تأثیر ترهالوز بر سیستم آنتی­اکسیدانت جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana)

انیسه نوروزی پور، مهناز اقدسی^* و حمیدرضا­صادقی پور

ایران، گرگان،دانشگاهگلستان،دانشکدهعلوم،گروهزیستشناسی

تاریخ دریافت: 23/10/96              تاریخ پذیرش: 8/12/96

چکیده

ترهالوز دی ساکاریدی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند 1و1- آلفا و آلفا تشکیل شده است. این قند نقشهای بسیار مهمی در رشد و نمو و مقاومت به تنش در گیاهان بازی می­کند. NADP⁺- تیوردوکسین ردکتاز C ((NTRC پروتئینی است که در کنترل چندین واکنش مهم کلروپلاستی نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی اثر ترهالوز بر فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانت گیاه است. به این منظور بذر آرابیدوپسیس تالیانا و گیاه جهش یافته ntrc (به عنوان گیاه حساس به تنش اکسیداتیو) به مدت 14 روز بر محیط کشت MS حاوی غلظتهای 0 و 100 میلی­مولار ساکارز و یا ترهالوز کشت داده شدند. نتایج نشان داد که تیمار ترهالوز سبب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیمهای پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، و پلی فنول اکسیداز در گیاهچه وحشی و جهش یافته در مقایسه با تیمار شاهد و ساکارز شده است. همچنین میزان فعالیت این آنزیمها در تیمار ترهالوز در گیاهچه وحشی بالاتر از گیاهچه جهش­یافته بود. تیمار ترهالوز سبب کاهش میزان پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدهید و افزایش فنول و آنتوسیانین در گیاهچه وحشی در مقایسه با تیمار شاهد شده است.  همچنین نتایج نشان داد که در تیمار ترهالوز مقدار پراکسیدهیدروژن گیاهچه­های وحشی کمتر از لاینهای جهش­یافته بود. این نتایج نشان می­دهد که ترهالوز با فعال کردن سیستم آنتی­اکسیدانت سبب پالایش رادیکالهای آزاد می­شود. نتایج حاضر می­تواند در درک چگونگی نقش ترهالوز در مقاومت به تنش در گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: ترهالوز، تیوردوکسین، جهش­یافته، ntrc، آنتی اکسیدانت

* نویسنده مسئول، تلفن: 01732548159، پست الکترونیکی: aghdasi1346@gmail.com، m.aghdasi@gu.ac.ir

مقدمه

در شرایط عادی، گونه­های فعال اکسیژن به­صورت محصولات جانبی در متابولیسم سلولی گیاهان (مانند فتوسنتر، تنفس و غیره) تولید می­شوند و عنوان مولکولهای پیام­رسان در انتقال پیام ردوکس عمل می­کنند (2، 17 و 18). اما از طرف دیگر برای متابولیسم سلولی گیاه مضر می­باشند. گونه­های فعال اکسیژن در تنشهای زیستی و غیرزیستی، به عنوان یک پاسخ عمومی گیاهان به شرایط محیطی نامطلوب، تولید می­شوند (30). زمانی­که گونه­های فعال اکسیژن به میزان زیادی در سلولهای گیاه تولید شوند، شرایطی را به وجود می­آورند که به آن تنش اکسیداتیو گفته می­شود. تنش اکسیداتیو می­تواند باعث تخریب و آسیب اجزای سلولی مانند DNA، پروتئین­ها، و غشاهای لیپیدی شود (3 و 32). در گیاهان آنزیمهای آنتی­اکسیدانت می­توانند گیاه را از تنش اکسیداتیو محافظت کنند (33). سیستمهای آنتی­اکسیداتیو شامل مولکولهای آنتی­اکسیدانت مثل اسید آسکوربیک، گلوتاتیون، آلفا توکوفرول و کاروتنوئیدها، و آنزیمهای آنتی­اکسیدانت مثل آسکوربات پراکسیدازها (APXs)، کاتالازها (CATs)، گلوتاتیون ردوکتاز (GLRs)، پراکسیدازها (PODs) و سوپراکسیددیسموتازها (SODs) می­باشند (3 و 38).

تیوردوکسین‌ها پروتئینهای کوچک با وزن مولکولی 14-12 کیلودالتون بوده که در تنظیم ردوکس بسیاری از فرآیندهای سلولی دخالت دارند (2، 13 و 48). در گیاهان نوعی تیوردوکسین به نام NTRC (NADPH-dependent thioredoxin reductase C)وجود دارد که حاوی قلمرو C – ترمینال تیوردوکسینی بوده و در کلروپلاست جای دارد (50). پروتئین NTRC قادر است با استفاده از NADPH، آنتی اکسیدانتهای کلروپلاستی از جمله آنزیم2-سیستئین پراکسی­ردوکسین (2-Cys-Prxs) را احیاء و فعال کند و سمیت پراکسیدهیدروژن (H₂O₂) را خنثی نماید (34، 42 و 43). همچنین NTRCدر تنظیم آنزیمهای سنتز کلروفیل (44 و 48) و نشاسته (33) نیز نقش دارد.

پاسخ موجودات زنده به انواع تنشها، انباشتگی قندها و دیگر محلولهای سازگار مشترک است (29). این ترکیبات به عنوان محافظت­کننده­های اسمزی عمل کرده و در برخی موارد مولکولهای زیستی را پایدار می­کنند (22 و 53). یکی از این ترکیبات ترهالوز است. ترهالوز دی­ساکاریدی غیراحیایی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند آلفا 1 و 1 ساخته شده است (16). این قند در مراحل مختلف رشد و نمو گیاهان نقشهای مهمی را بازی می­کند. به عنوان مثال می­توان به نقش آن در رشد و نمو، گلدهی، مصرف کربن و متابولیسم کربوهیدرات، فتوسنتز و مقاومت به تنش اشاره کرد (12، 40، 47 و 52). نقش ترهالوز در تحمل تنش غیرزیستی برای اولین بار در گیاهان رستاخیزی، مانند گونه­های مختلف علف­خوک به اثبات رسیده است. این گیاهان در فصول گرم یا تنش­ خشکی می­توانند تقریباً به طور کامل بی­آب شوند و به محض دریافت مجدد آب دوباره احیا شده و زندگی را از سر گیرند (14 و 27). تجمع ترهالوز در تنشهای غیرزیستی تنها محدود به گیاهان رستاخیزی نبوده  و بسیاری از گیاهان در هنگام تنش، ترهالوز را در اندام خاصی انباشته می­کنند (15 و 20). به عنوان مثال چنانچه گیاه آرابیدوپسیس تالیانا به مدت 4 ساعت تحت تنش گرما (40 درجه سانتی­گراد) قرار گیرد، مقدار ترهالوز در آن تا  دو برابر افزایش می یابد و چنانچه به مدت 4 روز در دمای  4 درجه سانتی­گراد قرار گیرد میزان این قند تا 8 برابر افزایش می­یابد (28). تیمار گیاه برنج با قند ترهالوز به طور معنی­داری آسیب ناشی از تنش شوری را کاهش می­دهد (19).

بررسیها نشان داده است که بسیاری از ژنهای درگیر در متابولیسم ترهالوز در آرابیدوپسیس تالیانا به طیف وسیعی از تنشهای غیرزیستی مانند سرما، شوری و UV پاسخ می­دهند (23). همچنین تیمار گیاهچه­های آرابیدوپسیس با غلظت 100 میلی­مولار ترهالوز، سبب تحریک بیان ژنهای پراکسیداز، پراکسیداز 42 (PER42)، پرولین اکسیداز (POX)، L- آسکوربات پراکسیداز تیلاکوییدی (tAPX)، و ژنهای مرتبط با متابولیسم ثانویه می­شود (1).

نقش ترهالوز در محافظت در برابر رادیکالهای آزاد اکسیژن به اثبات رسیده است (37). این ویژگی در میکروارگانیسمها و گیاهانی که ترهالوز را به مقدار زیاد انباشته می­کنند، اهمیت ویژه­ای دارد (35). شواهد نشان داده است که قند ترهالوز به عنوان یک آنتی­اکسیدانت عمل می­کند. به عنوان مثال زمانی­که مخمر در معرض پراکسید هیدروژن قرار گیرد مقدار قابل توجهی ترهالوز در درون سلولهای خود انباشته می­کند که با محافظت از پروتئینها، از آسیب اکسیداتیو جلوگیری خواهد کرد. از طرفی دیگر چنانچه سلولهای مخمر با محلول 10 درصد ترهالوز تیمار شوند، نسبت به H₂O₂ مقاوم­تر خواهند شد (7). گیاه گندم نیز زمانی­ که در معرض تنش گرما قرار گیرد، با افزایش مقدار ترهالوز درونی، رادیکالهای تولید شده را خنثی می­کند (27). در شرایط in vitro، ترهالوز به طور قابل توجهی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع را از طریق برهمکنش ضعیف با پیوندهای دوگانه، کاهش می­دهد (39).

در حال حاضر شواهد متناقضی در ارتباط با نقش ترهالوز در زندگی و رشد گیاهان وجود دارد. برخی گزارش­ها حاکی از آن است که تیمار گیاهان با ترهالوز سبب تنش اکسیداتیو شده و برخی دیگر از گزارشها به نقش محافظتی ترهالوز در برابر تنشها و ایجاد مقاومت در گیاهان اشاره دارد. مطالعه حاضر با هدف بررسی سیستم آنتی­اکسیدانت گیاهان در تیمار ترهالوز در رقم وحشی آرابیدوپسیس(Col-0) و جهش­یافته­های ntrc (به عنوان گیاهان حساس به تنش­ اکسیداتیو) انجام شده است.

مواد و روشها

شرایط کشت: در این آزمایش از بذرهای Arabidopsis thaliana رقم کلمبیا صفر (Col-0) و بذرهای دو لاین جهش‌یافته ntrc (096776 و 114293)(SALK_096776, SALK_114293)، اهدایی از گروه پروفسور Rintamäki و Lepistö از کشور فنلاند، انجام شده است. جایگاه ورود T-DNA در این دو جهش­یافته به ترتیب در اینترون 8 و اگزون 9 است. بذرها ابتدا با اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه ضدعفونی سطحی شده و سپس به مدت 5 دقیقه در آب ژاول 20 درصد قرار گرفتند. بعد از اتمام مراحل ضدعفونی، بذرها با آب مقطر استریل 5 بار شستشو داده شده و در 3 نوع محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوگ (MS)  (شاهد)، محیط کشت MS حاوی غلظت 100 میلی­مولار ساکاروز و محیط کشت MS حاوی غلظت 100 میلی­مولار ترهالوز کشت داده شدند. در هر پتری 50 بذر و هر تیمار با 5 تکرار انجام شد. به منظور استراتیفیکاسیون پتری­های حاوی بذور به مدت سه روز در دمای 4 درجه سانتی­گراد در یخچال نگهداری شدند و بعد از آن به اتاقک رشد با دمای 2± 24 درجه سانتی گراد در شرایط روز بلند ( 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) و شدت نور 150 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه انتقال یافتند. پس از گذشت 14 روز گیاهچه‌ها جهت بررسی پارامترهای بیوشیمیایی  برداشت شدند.

استخراج و سنجش آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز، پراکسیداز محلول و پلی فنول اکسیداز: مقدار 05/0 گرم بافت گیاهی در هاون چینی سرد با 2 میلی‌لیتر بافر فسفات مونوسدیک 1/0 مولار با اسیدیته 8/6 هموژن شد. هموژن حاصل به مدت 15 دقیقه در 16000 دور در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. از روشناور (سوپرناتانت) به‌ دست آمده برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیمها استفاده شد (24).

فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز با استفاده از روش Maehly وChance  (1955) و  فعالیت آنزیم پلی فنول ‌اکسیداز بر اساس روش Mishra و Kar (1976) همراه با تغییراتی اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش آنزیم کاتالاز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر، شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، آب اکسیژنه 15 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه شد. با افزودن سوبسترا (H₂O₂) به محیط واکنش، تجزیه پراکسید هیدروژن توسط آنزیم شروع و سپس تغییرات جذب نور محلول واکنش نسبت به شاهد در طول موج 240 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت شد. در نهایت فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه شده  (ضریب خاموشی mM^-1 cm^-1 40) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان گردید (9).

مخلوط واکنش آنزیم گایاکول پراکسیداز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، گایاکول 20 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 40 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه شد. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن آغاز شد. تغییرات جذب نور محلول واکنش نسبت به شاهد در طول موج 470 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت گردید. در نهایت فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس میکرومول تتراگایاکول تشکیل شده (ضریب خاموشی mM^-1 cm^-1 6/26) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان گردید (9).

مخلوط واکنش آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز با حجم نهایی 3 میلی‌لیتر شامل بافر‌فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، پیروگالل 10 میلی‌مولار و100 میکرولیتر عصاره آنزیمی تهیه و با افزودن پیروگالل به محلول واکنش، فعالیت آنزیمی آغاز شد. تغییرات جذب نور محلول نسبت به شاهد در طول موج 420 نانومتر برای مدت 120 ثانیه ثبت شد. در نهایت فعالیت آنزیم پلی­ فنول اکسیداز بر اساس میکرومول پورپوروگالین تشکیل شده (ضریب خاموشی mM^-1 cm^-1 47/2) در دقیقه به ازای گرم وزن تر بافت بیان شد (25).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به روش Asada وNakano  (1981) با اندکی تغییرات انجام شد (36). مخلوط واکنش به حجم نهایی 2 میلی‌لیتر شامل‌ بافر فسفات مونو‌سدیک 250 میلی مولار (‌7 =‌pH‌)، اسید آسکوربیک 5/0 میلی‌مولار، EDTA‌ 1/0 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 2/1 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. کاهش جذب نور ناشی از پراکسیداسیون اسید آسکوربیک در طول موج290 نانومتر به مدت 120 ثانیه ثبت گردید. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی (ε)معادل  mmol.L^-1.cm^-1 8/2 مربوط به آسکوربات محاسبه گردید.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از ریبوفلاوین و متیونین در حضور نور جهت تولید رادیکالهای سوپراکسید اندازه­گیری شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات مونوسدیک 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/7، EDTA 66/0 میلی‌مولار، متیونین 10 میلی‌مولار، NBT 33 میکرو‌مولار، ریبوفلاوین 0033/0 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود که شاهد در تاریکی و نمونه در معرض تابش نور سفید قرار گرفت. بعد از تابش نور به مدت 15 دقیقه، جذب نور در طول موج 560 نانومتر بر اساس ممانعت از تولید مونوفورمازان (احیای NBT) اندازه‌گیری و اختلاف جذب زمان صفر و 15 دقیقه تعیین شد. میزان مهارکنندگی احیای نوری NBT توسط عصارۀ آنزیمی هر نمونه در مقایسه با اختلاف جذب نور زمان صفر و 15 دقیقه واکنش شاهد (بدون آنزیم) مطابق فرمول زیر تععین گردید. یک واحد فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز معادل با 50 درصد مهار احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم به فورامازون تعریف شد. در نهایت فعالیت آنزیم براساس واحد سوپراکسید دیسموتاز بر دقیقه بر گرم وزن تر گیاه گزارش شد (6).

اندازه­گیری مقدار پراکسید هیدروژن: مقدار پراکسید هیدروژن با استفاده از رنگ‌سنجی و بر طبق روش Sergive و همکاران (1997) اندازه­گیری شد (49).

اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپید: اندازه­­گیری پراکسیداسیون لیپید با استفاده از اندازه­گیری مقدار مالون دی آلدهید (MDA) به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپید صورت گرفت (44). در نهایت عصاره به دست آمده در مد فتومتریک و در سه طول موج 440، 532 و 600 نانومتر خوانده شد و براساس نانومول مالون دی آلدهید تولید شده در یک گرم بافت تر گیاه بیان شد.

اندازه گیری مقدار کلروفیل: اندازه­گیری کلروفیل به روشArnon  (1949) انجام گرفت (4). به این منظور مقدار 05/0 گرم از بافت تر بخش هوایی با 5 میلی­لیتر استون 80 درصد ساییده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد. در نهایت قسمت بالایی عصاره جدا شده و حجم نهایی آن به 8 میلی­لیتر رسید. سپس میزان جذب آن در دو طول موج 645 و 663 و 670 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه­گیری شد. در نهایت مقدار کلروفیل بر اساس مقدار میلی­گرم کلروفیل به ازای یک گرم وزن تر گیاه نشان داده شد.

اندازه­گیری مقدارآنتوسیانین:  به روش Mita و همکاران (1997) انجام شد (31). مقدار 02/0 گرم بافت تازه گیاه در ازت مایع خرد شده و سپس 4 میلی­لیتر محلول 1 درصد اسید کلریدریک در متانول به آن اضافه شده و به مدت 24 ساعت در یخچال قرار داده شد. محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد. جذب نور در فاز رویی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موجهای 530 و 657 نانومتر خوانده شد و با استفاده از فرمول زیر، میزان نسبی آنتوسیانین تعیین شد.

A= A₅₅₀- (0.25 A₆₅₇)

A= میزان نسبی آنتوسیانین

A₅₃₀و A₆₅₇ به ترتیب جذب نور نمونه در طول موجهای 530 و 657 نانومتر است.

اندازه‌گیری فنول محلول: میزان فنول کل در عصاره­های استخراج شده  با استفاده از معرف فولین­سیو­کالتیو(Folin-CiocalteuReagent) تعیین شد (18). ابتدا 250 میکرولیتر از عصاره­ استخراج­شده با غلظت  10 میلی­گرم در لیتراز فیلتر میلی­پور mm) 45_/0( عبور داده شده و با 25_/1 میلی لیتر از معرف فولین­سیو­کالتیو 2_/0 مولار مخلوط گردید. پس از 5 دقیقه قرارگیری در دمای محیط، یک میلی لیتر محلول Na₂CO₃ ( 5_/7 گرم در لیتر) به آنها اضافه شده  و به مدت 2 ساعت در دمای محیط مجدداً انکوبه شد. سپس جذب محلول در  طول موجnm  760 خوانده شد. برای رسم منحنی استاندارد غلظتهای مختلفی از اسید گالیک (2 ،5_/1، 1 ، 5_/0 ، 0 میلی­گرم در لیتر) تهیه  و طول موج آن در در دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد.  میزان فنول کل عصاره­های استخراج شده بر مبنای میلی­گرم گالیک­اسید بر گرم عصاره استخراج شده محاسبه شد.

تجزیه و تحلیلهای آماری: آزمایشها با 4 تکرار و در قالب طرح آزمایشی کاملاً تصادفی انجام شد. تجزیه واریانس داده­ها با نرم افزار SAS مورد بررسی قرار گرفت و میانگینها با آزمون دانکن در سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند. نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel رسم شدند.

نتایج

در این مطالعه از گیاه وحشی آرابیدوپسیس لاین Col-0 و دو لاین جهش­یافته ntrc 096776 و 114293 استفاده شد. و جایگاه ورود T-DNA در آنها به ترتیب در اینترون 8 و اگزون 9 است.  فنوتیپ بارز این جهش­یافته­ها رنگ سبز پریده و سرعت رشد در آنها کمتر از گیاهچه­های وحشی آرابیدوپسیس بود (شکل 1).

شکل1- فنوتیپ گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه  MS.

اثر تیمار ترهالوز بر فعالیت آنزیمهای آنتی­اکسیدانتی در جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی آرابیدوپسیس: گیاهچه­های‌ جهش‌یافته و وحشی رشد­یافته بر روی  محیط کشت پایه MS (شاهد) و یا محیط کشت حاوی ساکاروز تفاوت معنی­داری را در فعالیت آنزیم کاتالاز نشان ندادند. در تیمار ترهالوز فعالیت آنزیم کاتالاز در جهش­یافته­های ntrc نسبت به گیاه وحشی 40 درصد افزایش نشان داد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار ترهالوز و در همه گیاهان وحشی و جهش­یافته، در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز بالاتر بود (شکل 2-الف). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم کاتالاز نشان داد که فاکتور تیمار در سطح کمتر از 1 درصد، و فاکتور رقم و اثر متقابل تیمار و رقم در سطح کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری را در فعالیت آنزیم ایجاد کردند (جدول 1).

همچنین نتایج حاضر نشان داد که فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول در بین گیاهچه­های‌ جهش‌یافته و وحشی رشد­یافته بر روی  محیط کشت پایه MS تفاوت معنی­داری نشان نمی­دهد. در تیمار ساکاروز نیز میزان فعالیت آنزیم در گیاهچه­های‌ وحشی و جهش­یافته­ها تفاوت معنی­داری نداشت. در حالی­که تیمار ترهالوز سبب افزایش 30 درصدی فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول در گیاهچه­های‌ مورد بررسی در مقایسه با تیمار شاهد شد. این در حالی است که در جهش­یافته­های ntrc فعالیت این آنزیم نسبت به گیاه وحشی کمتر بود (شکل 2-ب).نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول نیز نشان داد که فاکتور تیمار در سطح کمتر از 5 درصد و اثر متقابل تیمار و رقم گیاهی تأثیر معنی­داری در سطح در فعالیت آنزیم نشان ندادند (جدول 1).

در گیاهچه­های جهش­یافته ntrc رشد یافته در محیط کشت Ms، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در نسبت به گیاهچه­های‌ وحشی پایین­تر بود.  اما کاهش معنی دار فعالیت آنزیم تنها در جهش­یافته لاین 096776 مشاهده شد. تیمار ساکاروز تفاوت معنی­داری را در فعالیت آنزیم، بین گیاهچه­های‌ جهش­یافته و وحشی ایجاد نکرد. تیمار ترهالوز سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهچه­های‌ مورد بررسی در مقایسه با  تیمار شاهد و ساکاروز شد.  اما در لاینهای جهش­یافته میزان فعالبت آنزیم به طور معنی­داری کمتر از گیاهچه­های‌ وحشی بود (شکل 2-ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نشان داد که تنها اثر فاکتور رقم در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری در فعالیت آنزیم دارد (جدول 1).

در تمامی تیمارهای مورد بررسی، فعالیت آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز در گیاهچه­های وحشی به طور معنی­داری بیشتر از لاین‌ جهش‌یافته بود. تیمار ترهالوز باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم در گیاهچه­های وحشی و جهش­یافته نسبت به تیمار شاهد و ساکاروز شد. اما میزان فعالیت این آنزیم در جهش­یافته­ها نصف فعالیت آن در گیاهچه­های وحشی بود. در کل فعالیت آنزیم پلی‌فنول‌اکسیداز در هر سه تیمار مورد مطالعه، در دو لاین‌ جهش‌یافته به طور معنی­داری کمتر از گیاه وحشی بود (شکل 2-د). نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم پلی­فنول اکسیداز نشان داد که اثر فاکتورهای رقم­ و نوع تیمار و نیز اثر متقابل رقم و تیمار تأثیر معنی­داری در سطح کمتر از 1 درصد بر فعالیت آنزیم داشتند (جدول 1).

فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در تیمار شاهد، تفاوت معنی­داری را بین گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته­ ntrc، نشان نداد. همین نتیجه در تیمار ساکاروز نیز مشاهده شد. گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته­ ntrc رشد یافته در محیط کشت MS و یا محیط حاوی 100 میلی مولار ساکارز تفاوت معنی­داری از نظر فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز نداشتند. اما تیمار ترهالوز باعث افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در گیاهچه­های وحشی شد و جهش­یافته­های ntrc به طور معنی­داری فعالیت کمتری را نشان دادند. فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در گیاهچه­های وحشی تیمار شده با ترهالوز در مقایسه با گیاهچه­های وحشی شاهد و گیاهچه­های وحشی تیمار شده با ساکاروز به طور معنی­داری بیشتر بود. (شکل 3-الف). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز نشان داد که اثر فاکتور رقم­ و تیمار بر فعالیت آنزیم تأثیری نداشت، اما اثر متقابل رقم و تیمار تأثیر معنی­داری در سطح کمتر از 1درصد بر فعالیت آنزیم داشتند (جدول 1).

شکل 2- مقایسه فعالیت آنزیم الف)کاتالاز، ب) پراکسیداز، ج) آسکوربات محلول و د) پلی فنول اکسیداز در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشدیافته در محیط کشت پایه  MS، محیط کشت  MS حاوی 100 میلی­مولار ساکاروز و یا 100 میلی مولار ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

میزان مالون­دی­آلدهید تولید شده در طی پراکسیداسیون لیپید تفاوت معنی­داری را بین گیاهچه­های جهش­یافته و وحشی در تیمار شاهد و ساکاروز، نشان ندادند. اما در تیمار ترهالوز، میزان پراکسیداسیون لیپید در جهش­یافته­های ntrc  دو برابر بیشتر از گیاهچه­های وحشی بود.  همچنین تیمار ترهالوز باعث کاهش معنی­دار میزان پراکسیداسیون لیپید در گیاه وحشی، درمقایسه با گیاهچه­های وحشی تیمارهای شاهد و ساکاروز شد (شکل 3-ب). از طرفی نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به پراکسیداسیون لیپید نشان داد که اثر فاکتور  تیمار و رقم به طور مجزا به ترتیب در سطح کمتر از 1درصد و کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر میزان پراکسیداسیون لیپید داشتند و اثر متقابل بین دو فاکتور اثری بر مقدار پراکسیداسیون لیپید نداشت (جدول 1).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بین لاینهای جهش­یافته و وحشی رشد یافته در محیط کشت MS (تیمار شاهد) تفاوت معنی­داری در مقدار پراکسیدهیدروژن تولید شده وجود نداشت. در تیمار ساکاروز مقدار پراکسیدهیدروژن در دو لاین جهش­یافته نسبت به گیاهچه­های وحشی کاهش معنی­داری نشان داد. اما در تیمار ترهالوز، میزان پراکسیداسیون هیدروژن در جهش­یافته­های ntrc  دو برابر بیشتر از گیاهچه­های وحشی بود. همچنین مقایسه بین تیمارها نشان داد که میزان پراکسیدهیدروژن در تیمار ترهالوز و در گیاهچه­های وحشی نسبت به تیمار ساکاروز و شاهد کمتر بود (شکل 3-ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به پراکسید هیدروژن نشان داد که اثر فاکتور تیمار به طور مجزا و اثر متقابل دو فاکتور تیمار و رقم در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار پراکسید هیدروژن داشتند و فاکتور رقم در سطح کمتر از 5 درصد بر میزان پراکسید هیدروژن اثر داشت (جدول 1).

در تیمار شاهد مقدار فنول تولید شده در لاینهای جهش­یافته دو برابر کمتر از گیاهچه­های وحشی بود. همین طور در تیمار ساکاروز و ترهالوز مقدار فنول تولید شده در جهش­یافته­های ntrc در مقایسه با گیاهچه­های وحشی به طور معنی­داری کمتر بود (شکل 3-د). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار فنول نشان داد که اثر فاکتور رقم به طور مجزا و اثر متقابل دو فاکتور به ترتیب در سطح کمتر از 1 درصد و کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار فنول داشته و فاکتور تیمار اثری بر مقدار فنول نداشت (جدول 1).

اثر تیمار ترهالوز بر میزان آنتوسیانین در جهش­یافته­های ntrc و گیاه وحشی: مقدار آنتوسیانین در گیاهچه­های وحشی و جهش­یافته­های ntrc در تیمارهای شاهد و ساکاروز بسیار اندک بوده و تفاوت معنی­داری را با یکدیگر نشان ندادند. درحالی که در تیمار ترهالوز مقدار آنتوسیانین در گیاهچه­های وحشی 25 برابر بیشتر از لاینهای جهش­یافته افزایش یافت. اما تیمار ساکاروز و ترهالوز اثر معنی­داری بر میزان آنتوسیانین در جهش­یافته­های ntrc نداشتند (شکل 4). نتایج تجزیه واریانس داده های مربوط به مقدار آنتوسیانین نشان داد که اثر هر سه فاکتور تیمار، رقم و اثر متقابل دو فاکتور در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر میزان آنتوسیانین داشتند (جدول 1).

شکل 3- الف) فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز، ب) مقدار مالون در آلدهید، ج) پراکسید هیدروژن و د) فنول محلول در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه  MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

شکل 4- میزان آنتوسیانین در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293) رشد یافته در محیط کشت پایه MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).

اثر تیمار ترهالوز بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید و گزانتوفیل: مقدار کلروفیل a، b، و کل در جهش‌یافته­ ‌ntrc لاین 096776 در تیمار شاهد و ساکاروز نسبت به گیاهچه­های وحشی کاهش معنی‌داری را نشان دادند، اما در تیمار ترهالوز تفاوت معنی­داری از نظر محتوای کلروفیل بین گیاهچه­های جهش­یافته و وحشی دیده نشد. محتوای کلروفیل  a، b، و کل در گیاهچه­های وحشی در تیمار ترهالوز در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز کاهش معنی­دار یافت. بررسی مقدار کلروفیل در لاینهای جهش­یافته نشان داد که تفاوت معنی­داری بین تیمارهای مختلف وجود ندارد (شکل 5-الف، ب و ج). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار کلروفیل نشان داد که فاکتور اثر تیمار به طور مجزا در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار کلروفیل a، b، و کل داشت. و فاکتور رقم به طور مجزا در سطح کمتر از 1درصد بر کلروفیل b و کمتر از 5 درصد بر کلروفیل a و کل نشان داد. اثر متقابل دو فاکتور نیز در سطح کمتر از 1 درصد تأثیر معنی­داری بر هر سه کلروفیل a، b، و کل نشان داد (جدول 1).

محتوای کاروتنوئید و گزانتوفیل در لاینهای جهش­یافته ntrc در مقایسه با گیاهچه­های وحشی رشد یافته در محیط کشت MS (تیمار شاهد) کاهش معنی­داری نشان دادند (35 درصد کاهش). نتایج مشابهی درگیاهچه­های تیمار شده با ساکاروز دیده شد. اما در تیمار ترهالوز تفاوت معنی­داری بین گیاهچه­های وحشی و لاینهای جهش­یافته مشاهده نشد. مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل گیاهچه­های وحشی در تیمار ترهالوز در مقایسه با تیمار شاهد و ساکاروز کاهش معنی­داری نشان داد. درحالی­که جهش­یافته­ها تفاوت قابل توجهی را در تیمارهای مختلف نشان ندادند (شکل 5-د). همچنین نتایج تجزیه واریانس داده­های مربوط به مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل نشان داد که اثر فاکتور تیمار به طور مجزا در سطح کمتر از 5 درصد تأثیر معنی­داری بر مقدار کاروتنوئید و گزانتوفیل داشت. و فاکتور رقم به طور مجزا اثری بر فعالیت آنزیم نداشت. اثر متقابل دو فاکتور در سطح کمتر از 1درصد تأثیر معنی­داری بر فعالیت آنزیم نشان داد (جدول 1).

بحث

تاکنون گزارشهای متعددی از  ویژگیهای شیمیایی و فیزیکی ترهالوز و نیز نقش آن در پاسخهای دفاعی در مخمر، قارچها، باکتریها و گیاهان  منتشر شده است (23، 36، 42 و 45). از طرفی دیگر نقش پروتئین NTRC در کنترل واکنشهای مهم چند‌گانه کلروپلاستی از جمله احیای پروکسی‌ردوکسین و محافظت در مقابل تنش اکسیداتیو به اثبات رسیده است.  این پژوهش با هدف بررسی اثر تیمار ترهالوز بر فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانت دو لاین جهش­یافتۀ ntrc (114293 و 096776) و گیاهچه­های وحشی آرابیدوپسیس انجام شده است.  

شکل 5- مقدار الف) کلروفیل a، ب) کلروفیل b، ج) کلروفیل کل و د) کاروتنویید و گزانتوفیل در گیاهچه­های 14 روزه وحشی (WT) و دو لاین جهش یافته ntrc (096776 و 114293)  رشد یافته در محیط کشت پایه MS، محیط کشت  MS حاوی غلظت 100 میلی مولارساکاروز و یا ترهالوز. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± خطای معیار هستند. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی دار در سطح 05/0 > P است. ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک، با یکدیگر تفاوت معنی­داری ندارند (P < 0/05).