نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران.
2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران.
3 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران
4 دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران
چکیده
استویا با نام علمی Stevia rebaudiana Bertoni از تیره Composite گیاهی چندساله، علفی و دگرگردهافشان میباشد. با توجه به پایین بودن درصد جوانهزنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از بذور از نظر میزان شیرینی، ریزازدیادی این گیاه با استفاده از روشهای کشت بافت به منظور تکثیر انبوه مطلوب میباشد. در این مطالعه عملکرد دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره با استفاده از سه تیمار غلظت محیط کشت MS ، سطوح مختلف زغال فعال و هورمونهایBAP وKn در دو آزمایش مقایسه و بررسی گردیدند. به طوری که در آزمایش اول اثر زغال فعال وغلظت محیط کشت MS و در آزمایش دوم استفاده از غلظت-های جداگانه (0، 5/0، 1 و 5/1 میلیگرم در لیتر) از هورمونهای BAP وKn در سه تکرار اجرا گردید. نتایج نشان داد بیشترین میزان افزایش صفات در کشت جوانههای انتهایی در غلظت کامل محیط کشت MS به همراه 5/1 گرم در لیتر زغال فعال به عنوان ماده جاذب فنولها مشاهده گردید. استفاده از غلظت 5/1 میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP وKn تاثیر معنیداری را بر افزایش راندمان ریزازدیادی هر دو نوع ریزنمونه نشان داد. در مقایسه عملکرد هورمونهای BAP وKn استفاده از 5/1 میلی-گرم در لیتر BAP در کشت جوانههای انتهایی بیشترین میزان صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی را نشان داد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Micropropagation drug plant Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) through cultivation two explants end buds and node with various cocentrations activated charcoal and hormones BAP and Kn.
نویسندگان [English]
1 M.Sc. Student of Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran
2 Assistant Professor of Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.
3 Faculty of Agriculture, Bu Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.
4 Faculty of Agriculture, Bu Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.
چکیده [English]
Stevia rebaudiana Bertoni is from the dark Composite perennial plant, herbaceous and pollinator. Due to the being below seed germination perecentage and heterogenous multiplication of plants from seed in terms of sweetness micropropagation of this plant with use of tissue culture methods in order to replicate mass is desirable. In this study, the performance of two explant end bud and node using three treatments the concentration of the medium MS and different levels of activated charcoal and hormones BAP and Kn in two experiment compared and reviewed. So that in the first experiment the effect of active charcoal and concentration of culture media MS and in the second experiment use separate concentrations (at 0,0/5,1 and 1/5mgr/l) of hormones BAP and Kn in three repeat was implemented. Results showed the highest increase traits in the cultivation of end buds at full concentration seen of culture medium MS with to 1/5gr/l activated charcoal as absorber substance phenols. Use concentration 1/5 mgr/l of hormones BAP and Kn showed an increase in micropropagation efficiency of both explants. Performance comparison hormones BAP and Kn using 1/5 mgr/l BAP in the cultivation of the end buds showed the most characteristics of shoot length, number of nodes and the number of lateral stems.
کلیدواژهها [English]
ریز ازدیادی گیاه دارویی استویا (Stevia rebaudiana Berton) از طریق کشت دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره به همراه غلظتهای مختلف زغال فعال و هورمونهای BAP و Kn
بهاره شعفی1، سیدسعیدموسوی1*، سعید قمبرعلی باغنی1، محمدرضا عبداللهی1 و حسن ساریخانی2
1 ایران،همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
2 ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
تاریخ دریافت: 8/5/96 تاریخ پذیرش: 16/11/96
چکیده
استویا با نام علمی Stevia rebaudiana Bertoni از تیره Composite گیاهی چندساله، علفی و دگرگردهافشان میباشد. با توجه به پایین بودن درصد جوانهزنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از بذور از نظر میزان شیرینی، ریزازدیادی این گیاه با استفاده از روشهای کشت بافت به منظور تکثیر انبوه مطلوب میباشد. در این مطالعه عملکرد دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره با استفاده از سه تیمار غلظت محیط کشت MS ، سطوح مختلف زغال فعال و هورمونهایBAP وKn در دو آزمایش مقایسه و بررسی گردید. به طوری که در آزمایش اول اثر زغال فعال وغلظت محیط کشت MS و در آزمایش دوم استفاده از غلظتهای جداگانه (0، 5/0، 1 و 5/1 میلیگرم در لیتر) از هورمونهای BAP وKn در سه تکرار اجرا گردید. نتایج نشان داد بیشترین میزان افزایش صفات در کشت جوانههای انتهایی در غلظت کامل محیط کشت MS به همراه 5/1 گرم در لیتر زغال فعال به عنوان ماده جاذب فنولها مشاهده گردید. استفاده از غلظت 5/1 میلیگرم در لیتر از هورمونهای BAP وKn تأثیر معنیداری را بر افزایش راندمان ریزازدیادی هر دو نوع ریزنمونه نشان داد. در مقایسه عملکرد هورمونهای BAP وKn استفاده از 5/1 میلیگرم در لیتر BAP در کشت جوانههای انتهایی بیشترین میزان صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی را نشان داد.
واژه های کلیدی: ریزازدیادی، استویا، زغال فعال ،BAP، Kn
* نویسنده مسئول، تلفن: 09188526940، پست الکترونیکی: s.moosavi@basu.ac.ir
مقدمه
استویا گیاهی دارویی، قندی، با عدد کروموزومی(2n=22) متعلق به خانوادهAsteraceaeمیباشد که برگهای آن حاوی گلیکوزید دیترپن ( شامل استویوزاید وربودیوزاید)، فاقدکالری، غیرسمی و خیلی شیرین است (18). شیرینی قند این گیاه حدود ۲۵۰ تا ۳۰۰ برابر دیگر گیاهان قندی مانند نیشکر و چغندر قند بوده و میزان قند موجود در آن ۱۵۰ برابر میباشد به طوری که این قند میتواند جایگزین مناسب برای شیرینکنندههای مصنوعی نظیر آسپارتام ، سدیم ساخارین و سیکلامات باشد (24). ازدیاد انبوه گیاه در شرایط درون شیشهای علاوه بر افزایش راندمان تولید در سطح وسیع، زمان و فضای محدودتر امکان حفظ و نگهداری ژرم پلاسم گیاهان با ارزش را نیز میسر مینماید (38 و 48). بنابراین دستیابی به یک پروتکل مناسب به منظور بهینه نمودن شرایط کشت نمونهها میتواند سبب افزایش راندمان تولید گیاهچهها گردد، به طوری که با توجه به خودناسازگاری، پایین بودن درصد جوانهزنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از طریق بذور مطالعه بر روی فاکتورهای مؤثر بر رشد نمونهها میتواند یک راهکار مناسب باشد (33). با توجه به مطالعات انجام شده مؤثرترین فاکتورها بر افزایش راندمان ریزازدیادی گیاهان ژنوتیپ، نوع ریزنمونه، سن گیاهچه، محیطکشت و نوع و غلظت تنظیم کنندههای رشد است. دو عامل نوع ریزنمونه وتنظیم کننده رشد از عوامل بسیار تأثیرگذار بر موفقیت و افزایش سرعت ریزازدیادی میباشند (41 و 50). در بسیاری از مشاهدات جوانههای انتهایی به دلیل فعالیتهای میتوزی بیشتر نسبت به جوانههای جانبی که در معرض غالبیت انتهایی قرار دارند از پتانسیل عملکرد بالاتری به منظور ریزازدیادی برخوردارند (12 و 53). امروزه ریزازدیادی گیاه دارویی استویا توسط محققان بر روی ریزنمونههای مختلف نظیر، قطعات گره، میترا و همکاران (26)، سینگ و همکاران (43) و سیوارام و همکاران (45)، قطعات میانگره، احمد و همکاران(7)، سایرکار و همکاران (39)، تیاقاراجان و همکاران (51) و یودین و همکاران (52)، برگ علی و همکاران(9) و جوانههای ساقه آنباژنگان و همکاران(11) و داس و همکاران (14) گزارش شده است. استفاده مناسب از پتانسیلهای کشت بافت میتواند بازده بالای تولید را در کنار صرفه اقتصادی به همراه داشته باشد طوریکه مطالعه بر روی غلظتهای مختلف محیط کشت و هورمونها با توجه به تفاوت گیاهان از نظر پاسخ به شرایط کشت درون شیشهای از مراحل مهم ریزازدیادی گیاهان دارویی محسوب میگردد. با توجه به اینکه کاهش عملکرد رشد گیاهچهها در غلظتهای تقلیل یافته محیط کشت به دلیل کاهش نسبتهای نیترات میباشند در صورت عدم تفاوت معنیدار بر افزایش بیوماس گیاهچهها استفاده از محیطهای MS با نمکهای تقلیل یافته نسبت به محیط MS کامل ارجحیت داشته و مقرون به صرفه میباشند (15 و 21). زغال فعال به عنوان یک آنتی اکسیدان مؤثر با داشتن سطح صاف و شبکه وسیع از منافذ ، با کاهش پدیده قهوهای شدن ریز نمونهها و تیره نمودن محیط کشت قدرت جذب ترکیبات در محیط کشت را افزایش داده و سبب بهبود باززایی درون شیشهای گیاهان میگردد (6 و 33). استفاده از هورمونهای سیتوکنین با ایجاد تورم در بافتها، تحریک نمو جوانههای جانبی نا به جا، تحریک تقسیم، افزایش تعداد و طول نوساقهها فاکتورهای مؤثری بر افزایش راندمان ریزازدیادی ریزنمونهها در شرایط درون شیشهای میباشند (10). در این پژوهش تأثیر دو سیتوکنین BAP و Kn با توجه به راندمان بالای آنها بر افزایش پتانسیل نمونهها در گیاه استویا در مقایسه با سایر سیتوکنینها بررسی گردید. با توجه به اینکه استفاده از ترکیب BAP و Kn میتواند با افزایش تعداد ساقهجانبی و جذب مواد مغذی محیط کشت سبب کاهش صفت طول ساقهچه گردد در این پژوهش به طور جداگانه سطوح مختلف هورمونها بررسی گردید (20). در این پژوهش برای اولین بار درکشورپتانسیل جوانههای انتهایی و گره با استفاده از سطوح مختلف زغال فعال و ترکیبات جداگانه BAP و Kn درمحیط کشت MS بررسی گردید. هدف از این پژوهش ارزیابی مقایسه عملکرد ریزنمونه گره و جوانه انتهایی با اعمال تیمارهای مؤثر بر کشت درون شیشهای بود به طوری که ضمن تعیین سطوح برتر هریک از تیمارها بهترین ریزنمونه نیز تعیین گردد.
مواد و روشها
گیاهچههای مورد استفاده در این پژوهش از نوع گیاهچههای استویا ریبودیانا برتونی بودند که از شرکت گلساران گرگان تهیه گردیدند. این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام گرفت. وسایلی از قبیل استوانه مدرج، بشر، ظروف شیشهای درب دار، پنس، اسکارپر، پیپت، پیست، هودلامینار، pH متر، کاغذ صافی و ..... در این تحقیق استفاده گردید. تمامی وسایل شیشهای و فلزی و همچنین محیط کشتها قبل از استفاده در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 2/1 بار به مدت 20 دقیقه سترون شده و سپس به زیر هود لامینار منتقل شدند. حدود دو ساعت قبل از کشت، لامینار را روشن کرده و با الکل 96 درصد محیط داخل آن را سترون کرده و 30 دقیقه قبل از کشت لامپ uv زیر لامینار روشن گردید. به منظور ضدعفونی ریزنمونهها پس از شستشوی گیاهچهها به مدت 15 دقیقه، ریز نمونهها به مدت 1 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند و پس از شستشو با آب استریل، به مدت 10 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 20 درصد قرار گرفته و پس از آن 3 مرتبه (هر بار 3 دقیقه) با آب استریل شستشو شدند. پس از ضد عفونی وجدا کردن برگها، ریزنمونههای جوانه انتهایی وتکگره به طول 15 الی 20 میلیمتر تهیه شده و به طور عمودی و با استفاده از پنس بر روی محیط کشت استقرار یافتند. نمونهها نیز به اتاقک رشد با شدت نور 2000 لوکس با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آزمایش اول به صورت فاکتوریل 2×2×4در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید. به طوری که چهار سطح مختلف زغال فعال (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) به عنوان فاکتور اول، دو نوع محیط کشت (MS و MS2/1) به عنوان فاکتور دوم و دو نوع ریزنمونه (جوانه انتهایی و تک گره) به عنوان فاکتور سوم در نظر گرفته شدند. آزمایش دوم به منظور بررسی استفاده جداگانه از هورمونهای BAP و Kn بر صفات ساقهزایی به صورت فاکتوریل 2×4در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید. در این آزمایش تمامی غلظتهای هورمون BAP و Kn به طور جداگانه به محیط کشت پایه MS اضافه گردیدند. چهار سطح مختلف از غلظت BAP (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) و Kn (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) به عنوان فاکتورهای اول و دو سطح نوع ریزنمونه به عنوان فاکتورهای دوم به صورت مستقل از هم در نظر گرفته شدند. محیط کشت پایه MS (30) حاوی غلظتهای استاندارد نمکها به همراه 100 میلیگرم میواینوزیتول، و30 گرم ساکارز به عنوان منبع کربوهیدرات و 8 گرم در لیتر آگار برای جامد کردن محیط کشت استفاده شد که pH برابر 7/5 تنظیم شده بود. برای تهیه محیط کشت MS2/1 تمام مواد مصرفی در محیط MS به نسبت 2/1 کاهش یافت. تجزیه آماری دادهها پس از بررسی نرمال بودن باقیمانده آنها انجام شد و مقایسه میانگین دادهها توسط آزمون دانکن (16) در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. به منظور تجزیه و تحلیل دادهها و رسم نمودارها از نرم افزارهای SAS و Excel استفاده گردید.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس برای صفت طول ساقه اختلاف معنیداری را در سطح 0001/0 برای نوع ریزنمونه، محیط کشت و غلظت زغال فعال نشان داد. اثر متقابل نوع ریزنمونه در محیط کشت و اثر متقابل محیط کشت در غلظت زغال فعال در سطح 5 درصد معنیدار بوده است. مشاهدات نشان دهنده این موضوع است که سه عامل نوع ریزنمونه، محیط کشت و سطوح مختلف زغال فعال سه فاکتور بسیار مؤثر بر افزایش صفت طول ساقه بودند. اثر متقابل نوع ریز نمونه در غلظت زغال فعال و همچنین اثرات سهگانه نوعریزنمونه در غلظت محیط کشت MS در غلظت زغال فعال معنیدار نبوده که این مشاهده بیانگر این موضوع میباشد که فاکتورها مستقل از هم عمل نمودند (جدول1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد کشت جوانه انتهایی در محیط کشت MS بیشترین میزان طول ساقه (32/0±37/6 سانتیمتر) و تعداد برگچه (87/0±75/15) را ایجاد کرد. همچنین کشت گره در محیط MS 2/1 منجر به کمترین میزان رشد ساقهچه (32/0±22/4 سانتیمتر) و تعداد برگچه (87/0±33/13) گردید (جدول2). در رابطه با اثر محیط کشت و غلظت زغال فعال بیشترین میزن طول ساقه (32/0±16/8 سانتیمتر) در غلظت کامل محیط کشتMS به همراه استفاده از 5/1 گرم در لیتر زغال فعال مشاهده گردید. کمترین میزان طول ساقهچه( 32/0±91/2 سانتیمتر) در محیط MS 2/1 در غلظت 0 (شاهد) زغال فعال مشاهده گردید که این موضوع نشان دهنده تأثیر معنیدار استفاده از زغال فعال بر افزایش طول ساقهچه میباشد (شکل های 1، 2 و جدول3).
جدول1- تجزیه واریانس اثر نوع ریزنمونه، محیط کشت و غلظت زغال فعال بر ریزازدیادی گیاه استویا
درجه آزادی و میانگین مربعات |
|||||
منبع تغییر |
درجه آزادی |
طول ساقه |
تعداد برگچه |
طول ریشه |
تعدا شاخه جانبی |
نوع ریز نمونه |
1 |
***0027/0 |
***0016/0 |
*** 0333/0 |
***0020/0 |
محیط کشت |
1 |
***0148/0 |
***0015/0 |
**0154/0 |
***0055/0 |
غلظت زغال فعال |
3 |
***0164/0 |
***0152/0 |
***3486/0 |
***0163/0 |
نوع ریزنمونه * محیط کشت |
1 |
*0003/0 |
*0004/0 |
ns0012/0 |
ns0000/0 |
نوع ریزنمونه *غلظت زغال فعال |
3 |
ns0000/0 |
*0003/0 |
ns0022/0 |
**0007/0 |
محیط کشت * غلظت زغال فعال |
3 |
*0002/0 |
ns0000/0 |
ns0004/0 |
ns0002/0 |
نوع ریزنمونه * محیط کشت * غلظت زغال فعال |
3 |
ns000/0 |
ns0000/0 |
ns0019/0 |
ns0000/0 |
خظای آزمایشی |
32 |
0000/0 |
0000/0 |
0018/0 |
0001/0 |
ضریب تغییرات(%) |
|
6693/0 |
6156/0 |
2542/4 |
0444/1 |
*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری میباشد.
جدول2- تأثیر نوع ریزنمونه و غلظت محیط کشت MS بر صفات طول ساقه و تعداد برگچه
نوع ریز نمونه |
محیط کشت |
طول ساقه |
تعداد برگچه |
تک گره |
MS |
32/0± b35/5 |
87/0± c45/13 |
MS2/1 |
32/0±d22/4 |
87/0± d33/13 |
|
جوانه انتهایی |
MS |
32/0±a37/6 |
87/0±a75/15 |
MS2/1 |
32/0± c59/4 |
87/0± b75/13 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
شکل1- رشد گیاهچهها در محیط حاوی 5/0 گرم در لیتر زغال فعال (a) محیط حاوی 1 گرم در لیتر زغال فعال (b) محیط حاوی 5/1 گرم در لیتر زغال فعال (c)
شکل2- رشد گیاهچهها در محیط حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر در لیتر BAP (a) محیط حاوی 1 میلیگرم در لیتر BAP (b) محیط حاوی 5/1 میلیگرم در لیتر BAP(c)
جدول 3- تأثیر نوع محیط کشت و غلظت زغال فعال بر صفت طول ساقه
نوع محیط کشت |
غلظت زغال فعال |
طول ساقه |
|
|
|
MS
MS 2/1 |
0 |
32/0±e41/4 |
5/0 |
32/0±d80/4 |
|
1 |
32/0±c08/6 |
|
5/1 |
32/0±a16/8 |
|
0 |
32/0±g91/2 |
|
5/0 |
32/0±f50/3 |
|
1 |
32/0±de63/4 |
|
5/1 |
32/0±b58/6 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
نتایج مقایسه میانگین نشان داد استفاده از 5/1 گرم در لیتر زغال فعال در هر دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره بیشترین میزان تعداد برگچه به ترتیب (87/0±16/19) و (87/0±23/18) را ایجاد می کند. کشت ریزنمونه جوانه انتهایی و گره به همراه استفاده از غلظت 5/1 گرم در لیتر زغال فعال بیشترین میزان تعداد ساقهجانبی به ترتیب (61/0±33/9) و (61/0±33/8) را ایجاد کرد. مشاهدات نشان داد استفاده از زغال فعال در هر دو ریزنمونه عامل بسیار مؤثری بر افزایش بیوماس گیاهچهها بوده و پاسخ جوانههای انتهایی و گره به افزایش تعداد برگچه و ساقهجانبی عملکرد مشابه و نزدیک به هم داشته است (جدول 4).کشت جوانه انتهایی در محیط کشت MS و MS 2/1با استفاده از 5/1 گرم در لیتر زغال فعال بیشترین طول ریشهچه به ترتیب (15/0±13/3 سانتیمتر) و (15/0±93/2 سانتیمتر) را نشان داد. کشت گره نیز در محیط MS 2/1 بیشترین میزان طول ریشهچه (15/0±43/2 سانتیمتر) را نشان داد. در واقع اضافه نمودن زغال فعال و استفاده از غلظت کامل محیط MS دو عامل بسیار مؤثر بر افزایش طول ریشهچهها بوده که به طور معنیداری این صفت را نسبت به شاهد افزایش داده است (جدول5).
جدول4- تأثیر نوع ریزنمونه و غلظت زغال فعال بر تعداد برگچه و ساقه جانبی
نوع ریز نمونه |
غلظت زغال فعال |
تعداد برگچه |
تعداد ساقه جانبی |
تک گره
جوانه انتهایی |
0 |
87/0±e00/9 |
61/0±e83/3 |
5/0 |
87/0±d33/11 |
61/0±d16/5 |
|
1 |
87/0±b33/15 |
61/0±b16/7 |
|
5/1 |
87/0±a83/18 |
61/0±a33/8 |
|
0 |
87/0±d83/10 |
61/0±d83/4 |
|
5/0 |
87/0±c33/13 |
61/0±c16/6 |
|
1 |
87/0±b66/15 |
61/0±b66/6 |
|
5/1 |
87/0±a16/19 |
61/0±a33/9 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
نتایج این آزمایش افزایش معنیدار عملکرد جوانهانتهایی نسبت به گره را نشان داد که این امر نشان دهنده پتانسیل بالای جوانهانتهایی نسبت به شرایط ریزازدیادی در گیاه دارویی استویا میباشد. با توجه به عدم غالبیت جوانه انتهایی امکان رشد نمونه در مدت زمان کمتر و بیوماس بالاتر اغلب در شرایط کشت درون شیشهای فراهم میگردد که این امر با مشاهدات حسین و همکاران (19) و مودی و همکاران (29) نیز مطابقت داشت. اما با توجه به امکان تفاوت در گیاهچههای تکثیر یافته و تیمارهای اعمال شده در کشت ریزنمونهها پاسخ به شرایط کشت بافت و ریزازدیادی میتواند متفاوت باشد. استفاده از قطعات گره با عملکرد بالا توسط کیسر و همکاران (13)، ماتور و همکاران (25)، مهتا و همکاران (28) وسینگ و همکاران (44) گزارش شده است.
جدول5- تأثیر نوع ریزنمونه و محیط کشت بر طول ریشهچه
نوع ریزنمونه |
نوع محیط کشت |
غلظت زغال فعال |
طول ریشهچه |
تک گره |
MS |
0 |
15/0±d06/1 |
5/0 |
15/0±c26/1 |
||
1 |
15/0±b66/1 |
||
5/1 |
15/0±a06/2 |
||
MS2/1 |
0 |
15/0±d00/1 |
|
5/0 |
15/0±e13/1 |
||
1 |
15/0±b70/1 |
||
5/1 |
15/0±a43/2 |
||
جوانه انتهایی |
MS |
0 |
15/0±d26/1 |
5/0 |
15/0±e43/1 |
||
1 |
15/0±b86/1 |
||
5/1 |
15/0±a13/3 |
||
MS2/1 |
0 |
15/0±d10/1 |
|
5/0 |
15/0±c36/1 |
||
1 |
15/0±b60/1 |
||
5/1 |
15/0±a93/2 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
نتایج تجزیه واریانس برای صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی تفاوت معنیداری در سطح 0001/0 برای نوع ریزنمونه و غلظت هورمون BAP نشان داد. اما اثر متقابل نوع ریزنمونه در غلظت هورمون BAP برای هر سه صفت معنیدار نبوده و این دو فاکتور مستقل از هم عمل نمودند (جدول6). نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت هورمون Knو نوع ریزنمونه نیز برای صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی اختلاف معنیدار را نشان داد. اثر متقابل نوع ریزنمونه در غلظت هورمون Knمعنیدار نبود و فاکتورها مستقل از هم عمل نمودند (جدول7). مقایسه میانگین تیمار کشت ریزنمونهها با استفاده از هورمون BAP ، بیشترین صفات طول ساقه (0036/0±58/9 سانتیمتر)، تعداد گره (027/0±08/6) و تعداد ساقه جانبی(004/0±50/10) را با کشت جوانهانتهایی نشان داد (جدول8).
جدول6- تجزیه واریانس اثرغلظت هورمونBAPو نوع ریز نمونه بر ریزازدیادی گیاه استویا
درجه آزادی و میانگین مربعات |
||||
منبع تغییر |
درجه آزادی |
طول ساقه |
تعداد گره |
تعداد ساقه جانبی |
نوع ریزنمونه |
1 |
*** 0022/0 |
*** 0686/0 |
*** 0008/0 |
غلظت هورمون BAP |
3 |
*** 0003/0 |
*** 0107/0 |
*** 0003/0 |
نوع ریز نمونه* غلظت هورمون BAP |
3 |
ns0000/0 |
ns0000/0 |
ns0000/0 |
خظای آزمایشی |
16 |
0000/0 |
0007/0 |
0000/0 |
ضریب تغییرات(%) |
|
26/0 |
03/2 |
33/0 |
*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری میباشد.
جدول7- تجزیه واریانس اثرغلظت هورمونKnونوع ریز نمونه بر روی ریزازدیادی گیاه استویا
درجه آزادی و میانگین مربعات |
||||
منبع تغییر |
درجه آزادی |
طول ساقه جانبی |
تعداد گره |
تعداد ساقه |
نوع ریزنمونه |
1 |
*** 0021/0 |
*** 0600/0 |
*** 0008/0 |
غلظت هورمون Kn |
3 |
**0001/0 |
*** 0156/0 |
*0001/0 |
نوع ریز نمونه* غلظت هورمون Kn |
3 |
ns0000/0 |
ns0014/0 |
ns0000/0 |
خظای آزمایشی |
16 |
0000/0 |
0017/0 |
0000/0 |
ضریب تغییرات(%) |
|
26/0 |
19/3 |
39/0 |
*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری میباشد.
جدول8- تأثیر نوع ریز نمونه با استفاده از هورمون BAP بر صفات رویشی ساقه در استویا
نوع ریزنمونه |
طول ساقه |
تعداد گره |
تعدادشاخه جانبی |
جوانه انتهایی |
0036/0±a58/9 |
027/0±a08/6 |
004/0±a50/10 |
گره |
0036/0±b04/8 |
027/0±b50/3 |
004/0±b33/9 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
مقایسه میانگین تیمار کشت ریزنمونهها با استفاده از هورمون Kn نیز بیشترین صفات طول ساقه (0038/0±20/9 سانتیمتر) تعداد گره (041/0±50/4) و تعداد ساقه جانبی(005/0±10) را با کشت جوانهانتهایی نشان داد (جدول9). این مشاهده در واقع بیانگر این موضوع است که جوانه انتهایی پتانسیل بالاتری را در مقایسه با قطعات گره به ریزازدیادی داشته است. استفاده از 5/1 میلیگرم در لیترBAP تفاوت معنیداری را بر افزایش صفات رویشی ریزنمونهها نسبت به شاهد و سایر غلظتها نشان داد به طوریکه بیشترین صفات طول ساقه (0036/0±66/9 سانتیمتر)، تعداد گره (027/0±16/6) و تعداد ساقه جانبی(004/0±83/10) مشاهده گردید (جدول10). مقایسه میانگین سطوح مختلف غلظت هورمون Kn بیشترین صفات طولساقه(0038/0±/9 سانتیمتر)، تعداد گره(041/0±66/4) و تعداد ساقه جانبی(005/0±16/10) را با استفاده از غلظت 5/1 میلیگرم در لیترنشان داد (جدول11).
جدول9- تأثیر نوع ریز نمونه با استفاده از هورمون Kn بر صفات رویشی ساقه در استویا
نوع ریزنمونه |
طول ساقه |
تعداد گره |
تعدادشاخه جانبی |
جوانه انتهایی |
0038/0±a20/9 |
041/0±a50/4 |
005/0±a10 |
گره |
0038/0±b83/7 |
041/0±b08/3 |
005/0±b91/8 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
جدول10- تأثیر غلظت هورمون BAP بر صفات رویشی ساقه در استویا
غلظت هورمون BAP |
طول ساقه |
تعداد گره |
تعداد شاخه جانبی |
0 |
0036/0±d25/8 |
027/0±d66/3 |
004/0±d16/9 |
5/0 |
0036/0±c50/8 |
027/0±c33/4 |
004/0±c50/9 |
1 |
0036/0±b83/8 |
027/0±b16/5 |
004/0±b16/10 |
5/1 |
0036/0±a66/9 |
027/0±a16/6 |
004/0±a83/10 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
جدول11- تأثیر غلظت هورمون Kn برصفات رویشی ساقه در استویا
غلظت هورمون Kn |
طول ساقه |
تعداد گره |
تعداد شاخه جانبی |
0 |
0038/0±d25/8 |
041/0±d3 |
005/0±c16/9 |
5/0 |
0038/0±c33/8 |
041/0±c50/3 |
005/0±c16/9 |
1 |
0038/0±b50/8 |
041/0±b50/4 |
005/0±b50/9 |
5/1 |
0038/0±a9 |
041/0±a66/4 |
005/0±a16/10 |
*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنیداری با هم ندارند.
شکل3- رشد گیاهچهها در محیط حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر در لیتر Kn (a) محیط حاوی 1 میلیگرم در لیتر Kn (b) محیط حاوی 5/1 میلیگرم در لیتر Kn(c)
بحث
انتخاب فاکتورها و تعیین سطح مناسب هر کدام در کشت بافت گیاهی اولین اقدام مهم در افزایش بازده اقتصادی و بیوماس گیاهچهها میباشد. استفاده از ریزنمونههای مناسب با توجه به نوع گیاه و شرایط فیزیولوژی آن با کشت در محیط مناسب حاوی عناصر غذایی مورد نیاز میتواند مهمترین عامل در دستیابی به پروتکل مناسب باشد. در بسیاری از مطالعات استفاده از غلظتهای کامل محیط کشت MSموفقیت آمیز بوده است اما در مواردی نیز استفاده از غلظتهای تقلیل یافته نیز تفاوت معنیداری را نداشته و استفاده از آنها مقرون به صرفه بوده به طوری که امکان کشت موفق نمونهها در غلظتهای تقلیل یافته MS نیز امکان پذیر بوده است (35). درآزمایش اول برای اولین بار مقایسه پتانسیلهای دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره در جذب عناصر غذایی از محیط کشت MS به همراه استفاده از زغال فعال به عنوان عامل مؤثر در کاهش فنولها و افزایش قدرت جذب نمونهها انجام گردید. درواقع زغال فعال با تیره نمودن محیط کشت و جذب عناصر فنولی رشد گیاهچهها را نسبت به شاهد به طور معنیداری افزایش داد. در این مطالعه استفاده از زغال فعال و غلظت محیط کشت MS تفاوت معنیداری را در دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره نشان داد. به طوری که کشت جوانههای انتهایی در محیط کشت MS به همراه استفاده از 5/1 میلیگرم در لیترزغال فعال نسبت به شاهد بیشترین تأثیر معنیدار را بر افزایش بیوماس گیاهچهها را نشان داد. پاوار و همکاران (32)، رانگانتان و همکاران (35) کشت قطعات گره را در غلظت کامل محیط کشت MS در مقایسه با غلظتهای تقلیل یافته مناسب گزارش کردند که با نتایج این آزمایش نیزمطابقت داشت. داس و همکاران (14) و کاویتا و همکاران (22) برتری عملکرد کشت جوانه انتهایی گیاه استویا را در محیط MS 2/1 گزارش کردند. مهریزاده و همکاران (5) بیشترین طول ساقه و تعداد برگچه را در کشت جوانه انتهایی استویا در محیط کشت MS حاوی 5/1 گرم در لیتر زغال فعال گزارش کردند که با نتایج حاصل از این آزمایش نیزمطابقت داشت. در واقع با توجه به اینکه ریزنمونهها پس از قرارگیری بر روی محیط کشت اغلب به دلیل تنشهای اعمال شده به گیاه و آسیب به بافت مقادیر فراوانی مواد فنولی آزاد میکنند افزودن سطوح مناسبی از زغال فعال به محیط کشت با جذب اتیلن و کاهش اثر فنولهای اکسید شده سبب بهبود صفات رشدی گیاهچهها گردیده است (16 و 27). مودی و همکاران (29) بیشترین طول ریشهچه (71/0±9/10 سانتیمتر) و 100 درصد ریشهزایی در کشت جوانههای جانبی و انتهایی استویا را با استفاده از ppm100 زغال فعال در غلظت کامل محیط کشت MS گزارش کردند. سینگ و همکاران (44) بیشترین افزایش تعداد ریشهچه (40/0±0/11) و طول ریشهچه (19/0±62/4 سانتیمتر) را با کشت قطعات گره گیاه دارویی استویا را با اضافه نمودن 50 میلیگرم در لیتر زغال فعال به محیط MS 4/1 گزارش کردند. اطراشی و همکاران (2) افزایش ریشهزایی و رشد گیاهچههای حاصل از کشت ریزنمونههای فلفل دلمهایCapsicumannuum L).) را با استفاده از زغال فعال4/0 در محیط کشت MS گزارش کردند، بهطوری که 70 تا 90 گیاهچههای انتقال یافته به گلخانه سازگار و رشد مطلوبی را داشتند. زبرجدی و همکاران (3) پاسخ متفاوت ریزنمونههای هیپوکوتیل و کوتیلدون را در ریزازدیادی گیاه دارویی سرخارگل گزارش کردند. استفاده از تنظیم کنندههای رشد در غلظتهای مناسب میتواند مؤثرترین عامل بر افزایش سرعت ازدیاد بیوماس نمونههای گیاهی باشد (31). در این پژوهش با توجه به پاسخ مناسب ریزنمونهها در گیاه استویا به ریشهزایی و رشد مطلوب ریزنمونهها و تأثیر هورمونهای اکسین بر کاهش متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار نگرفت (10). در مطالعات انجام شده در استویا و سایر گیاهان اغلب استفاده از دو سیتوکنین BAP و Kn نسبت به بقیه عملکرد برتری را نشان دادند. در مقایسه دو سیتوکنین فوق نتایج نشان داد استفاده از هورمون BAP بازده بیشتری را بر ریزازدیادی ریزنمونهها داشته است. میرزایی اصل و همکاران (4) افزایش ظرفیت باززایی نوساقه نا به جا ریزنمونههای برگی چغندرقند را در غلظت 1 میلیگرم در لیتر BAP، احمدی و همکاران (1) 87 درصد ساقهزایی با استفاده از 1/0 میلیگرم در لیتر BAP گیاه دارویی پروانش را گزارش کردند. مدنی و همکاران (6) نیز بیشتری میزان ریزازدیادی کشت جوانههای انتهایی را با استفاده از 2 میلیگرم در لیتر BAP در توت فرنگی رقم سلوا گزارش کردند. ترکیب BAP با سایر سیتوکنینها اغلب با افزایش تعداد ساقههای جانبی باعث کاهش رشد طولی ساقهچه گردیده است. اسریدهار و همکاران (47) کاهش معنیدار طول ساقهچه استویا را در ترکیب 2 میلیگرم در لیتر BAP و 5/0 میلیگرم در لیتر Kn گزارش کردند. استفاده ازKn به صورت ترکیب با BAP اغلب در غلظتهای بالا بازده بیشتری را نشان داده است که با توجه به هزینههای تولید مقرون به صرفه نمیباشد بنابراین بررسی تأثیر استفاده ازسطوح مختلف به صورت جداگانه بر عملکرد نمونهها کارآیی بهتری را نشان میدهد سینگ و همکاران (42) ،سیلوا و همکاران (46). بیشترین راندمان ازدیاد گیاهچههای استویا در مطالعات علی و همکاران (9) در غلظت 25/0 میلیگرم در لیتر هورمون Kn و 1 میلیگرم در لیتر BAP و لاریبی و همکاران (23) استفاده از غلظت 1 میلیگرم در لیتر BAP را سطوح برتر معرفی کردند. در سایر مطالعات انجام شده در بررسی تأثیر استفاده از تنظیم کنندههای رشد بر افزایش صفات بیوماس ریزنمونهها در گیاه دارویی استویا نیز نتایج متعددی گزارش شده است. مودی و همکاران (29) استفاده از 2 میلیگرم در لیتر Kn و 1 میلیگرم در لیتر BAP را بیشترین طول ساقهچه (11/0±46/3 سانتیمتر) و تعداد گره (89/0±6/3) ، کاویتا و همکاران (21) بیشترین تعداد ساقه جانبی (68/0±6/12)در غلظت 3 میلیگرم در لیتر Kn و تیواری و همکاران (50) افزایش صفات ساقهزایی در غلظت 5 میلیگرم در لیتر BAP در کشت قطعات گره، مهتا و همکاران (28) بیشترین ساقهزایی و تعداد ساقه جانبی (58/0±42/3) در غلظت 2 میلیگرم در لیتر BAP و 2 میلیگرم در لیتر Kn در کشت جوانه انتهایی گزارش کردند. رازاک و همکاران (35) بیشترین ساقهزایی قطعات گره را در محیط کشت MS در ترکیب 5/0 میلیگرم در لیتر BAP و 25/0 میلیگرم در لیتر Kn مشاهده کردند. نتایج به دست آمده از این پژوهش برای اولین بار عملکرد جوانههای انتهایی و گره را با استفاده از غلظت محیط کشتMS و زغال فعال و نیز تأثیر افزایش بیوماس گیاهچهها با استفاده از هورمونهای BAP و Kn مورد بررسی قرار داد. کشت جوانهانتهایی در غلظت کامل نمکهایMS و 5/1 گرمدر لیتر زغال فعال و 5/1 میلیگرم در لیترBAP بهترین سطوح تیماری بودند. با توجه به اینکه یکی از اهداف مهم ریزازدیادی استویا استخراج متابولیتهای ثانویه است، افزایش سرعت رشد نمونهها و امکان تهیه متابولیتهای ثانویه از بخش ریشه میتواند راهکار مؤثری در تولید و بهرهوری از این گیاه دارویی باشد. با توجه به ریشه زایی مناسب ریزنمونههای استویا در محیط کشت و تولید ریشهچههای انبوه، استفاده از زغال فعال با تاریک نمودن محیط کشت و ممانعت از آزاد شدن ترکیبات فنولی باعث افزایش قدرت رشد ساقهچه و استحکام آن به طور معنیداری نسبت به شاهد گردید که پایداری آن نیز پس از انتقال به شرایط گلخانهای نیز مشاهده شد به طوری که 70 درصد توانایی سازگاری را نشان دادند. برتری استفاده از هورمون BAPبر افزایش بازده ریزازدیادی استویا در مطالعات احمد و همکاران (8)، طالعی و همکاران (49)، شتناوی و همکاران (40) ، تیاگاراژان و همکاران (51) ، راشل و همکاران (37) گزارش شده که با نتایج این آزمایش نیز مطابقت داشت. در مطالعات بعدی میتوان تأثیر تغییرات احتمالی متابولیتهای ثانویه را در استفاده از تیمارهای مختلف نیز بررسی کرد. به طوریکه علاوه بر افزایش بازده تولید گیاهچهها از طریق کشت درون شیشهای متابولیتهای ثانویه در اندامهای هدف به ویژه برگ، ثابت و یا به طور معنیداری افزایش یابند تا به منظور تولید تجاری استویا در سطح وسیع نتایج قابل تعمیم باشند.