاوم­تر خواهند شد (7). گیاه گندم نیز زمانی­ که در معرض تنش گرما قرار گیرد، با افزایش مقدار ترهالوز درونی، رادیکالهای تولید شده را خنثی می­کند (27). در شرایط in vitro، ترهالوز به طور قابل توجهی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع را از طریق برهمکنش ضعیف با پیوندهای دوگانه، کاهش می­دهد (39).

در حال حاضر شواهد متناقضی در ارتباط با نقش ترهالوز در زندگی و رشد گیاهان وجود دارد. برخی گزارش­ها حاکی از آن است که تیمار گیاهان با ترهالوز سبب تنش اکسیداتیو شده و برخی دیگر از گزارشها به نقش محافظتی ترهالوز در برابر تنشها و ایجاد مقاومت در گیاهان اشاره دارد. مطالعه حاضر با هدف بررسی سیستم آنتی­اکسیدانت گیاهان در تیمار ترهالوز در رقم وحشی آرابیدوپسیس(Col-0) و جهش­یافته­های ntrc (به عنوان گیاهان حساس به تنش­ اکسیداتیو) انجام شده است.

مواد و روشها

شرایط کشت: در این آزمایش از بذرهای Arabidopsis thaliana رقم کلمبیا صفر (Col-0) و بذرهای دو لاین جهش‌یافته ntrc (096776 و 114293)(SALK_096776, SALK_114293)، اهدایی از گروه پروفسور Rintamäki و Lepistö از کشور فنلاند، انجام شده است. جایگاه ورود T-DNA در این دو جهش­یافته به ترتیب در اینترون 8 و اگزون 9 است. بذرها ابتدا با اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه ضدعفونی سطحی شده و سپس به مدت 5 دقیقه در آب ژاول 20 درصد قرار گرفتند. بعد از اتمام مراحل ضدعفونی، بذرها با آب مقطر استریل 5 بار شستشو داده شده و در 3 نوع محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوگ (MS)  (شاهد)، محیط کشت MS حاوی غلظت 100 میلی­مولار ساکاروز و محیط کشت MS حاوی غلظت 100 میلی­مولار ترهالوز کشت داده شدند. در هر پتری 50 بذر و هر تیمار با 5 تکرار انجام شد. به منظور استراتیفیکاسیون پتری­های حاوی بذور به مدت سه روز در دمای 4 درجه سانتی­گراد در یخچال نگهداری شدند و بعد از آن به اتاقک رشد با دمای 2± 24 درجه سانتی گراد در شرایط روز بلند ( 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) و شدت نور 150 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه انتقال یافتند. پس از گذشت 14 روز گیاهچه‌ها جهت بررسی پارامترهای بیوشیمیایی  برداشت شدند.

استخراج و سنجش آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز، پراکسیداز محلول و پلی فنول اکسیداز: مقدار 05/0 گرم بافت گیاهی در هاون چینی سرد با 2 میلی‌لیتر بافر فسفات مونوسدیک 1/0 مولار با اسیدیته 8/6 هموژن شد. هموژن حاصل به مدت 15 دقیقه در 16000 دور در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. از روشناور (سوپرناتانت) به‌ دست آمده برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیمها استفاده شد (24).

فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز با استفاده از روش Maehly وChance  (1955) و  فعالیت آنزیم پلی فنول ‌اکسیداز بر اساس روش Mishra و Kar (1976) همراه با تغییراتی اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش آنزیم کاتالاز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر، شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، آب اکسیژنه 15 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه شد. با افزودن سوبسترا (H2O2) به محیط واکنش، تجزیه پراکسید هیدروژن توسط آنزیم شروع و سپس تغییرات جذب نور محلول واکنش نسبت به شاهد در طول موج 240 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت شد. در نهایت فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده  (ضریب خاموشی mM-1 cm-1 40) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان گردید (9).

مخلوط واکنش آنزیم گایاکول پراکسیداز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، گایاکول 20 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 40 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه شد. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن آغاز شد. تغییرات جذب نور محلول واکنش نسبت به شاهد در طول موج 470 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت گردید. در نهایت فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس میکرومول تتراگایاکول تشکیل شده (ضریب خاموشی mM-1 cm-1 6/26) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان گردید (9).

مخلوط واکنش آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر شامل بافر‌فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، پیروگالل 10 میلی‌مولار و100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه و با افزودن پیروگالل به محلول واکنش، فعالیت آنزیمی آغاز شد. تغییرات جذب نور محلول نسبت به شاهد در طول موج 420 نانومتر برای مدت 120 ثانیه ثبت شد. در نهایت فعالیت آنزیم پلی­ فنول اکسیداز بر اساس میکرومول پورپوروگالین تشکیل شده (ضریب خاموشی mM-1 cm-1 47/2) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان شد (25).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به روش Asada وNakano  (1981) با اندکی تغییرات انجام شد (36). مخلوط واکنش به حجم نهایی 2 میلی‌لیتر شامل‌ بافر فسفات مونو‌سدیک 250 میلی مولار (‌7 =‌pH‌)، اسید آسکوربیک 5/0 میلی‌مولار، EDTA‌ 1/0 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 2/1 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. کاهش جذب نور ناشی از پراکسیداسیون اسید آسکوربیک در طول موج290 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت گردید. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی (ε)معادل  mmol.L-1.cm-1 8/2 مربوط به آسکوربات محاسبه گردید.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از ریبوفلاوین و متیونین در حضور نور جهت تولید رادیکالهای سوپراکسید اندازه­گیری شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات مونوسدیک 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/7، EDTA 66/0 میلی‌مولار، متیونین 10 میلی‌مولار، NBT 33 میکرو‌مولار، ریبوفلاوین 0033/0 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود که شاهد در تاریکی و نمونه در معرض تابش نور سفید قرار گرفت. بعد از تابش نور به مدت 15 دقیقه، جذب نور در طول موج 560 نانومتر بر اساس ممانعت از تولید مونوفورمازان (احیای NBT) اندازه‌گیری و اختلاف جذب زمان صفر و 15 دقیقه تعیین شد. میزان مهارکنندگی احیای نوری NBT توسط عصارۀ آنزیمی هر نمونه در مقایسه با اختلاف جذب نور زمان صفر و 15 دقیقه واکنش شاهد (بدون آنزیم) مطابق فرمول زیر تععین گردید. یک واحد فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز معادل با 50 درصد مهار احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم به فورامازون تعریف شد. در نهایت فعالیت آنزیم براساس واحد سوپراکسید دیسموتاز بر دقیقه بر گرم وزن تر گیاه گزارش شد (6).

 

اندازه­گیری مقدار پراکسید هیدروژن: مقدار پراکسید هیدروژن با استفاده از رنگ‌سنجی و بر طبق روش Sergive و همکاران (1997) اندازه­گیری شد (49).

اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپید: اندازه­­گیری پراکسیداسیون لیپید با استفاده از اندازه­گیری مقدار مالون دی آلدهید (MDA) به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپید صورت گرفت (44). در نهایت عصاره به دست آمده در مد فتومتریک و در سه طول موج 440، 532 و 600 نانومتر خوانده شد و براساس نانومول مالون دی آلدهید تولید شده در یک گرم بافت تر گیاه بیان شد.

اندازه گیری مقدار کلروفیل: اندازه­گیری کلروفیل به روشArnon  (1949) انجام گرفت (4). به این منظور مقدار 05/0 گرم از بافت تر بخش هوایی با 5 میلی­لیتر استون 80 درصد ساییده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد. در نهایت قسمت بالایی عصاره جدا شده و حجم نهایی آن به 8 میلی­لیتر رسید. سپس میزان جذب آن در دو طول موج 645 و 663 و 670 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه­گیری شد. در نهایت مقدار کلروفیل بر اساس مقدار میلی­گرم کلروفیل به ازای یک گرم وزن تر گیاه نشان داده شد.

اندازه­گیری مقدارآنتوسیانین:  به روش Mita و همکاران (1997) انجام شد (31). مقدار 02/0 گرم بافت تازه گیاه در ازت مایع خرد شده و سپس 4 میلی­لیتر محلول 1 درصد اسید کلریدریک در متانول به آن اضافه شده و به مدت 24 ساعت در یخچال قرار داده شد. محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد. جذب نور در فاز رویی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موجهای 530 و 657 نانومتر خوانده شد و با استفاده از فرمول زیر، میزان نسبی آنتوسیانین تعیین شد.

A= A550- (0.25 A657)

A= میزان نسبی آنتوسیانین

A530و A657 به ترتیب جذب نور نمونه در طول موجهای 530 و 657 نانومتر است.

اندازه‌گیری فنول محلول: میزان فنول کل در عصاره­های استخراج شده  با استفاده از معرف فولین­سیو­کالتیو(Folin-CiocalteuReagent) تعیین شد (18). ابتدا 250 میکرولیتر از عصاره­ استخراج­شده با غلظت  10 میلی­گرم در لیتراز فیلتر میلی­پور mm) 45/0( عبور داده شده و با 25/1 میلی لیتر از معرف فولین­سیو­کالتیو 2/0 مولار مخلوط گردید. پس از 5 دقیقه قرارگیری در دمای محیط، یک میلی لیتر محلول Na2CO3 ( 5/7 گرم در لیتر) به آنها اضافه شده  و به مدت 2 ساعت در دمای محیط مجدداً انکوبه شد. سپس جذب محلول در  طول موجnm  760 خوانده شد. برای رسم منحنی استاندارد غلظتهای مختلفی از اسید گالیک (2 ،5/1، 1 ، 5/0 ، 0 میلی­گرم در لیتر) تهیه  و طول موج آن در در دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد.  میزان فنول کل عصاره­های استخراج شده بر مبنای میلی­گرم گالیک­اسید بر گرم عصاره استخراج شده محاسبه شد.

تجزیه و تحلیلهای آماری: آزمایشها با 4 تکرار و در قالب طرح آزمایشی کاملاً تصادفی انجام شد. تجزیه واریانس داده­ها با نرم افزار SAS مورد بررسی قرار گرفت و میانگینها با آزمون دانکن در سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند. نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel رسم شدند.

نتایج

در این مطالعه از گیاه وحشی آرابیدوپسیس لاین Col-0 و دو لاین جهش­یافته ntrc 096776 و 114293 استفاده شد. و جایگاه ورود T-DNA در آنها به ترتیب در اینترون 8 و اگزون 9 است.  فنوتیپ بارز این جهش­یافته­ها رنگ سبز پریده و سرعت رشد در آنها کمتر از گیاهچه­های وحشی آرابیدوپسیس بود (شکل 1).


 

شکل1- فنوتیپ گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه  MS.


اثر تیمار ترهالوز بر فعالیت آنزیمهای آنتی­اکسیدانتی در جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی آرابیدوپسیس: گیاهچه­های‌ جهش‌یافته و وحشی رشد­یافته بر روی  محیط کشت پایه MS (شاهد) و یا محیط کشت حاوی ساکاروز تفاوت معنی­داری را در فعالیت آنزیم کاتالاز نشان ندادند. در تیمار ترهالوز فعالیت آنزیم کاتالاز در جهش­یافته­های ntrc نسبت به گیاه وحشی 40 درصد افزایش نشان داد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار ترهالوز و در همه گیاهان وحشی و جهش­یافته، در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز بالاتر بود (شکل 2-الف). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم کاتالاز نشان داد که فاکتور تیمار در سطح کمتر از 1 درصد، و فاکتور رقم و اثر متقابل تیمار و رقم در سطح کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری را در فعالیت آنزیم ایجاد کردند (جدول 1).

همچنین نتایج حاضر نشان داد که فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول در بین گیاهچه­های‌ جهش‌یافته و وحشی رشد­یافته بر روی  محیط کشت پایه MS تفاوت معنی­داری نشان نمی­دهد. در تیمار ساکاروز نیز میزان فعالیت آنزیم در گیاهچه­های‌ وحشی و جهش­یافته­ها تفاوت معنی­داری نداشت. در حالی­که تیمار ترهالوز سبب افزایش 30 درصدی فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول در گیاهچه­های‌ مورد بررسی در مقایسه با تیمار شاهد شد. این در حالی است که در جهش­یافته­های ntrc فعالیت این آنزیم نسبت به گیاه وحشی کمتر بود (شکل 2-ب).نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول نیز نشان داد که فاکتور تیمار در سطح کمتر از 5 درصد و اثر متقابل تیمار و رقم گیاهی تأثیر معنی­داری در سطح در فعالیت آنزیم نشان ندادند (جدول 1).

در گیاهچه­های جهش­یافته ntrc رشد یافته در محیط کشت Ms، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در نسبت به گیاهچه­های‌ وحشی پایین­تر بود.  اما کاهش معنی دار فعالیت آنزیم تنها در جهش­یافته لاین 096776 مشاهده شد. تیمار ساکاروز تفاوت معنی­داری را در فعالیت آنزیم، بین گیاهچه­های‌ جهش­یافته و وحشی ایجاد نکرد. تیمار ترهالوز سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهچه­های‌ مورد بررسی در مقایسه با  تیمار شاهد و ساکاروز شد.  اما در لاینهای جهش­یافته میزان فعالبت آنزیم به طور معنی­داری کمتر از گیاهچه­های‌ وحشی بود (شکل 2-ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نشان داد که تنها اثر فاکتور رقم در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری در فعالیت آنزیم دارد (جدول 1).

در تمامی تیمارهای مورد بررسی، فعالیت آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز در گیاهچه­های وحشی به طور معنی­داری بیشتر از لاین‌ جهش‌یافته بود. تیمار ترهالوز باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم در گیاهچه­های وحشی و جهش­یافته نسبت به تیمار شاهد و ساکاروز شد. اما میزان فعالیت این آنزیم در جهش­یافته­ها نصف فعالیت آن در گیاهچه­های وحشی بود. در کل فعالیت آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز در هر سه تیمار مورد مطالعه، در دو لاین‌ جهش‌یافته به طور معنی­داری کمتر از گیاه وحشی بود (شکل 2-د). نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم پلی­فنول اکسیداز نشان داد که اثر فاکتورهای رقم­ و نوع تیمار و نیز اثر متقابل رقم و تیمار تأثیر معنی­داری در سطح کمتر از 1 درصد بر فعالیت آنزیم داشتند (جدول 1).

فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در تیمار شاهد، تفاوت معنی­داری را بین گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته­ ntrc، نشان نداد. همین نتیجه در تیمار ساکاروز نیز مشاهده شد. گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته­ ntrc رشد یافته در محیط کشت MS و یا محیط حاوی 100 میلی مولار ساکارز تفاوت معنی­داری از نظر فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز نداشتند. اما تیمار ترهالوز باعث افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در گیاهچه­های وحشی شد و جهش­یافته­های ntrc به طور معنی­داری فعالیت کمتری را نشان دادند. فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در گیاهچه­های وحشی تیمار شده با ترهالوز در مقایسه با گیاهچه­های وحشی شاهد و گیاهچه­های وحشی تیمار شده با ساکاروز به طور معنی­داری بیشتر بود. (شکل 3-الف). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز نشان داد که اثر فاکتور رقم­ و تیمار بر فعالیت آنزیم تأثیری نداشت، اما اثر متقابل رقم و تیمار تأثیر معنی­داری در سطح کمتر از 1درصد بر فعالیت آنزیم داشتند (جدول 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- مقایسه فعالیت آنزیم الف)کاتالاز، ب) پراکسیداز، ج) آسکوربات محلول و د) پلی فنول اکسیداز در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشدیافته در محیط کشت پایه  MS، محیط کشت  MS حاوی 100 میلی­مولار ساکاروز و یا 100 میلی مولار ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

 

میزان مالون­دی­آلدهید تولید شده در طی پراکسیداسیون لیپید تفاوت معنی­داری را بین گیاهچه­های جهش­یافته و وحشی در تیمار شاهد و ساکاروز، نشان ندادند. اما در تیمار ترهالوز، میزان پراکسیداسیون لیپید در جهش­یافته­های ntrc  دو برابر بیشتر از گیاهچه­های وحشی بود.  همچنین تیمار ترهالوز باعث کاهش معنی­دار میزان پراکسیداسیون لیپید در گیاه وحشی، درمقایسه با گیاهچه­های وحشی تیمارهای شاهد و ساکاروز شد (شکل 3-ب). از طرفی نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به پراکسیداسیون لیپید نشان داد که اثر فاکتور  تیمار و رقم به طور مجزا به ترتیب در سطح کمتر از 1درصد و کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر میزان پراکسیداسیون لیپید داشتند و اثر متقابل بین دو فاکتور اثری بر مقدار پراکسیداسیون لیپید نداشت (جدول 1).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بین لاینهای جهش­یافته و وحشی رشد یافته در محیط کشت MS (تیمار شاهد) تفاوت معنی­داری در مقدار پراکسیدهیدروژن تولید شده وجود نداشت. در تیمار ساکاروز مقدار پراکسیدهیدروژن در دو لاین جهش­یافته نسبت به گیاهچه­های وحشی کاهش معنی­داری نشان داد. اما در تیمار ترهالوز، میزان پراکسیداسیون هیدروژن در جهش­یافته­های ntrc  دو برابر بیشتر از گیاهچه­های وحشی بود. همچنین مقایسه بین تیمارها نشان داد که میزان پراکسیدهیدروژن در تیمار ترهالوز و در گیاهچه­های وحشی نسبت به تیمار ساکاروز و شاهد کمتر بود (شکل 3-ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به پراکسید هیدروژن نشان داد که اثر فاکتور تیمار به طور مجزا و اثر متقابل دو فاکتور تیمار و رقم در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار پراکسید هیدروژن داشتند و فاکتور رقم در سطح کمتر از 5 درصد بر میزان پراکسید هیدروژن اثر داشت (جدول 1).

در تیمار شاهد مقدار فنول تولید شده در لاینهای جهش­یافته دو برابر کمتر از گیاهچه­های وحشی بود. همین طور در تیمار ساکاروز و ترهالوز مقدار فنول تولید شده در جهش­یافته­های ntrc در مقایسه با گیاهچه­های وحشی به طور معنی­داری کمتر بود (شکل 3-د). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار فنول نشان داد که اثر فاکتور رقم به طور مجزا و اثر متقابل دو فاکتور به ترتیب در سطح کمتر از 1 درصد و کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار فنول داشته و فاکتور تیمار اثری بر مقدار فنول نداشت (جدول 1).

اثر تیمار ترهالوز بر میزان آنتوسیانین در جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی: مقدار آنتوسیانین در گیاهچه­های وحشی و جهش­یافته­های ntrc در تیمارهای شاهد و ساکاروز بسیار اندک بوده و تفاوت معنی­داری را با یکدیگر نشان ندادند. درحالی که در تیمار ترهالوز مقدار آنتوسیانین در گیاهچه­های وحشی 25 برابر بیشتر از لاینهای جهش­یافته افزایش یافت. اما تیمار ساکاروز و ترهالوز اثر معنی­داری بر میزان آنتوسیانین در جهش­یافته­های ntrc نداشتند (شکل 4). نتایج تجزیه واریانس داده های مربوط به مقدار آنتوسیانین نشان داد که اثر هر سه فاکتور تیمار، رقم و اثر متقابل دو فاکتور در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر میزان آنتوسیانین داشتند (جدول 1).

 

 

 

شکل 3- الف) فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز، ب) مقدار مالون در آلدهید، ج) پراکسید هیدروژن و د) فنول محلول در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه  MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

 

 

شکل 4- میزان آنتوسیانین در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

 

اثر تیمار ترهالوز بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید و گزانتوفیل: مقدار کلروفیل a، b، و کل در جهش‌یافته­ ‌ntrc لاین 096776 در تیمار شاهد و ساکاروز نسبت به گیاهچه­های وحشی کاهش معنی‌داری را نشان دادند، اما در تیمار ترهالوز تفاوت معنی­داری از نظر محتوای کلروفیل بین گیاهچه­های جهش­یافته و وحشی دیده نشد. محتوای کلروفیل  a، b، و کل در گیاهچه­های وحشی در تیمار ترهالوز در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز کاهش معنی­دار یافت. بررسی مقدار کلروفیل در لاینهای جهش­یافته نشان داد که تفاوت معنی­داری بین تیمارهای مختلف وجود ندارد (شکل 5-الف، ب و ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار کلروفیل نشان داد که فاکتور اثر تیمار به طور مجزا در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار کلروفیل a، b، و کل داشت. و فاکتور رقم به طور مجزا در سطح کمتر از 1درصد بر کلروفیل b و کمتر از 5 درصد بر کلروفیل a و کل نشان داد. اثر متقابل دو فاکتور نیز در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر هر سه کلروفیل a، b، و کل نشان داد (جدول 1).

محتوای کاروتنوئید و گزانتوفیل در لاینهای جهش­یافته ntrc در مقایسه با گیاهچه­های وحشی رشد یافته در محیط کشت MS (تیمار شاهد) کاهش معنی­داری نشان دادند (35 درصد کاهش). نتایج مشابهی درگیاهچه­های تیمار شده با ساکاروز دیده شد. اما در تیمار ترهالوز تفاوت معنی­داری بین گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته مشاهده نشد. مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل گیاهچه­های وحشی در تیمار ترهالوز در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز کاهش معنی­داری نشان داد. درحالی­که جهش­یافته­ها تفاوت قابل توجهی را در تیمارهای مختلف نشان ندادند (شکل 5-د). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل نشان داد که اثر فاکتور تیمار به طور مجزا در سطح کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل داشت. و فاکتور رقم به طور مجزا اثری بر فعالیت آنزیم نداشت. اثر متقابل دو فاکتور در سطح کمتر از 1درصد تأثیر معنی­داری بر فعالیت آنزیم نشان داد (جدول 1).

بحث

تاکنون گزارشهای متعددی از  ویژگیهای شیمیایی و فیزیکی ترهالوز و نیز نقش آن در پاسخهای دفاعی در مخمر، قارچها، باکتریها و گیاهان  منتشر شده است (23، 36، 42 و 45). از طرفی دیگر نقش پروتئین NTRC در کنترل واکنشهای مهم چند‌گانه کلروپلاستی از جمله احیای پروکسی‌ردوکسین و محافظت در مقابل تنش اکسیداتیو به اثبات رسیده است.  این پژوهش با هدف بررسی اثر تیمار ترهالوز بر فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانت دو لاین جهش­یافتۀ ntrc (114293 و 096776) و گیاهچه­های وحشی آرابیدوپسیس انجام شده است.  

 

 

شکل 5- مقدار الف) کلروفیل a، ب) کلروفیل b، ج) کلروفیل کل و د) کاروتنویید و گزانتوفیل در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293)  رشد یافته در محیط کشت پایه MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).


نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که تیمار ترهالوز سبب افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی­اکسیدانت کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات­ پراکسیداز، و سوپر­اکسید دیسموتاز در گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته­ (به استثنای سوپراکسید دیسموتاز) نسبت به تیمار شاهد و ساکاروز شده است.

از طرفی فعالیت این آنزیمها (به استثنای کاتالاز) در گیاهچه­های وحشی تحت تیمار ترهالوز نسبت به جهش­یافته­ها بالاتر بود. همچنین در تیمار ترهالوز مقدار پراکسید هیدروژن تولید شده در گیاهچه­های وحشی نسبت به تیمار شاهد و ساکاروز کاهش یافت. علاوه بر این مقدار پراکسیدهیدروژن گیاهچه­های وحشی کمتر از لاینهای جهش­یافته بود. این نتایج بیانگر نقش مؤثر آنزیمهای آنتی اکسیدانت در پالایش پراکسیدهیدروژن است. به عبارتی تیمار ترهالوز منجر به کاهش مقدار پراکسیدهیدروژن در گیاهچه وحشی شده و به دنبال آن پراکسیداسیون لیپید نیز کاهش یافته است. اندازه­گیری مقدار پراکسیداسیون لیپید نشان داد که تیمار ترهالوز در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز، باعث کاهش مقدار مالون­دی­آلدهید در گیاهچه­های وحشی شده و نیز میزان پراکسیداسیون لیپید گیاهچه­های وحشی در مقایسه با لاینهای جهش­یافته­ها کمتر بود. در شرایط in vitro، ترهالوز به طور قابل توجهی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع را از طریق برهمکنش ضعیف با پیوندهای دوگانه، کاهش می­دهد. ترهالوز با یک پیوند دوگانه با اسید چرب غیر اشباع برهمکنش نشان داده و یک کمپلکس پایدار تشکیل می­دهد که منجر به کاهش معنی­دار در سطوح اکسیداسیون اسیدهای چرب می­گردد (39). در مخمر در شرایط تنش کم آبی، ترهالوز سطح پراکسیداسیون لیپید را کاهش می­دهد (41). از طرفی تیمار سلولهای مخمر با ترت بوتیل هیدروپراکسید (پراکسید آلی که غشای پلاسمایی را مورد هدف قرار می­دهد) نشان داد که وجود ترهالوز در دو طرف دو لایه لیپیدی برای حفاظت از غشاء مورد نیاز است (22). همچنین در بسیاری از موجودات، ترهالوز به عنوان یک پایدار کننده بهتر نسبت به سایر قندها برای محافظت از غشاها و مولکولهای زیستی و یک محلول سازگار  گزارش شده است (5، 11 و 16). یکی از اصلی­ترین پیامدهای تنش از جمله تنش اکسیداتیو، افزایش مقدر گونه­های فعال اکسیژن و به دنبال آن تخریب پروتئینها، غشاها و افزایش پراکسیداسیون لیپید است (3 و 32). نتایج این پژوهش نیز نشان داده که بین فعالیت آنزیمهای پالاینده پراکسیدهیدروژن و مقدار پراکسیدهیدروژن و نیز میزان پراکسیداسیون لیپید هماهنگی وجود دارد. به نظر می­رسد نقص در پروتئین NTRC، احتمالاً سیستم کنترل ردوکس برخی آنزیمهای آنتی­اکسیدانت را تحت تأثیر قرار داده است. گزارشهای دیگر نیز نشان داده که برخی از آنزیمهای آنتی اکسیدانت از جمله، کاتالاز، و آسکوربات پراکسیداز از اهداف بالقوه تیوردوکسین­ها می­باشند (2). نتایج حاضر نشان داد که جهش یافته­های ntrc در مقایسه با گیاهچه­های وحشی مقدار پراکسید هیدروژن کمتری را در تیمار ترهالوز پالایش کرده­اند. به همین دلیل مقدار پراکسید هیدروژن در جهش­یافته ها با تیمار ترهالوز نسبت به تیمار شاهد و نیز در مقایسه با گیاهچه­های وحشی بیشتر بوده است. گزارشهای دیگر نیز نقش NTRC را در سمیت­زدایی پراکسیدهیدروژن نشان داده­اند (42). اما مقدار پراکسید هیدروژن جهش­یافته­ها در تیمار شاهد تفاوت معنی­داری را با گیاهچه­های وحشی نشان نداد.  در تیمار ساکاروز نیز مقدار پراکسید هیدروژن جهش­یافته­ها کمتر از نمونه ­وحشی بود. به نظر می­رسد در جهش­یافته­های ntrc با خاموش­شدن سیستم 2-Cys Prxs وابسته به NTRC، سیستمهای سوپراکسید دیسموتاز وابسته به آسکوربات و آسکوربات پراکسیداز در سمیت­زدایی H2O2 در این گیاهان نقش جبرانی داشته باشند (26).

مقدار فنول در گیاهچه­های وحشی تحت تیمار ترهالوز در مقایسه با گیاهچه­های وحشی شاهد افزایش یافت. افزایش محتوای فنول می­تواند دلیل دیگری بر افزایش مقاومت گیاه وحشی در تیمار ترهالوز باشد. فنولها از ترکیبات دارای ویژگی آنتی­اکسیدانتی می­باشند و به عنوان عوامل دهنده الکترون یا هیدروژن، سلولها را در مقابل گونه‌های فعال اکسیژن محافظت می‌کنند و باعث پایداری غشای سلولی می­شوند (8 و 51). گیاهچه­های جهش­یافته از نظر مقدار فنول، تفاوت معنی­داری را در تیمار ترهالوز نسبت به جهش­یافته­های شاهد نشان ندادند. همچنین در تمامی تیمارهای مورد بررسی مقدار فنول در جهش­یافته­ها کمتر از گیاهچه­های وحشی بود. نقش پروتتین NTRC در تنظیم ردوکس اولین آنزیم مسیر شیکیمات (DAHP) در تولید متابولیت­های ثانویه از جمله ترکیبات فنولی به اثبات رسیده است (25)، بنابراین دلیل کاهش مقدار ترکیبات فنولی در جهش­یافته­های ntrc می­تواند همین امر باشد. ترکیبات فنولی به عنوان آنتی‌اکسیدانتهای طبیعی در گیاه بوده و با دارا بودن ویژگیهای ردوکس (21) مقادیر بهینه آن می‌تواند حاکی از وضعیت مطلوب تر ردوکس سلولی باشد.

نتایج مربوط به اندازه­گیری میزان آنتوسیانین نشان داد که مقدار آن در گیاهچه­های وحشی و در تیمار ترهالوز به شدت افزایش یافته در حالی­که در سایر تیمارها و در گیاهچه­های جهش­یافته میزان آن پایین بود. جهش­یافته­های ntrc احتمالاً به دلیل نقص در NTRC قادر به سنتز آنتوسیانین نمی­باشند. فقدان NTRC، هموستازی مسیرهای متابولیکی که از مسیر شیکیمات مشتق می­شوند را تغییر داده و منجر به تجمع اسیدهای آمینه آروماتیک می­شود و متابولیتهای ثانویه مانند آنتوسیانینها را کاهش می­دهد. NTRC اولین آنزیم در مسیر شیکیمات، 3-داُکسی-د-آرابینو-هپتولوسونات-7-فسفات سنتاز (DAHP سنتاز) که تولید 3-دهیدروکویینات را از فسفوانول­­پیروات و اریتروز-4-فسفات کاتالیز می­کند را فعال می سازد. گزارشها نشان داده که گیاهچه­های جهش­یافته ntrc، قادر به انباشتن  آنتوسیانین در پاسخ به درجه حرارت پایین و پیری نبوده و مقدار آنتوسیانین در این گیاهان کاهش یافت. بالا بودن مقدار آنتوسیانین در گیاهچه­های وحشی و در تیمار ترهالوز نمی­تواند تنها به دلیل داشتن NTRC فعال باشد و احتمالاً ترهالوز از طریق افزایش قندهای محلول به طور غیرمستقیم در توانسته بیان ژن بیوسنتز آنتوسیانین را تحریک کند. در بسیاری از گونه­های گیاهی نظیر انگور تجمع آنتوسیانین به وسیلۀ قندها القاء می­شود (26).

ارزیابی میزان کلروفیل و کارتنوئید در گیاهچه­های وحشی و جهش‌یافته ntrc نشان داد که در تیمار شاهد و ساکاروز، میزان کلروفیلa ، b و کلروفیل‌کل و کارتنوئید و گزانتوفیل در گیاهچه­های جهش‌یافته نسبت به گیاه وحشی کاهش یافت. پیش از این نقش تیوردوکسین‌ها در نمو کلروپلاست، کارآیی دستگاه فتوسنتزی، محتوی رنگیزه‌ها از جمله کلروفیل، کارتنوئیدها و گزانتوفیل به اثبات رسیده است (10، 16 و 50). همچنین NTRC در کنترل چند‌ین واکنش‌ مهم کلروپلاستی شرکت می‌کند. به عنوان مثال، NTRC به صورت مستقیم بر روی پایداری و فعالیت وابسته به ردوکس آنزیمهای مسیر سنتز کلروفیل مانند منیزیم پوروتوپورفیرین متیل ترانسفراز (CHLM) و گلوتامیل ترانسفر RNA ردوکتاز (GluTR) اثر داشته است. در جهش­یافته­های ntrc فعالیت این آنزیمها کاهش یافته که در نتیجه منجر به کاهش بیوسنتز کلروفیل و در نهایت کم شدن محتوای کلروفیلی گیاه می شود (46). بنابراین فنوتیپ رنگ پریدگی مشاهده شده در گیاهچه­های جهش­یافته مورد آزمایش به دلیل کاهش سنتز کلروفیل می­باشد.

نتیجه­گیری

اگرچه گزارشها نشان داده­اند که ترهالوز در بسیاری از موجودات در پاسخ به تنش نقش دارد، اما نقش دقیق آن در گیاهان هنوز مشخص نیست. نتایج حاضر نشان داد که تیمار ترهالوز سبب افزایش فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانتی آنزیمی (نظیر کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، و سوپراکسیددیسموتاز) و غیرآنزیمی (نظیر فنول، آنتوسیانین، کاروتنوئید و گزانتوفیل) می­شود که در نتیجه منجر به کاهش میزان پراکسیدهیدروژن و پراکسیداسیون لیپید در گیاهچه­های وحشی می­گردد. به نظر می­رسد تیمار ترهالوز با تغییر الگوی بیان ژنها نقش مهمی در مقابله گیاهان با تنش داشته باشد. مطالعات بیشتری جهت روشن شدن نقش دقیق ترهالوز در ایجاد مقاومت و تحمل تنش در گیاهان نیاز می­باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه گلستان به سبب حمایت مالی پژوهش حاضر تشکر و قدردانی دارند.

1- Aghdasi, M. 2007. Analysis of trehalose-6- phosphate control over carbon allocation and growth in plants. PhD Thesis, Utrecht University.
2- Alkhalfioui F, Renard M, Vensel WH, Wong J, Tanaka CK, Hurkman WJ, Buchanan BB and Montrichard, B, 2007. Thioredoxin-linked proteins are reduced during germination of Medicago truncatula seeds. Plant Physiol. 144: 1559–1579.
3- Apel K and Hirt H, 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Bio. 55:373–399.
4- Arnon DI, 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenol oxidase in  Beta vulgaris. Plant Physiol. 24: 1-15.
5- Avonce N, Mendoza-Vargas A, Morett E and Iturriaga G, 2006. Insights on the evolution of trehalose biosynthesis. BMC Evol Biol. 6: 109–113.

6- Beauchamp C and Fridovich I, 1971. Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem. 44: 276-287.

7- Benaroudj N, Lee DH and Goldberg AL, 2001. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals, J Biol Chem. 276: 24261–24267.
8- Burguieres EP, McCXue Y, Kwon and Shelty K, 2006. Effect of vitamin c and folic acid on seed vigour response and phenolic linked antioxidant activity. Bioresource Technol. 95: 1393-1404.
9- Chance B and Maehly AC, 1955. Assay of catalase and peroxidases. Molecular in Enzymology. 11: 755-764.
10- Collin V, Lamkemeyer P, Miginiac-Maslow M, Hirasawa M, Knaff DB, Dietz KJ and Issakidis-Bourguet E, 2004. Characterization of plastidial thioredoxins from Arabidopsis belonging to the new y-type. Plant Physiol. 136:4088 –4095.
11- Crowe JH, 2007. Trehalose as a ‘‘chemical chaperone’’: fact and fantasy. Adv Exp Med Biol. 594: 143–158.
12- Crowe JH, Hoekstra FA and Crowe LM, 1992. Anhydrobiosis. Annu Rev Plant Physiol. 54: 579–599.
13- De Dios Barajas-Lopez J, Serrato AJ, Olmedilla A, Chueca A and Sahrawy M, 2007. Localization in roots and flowers of Pea chloroplastic thioredoxin f and thioredoxin m proteins reveals new roles in non photosynthetic organs. Plant Physiol. 145: 946–960.
14- Drennan PM, Smith MT, Goldsworthy D and Van Staden J, 1993. The occurrence of trehalose in the leaves of the desiccation-tolerant angiosperm Myrothamnus  flabellifolius Welw. J Plant Physiol. 142:493 –496.
15- El-Bashiti T, Hamamc H, Hüseyin, Öktem A and Yucel M, 2005. Biochemical analysis of trehalose and its metabolizing enzymes in wheat under abiotic stress conditions. Plant Science. 169: 47-54.
16- Elbein AD, Pan YT, Pastuszak I and Carroll D, 2003. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13:17–27.
17- Foyer CH and Noctor G, 2000. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New Phytol. 146: 359–388.
18- Fukuda, T. Ito, H. and Yoshida, T. 2003 Antioxidative polyphenols from Walnuts (Juglans regia L.). Phytochemistry. 63:795-801.
19- Garcia AB, Engler JDA, Iyer S, Gerats T, Montagu V and Caplan AB, 1997. Effects of osmoprotectants upon NaCl stress in rice. Plant Physiol. 115: 159–169.
20- Garg AK, Kim JK, Owens TG, Ranwala AP, Choi YD, Kochian LV and Wu RJ, 2002. Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses. Proc Natl Acad Sci. 99:15898 –15903.
21- Halliwell B, Rafter J and Jenner A, 2005. Health ptomotion by flavonoids, tocopherols, tocotrienols and other phenols: direct or indirect effects? Antioxidant or not? Am J Clin Nutr. 81:268S-276S.

22- Hare PD, Cress WA and Van Staden J, 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress.  Plant Cell Environ. 21: 535 –553.

23- Iordachescu M and Imai R, 2008. Trehalose biosynthesis in response to abiotic stresses. J. Integr Plant Biol. 50: 1223–1229.
24- Kaplan F, Kopka J, Haskell DW, Zhao W, Schiller KC, Gatzke N, Sung DK and Guy CL, 2004. Exploring the temperature-stress metabolome of Arabidopsis. Plant Physiol. 136: 4159–4168.
25- Kar M and Mishra D, 1976. Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiol. 57: 315 -319.
26- Lepisto A, Kangasjarvi S, Luomala EM, Brader G, Sipari N, Keranen M, Keinanen M and Rintamaki E, 2009. Chloroplast NADPH-thioredoxin reductase interacts with photoperiodic development in Arabidopsis. Plant Physiol. 149: 1261–1276.
27- Liu MS, Chien CT and Lin TD, 2008. Constitutive components and induced gene expression are involved in the desiccation tolerance of Selaginella tamariscina. Plant and Cell Physiol. 49: 653–663.
28- Luo Y, Li WM and Wang W, 2008. Trehalose: Protector of antioxidant enzymes or reactive oxygen species scavenger under heat stress. Environ Exp Bot. 63:78–384.
29- Michalska J, Zauber H, Buchanan BB, Cejudo FJ and Geigenberger P, 2009. NTRC links built-in thioredoxin to light and sucrose in regulating starch synthesis in chloroplasts and amyloplasts. PNAS. 106: 9908-9913.
30- Miller G, Shulaev V and Mittler R, 2008. Reactive oxygen signaling and abiotic stress. Physiologia Plantarum. 133: 481–489.

31- Mita S, Murano N, Akaike M and Nakamura K, 1997. Mutants of Arabidopsis thaliana with pleiotropic effects on the expression of the gene for beta-amylase and on the accumulation of anthocyanin that is inducible by sugars. Plant J. 11: 841-851.

32- Mittler R, 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Sci. 7: 405–410.
33- Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M and Van Breusegem F, 2004. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Sci. 9: 490–498.
34- Moon JC, Jang HH, Chae HB, Lee JR, Lee SY, Jung YJ, Shin MR, Lim HS, Chung WS, Yun DJ, Lee KO and Lee SY, 2006. The C-type Arabidopsis thioredoxin reductase ANTR-C acts as an electron donor to 2-Cys peroxiredoxins in chloroplasts. Biochem Biophys Res Commun. 348:478–484.
35- Muller J, Boller T, Wiemken A, 1995. Trehalose and trehalase in plants: recent developments. Plant Sci. 112: 1–9.
36- Nakano Y and Asada K, 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22: 867-880
37- Nery DCM, da Silva CG, Mariani D, Fernandes PN, Pereira MD, Panek AD and Eleutherio ECA, 2008. The role of trehalose and its transporter in protection against reactive oxygen species. Biochem Biophys Acta. 1780: 1408–1411.
38- Noctor G and Foyer CH, 1998. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annu Rev Plant Physiol and Plant Mol Bio. 49: 249–279.
39- Oku K, Watanabe H, Kubota M, Fukuda S, Kurimoto M, Tsujisaka Y, Komori M, Inoue Y and Sakurai M, 2003. NMR and quantum chemical study on the OH...π and CH...O interactions between trehalose and unsaturated fatty acids: implication for the mechanism of antioxidant function of trehalose. J Am Chem Soc. 125:12739 –12748.
40- Pellny Tk, Ghannoum O, Conroy JP, Schlupmann, H, Smeekens S, Andralojc J, Krause KP, Goddijn O and Paul MJ, 2004. Genetic modification of photosynthesis with E.coli genes for trehalose synthesis. Plant Biotech J. 2: 71 -82.
41- Pereira EJ, Panek AD and Eleutherio ECA, 2003. Protection against oxidation during dehydration of yeast. Cell Stress Chaperones. 8: 120–124.
42- Perez-Ruiz , J.M., Maria Cristina Spinola, M.C., Kirchsteiger, K., Moreno, J., Sahrawy, M. and Cejudoa, F.J. 2006. Rice NTRC Is a High-Efficiency Redox System for Chloroplast Protection against Oxidative Damage. The Plant Cell. 18: 2356–2368.
43- Pérez-Ruiz JM and Cejudo FJ, 2009. A proposed reaction mechanism for rice NADPH thioredoxin reductase C, an enzyme with protein disulfide reductase activity. FEBS Lett. 583: 1399–1402.
44- Prochazkova D, Haisel D and Wilhelmova N, 2009. Content of carotenoids during ageing and senescence of tobacco leaves with genetically modulated life-span. Photosynthetica. 47:409-414.
45- Resende MLV, Nojosa GBA, Cavalcanti LS, Aguilar MAG, Silva LHCP, Perez JO, Andrade GCG, Carvalho GA and Castro RM, 2002. Induction of resistance in cocoa against Crinipellis perniciosa and verticillium dahliae by acibenzolar-s-methyl (ASM). Plant P athol. 51:621-628.
46- Richter AS, Peter E, Rpthbart M, Schlicke H, Toivola J, Rintamaki E and Grimm B, 2013. Posttranslational Influence of NADPH-dependent thioredoxin reductase C on enzymes in tetrapyrrole synthesis. Plant Physiol.162: 63–73.
47- Schluepmann H, Van Dijken A, Aghdasi M, Wobbes B, Paul M and Smeekens S, 2004. Trehalose mediated growth inhibition of Arabidopsis seedlings is due to trehalose-6-phosphate accumulation. Plant Physiol. 135:879 –890.
48- Schurmann P and Jacquot JP, 2000. Plant thioredoxin systems revisited. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 51: 371–400.
49- Sergive I, Alexieva V and Karanov E, 1997. Effect of spermine, atrazine and combination between them on some endogeneus protective systems and stress markers in plants. Compt Rend Acad Bulg Sci. 51: 121-124.
50- Serrato A, Perez-Ruiz JM, Spinola MC and Cejudo FJ, 2004. A novel NADPH thioredoxin reductase, localized in the chloroplast, which deficiency causes hypersensitivity to abiotic stress in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 279: 43821–43827.
51- Stankovic MS, Niciforovic N, Mihailovic V, Topuzovic M and Solujic S, 2012. Antioxidant activity, total phenolic content and flavonoid concentrations of different plant parts of Teucium Polium L. subsp. Polium. Acta Societatis Botanni Poloniae. 81:117 -122.
52- Van Dijken AJH, Schluepmann H and Smeekens SCM, 2004. Arabidopsis trehalose-6-phosphate synthase 1 is essential for normal vegetative growth and transition to flowering. Plant Physiol. 135:969–977.
53-Yancey PH, Clark ME, Hand SC, Bowlus RD and Somero GN, 1982.  Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science.217: 1214–1222.