نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران.

2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران.

3 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران

4 دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بو علی سینا، همدان، ایران

چکیده

استویا با نام علمی Stevia rebaudiana Bertoni از تیره Composite گیاهی چند‌ساله، علفی و دگر‌گرده‌افشان می‌باشد. با توجه به پایین بودن در‌صد جوانه‌زنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از بذور از نظر میزان شیرینی، ریز‌ازدیادی این گیاه با استفاده از روش‌های کشت بافت به منظور تکثیر انبوه مطلوب می‌باشد. در این مطالعه عملکرد دو ریز‌نمونه جوانه‌ انتهایی و گره با استفاده از سه تیمار غلظت‌ محیط کشت MS ، سطوح مختلف زغال فعال و هورمون‌هایBAP وKn در دو آزمایش مقایسه و بررسی گردیدند. به طوری که در آزمایش اول اثر زغال فعال وغلظت‌ محیط کشت MS و در آزمایش دوم استفاده از غلظت-های جداگانه (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر) از هورمون‌های BAP وKn در سه تکرار اجرا گردید. نتایج نشان داد بیشترین میزان افزایش صفات در کشت جوانه‌های انتهایی در غلظت کامل محیط کشت MS به همراه 5/1 گرم‌ در لیتر زغال فعال به عنوان ماده جاذب فنول‌ها مشاهده گردید. استفاده از غلظت 5/1 میلی‌گرم در لیتر از هورمون‌های BAP وKn تاثیر معنی‌داری را بر افزایش راندمان ریز‌ازدیادی هر دو نوع ریز‌نمونه نشان داد. در مقایسه عملکرد هورمون‌های BAP وKn استفاده از 5/1 میلی-گرم در لیتر BAP در کشت جوانه‌های انتهایی بیشترین میزان صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی را نشان داد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Micropropagation drug plant Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) through cultivation two explants end buds and node with various cocentrations activated charcoal and hormones BAP and Kn.

نویسندگان [English]

  • Bahareh Shaafi 1
  • Seyed Saeed Mousavi 2
  • saeed ghambarali bagheney 1
  • Mohammad Reza Abdollahi 3
  • hasan sarikhani 4

1 M.Sc. Student of Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran

2 Assistant Professor of Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.

3 Faculty of Agriculture, Bu Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.

4 Faculty of Agriculture, Bu Ali Sina University, Hamedan, I.R. of Iran.

چکیده [English]

Stevia rebaudiana Bertoni is from the dark Composite perennial plant, herbaceous and pollinator. Due to the being below seed germination perecentage and heterogenous multiplication of plants from seed in terms of sweetness micropropagation of this plant with use of tissue culture methods in order to replicate mass is desirable. In this study, the performance of two explant end bud and node using three treatments the concentration of the medium MS and different levels of activated charcoal and hormones BAP and Kn in two experiment compared and reviewed. So that in the first experiment the effect of active charcoal and concentration of culture media MS and in the second experiment use separate concentrations (at 0,0/5,1 and 1/5mgr/l) of hormones BAP and Kn in three repeat was implemented. Results showed the highest increase traits in the cultivation of end buds at full concentration seen of culture medium MS with to 1/5gr/l activated charcoal as absorber substance phenols. Use concentration 1/5 mgr/l of hormones BAP and Kn showed an increase in micropropagation efficiency of both explants. Performance comparison hormones BAP and Kn using 1/5 mgr/l BAP in the cultivation of the end buds showed the most characteristics of shoot length, number of nodes and the number of lateral stems.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Stevia
  • activated charcoal
  • BAP
  • Kn

ریز ازدیادی گیاه دارویی استویا (Stevia rebaudiana Berton) از طریق کشت دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره به همراه غلظتهای مختلف زغال فعال و هورمونهای BAP و Kn

بهاره شعفی1، سیدسعیدموسوی1*، سعید قمبرعلی باغنی1، محمدرضا عبداللهی1 و حسن ساریخانی2

1 ایران،همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

2 ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

تاریخ دریافت: 8/5/96                  تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

استویا با نام علمی Stevia rebaudiana Bertoni از تیره Composite گیاهی چند­ساله، علفی و دگر­گرده­افشان می­باشد. با توجه به پایین بودن در­صد جوانه­زنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از بذور از نظر میزان شیرینی، ریز­ازدیادی این گیاه با استفاده از روشهای کشت بافت به منظور تکثیر انبوه مطلوب می­باشد. در این مطالعه عملکرد دو ریز­نمونه جوانه­ انتهایی و گره با استفاده از سه تیمار غلظت محیط کشت MS ، سطوح مختلف زغال فعال و هورمونهایBAP وKn در دو آزمایش مقایسه و بررسی گردید. به طوری که در آزمایش اول اثر زغال فعال وغلظت محیط کشت MS و در آزمایش دوم استفاده از غلظتهای جداگانه (0، 5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر) از هورمونهای BAP وKn در سه تکرار اجرا گردید. نتایج نشان داد بیشترین میزان افزایش صفات در کشت جوانه­های انتهایی در غلظت کامل محیط کشت MS به همراه 5/1 گرم­ در لیتر زغال فعال به عنوان ماده جاذب فنولها مشاهده گردید. استفاده از غلظت 5/1 میلی­گرم در لیتر از هورمونهای BAP وKn تأثیر معنی­داری را بر افزایش راندمان ریز­ازدیادی هر دو نوع ریز­نمونه نشان داد. در مقایسه عملکرد هورمونهای BAP وKn استفاده از 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP در کشت جوانه­های انتهایی بیشترین میزان صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی را نشان داد.

واژه های کلیدی: ریزازدیادی، استویا، زغال فعال ،BAP، Kn

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188526940، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

استویا گیاهی دارویی، قندی، با عدد کروموزومی(2n=22) متعلق به خانوادهAsteraceaeمی­باشد که برگهای آن حاوی گلیکوزید دیترپن ( شامل استویوزاید­ وربودیوزاید)، فاقدکالری، غیرسمی و خیلی ­شیرین است (18). شیرینی قند این گیاه حدود ۲۵۰ تا ۳۰۰ برابر دیگر گیاهان قندی مانند نیشکر و چغندر قند بوده و میزان قند موجود در آن ۱۵۰ برابر می­باشد به طوری که این قند می­تواند جایگزین مناسب برای شیرین­کننده­های مصنوعی نظیر آسپارتام ، سدیم ساخارین و سیکلامات باشد (24). ازدیاد انبوه گیاه در شرایط درون شیشه­ای علاوه بر افزایش راندمان تولید در سطح وسیع، زمان و فضای محدودتر امکان حفظ و نگهداری ژرم پلاسم گیاهان با­ ارزش را نیز میسر می­نماید (38 و 48). بنابراین دستیابی به یک پروتکل مناسب به منظور بهینه نمودن شرایط کشت نمونه­ها می­تواند سبب افزایش راندمان تولید گیاهچه­ها گردد، به طوری که با توجه به خود­ناسازگاری، پایین بودن در­صد جوانه­زنی بذر و ناهمگنی گیاهان تکثیر یافته از طریق بذور مطالعه بر روی فاکتورهای مؤثر بر رشد نمونه­ها می­تواند یک راهکار مناسب باشد (33). با توجه به مطالعات انجام شده مؤثرترین فاکتور­ها بر افزایش راندمان ریزازدیادی گیاهان ژنوتیپ، نوع ریز­نمونه، سن گیاهچه­، محیط­کشت و نوع و غلظت تنظیم کننده­های رشد است. دو عامل نوع ریز­نمونه وتنظیم کننده رشد از عوامل بسیار تأثیرگذار بر موفقیت و افزایش سرعت ریزازدیادی می­باشند (41 و 50). در بسیاری از مشاهدات جوانه­های انتهایی به دلیل فعالیتهای میتوزی بیشتر نسبت به جوانه­های جانبی که در معرض غالبیت انتهایی قرار دارند از پتانسیل عملکرد بالاتری به منظور ریزازدیادی برخوردارند (12 و 53). امروزه ریزازدیادی گیاه دارویی استویا توسط محققان بر روی ریز­نمونه­های مختلف نظیر، قطعات گره، میترا و همکاران (26)، سینگ و همکاران (43) و سیوارام و همکاران (45)، قطعات میان­گره، احمد و همکاران(7)، سایرکار و همکاران (39)، تیاقاراجان و همکاران (51) و یودین و همکاران (52)، برگ علی و همکاران(9) و جوانه­های ساقه آنباژنگان و همکاران(11) و داس و همکاران (14) گزارش شده است. استفاده مناسب از پتانسیلهای کشت بافت می­تواند بازده بالای تولید را در کنار صرفه اقتصادی به همراه داشته باشد طوری­که مطالعه بر روی غلظتهای مختلف محیط کشت و هورمونها با توجه به تفاوت گیاهان از نظر پاسخ به شرایط کشت درون شیشه­ای از مراحل مهم ریزازدیادی گیاهان دارویی محسوب می­گردد. با توجه به اینکه کاهش عملکرد رشد گیاهچه­ها در غلظتهای تقلیل یافته محیط کشت به دلیل کاهش نسبتهای نیترات می­باشند در صورت عدم تفاوت معنی­دار بر افزایش بیوماس گیاهچه­ها استفاده از محیطهای MS با نمکهای تقلیل یافته نسبت به محیط MS کامل ارجحیت داشته و مقرون به صرفه می­باشند (15 و 21). زغال فعال به عنوان یک آنتی اکسیدان مؤثر با داشتن سطح صاف و شبکه وسیع از منافذ ، با کاهش پدیده قهوه­ای شدن ریز نمونه­ها و تیره نمودن محیط کشت قدرت جذب ترکیبات در محیط کشت را افزایش داده و سبب بهبود باززایی درون شیشه­ای گیاهان می­گردد (6 و 33). استفاده از هورمونهای سیتوکنین با ایجاد تورم در بافتها، تحریک نمو جوانه­های جانبی نا به جا، تحریک تقسیم، افزایش تعداد و طول نوساقه­ها فاکتور­های مؤثری بر افزایش راندمان ریزازدیادی ریز­نمونه­ها در شرایط درون شیشه­ای می­باشند (10). در این پژوهش تأثیر دو سیتوکنین BAP و Kn با توجه به راندمان بالای آنها بر افزایش پتانسیل نمونه­ها در گیاه استویا در مقایسه با سایر سیتوکنینها بررسی گردید. با توجه به اینکه استفاده از ترکیب BAP و Kn می­تواند با افزایش تعداد ساقه­جانبی و جذب مواد مغذی محیط کشت سبب کاهش صفت طول ساقه­چه گردد در این پژوهش به طور جداگانه سطوح مختلف هورمونها بررسی گردید (20). در این پژوهش برای اولین بار درکشورپتانسیل جوانه­های انتهایی و گره با استفاده از سطوح مختلف زغال فعال و ترکیبات جداگانه BAP و Kn درمحیط کشت MS بررسی گردید. هدف از این پژوهش ارزیابی مقایسه عملکرد ریز­نمونه گره و جوانه انتهایی با اعمال تیمار­های مؤثر بر کشت درون شیشه­ای بود به طوری که ضمن تعیین سطوح برتر هریک از تیمار­ها بهترین ریز­نمونه نیز تعیین گردد.

مواد و روشها

گیاهچه­های مورد استفاده در این پژوهش از نوع گیاهچه­های استویا ریبودیانا برتونی بودند که از شرکت گلساران گرگان تهیه گردیدند. این پژوهش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام گرفت. وسایلی از قبیل استوانه مدرج، بشر، ظروف شیشه­ای درب دار، پنس، اسکارپر، پیپت، پیست، هودلامینار، pH متر، کاغذ صافی و ..... در این تحقیق استفاده گردید. تمامی وسایل شیشه­ای و فلزی و همچنین محیط کشتها قبل از استفاده در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 2/1 بار به مدت 20 دقیقه سترون شده و سپس به زیر هود لامینار منتقل شدند. حدود دو ساعت قبل از کشت، لامینار را روشن کرده و با الکل 96 درصد محیط داخل آن را سترون کرده و 30 دقیقه قبل از کشت لامپ uv زیر لامینار روشن گردید. به منظور ضدعفونی ریزنمونه­ها پس از شستشوی گیاهچه­ها به مدت 15 دقیقه، ریز نمونه­ها به مدت 1 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند و پس از شستشو با آب استریل، به مدت 10 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 20 درصد قرار گرفته و پس از آن 3 مرتبه (هر بار 3 دقیقه) با آب استریل شستشو شدند. پس از ضد عفونی وجدا کردن برگها، ریز­نمونه­های جوانه انتهایی وتک­گره به طول 15 الی 20 میلی­متر تهیه شده و به طور عمودی و با استفاده از پنس بر روی محیط کشت استقرار یافتند. نمونه­ها نیز به اتاقک رشد با شدت نور 2000 لوکس با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آزمایش اول به صورت فاکتوریل 2×2×4در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید. به طوری که چهار سطح مختلف زغال فعال (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) به عنوان فاکتور اول، دو نوع محیط کشت (MS و MS2/1) به عنوان فاکتور دوم و دو نوع ریز­نمونه (جوانه انتهایی و تک گره) به عنوان فاکتور سوم در نظر گرفته شدند. آزمایش دوم به منظور بررسی استفاده جداگانه از هورمونهای BAP و Kn بر صفات ساقه­زایی به صورت فاکتوریل 2×4در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گردید. در این آزمایش تمامی غلظتهای هورمون BAP و Kn به طور جداگانه به محیط کشت پایه MS اضافه گردیدند. چهار سطح مختلف از غلظت BAP (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) و Kn (0، 5/0، 1، 5/1 گرم در لیتر) به عنوان فاکتور­های اول و دو سطح نوع ریز­نمونه به عنوان فاکتور­های دوم به صورت مستقل از هم در نظر گرفته شدند. محیط کشت پایه MS (30) حاوی غلظتهای استاندارد نمکها به همراه 100 میلی­گرم میواینوزیتول، و30 گرم ساکارز به عنوان منبع کربوهیدرات و 8 گرم در لیتر آگار برای جامد کردن محیط کشت استفاده شد که pH برابر 7/5 تنظیم شده بود. برای تهیه محیط کشت MS2/1 تمام مواد مصرفی در محیط MS به نسبت 2/1 کاهش یافت. تجزیه آماری داده­ها پس از بررسی نرمال بودن باقیمانده آنها انجام شد و مقایسه میانگین داده­ها توسط آزمون دانکن (16) در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. به منظور تجزیه و تحلیل داده­ها و رسم نمودارها از نرم افزار­های SAS و Excel استفاده گردید.

نتایج

نتایج تجزیه واریانس برای صفت طول ساقه اختلاف معنی­داری را در سطح 0001/0 برای نوع ریزنمونه، محیط کشت و غلظت زغال فعال نشان داد. اثر متقابل نوع ریزنمونه در محیط کشت و اثر متقابل محیط کشت در غلظت زغال فعال در سطح 5 در­صد معنی­دار بوده است. مشاهدات نشان دهنده این موضوع است که سه عامل نوع ریزنمونه، محیط کشت و سطوح مختلف زغال فعال سه فاکتور بسیار مؤثر بر افزایش صفت طول ساقه بودند. اثر متقابل نوع ریز نمونه در غلظت زغال فعال و همچنین اثرات سه­گانه نوع­ریزنمونه در غلظت محیط کشت MS در غلظت زغال فعال معنی­دار نبوده که این مشاهده بیانگر این موضوع می­باشد که فاکتور­ها مستقل از هم عمل نمودند (جدول1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد کشت جوانه انتهایی در محیط کشت MS بیشترین میزان طول ساقه (32/0±37/6 سانتیمتر) و تعداد برگچه (87/0±75/15) را ایجاد کرد. همچنین کشت گره در محیط MS 2/1 منجر به کمترین میزان رشد ساقه­چه (32/0±22/4 سانتیمتر) و تعداد برگچه (87/0±33/13) گردید (جدول2). در رابطه با اثر محیط کشت و غلظت زغال فعال بیشترین میزن طول ساقه (32/0±16/8 سانتیمتر) در غلظت کامل محیط کشتMS به همراه استفاده از 5/1 گرم­ در لیتر زغال فعال مشاهده گردید. کمترین میزان طول ساقه­چه( 32/0±91/2 سانتیمتر) در محیط MS 2/1 در غلظت 0 (شاهد) زغال فعال مشاهده گردید که این موضوع نشان دهنده تأثیر معنی­دار استفاده از زغال فعال بر افزایش طول ساقه­چه می‍باشد (شکل های 1، 2 و جدول3).

 

جدول1- تجزیه واریانس اثر نوع ریز­نمونه، محیط کشت و غلظت زغال فعال بر ریزازدیادی گیاه استویا

                                                                                درجه آزادی و میانگین مربعات

منبع تغییر

درجه آزادی

طول ساقه

تعداد برگچه

طول ریشه

تعدا شاخه جانبی

نوع ریز نمونه

1

***0027/0

***0016/0

*** 0333/0

***0020/0

محیط کشت

1

***0148/0

***0015/0

**0154/0

***0055/0

غلظت زغال فعال

3

***0164/0

***0152/0

***3486/0

***0163/0

نوع ریزنمونه * محیط کشت

1

*0003/0

*0004/0

 ns0012/0

ns0000/0

نوع ریزنمونه *غلظت زغال فعال

3

ns0000/0

*0003/0

 ns0022/0

**0007/0

محیط کشت * غلظت زغال فعال

3

*0002/0

ns0000/0

 ns0004/0

ns0002/0

نوع ریزنمونه * محیط کشت * غلظت زغال فعال

3

ns000/0

ns0000/0

 ns0019/0

ns0000/0

خظای آزمایشی

32

0000/0

0000/0

0018/0

0001/0

ضریب تغییرات(%)

 

6693/0

6156/0

2542/4

0444/1

*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری می­باشد.

جدول2- تأثیر نوع ریزنمونه و غلظت محیط کشت MS بر صفات طول ساقه و تعداد برگچه

نوع ریز نمونه

محیط کشت

طول ساقه

تعداد برگچه

تک گره

MS

32/0± b35/5

87/0± c45/13

MS2/1

32/0±d22/4

87/0± d33/13

جوانه انتهایی

MS

32/0±a37/6

87/0±a75/15

MS2/1

32/0± c59/4

87/0± b75/13

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

شکل1- رشد گیاهچه­ها در محیط حاوی 5/0 گرم در لیتر زغال فعال (a) محیط حاوی 1 گرم در لیتر زغال فعال (b) محیط حاوی 5/1 گرم در لیتر زغال فعال (c)

 

شکل2- رشد گیاهچه­ها در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر در لیتر BAP (a) محیط حاوی 1 میلی­گرم در لیتر BAP (b) محیط حاوی 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP(c)

 

جدول 3- تأثیر نوع محیط کشت و غلظت زغال فعال بر صفت طول ساقه

نوع محیط کشت

غلظت زغال فعال

طول ساقه

 

 

 

 

MS

 

 

 

MS 2/1

0

32/0±e41/4

5/0

32/0±d80/4

1

32/0±c08/6

5/1

32/0±a16/8

0

32/0±g91/2

5/0

32/0±f50/3

1

32/0±de63/4

5/1

32/0±b58/6

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

نتایج مقایسه میانگین نشان داد استفاده از 5/1 گرم در لیتر زغال فعال در هر دو ریز­نمونه جوانه انتهایی و گره بیشترین میزان تعداد برگچه به ترتیب (87/0±16/19) و (87/0±23/18) را ایجاد می کند. کشت ریز­نمونه جوانه انتهایی و گره به همراه استفاده از غلظت 5/1 گرم در لیتر زغال فعال بیشترین میزان تعداد ساقه­جانبی به ترتیب (61/0±33/9) و (61/0±33/8) را ایجاد کرد. مشاهدات نشان داد استفاده از زغال فعال در هر دو ریز­نمونه عامل بسیار مؤثری بر افزایش بیوماس گیاهچه­ها بوده و پاسخ جوانه­های انتهایی و گره به افزایش تعداد برگچه و ساقه­جانبی عملکرد مشابه و نزدیک به هم داشته است (جدول 4).کشت جوانه انتهایی در محیط کشت MS و MS 2/1با استفاده از 5/1 گرم در لیتر زغال فعال بیشترین طول ریشه­چه به ترتیب (15/0±13/3 سانتیمتر) و (15/0±93/2 سانتیمتر) را نشان داد. کشت گره نیز در محیط MS 2/1 بیشترین میزان طول ریشه­چه (15/0±43/2 سانتیمتر) را نشان داد. در واقع اضافه نمودن زغال فعال و استفاده از غلظت کامل محیط MS دو عامل بسیار مؤثر بر افزایش طول ریشه­چه­ها بوده که به طور معنی­داری این صفت را نسبت به شاهد افزایش داده است (جدول5).

 

جدول4- تأثیر نوع ریز­نمونه و غلظت زغال فعال بر تعداد برگچه و ساقه جانبی

نوع ریز نمونه

غلظت زغال فعال

تعداد برگچه

تعداد ساقه جانبی

 

تک گره

 

 

 

جوانه انتهایی

0

87/0±e00/9

61/0±e83/3

5/0

87/0±d33/11

61/0±d16/5

1

87/0±b33/15

61/0±b16/7

5/1

87/0±a83/18

61/0±a33/8

0

87/0±d83/10

61/0±d83/4

5/0

87/0±c33/13

61/0±c16/6

1

87/0±b66/15

61/0±b66/6

5/1

87/0±a16/19

61/0±a33/9

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

نتایج این آزمایش افزایش معنی­دار عملکرد جوانه­انتهایی نسبت به گره را نشان داد که این امر نشان دهنده پتانسیل بالای جوانه­انتهایی نسبت به شرایط ریزازدیادی در گیاه دارویی استویا می­باشد. با توجه به عدم غالبیت جوانه انتهایی امکان رشد نمونه در مدت زمان کمتر و بیوماس بالاتر اغلب در شرایط کشت درون شیشه­ای فراهم می­گردد که این امر با مشاهدات حسین و همکاران (19) و مودی و همکاران (29) نیز مطابقت داشت. اما با توجه به امکان تفاوت در گیاهچه­های تکثیر یافته و تیمار­های اعمال شده در کشت ریز­نمونه­ها پاسخ به شرایط کشت بافت و ریزازدیادی می­تواند متفاوت باشد. استفاده از قطعات گره با عملکرد بالا توسط کیسر و همکاران (13)، ماتور و همکاران (25)، مه­تا و همکاران (28) وسینگ و همکاران (44) گزارش شده است.

جدول5- تأثیر نوع ریز­نمونه و محیط کشت بر طول ریشه­چه

نوع ریزنمونه

نوع محیط کشت

غلظت زغال فعال

طول ریشه­چه

 

 

 

تک گره

 

MS

0

15/0±d06/1

5/0

15/0±c26/1

1

15/0±b66/1

5/1

15/0±a06/2

 

MS2/1

0

15/0±d00/1

5/0

15/0±e13/1

1

15/0±b70/1

5/1

15/0±a43/2

 

 

جوانه انتهایی

 

MS

0

15/0±d26/1

5/0

15/0±e43/1

1

15/0±b86/1

5/1

15/0±a13/3

 

MS2/1

0

15/0±d10/1

5/0

15/0±c36/1

1

15/0±b60/1

5/1

15/0±a93/2

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

نتایج تجزیه واریانس برای صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی تفاوت معنی­داری در سطح 0001/0 برای نوع ریز­نمونه و غلظت هورمون BAP نشان داد. اما اثر متقابل نوع ریز­نمونه در غلظت هورمون BAP برای هر سه صفت معنی­دار نبوده و این دو فاکتور مستقل از هم عمل نمودند (جدول6). نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت هورمون Knو نوع ریز­نمونه نیز برای صفات طول ساقه، تعداد گره و تعداد ساقه جانبی اختلاف معنی­دار را نشان داد. اثر متقابل نوع ریز­نمونه در غلظت هورمون Knمعنی­دار نبود و فاکتور­ها مستقل از هم عمل نمودند (جدول7). مقایسه میانگین تیمار کشت ریز­نمونه­ها با استفاده از هورمون BAP ، بیشترین صفات طول ساقه (0036/0±58/9 سانتیمتر)، تعداد گره (027/0±08/6) و تعداد ساقه جانبی(004/0±50/10) را با کشت جوانه­انتهایی نشان داد (جدول8).

 

جدول6- تجزیه واریانس اثرغلظت هورمونBAPو نوع ریز نمونه بر ریزازدیادی گیاه استویا

                                                                                درجه آزادی و میانگین مربعات

منبع تغییر

درجه آزادی

طول ساقه

تعداد گره

تعداد ساقه جانبی

نوع ریزنمونه

1

*** 0022/0

*** 0686/0

*** 0008/0

غلظت هورمون BAP

3

*** 0003/0

*** 0107/0

*** 0003/0

نوع ریز نمونه* غلظت هورمون BAP

3

ns0000/0

ns0000/0

ns0000/0

خظای آزمایشی

16

0000/0

0007/0

0000/0

ضریب تغییرات(%)

 

26/0

03/2

33/0

*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری می­باشد.

جدول7- تجزیه واریانس اثرغلظت هورمونKnونوع ریز نمونه بر روی ریزازدیادی گیاه استویا

                                                                                درجه آزادی و میانگین مربعات

منبع تغییر

درجه آزادی

طول ساقه جانبی

تعداد گره

تعداد ساقه

نوع ریزنمونه

1

*** 0021/0

*** 0600/0

*** 0008/0

غلظت هورمون Kn

3

**0001/0

*** 0156/0

*0001/0

نوع ریز نمونه* غلظت هورمون Kn

3

ns0000/0

ns0014/0

ns0000/0

خظای آزمایشی

16

0000/0

0017/0

0000/0

ضریب تغییرات(%)

 

26/0

19/3

39/0

*** ، ** ، *: به ترتیب نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح 001/0، 01/0 ، 05/0 ns عدم اختلاف معنی دار آماری می­باشد.

جدول8- تأثیر نوع ریز نمونه با استفاده از هورمون BAP بر صفات رویشی ساقه در استویا

نوع ریزنمونه

طول ساقه

تعداد گره

تعدادشاخه جانبی

جوانه انتهایی

0036/0±a58/9

027/0±a08/6

004/0±a50/10

گره

0036/0±b04/8

027/0±b50/3

004/0±b33/9

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

مقایسه میانگین تیمار کشت ریز­نمونه­ها با استفاده از هورمون Kn نیز بیشترین صفات طول ساقه (0038/0±20/9 سانتیمتر) تعداد گره (041/0±50/4) و تعداد ساقه جانبی(005/0±10) را با کشت جوانه­انتهایی نشان داد (جدول9). این مشاهده در واقع بیانگر این موضوع است که جوانه انتهایی پتانسیل بالاتری را در مقایسه با قطعات گره به ریزازدیادی داشته است. استفاده از 5/1 میلی­گرم در لیترBAP تفاوت معنی­داری را بر افزایش صفات رویشی ریز­نمونه­ها نسبت به شاهد و سایر غلظتها نشان داد به طوری­که بیشترین صفات طول ساقه (0036/0±66/9 سانتیمتر)، تعداد گره (027/0±16/6) و تعداد ساقه جانبی(004/0±83/10) مشاهده گردید (جدول10). مقایسه میانگین سطوح مختلف غلظت هورمون Kn بیشترین صفات طول­ساقه(0038/0±/9 سانتیمتر)، تعداد گره(041/0±66/4) و تعداد ساقه جانبی(005/0±16/10) را با استفاده از غلظت 5/1 میلی­گرم در لیترنشان داد (جدول11).


 

جدول9- تأثیر نوع ریز نمونه با استفاده از هورمون Kn بر صفات رویشی ساقه در استویا

نوع ریزنمونه

طول ساقه

تعداد گره

تعدادشاخه جانبی

جوانه انتهایی

0038/0±a20/9

041/0±a50/4

005/0±a10

گره

0038/0±b83/7

041/0±b08/3

005/0±b91/8

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

جدول10- تأثیر غلظت هورمون BAP بر صفات رویشی ساقه در استویا

غلظت هورمون BAP

طول ساقه

تعداد گره

تعداد شاخه جانبی

0

0036/0±d25/8

027/0±d66/3

004/0±d16/9

5/0

0036/0±c50/8

027/0±c33/4

004/0±c50/9

1

0036/0±b83/8

027/0±b16/5

004/0±b16/10

5/1

0036/0±a66/9

027/0±a16/6

004/0±a83/10

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

جدول11- تأثیر غلظت هورمون Kn برصفات رویشی ساقه در استویا

غلظت هورمون Kn

طول ساقه

تعداد گره

تعداد شاخه جانبی

0

0038/0±d25/8

041/0±d3

005/0±c16/9

5/0

0038/0±c33/8

041/0±c50/3

005/0±c16/9

1

0038/0±b50/8

041/0±b50/4

005/0±b50/9

5/1

0038/0±a9

041/0±a66/4

005/0±a16/10

*اعداد موجود در هر ستون که دارای حروف مشابه هستند، تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

 

شکل3- رشد گیاهچه­ها در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر در لیتر Kn (a) محیط حاوی 1 میلی­گرم در لیتر Kn (b) محیط حاوی 5/1 میلی­گرم در لیتر Kn(c)


بحث

انتخاب فاکتور­ها و تعیین سطح مناسب هر کدام در کشت بافت گیاهی اولین اقدام مهم در افزایش بازده اقتصادی و بیوماس گیاهچه­ها می­باشد. استفاده از ریزنمونه­های مناسب با توجه به نوع گیاه و شرایط فیزیولوژی آن با کشت در محیط مناسب حاوی عناصر غذایی مورد نیاز می­تواند مهمترین عامل در دستیابی به پروتکل مناسب باشد. در بسیاری از مطالعات استفاده از غلظتهای کامل محیط کشت MSموفقیت آمیز بوده است اما در مواردی نیز استفاده از غلظتهای تقلیل یافته نیز تفاوت معنی­داری را نداشته و استفاده از آنها مقرون به صرفه بوده به طوری که امکان کشت موفق نمونه­ها در غلظتهای تقلیل یافته MS نیز امکان پذیر بوده است (35). درآزمایش اول برای اولین بار مقایسه پتانسیلهای دو ریزنمونه جوانه انتهایی و گره در جذب عناصر غذایی از محیط کشت MS به همراه استفاده از زغال فعال به عنوان عامل مؤثر در کاهش فنولها و افزایش قدرت جذب نمونه­ها انجام گردید. درواقع زغال فعال با تیره نمودن محیط کشت و جذب عناصر فنولی رشد گیاهچه­ها را نسبت به شاهد به طور معنی­داری افزایش داد. در این مطالعه استفاده از زغال فعال و غلظت محیط کشت MS تفاوت معنی­داری را در دو ریز­نمونه جوانه انتهایی و گره نشان داد. به طوری که کشت جوانه­های انتهایی در محیط کشت MS به همراه استفاده از 5/1 میلی­گرم در لیترزغال فعال نسبت به شاهد بیشترین تأثیر معنی­دار را بر افزایش بیوماس گیاهچه­ها را نشان داد. پاوار و همکاران (32)، رانگانتان و همکاران (35) کشت قطعات گره را در غلظت کامل محیط کشت MS در مقایسه با غلظتهای تقلیل یافته مناسب گزارش کردند که با نتایج این آزمایش نیزمطابقت داشت. داس و همکاران (14) و کاویتا و همکاران (22) برتری عملکرد کشت جوانه انتهایی گیاه استویا را در محیط MS 2/1 گزارش کردند. مهری­زاده و همکاران (5) بیشترین طول ساقه و تعداد برگچه را در کشت جوانه انتهایی استویا در محیط کشت MS حاوی 5/1 گرم در لیتر زغال فعال گزارش کردند که با نتایج حاصل از این آزمایش نیزمطابقت داشت. در واقع با توجه به اینکه ریزنمونه­ها پس از قرار­گیری بر روی محیط کشت اغلب به دلیل تنشهای اعمال شده به گیاه و آسیب به بافت مقادیر فراوانی مواد فنولی آزاد می­کنند افزودن سطوح مناسبی از زغال فعال به محیط کشت با جذب اتیلن و کاهش اثر فنولهای اکسید شده سبب بهبود صفات رشدی گیاهچه­ها گردیده است (16 و 27). مودی و همکاران (29) بیشترین طول ریشه­چه (71/0±9/10 سانتیمتر) و 100 در­صد ریشه­زایی در کشت جوانه­های جانبی و انتهایی استویا را با استفاده از ppm100 زغال فعال در غلظت کامل محیط کشت MS گزارش کردند. سینگ و همکاران (44) بیشترین افزایش تعداد ریشه­چه (40/0±0/11) و طول ریشه­چه (19/0±62/4 سانتیمتر) را با کشت قطعات گره گیاه دارویی استویا را با اضافه نمودن 50 میلی­گرم در لیتر زغال فعال به محیط MS 4/1 گزارش کردند. اطراشی و همکاران (2) افزایش ریشه­زایی و رشد گیاهچه­های حاصل از کشت ریز­نمونه­های فلفل دلمه­ایCapsicumannuum L).) را با استفاده از زغال فعال4/0 در محیط کشت MS گزارش کردند، به­طوری که 70 تا 90 گیاهچه­های انتقال یافته به گلخانه سازگار و رشد مطلوبی را داشتند. زبرجدی و همکاران (3) پاسخ متفاوت ریزنمونه­های هیپوکوتیل و کوتیلدون را در ریزازدیادی گیاه دارویی سرخارگل گزارش کردند. استفاده از تنظیم کننده­های رشد در غلظتهای مناسب می­تواند مؤثرترین عامل بر افزایش سرعت ازدیاد بیوماس نمونه­های گیاهی باشد (31). در این پژوهش با توجه به پاسخ مناسب ریز­نمونه­ها در گیاه استویا به ریشه­زایی و رشد مطلوب ریز­نمونه­ها و تأثیر هورمونهای اکسین بر کاهش متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار نگرفت (10). در مطالعات انجام شده در استویا و سایر گیاهان اغلب استفاده از دو سیتوکنین BAP و Kn نسبت به بقیه عملکرد برتری را نشان دادند. در مقایسه دو سیتوکنین فوق نتایج نشان داد استفاده از هورمون BAP بازده بیشتری را بر ریزازدیادی ریز­نمونه­ها داشته است. میرزایی اصل و همکاران (4) افزایش ظرفیت باززایی نوساقه نا به جا ریز­نمونه­های برگی چغندر­قند را در غلظت 1 میلی­گرم در لیتر BAP، احمدی و همکاران (1) 87 در­صد ساقه­زایی با استفاده از 1/0 میلی­گرم در لیتر BAP گیاه دارویی پروانش را گزارش کردند. مدنی و همکاران (6) نیز بیشتری میزان ریزازدیادی کشت جوانه­های انتهایی را با استفاده از 2 میلی­گرم در لیتر BAP در توت فرنگی رقم سلوا گزارش کردند. ترکیب BAP با سایر سیتوکنینها اغلب با افزایش تعداد ساقه­های جانبی باعث کاهش رشد طولی ساقه­چه­ گردیده است. اسریدهار و همکاران (47) کاهش معنی­دار طول ساقه­چه استویا را در ترکیب 2 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر Kn گزارش کردند. استفاده ازKn به صورت ترکیب با BAP اغلب در غلظتهای بالا بازده بیشتری را نشان داده است که با توجه به هزینه­های تولید مقرون به صرفه نمی­باشد بنابراین بررسی تأثیر استفاده ازسطوح مختلف به صورت جداگانه بر عملکرد نمونه­ها کارآیی بهتری را نشان می­دهد سینگ و همکاران (42) ،سیلوا و همکاران (46). بیشترین راندمان ازدیاد گیاهچه­های استویا در مطالعات علی و همکاران (9) در غلظت 25/0 میلی­گرم در لیتر هورمون Kn و 1 میلی­گرم در لیتر BAP و لاریبی و همکاران (23) استفاده از غلظت 1 میلی­گرم در لیتر BAP را سطوح برتر معرفی کردند. در سایر مطالعات انجام شده در بررسی تأثیر استفاده از تنظیم کننده­های رشد بر افزایش صفات بیوماس ریز­نمونه­ها در گیاه دارویی استویا نیز نتایج متعددی گزارش شده است. مودی و همکاران (29) استفاده از 2 میلی­گرم در لیتر Kn و 1 میلی­گرم در لیتر BAP را بیشترین طول ساقه­چه (11/0±46/3 سانتیمتر) و تعداد گره (89/0±6/3) ، کاویتا و همکاران (21) بیشترین تعداد ساقه جانبی (68/0±6/12)در غلظت 3 میلی­گرم در لیتر Kn و تیواری و همکاران (50) افزایش صفات ساقه­زایی در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر BAP در کشت قطعات گره، مه­تا و همکاران (28) بیشترین ساقه­زایی و تعداد ساقه جانبی (58/0±42/3) در غلظت 2 میلی­گرم در لیتر BAP و 2 میلی­گرم در لیتر Kn در کشت جوانه انتهایی گزارش کردند. رازاک و همکاران (35) بیشترین ساقه­زایی قطعات گره را در محیط کشت MS در ترکیب 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و 25/0 میلی­گرم در لیتر Kn مشاهده کردند. نتایج به دست آمده از این پژوهش برای اولین بار عملکرد جوانه­های انتهایی و گره را با استفاده از غلظت محیط کشتMS و زغال فعال و نیز تأثیر افزایش بیوماس گیاهچه­ها با استفاده از هورمونهای BAP و Kn مورد بررسی قرار داد. کشت جوانه­انتهایی در غلظت کامل نمکهایMS و 5/1 گرم­در لیتر زغال فعال و 5/1 میلی­گرم در لیترBAP بهترین سطوح تیماری بودند. با توجه به اینکه یکی از اهداف مهم ریزازدیادی استویا استخراج متابولیتهای ثانویه است، افزایش سرعت رشد نمونه­ها و امکان تهیه متابولیتهای ثانویه از بخش ریشه می­تواند راهکار مؤثری در تولید و بهره­وری از این گیاه دارویی باشد. با توجه به ریشه زایی مناسب ریزنمونه­های استویا در محیط کشت و تولید ریشه­چه­های انبوه، استفاده از زغال فعال با تاریک نمودن محیط کشت و ممانعت از آزاد شدن ترکیبات فنولی باعث افزایش قدرت رشد ساقه­چه و استحکام آن به طور معنی­داری نسبت به شاهد گردید که پایداری آن نیز پس از انتقال به شرایط گلخانه­ای نیز مشاهده شد به طوری که 70 درصد توانایی سازگاری را نشان دادند. برتری استفاده از هورمون  BAPبر افزایش بازده ریزازدیادی استویا در مطالعات احمد و همکاران (8)، طالعی و همکاران (49)، شتناوی و همکاران (40) ، تیاگاراژان و همکاران (51) ، راشل و همکاران (37) گزارش شده که با نتایج این آزمایش نیز مطابقت داشت. در مطالعات بعدی می­توان تأثیر تغییرات احتمالی متابولیتهای ثانویه را در استفاده از تیمارهای مختلف نیز بررسی کرد. به طوری­که علاوه بر افزایش بازده تولید گیاهچه­ها از طریق کشت درون شیشه­ای متابولیتهای ثانویه در اندامهای هدف به ویژه برگ، ثابت و یا به طور معنی­داری افزایش یابند تا به منظور تولید تجاری استویا در سطح وسیع نتایج قابل تعمیم باشند.

1- احمدی، ج، محمدی ر، و گروسی ق. 1393. ریزازدیادی درون شیشه­ای گیاه دارویی پروانش (Catharanthus roseus) از طریق اندام­زایی ساقه. مجله پژوهش­های سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 27. شماره1. ص: 25-14.
2- اطراشی، م و مرادی،ک. 1393. بررسی کالوس زائی و اندام زائی غیر مستقیم گیاه فلفل دلمه­ای (Capsicum annuum L.) در شرایط کشت درون شیشه­ای. مجله پژ وهش­های گیاهی.دوره 27. شماره3. ص: 355-346.
3- زبرجدی ع، معتمدی م، طراوت ا، اسماعیلی ا. 1393. ریزازدیادی گیاه دارویی سرخارگل(Echinacea purpurea L.) با استفاده از قطعات کوتیلدون و هیپوکوتیل، مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 2. شماره3. ص: 319-311.  
4- میرزایی اصل، الف، هاتف سلمانیان ع، و جلال جوران، م. 1388. بررسی اثر پیش تیمار­های هورمونی و ژنوتیپ در تشکیل نوساقه­های نا به جا مستقیم روی برگ چغندرقند (Beta vulgaris) در شرایط درون شیشه­ای. مجله زیست شناسی ایران. جلد 22. شماره 4. صفحات 722-719.
5- مهری­زاده و، باغبان کهنه­ورز، ب ، دورانی الف. 1392. بررسی اثر زغال فعال در ریزازدیادی گیاه استویا (Stevia rebaudiana Bertoni) . اولین همایش سراسری کشاورزی و منابع طبیعی.
6- مدنی، قبادی س، سید طباطبایی، الف، طالبیم، یامچی، و. 1392. اثر تنظیم کننده­های رشد و انواع ریز­نمونه بر باززایی و ریزازدیادی توت فرنگی تجاری رقم سلوا . (Fragariax ananassa cv. Selva) علوم و فنون کشت­های گلخانه­ای. سال چهارم، شماره پانزدهم.
 
7- Ahmed MB, Salahin M, Karim R, Razvy MA, Hannan MM,Sultana R,Hossain M, Islam R. 2007. An efficient method for in vitro clonal propagation of newly introduction sweetener from plant Stevia rebaudiana Bertoni in Bangladesh. AM-Eurasian J Sci Res 2(2): 121-125.
8- Ahmed N, Fazal H, Zamir R, Khalil SA, Abbasi BH. 2011a. Callogenesis and shoot organogenesis from flowers of Stevia rebaudiana (Bert). C.R. Biol. 336, 486-492.
9- Ali A, Gull I,Naz S. 2010. Biochemical investigation during different stages of invitro propagation of Stevia rebaudiana. Pakj Bot 42(4): 2827-2837.
10- Aman N., Hadi F, Khalil SA, Zamir R, Ahmad N. 2013. Efficient regeneration for enhanced steviol glycosides production Stevia rebaudiana (Bertoni). C.R. Biol 336, 486-492.
11-AnbazahaganM,Kalpana M, Rajendran R, Natarajan V, Dhanavel D. 2010. In vitro production of Stevia rebaudiana Bertoni. Emirates J Food Agric, 22(3): 216-222.
12-Bano R, Haroon Khan M, Sher Khan R, Rashid H, Swati ZA. 2010. Development of an efficient regeneration protocol for three genotypes of Brassica juncea. Pakistan Journal of Botany 42: 963-969.
13-Ceasar SA, Maxwell SL, Prasad KB, Karthigan M, Ignacimuthu S. 2010. Highly efficient shoot regeneration of Bacopa monnieri (L.) using a two stage culture procedure and assessment of genetic integrity of micropropagated plants by RAPD. Acta Physiol Plant, 32:443-452.
14-Das A, Gantait S, Mandal N. 2011. Micropropagation of an elite medicinal plant: Stevia rebaudiana Bert. Int J Agric Res 6: 40-48.
15-Danesh YR, Gotapeh EM, Alizadeh A, Sanavy MM. 2006. Optimizing carrot hairy root production for monoxenic culture of arbuscular mycorrhizal fungi in Iran. J Biol Sci, 6: 87-91.
16-Dennis TT. 2008. The role of activated charcoal in plant tissue culture. Biotechnology Advances, 26: 618-631.
17-Duncan, D.B. 1955. Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11:1-42.
18-Goyal S.K, Samsher L, and Goyal R.K. 2010. Stevia (Stevia rebaudiana L.) a bio-sweetener: a review. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 61: 1-10.
19-Hossain, M. A., A. H. M. Shamim, T. A. J. Kabir and M. N. Hasan. 2008. Micropropagation of Stevia. Inter. J. Sustainable Crop Prod. 3(4): 1-9.
20-Huy NT and TT Xan-Mai 2014. Investigation of effective in vitro propagation Media for Stevia rebaudiana Bertoni. KKU Research Journal, 19: 172-180.
21-Jagatheeswari D, and Ranganthan P. 2012. Studies on micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni. International Journal of Pharmaceutical and Biological Archives, 3: 315-320.
22-Kavitha MS, EG Wesely and P Meha lingam. 2012. Direct multiple shoot regeneration from shoot tip and nodal explant of Solanum Nigrum L.A Medicinal Herb. Journal of Ornamental and Hort Cultural Plants, 2: 65-72.
23-Laribi, B., N. Rouatbi, K. Kouki, and T.Bettaieb, 2010. In vitro propagation of Stevia rebaudiana (Bert.)-Anou-Caloric sweetener and antidiabetic medicinal plant. International Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 2: 333-339.
24-Lorenzo, C, Serrano-Diaz, J, Plaza, M, Quintanilla, C, Alonso, G. 2014. Fast methology of analyzing major Steviol glycosides from Stevia rebaudiana leaves. Food chemistry. 157, 518-523.
25-Mathur M and T Begum. 2015. Shoot lets regeneration and tissue culture studies on Stevia rebaudiana Bertoni and terminalia belleric Roxb. International Journal of Recent Biotechnology, 3: 25-35.
26-Mitra A, Pal A. 2007. In vitro regeneration of Stevia rebaudiana Bert from nodal explants. J Plant Biotechnol 16: 59-62.
27-Mirniam A, Roshandel P, Otroshi M, Ebrahimi M. 2013. A novel protocol for Stevia rebaudiana Bert regeneration. Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 7(4): 15-22.
28-Mehta J, Sain M, Sharma DR, Gehlot P, Sharma P, Dhaker JK. 2010. Micropropagation of an anti diabetic plant Stevia rebaudiana Bertoni (natural sweetener) in Hadoti region of South-east Rajasthan, India. ICCA J Biol Sci, 1(3):37-42.
29-Modi AR, Patil G, Kumar N, Singh AS, Subhash N. 2012. A simple and efficient in vitro mass multiplication procedure for Stevia rebaudiana Bertoni and analysis of genetic fidelity of in vitro raised plants through RAPD. Suger Tech, doi: 10.1007/s 12355-012-0169-6.
30-Murashige T, Skooge F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-494.
31-Papry M, Ahsan SM and Shahriyar S. 2015. In vitro regeneration protocol development via callus formation from stem explant of tomato. Asian J Med Biol Res, 1: 589-599.
32-Pawar SV, VG Khandagale, VM Jambhale, AS Jadhav and BD Pawar. 2015. In vitro regeneration studies in Stevia through nodal segment and shoot tip. The Bioscan, 10: 1007-1010.
33-Pan, M.J. and Van Staden, J. 2004. The use of charcoal in vitro culture, a review. Plant Growth Regulation, 26: 155-163.
34-Razak UNAA, OC Boon, VT Sing and LL Kiaw. 2014. In vitro micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni in Malaysia Chong Boon ong. Brazilian Archives of Biology and Technology, 57: 23-28.
35-Ranganthan ,J. 2012. Studies on micropropagation of Stevia rebaudiana. Int J Pharmacol Biol Arch, 3(2): 315-320.
36-Ramirez- Mosqueda MA, Lglesias-Andreu. 2016. Direct organogenesis of Stevia rebaudiana. Suger Tech, volume (18): 424-428.
37-Rashel SA, Moniruzzaman SH,Pijush S and S Yasmi. 2016. An efficient protocol for in vitro regeneration of Stevia rebaudiana. Asian Journal of Medicinal and Biological Research, 2(1): 95-106.
38-Sabah, A.H., Rasha, M.A.K. 2013. Biotechnological studies for improving of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro Plant lets. Middle-East J.Sci.Res. 14,93-106.
39-Sairkar P,Chandravanshi MK, Shukla NK, Mehrotra MN. 2009.Mass propagation of an economically important medicinal plant Stevia rebaudiana using in vitro propagation technique. J Med Plant Res 3(4): 266-270.
40-Shatnawi MA, Shibli RA, Abu-Romman SM, Al-Mazraawi MS, Ajlouni ZL, Shatnawi WA, Odeh WH. 2011. Clonal propagation and cryogenic storage of the medicinal plant Stevia rebaudian. Spanish Journal of Agricultural Research, 9(1): 213-220.
41-Sanjida RM, Sarker RH,Hoque MI. 2011. In vitro plant regeneration in Brassica Spp. Plant Tissue Culture and Biotechnology 21: 127-134.
42-Singh A, Kumar J, Kumar P. 2008. Effect of plant growth regulators and sucrose on postharvest physiology membrane stability and vase life of cut S pikes of gladiolus. Plant Growth Regulation 55: 222-229.
43-Singh P, Dwivedi P, Atri N. 2012. In vitro shoot regeneration of Stevia rebaudiana through callus and nodal segments. Int J Agric Environ Biotechnol 5(2): 101-108.
44-Singh, P, Dwived I P. 2013. Efficient micropropagation protocols of regeneration of Stevia rebaudiana Bertoni, an anti-diabetic herb. Vegetos 26(1), 318-323.
45-Sivaram, L., and U. Mukundan. 2003. In vitro culture studies on Stevia rebaudiana. In Vitro Cellular and Development Biology Plant, 39: 520-523.
46-Silva All, Oliviera Y, Costa JL, Scheidt GN Carvalho DC, Santos JD, Guerra EP. 2011. Pre-acclimatization ofmicropropagated plants ofEucalyptus saligana Sm. Rev Acad Agrar Ambient. 9: 179-184.
47-Sridhar TM and C Aswath. 2014. Influence of additives on enhanced in vitro shoot multiplication of Stevia rebaudiana(Bert) an important anti diabetic medicinal plant. American Journal of Plant Sciences, 5: 192-199.
48-Taware AS, DS Mukadam, AM Chavam and SD Taware. 2010. Compartive studies of in vitro and in vivo grown plants and callus of Stevia Rebaudiana. International Journal of Integrative Biology, 1:10.
49-Taleie N, Hamidochli S, and Hamidoghli Y. 2012. In vitro plantlet propagation of Stevia rebaudiana Bertoni. South Western Journal of Horticulture Biology and Environment, V(2), No, 1. Pp: 99-108.
50-Tiawari S, Arnold R, Saxena A, Mishra RM, Rajak A and Singh P. 2013. Studies on rapid micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni: a natural sweetener. International Journal of Pharmacy and Life Sciences, V(4), ISSUE 5: 2667-2671.
51-Thiyagarajan M, Venkatachalam P. 2012. Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana Bert for commercial application pharmaceutically important and anti diabetic medicinal herb. Ind Crops Prod 37(1):111-117.
52-Udin MS, Chowdhury MS, Khan MM, Uddin MB, Ahmed R, Betan MA. 2006. In vitro propagation of Stevia rebaudiana Bert in Bangladesh. Afr J Biotechnol 5: 1238-1240.
53-Verma SK, Raj MK, Asthana P, Jaiswal VS, Jaiswal U. 2010. In vitro plantlets from alginate- encapsulated shoot tips of Solanum nigrum L. Sci. Hortic. 124:517-521.