ارتباط نشانگر­های ISSR  با صفات زراعی برنج در شرایط غرقاب و تنش خشکی

محمدرضا کریم¹، حسین صبوری^2*و محمد علی ابراهیمی¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه بیوتکنولوژی

² ایران، گنبدکاووس، دانشگاه گنبدکاووس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولیدات گیاهی

تاریخ دریافت: 5/9/95                  تاریخ پذیرش: 1/9/96

چکیده

در این تحقیق ارتباط بین صفات زراعی و نشانگرهای مولکولی دربرنج با استفاده از 21 صفت زراعی و 144 باند تشکیل شده  حاصل از 10 آغازگر بین ریزماهواره در 59 ژنوتیپ­ برنج مورد مطالعه قرار گرفت. آبیاری مزرعه در هر دو محیط غرقاب و تنش، تا مرحله پنجه­دهی ارقام به طور غرقاب انجام شد. سپس برای ایجاد تنش، از 40 روز پس از نشاء (مرحله حداکثر پنجه­زنی) تا پایان فصل زراعی به فاصله 25 روز انجام شد بیشترین محتوای اطلاعات چند شکل(PIC) را آغازگر ISSR-7 با 49/0 و آغازگرهایی ISSR-2، ISSR-8، ISSR-9 و ISSR-10 با 47/0 کمترین مقدار PIC را به خود اختصاص دادند. براساس تجزیه رگرسیون داده­های مولکولی و صفات مورفولوژیکی، در مجموع 70 نشانگر برای شرایط نرمال و 72  نشانگر برای شرایط تنش خشکی برای صفات مرفولوژیکی شناسایی شد. در شرایط نرمال عرض برگ پرچم با 9 نشانگر و در شرایط تنش خشکی طول خروج خوشه از غلاف، عرض برگ پرچم، تعداد دانه کل، تعداد دانه پر خوشه و عملکرد در هکتار با 6 نشانگر  بیشترین نشانگر­های مثبت را نشان دادند. بیشترین توجیه تغییرات در شرایط نرمال مربوط به صفت مدت زمان رسیدگی (20/0) توسط مکان­های ژنی ISSR6-7, ISSR10-11, ISSR7-4, ISSR1-7 ISSR2-5, ISSR8-9, ISSR4-8, ISSR1-5, ISSR1-2, ISSR5-1 تبین شد. در شرایط تنش خشکی بیشترین توجیه تغییرات مربوط به صفت عملکرد در هکتار(17/0) توسط مکان­های ژنی ISSR2-8, ISSR9-ISSR1-6, ISSR10-8, ISSR10-10, ISSR3-1 تبیین شد. تعدادی از نشانگر­ها با بیش از یک صفت در ارتباط  می­باشند از نتایج این تحقیق در تامین اطلاعات اولیه برای انتخاب غیر مستقیم صفات از طریق نشانگر­های مرتبط مفید می­باشد.

واژه­های کلیدی: برنج، تجزیه ارتباط، تنش خشکی، نشانگر­های آگاهی­بخش

* نویسنده مسئول، تلفن: 01733228883، پست الکترونیکی: Hos.sabouri@Gmail.com

مقدمه

برنج یکی از مهمترین گیاهان زراعی جهان می­باشد و غذای اصلی و منبع  تامین کربوهیدرات کثیری از مردم جهان بوده که سطح وسیعی از زمین­های  زیر کشت در آسیا را به خود اختصاص داده است. به طوری که بیش از 90 درصد برنج در آسیا تولید و مصرف می­گردد. بیش از 80 درصد کالری و 75 درصد پروتین مصرفی مردم آسیا از برنج تامین می­گردد (32). تولید برنج در مقایسه با تولید سایر غلات به دلیل تخصصی­تر بودن و سرمایه مورد نیاز بیشتر، به راحتی قابل توسعه و افزایش نمی­باشد. بعلاوه برنج تحت هر شرایط آب و هوایی قابل کشت نیست. در حال حاضر سطح زیر کشت برنج در دنیا بالغ بر 4/163 میلیون هکتار و میزان تولید آن بیش از 718 میلیون تن با عملکرد متوسط 3800 کیلوگرم شلتوک در هکتار می­باشد. در بین مناطق جهان، آسیا حدود 90-91 در درصد از کل تولید جهانی برنج را دارا می­باشد و تنها  8-9 درصد از تولید به بقیه مناطق جهان اختصاص دارد (13). خشکی از عمده خطرات جدی برای تولید موفق محصولات زراعی بخصوص برنج در جهان است که می­تواند در هر زمان طی فصل رشد رخ دهد (2 و 7). از این‌ رو یکی از چالش­های اصلی در کشاورزی تولید غذای بیشتر با آب کمتر می­باشد (29).  تنش خشکی مهم­ترین عامل محدود کننده تولید برنج در 40 میلیون هکتار از اراضی زیر کشت برنج در آسیا می­باشد (31). انتخاب بر اساس عملکرد ژنوتیپ­ها در هر دو محیط تنش و بدون تنش باعث انتخاب ژنوتیپ­های با عملکرد بالا در شر ایط تنش می­شود، زیرا آلل­های مطلوب تحت شرایط تنش خشکی انتخاب­شده و همزمان پاسخ به انتخاب در شرایط بدون تنش به دلیل وراثت پذیری بالاتر عملکرد، حداکثر است (23). 

انتخاب در برنامه­های اصلاحی زمانی به نتیجه منهی خواهد شد که در جمعیت تنوع ژنتیکی وجود داشته باشد. فقدان تنوع ژنتیکی علاوه برمحدود ساختن برنامه­های اصلاحی، موجب از دست رفتن نژادها و سویه­های می­شود. بهترین نتیجه از آنالیز تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­ها زمانی حاصل می­شود که اطلاعات  صفات فنوتیپی با داده­های مولکولی مقایسه شوند و روابط بین ژنوتیپ­ها در این صورت بهتر مقایسه می­شود. به کمک نشانگرهای مولکولی می­توان به تنوع ژنتیکی در بین زنوتیپ­های برنج پی برد و ژنوتیپ­های که تحمل مناسبی در مقابله با تنش خشکی نشان دهند را گزینش نمود و در برنامه­های اصلاحی برای رسیدن به جمعیتی با هتروزیگوسیتی بالا در صفات ژنوتیپی و فنوتیپی مطلوب استفاده کرد(10).

باتوجه به روند فزاینده گسترش خشکی در جهان، داشتن گیاهان مقاوم به خشکی برای بسیاری از کشورها امری حیاتی می­باشد و انتقال ژن­های ایجاد کننده مقاومت به خشکی از واریته­های محلی و یا ارقام وحشی به ارقام اصلاح شده یا سایر ارقام تجاری، می­تواند تحول عظیمی در تغذیه کشورهای مناطق خشک پدید آورد همچنین با بررسی ژرم پلاسم و تعیین وضعیت تنوع ژنتیکی گیاهان، محقق می­تواند با صرف حداقل زمان ممکن از پایه­های ژنتیکی متنوع که در بانک ژن وجود دارد در برنامه­های به­نژادی خود استفاده کند. برای این کارتعیین تنوع ژنتیکی درون گونه­ای اولین قدم در قبال استفاده کردن منابع ژرم پلاسم می­باشد (15).

گریما و همکاران (14)  به بررسی تنوع ژنتیکی 3 جمعیت وحشی و زراعی برنج اتیوپی با استفاده از نشانگر بین­ ریز ماهواره  پرداختند نتایج این پژوهش نشان داد که نشانگرهای  بین­ریزماهواره به طور موثری می­تواند برای مطالعه تنوع ژنتیکی بین جمعیت­های وحشی و زراعی مورد استفاده قرار گیرد و تنوع ژنی بیشتری را در جمعیت­های وحشی نشان داد. فریدریس و همکاران (12)  برای بررسی تنوع سوماکلون درسطح توالی نوکلوتیدی برنج 24 نشانگر RAPD و 20 نشانگر بین­ریزماهواره مورد مطالعه قرار دادند که متوسط ژنی برای هر نشانگر به ترتیب 83/20 و 04/17 برآورد شد. بلایر و همکاران (9) 59 ژنوتیپ برنج توسط 32 آغازگر بین­ریزماهواره  مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که نشانگر بین­ریزماهواره کارآمدترین ابزار برای تخمین تنوع ژنتیکی برنج است.

آگاهی از سطح تنوع ژنتیکی و برآورد میزان آن در ژرم پلاسم گیاهان و تعیین روابط ژنتیکی مواد اصلاحی، پایه و اساس بسیاری از برنامه های اصلاح نباتات به شمار می رود (33).  پیش از شناسایی و کاربرد نشانگرهای مولکولی، محققان و پژوهشگران اغلب از صفات مورفولوژیک در ارزیابی­های تنوع ژنتیکی و ارتباط بین ژنوتیپ­های یک گونه خاص استفاده می­کردند (23). کم بودن تعداد نشانگرهای مورفولوژیک و متاثر بودن آنها از عوامل محیطی سبب شد کاربرد اینگونه نشانگرها محدود شود. پیشرفت علوم بیوتکنولوژی و شناسایی نشانگرهای مبتنی DNA و حذف اثرهای ناشی از عوامل محیطی، توانست بسیاری از مشکلات مربوط به نشانگرهای مورفولوژیک را برطرف کند و تکمیل کننده نشانگرهای مورفولوژیک باشد (18). در سال­های اخیر نشانگرهای پیوسته با صفات مطلوب زراعی و کاربرد آنها در تجزیه وراثت صفات در گیاهان زراعی و ساختار و سازماندهی ژنوم مشخص شده است (18). با توجه به اینکه نشانگرهای مولکولی و صفات مورفولوژیک مکمل یکدیگر بوده و نمی­توانند به تنهایی ابزار مفید و سودمندی در روش­های مختلف اصلاحی باشند (20 و 21)، از اینرو مطالعه رابطه بین نشانگرهای مولکولی و صفات زراعی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. هامزا و همکاران (16) در پژوهشی 17 نشانگر ریزماهواره برای بررسی تنوع ژنتیک 26 گونة جو و تعیین ارتباط این نشانگرها با برخی صفات مورفولوژیک استفاده کردند. آن­ها نشان دادند همبستگی مثبت و معنی­داری بین برخی از نشانگرها و داده­های مورفولوژیکی وجود دارد. در ضمن با توجه به پژوهش آچلینتر و همکاران (8)  بر روی 114 گونة یولاف، با استفاده از 77 نشانگر  چندشکل حاصل از هشت ترکیب آغازگری، تجزیة ارتباط را برای مکان­یابی عملکرد و اجزای عملکرد انجام دادند؛ درنهایت 23 نشانگر را برای استفاده در برنامه­های اصلاحی بعدی معرفی کردند. وایرک و همکاران (30) رابطه بین صفات تاریخ گلدهی و تعداد پنجه را با نشانگرهای RAPD و ایزوزیم در47 ژنوتیپ برنج مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل  نشان داد که رگرسیون چندگانه با استفاده از63 نشانگر RAPD  و 39 آلوزایم به عنوان متغییر وابسته نشان داد، 29 نشانگر حدود 99 درصد تغییرات را توجیه کردند ومشخص شد در صورتی که پیوستگی ژنتیکی علت اصلی رابطه بین نشانگرهای مولکولی و صفات کمی باشد، گزینش کارایی والدین به منظور ایجاد جوامع مورد استفاده در مکان­یابی QTL­­­ های یک صفت معین می­باشد. سخدری و همکاران (4) 20 ژنوتیپ سیب زمینی توسط 16 نشانگر­­های بین­ریزماهواره مورد بررسی قرار دادند.­ نتایج حاصل نشان داد که ­در مجموع 65 مکان ژنی تولید شد. تجزیه ارتباط تجزیه ارتباط صفات مورفولوژیکی با 65 مکان ژنی، ارتباط معنی­داری با 8 صفت از صفات مورد ارزیابی در ژنوتیپ­های سیب زمینی نشان دادند. صفت وزن خشک برگ با 7 آلل بیشترین ارتباط معنی­دار و صفت وزن خشک ریشه با 2 آلل کمترین ارتباط معنی دار با نشانگر­ها را از خود نشان دادند. شکرپور و همکاران (6) در بررسی رابطه بین نشانگر­های مورفولوژیکی، فیتوشیمیایی و مولکولی در گیاه مارتیغال در گونهSilybum marianum L  مورد ارزیابی قرار دادند، نتایج نشان داد که بیش از 40 درصد از تغییرات مربوط به وزن هزاردانه، ارتفا ع بوته و تاریخ گلدهی توسط نشانگرهای مثبت شناسایی شده توجیه گردید.

هدف از این تحقیق شناسایی نشانگر­های آگاهی بخش  مرتبط با صفات زراعی در 59 ژنوتیپ برنج در شرایط نرمال و تنش خشکی با استفاده از سیستم نشانگری بین ریزماهواره ای بود.

 مواد و روشها

مواد گیاهی: به منظور شناسایی نشانگر­های آگاهی بخش ISSR مرتبط با صفات زراعی برنج در شرایط غرقاب و تنش خشکی 59 ژنوتیپ دریافتی از موسسه تحقیقات برنج کشور و موسسه بین المللی تحقیقات برنج (جدول1) در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار در دو شرایط جداگانه، بدون تنش (غرقاب) و تنش خشکی در مزرعه پژوهشی واقع در شهرستان علی آباد کتول با طول جغرافیایی 51/54 شرقی و عرض جغرافیایی 54/36 شمالی با ارتفاع 136 متر از سطح دریا، در سال زراعی 1392 انجام شد.  قبل از کاشت در خزانه، محل خزانه با دقت توسط تیلر شخم زده شد. بذرها به مدت 24 ساعت در آب معمولی خیسانده شدند و بعد به مدت 12 ساعت در محلول 2 در هزار مانکوزب قرار داده شدند. سپس بذرها در پارچه­های کنفی قرار داده شدند تا جوانه­دار شوند. در این مدت، بذرها چندین بار به آرامی تکان داده شدند تا جوانه­زنی به طور یکنواخت انجام شود و برای خشک نشدن بذرها، چندین بار آب پاشی انجام شد. خزانه به طریق ژاپنی احداث شد، بدین ترتیب که سطح خزانه بالاتر از جوی­های آبیاری طرفین قرار می­گیرد سپس آبیاری خزانه انجام شد و زمانی که سطح آن کاملآ مرطوب شد آب اضافی خارج گردید و بذور جوانه­دار شده در سطح خزانه پاشیده شدند. هم زمان با رشد نشاها درخزانه اقدام به آماده سازی زمین اصلی شد. اندازه واحدهای آزمایشی دو متر مربع ابعاد کرت (1×2) و با فاصله یک متر از یکدیگر در نظر گرفته شده بعد از انتساب تصادفی تیمارها به واحدهای آزمایشی نشاکاری به صورت چهار بوته در هر کپه انجام شد هر ژنوتیپ در پنج ردیف با فاصله 25 سانتی متر بین بوته­ها و 25 سانتی متر بین ردیف­ها در ردیف­های به طول دو متر کشت شد. آبیاری مزرعه آزمایشی در هر دو محیط غرقاب و تنش، تا مرحله پنجه­دهی ارقام به طور یکسان و به طور غرقاب انجام شد. سپس برای ایجاد تنش، آبیاری از 40 روز پس از نشاء (مرحله حداکثر پنجه­زنی) براساس ظهور علایم تنش خشکی در گیاهان (لوله شدن برگ) تا پایان فصل زراعی به فاصله 25 روز انجام شد. جهت جلوگیری از فرار آب و علف کش­ها مرز کرت­ها تا عمق یک متری با پوشش نایلونی پوشانیده شدند. وجین علف­های هرز،21 روز پس از نشاءکاری و وجین دوم به فاصله 19 روز از وجین اول انجام شد.  به منظور مبارزه با پروانه ساقه خوار برنج از سم دیازینون 10 درصد به میزان 15 کیلوگرم در هکتار در موقع وجین و در زمان خوشه­دهی و چند روز قبل از رسیدگی استفاده شد.

 صفات مورد مطالعه روی 15 خوشه اصلی از 15 بوته تصادفی از هر کرت ثبت شد. صفات عبارت بودند از: شامل طول خوشه (فاصله طولی از گره زیر خوشه تا انتهای خوشه بدون در نظر گرفتن ریشک برحسب سانتیمتر)، تعداد خوشه چه، دانه پوک، طول خروج خوشه از غلاف، طول برگ پرچم (فاصله طولی از زیر برگ پرچم تا نوک آن بر حسب سانتیمتر)، عرض برگ پرچم (فاصله طولی پهن­ترین قسمت برگ پرچم بر حسب سانتیمتر)، مساحت برگ پرچم (طول و عرض برگ پرچم در ضریب 75/0)، دانه کل خوشه، ارتفاع بوته (ارتفاع بلندترین پنجه از ناحیه طوقه در سطح خاک تا نوک خوشه بدون احتساب ریشک بر حسب سانتیمتر)، تعداد خوشه بوته، وزن کاه بوته، وزن خوشه، وزن کل بوته، باروری (از تقسیم تعداد دانه پر بر تعداد کل دانه­ها)، تعداد دانه پرخوشه، وزن دانه پرخوشه، عملکرد در هکتار(عملکرد شلتوک در یک هکتار برحسب تن)، وزن کاه در هکتار (وزن کاه در یک هکتار برحسب تن)، شاخص برداشت (از تقسیم وزن دانه بر وزن کل گیاه)، تعداد روز تا گلدهی (تعداد روزهای از کاشت نشاها در خزانه تا مرحله 50  درصد گلدهی بوته­های هر کرت)، تعداد روز تا رسیدگی (تعداد روزهای از کاشت نشاها در خزانه تا مرحله رسیدگی کامل بوته­های هر کرت)، دوره پر شدن دانه (از تفریق تعداد روز تا گلدهی به تعداد روز تا رسیدگی). اندازه گیری ارزش­های فنوتیپی عملکرد دانه و وزن هزار دانه در دو شرایط بر اساس دستورالعمل استاندارد ارزیابی صفات در برنج انجام شد (27).

استخراج  DNAو ارزیابی نشانگرهای مولکولی: به منظور بررسی ارتباط بین صفات زراعی و نشانگر­های بین ریزماهواره با 59 ژنوتیپ برنج از 10 نشانگرمولکولی بین ریز ماهواره­ای (جدول2) در آزمایشگاه اصلاح نباتات و ژنتیک دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه گنبد کاووس انجام گرفت. استخراج برگ­های جوان گیاهچه­های 21 روزه در مرحله چهار برگی با استفاده از روش   CTAB (11) انجام شد. برای تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراجی از روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز آگار 1 درصد استفاده شد. تکثیر قطعه DNA با واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 5/12 میکرولیتر PCR Master، 10 میکرولیتر dH₂o ، 1 میکرولیتر DNA و 5/1 میکرولیتر از هر آغازگر به همراه یک قطره روغن مینرال برای جلوگیری از تبخیر انجام گرفت.

جدول1- ژنوتیپ­های مورد بررسی در آزمایش

برای تکثیر نشانگر­های بین­ریزماهواره  واکنش PCR با دستگاه ترموسایکر  با برنامه PCR شامل مراحل واسرشت سازی اولیه به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد در ادامه 35 چرخه به صورت واسرشته سازی به مدت 30 ثانیه در دمای 94 سانتی گراد اتصال آغازگر­ها به مدت یک دقیقه در دمای مناسب اتصال برای هر آغازگر و مرحله توسعه رشته جدید به مدت 5/1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام گرفت.  سپس محصولات تکثیر یافته واکنش زنجیره­ای پلی مراز با استفاده از ژل آگار5/ 1 درصد با ولتاژ  100 به مدت 50 دقیقه الکترفورز شد. ژل­ها به مدت 12 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شدند و توسط دستگاه عکس برداری از ژل (ژل داک) قطعات تکثیر یافته DNA تحت نور فرابنفش مورد مشاهده قرار گرفتند. باند­های تکثیر یافته بصورت یک(حضور باند)  و صفر (عدم حضور باند) نمره­دهی شد.. محتوای اطلاعات چند شکل (Polymorphism Information Content) که نشان دهنده ارزش هر نشانگر برای بیان چندشکلی است توسط رابطه 1 محاسبه شد(24).

رابطه 1)          16PICi=2 fi1-fi">

در این رابطه PICi، PIC نشانگر iام، fi فراوانی قطعه نشانگر iام هنگام وجود و (1-fi) فراوانی قطعه نشانگر iام در حالت عدم وجود نوار است.

جدول 2- نشانگرهای بین ریز ماهواره (ISSR) مورد بررسی در آزمایش

نتایج و بحث

ارزیابی­های فنوتیپی

همبستگی: در هر دو شرایط غرقاب و تنش خشکی وزن دانه پر بیشترین ضریب همبستگی مثبت و معنی­دار را با عملکرد به ترتیب (^**96/0) و (^**89/0) داشت با نتایج ساراوگی و همکاران (26) موتان و سامی (22) مطابقت دارد. صفت روز تا گلدهی در شرایط تنش همبستگی منفی و نسبتاً معنی­داری را نشان داد. بدین ترتیب، انتخاب ژنوتیپ‌های با تعداد روز تا گلدهی‌ کمترتا حدودی می­تواند منجر به انتخاب ژنوتیپ­های با عملکرد بالا شود زیرا ژنوتیپ­های مطلوب تر با مکانیسم فرار از تنش استفاده نمودند.لافیته و همکاران (18) نیز زودرسی را به عنوان یکی از صفات مهم برای انتخاب ژنوتیپ­های ­ متحمل به خشکی عنوان نمودند. بنابراین یکی از مکانیسم های تحمل به خشکی در ژونتیپ­های مورد بررسی می­تواند فرار از تنش خکی با گلدهی زودتر آن­ها باشد. صفت طول برگ پرچم تحت هر دو شرایط تنش و بدون تنش،  همبستگی مثبت و معنی­داری با عملکرد دانه به ترتیب در سطح یک و پنج درصد نشان دادند (جدول8). افزایش سطح برگ پرچم که جوان­ترین و مهم­ترین عضو فتوسنتز کننده در برنج در مراحل پس از گلدهی، باعث افزایش میزان فتوسنتز و در نتیجه افزایش عملکرد دانه را به دنبال خواهد داشت. لافیته و همکاران (18) عنوان نمودند برگ پرچم ژنوتیپ­های حساس به خشکی در اثر تنش خشکی در مرحله گلد­هی پیچ خورده و لوله شکل می­شود و سطح مؤثرترین عضو فتوسنتز کننده آن­ها کاهش یافته و علاوه بر کاهش اندازه دانه، تعداد دانه­های پر و در نهایت عملکرد دانه در آنها کاهش می­یابد، ولی ژنوتیپ ­های­ متحمل در مقابل تنش خشکی مقاومت نشان داده و سطح برگ پرچم خود را حفظ می­کنند. نتیجه این تغییرات به افزایش تعداد دانه پر در خوشه، تعداد خوشه چه در خوشه چه در خوشه و تعداد خوشه در بوته یعنی اجزای اصلی عملکرد و معنی­دار شدن این همبستگی در این مطالعه شد. ارتفاع بوته همبستگی منفی و معنی­داری را با عملکرد شلتوک در شرایط تنش خشکی (جدول3) داشت. همبستگی­ منفی و معنی­دار ارتفاع بوته با عملکرد شلتوک توسط لافیته و همکاران (18) و هاو زو و همکاران (17) نیز گزارش شده است. به عقیده این محققین، برنج­های­ پاکوتاه در شرایط تنش خشکی سریع تر از ارقام پابلند آب و مواد غذایی خاک را در اختیار سطوح فتوسنتز کننده مانند برگ پرچم (انتهایی ترین برگ ساقه ) قرار می­دهند. در این پژوهش نیز نتیجه مشابهی به دست آمد.

تجزیه کلاستر و تابع تشخیص: تجزیه  کلاستر  بر اساس روش  wardو برش دندروگرام در فاصله 8 و 10 واحدی برای ژنوتیپ­های مورد مطالعه موجب گروه بندی ژنوتیپ­ها به ترتیب در سه گروه در شرایط نرمال و تنش خشکی گردید(شکل 2 و 4). گروه­بندی ژنوتیپ­ها در شرایط تنش باعث تقسیم­بندی ژنوتیپ­ها به سه گروه مقاوم به خشکی، نیمه حساس به خشکی و حساس به خشکی گردید. کلاستر اول دارای 20 ژنوتیپ بودند که مهم­ترین ویژگی آن­ها سرعت بالای پرشدن دانه در این ژنوتیپ­ها برای فرار از خشکی مناسب هستند و ­­ در گروه مقاوم به خشکی قرار گرفتند. کلاستر دوم دارای بیشترین ژنوتیپ­ (31) بودند. ارقام ایرانی سنگ جو و عنبربو ایلام در گروه نیمه حساس به خشکی قرار گرفتند. ارقام IR 47686-12-5-B-1 و  Pandaکه زودرس­ترین ژنوتیپ در شرایط خشکی بودند ولی به علت اینکه که دوره پرشدن دانه آن­ها طولانی بود، جزوه این گروه قرار گرفتند. کلاستر سوم که دارای ارقام CT13382–8-3-M، LINE 835، UPLRi-7، IRAT177، IR60080-42، IRAT212، IR62761-20، B6144F-MR-6–0-0 بیشترین تعداد روز تا گلدهی داشتند، جزوه ارقام حساس به خشکی قرار گرفتند.

تنوع ژنتیکی: ژنوتیپ­های مورد بررسی براساس 10 نشانگر بین ریزماهواره در مجموع 144 باند با میانگین 4/14  باند به ازای هر جایگاه نشانگری ایجاد نمود و از 144 باند تشکیل شده 17/69 درصد از باند­ها چندشکل بودند.  بیشترین محتوای اطلاعات چند شکل(PIC) را آغازگر ISSR-7 با 49/0 و آغازگرهایی ISSR-2، ISSR-8، ISSR-9 و ISSR-10 با 47/0 کمترین مقدار PIC را به خود اختصاص دادند  (جدول4). چمنی­محصص و همکاران (3) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 9 لاین والدینی برنج شامل 4 لاین ایرانی و 5 لاین استحصالی از IRR از 12 نشانگر ISSR و 24 نشانگر SSR استفاده نمودند. مجموع نشانگرهای SSR  و ISSR در این تحقیق 150 باند تشکیل شد که 120 باند چندشکل بودند و مجموع چندشکلی 68 درصد بود. تعداد باند برای هر نشانگر ISSR از 2 تا 17 متغییر بود و میانگین تعداد باند هر نشانگر معادل 5/6 برآورد شد.

شکل2- تجزیه کلاستر ژنوتیپ­های مورد بررسی در شرایط غرقاب

شکل3- تفکیک گروه­های ایجاد شده در تجزیه کلاستر با استفاده از تابع تشخیص خطی فیشر در شرایط غرقاب

شکل4- تجزیه کلاستر ژنوتیپ­های مورد بررسی در شرایط تنش خشکی

شکل5- تفکیک گروه­های ایجاد شده در تجزیه کلاستر با استفاده از تابع تشخیص خطی فیشر در شرایط تنش خشکی

جدول4- تعداد کل باند­ها، درصد چندشکلی(POL)، محتوای اطلاعات چندشکل PIC) (،شاخص نشانگری (MI) برای هر آغازگر ISSR

گروه بندی ژنوتیپ­های مورد بررسی با استفاده از نشانگر­های ISSR : گروه بندی ژنوتیپ­ها براساس روش UPGMA و ضریب تشابه جاکارد و برش دندروگرام در فاصله 25 واحدی باعث  گروه بندی ژنوتیپ­ها در 2 گروه گردید (شکل6) که گروه دوم دارای دو زیر گروه بزرگ بود. گروه اول دارای 25 ژنوتیپ  و دو زیر گروه کوچک می­باشد. ژنوتیپ­های IR70358–84–1-1 ، CT6510-24-7-8، IR65261–09–1-B، IR30، IR62761-20، IR 55411-50، IR60080-46A، Pegaso، IR63371-38، IRAT216، CT13382–8-3-M، IRAT177، SAMBA MAHSURI، IR66421–062–1-1–2، IR69626B، WAB638–1،UPLRi-7،LINE226، LINE 835، ANBARBO ILAM، IR55419–04، Way Rarem، IR68702–072–1 در گروه اول قرار گرفتند. و 35 ژنوتیپ در گروه دوم قرار گرفتند که زیر گروه اول دارای 17 ژنوتیپ IR 47686-12-5-B-1،IR66424–1-2–1-5،IRFAON-308، IR60080-42، CT6510–24–1-2،IR63377-08، IR63372-15، Caiapo،IR47686-12-5-B-1،USEN،IR67015-49-2-6، IRAT170، IR62752-07، Palawan، CT6510–24–7-8، IR7471-199-1-302بود. وزیر گروه دوم ژنوتیپ­های IR70360–38–1-B-1، IR60080-48، SANGJO، DAGADDESHI، LINE 213،IR66417–18–1-1–1، IR7471-199-1-302، IRGC-15092RT-1031-62، Panda، IR57924-24، IR55423-01، NONABOKA،IR3441-97، IR63380-08، IR 53236-342، IR57924-24، به خود اختصاص داده بود. نتیجه گرفت شد ژنوتیپ­های که در یک گروه قرار گرفتند، با وجود تفاوت­های ظاهری دارای تعداد توالی­های تکراری مشابه هستند. اختلاف بین ژنوتیپ­ها می­تواند ناشی از پدیده­های مختلف جهش­زا، از جمله کراسینگ اور نابرابر و عدم جفت شدن بوده باشد. سفالیان و همکاران (28) در بررسی تنوع ژنتیکی 20 رقم جو با استفاده از نشانگر بین­ریزماهواره تجزیه و تحلیل خوشه ای از داده های مولکولی با استفاده از ضریب تشابه جاکارد ژنوتیپ در چهار گروه مجزا دسته بندی کرد. نتایج تحقیق آن­ها نشان داد که نشانگر­ بین ریزماهواره ابزار مناسبی برای تخمین تنوع ژنتیکی در جو است.

رگرسیون گام به گام: رابطه بین داده­های مولکولی و صفات ژنوتیپ­های برنج  مورد مطالعه با استفاده از رگرسیون چندگانه بررسی شد.  بدین ترتیب هرصفت کمی به عنوان متغیر وابسته و آلل­های تکثیر شده توسط نشانگر­های ریزماهواره به عنوان متغیی­های مستقل در نظر گرفته شدند. نتایج رگرسیون چندگانه برای هریک از صفات مورد مطالعه در محیط نرمال و تنش و 144 مکان ژنی در جدول­های 5 و 6 آمده است. براساس تجزیه رگرسیون داده­های مولکولی و صفات مورفولوژیکی، در مجموع 70 نشانگر برای شرایط نرمال و 72  نشانگر برای شرایط تنش خشکی برای صفات مرفولوژیکی شناسایی شد. در شرایط نرمال عرض برگ پرچم با 9 نشانگر و در شرایط تنش خشکی طول خروج خوشه از غلاف، عرض برگ پرچم، تعداد دانه کل، تعداد دانه پر خوشه و عملکرد در هکتار با 6 نشانگر  بیشترین نشانگر­های مثبت را نشان دادند.

بیشترین و کمترین ضریب تبیین  کل در شرایط نرمال  به ترتیب مربوط به تعداد روز تا رسیدگی(67/0 درصد) و تعداد دانه کل خوشه (1/5 درصد) و در شرایط تنش خشکی طول خروج خوشه از غلاف بیشترین (49/0) و طول برگ پرچم (3/9) کمترین ضریب تبیین  کل را به خود اختصاص دادند. بیشترین و کمترینmax   R²  در شرایط نرمال به ترتیب مربوط به صفات مدت زمان رسیدگی (20/0) و تعداد دانه کل خوشه (1/5) و در شرایط تنش خشکی عملکرد در هکتار(17/0) بیشترین و تعداد خوشه چه(2/6) کمترین max   R²را به خود اختصاص دادند. ابراهیمی و  همکاران (1) تجزیه ارتباطی 11 صفات زراعی با 70 نشانگر ریزماهواره در جو­های بومی بررسی کردند. بیشترین تعداد  نشانگر برای صفت تعداد گره و کمترین آن مربوط تعداد برگ و طول  رادیکال

شناسایی شد.

جدول5- تعداد نشانگر­های آگاهی بخش پیوسته با صفات در شرایط نرمال ودر صد تغییراتی که توسط این نشانگر­ها توجیه می­شود.

جدول6- تعداد نشانگر­های آگاهی بخش پیوسته با صفات در شرایط نرمال ودر صد تغییراتی که توسط این نشانگر­ها توجیه می­شود.

T: تعداد نشانگر­های آگاهی بخش با صفات کمی، R²max بیشترین ضریب تنبین مربوط به یک نشانگر برای صفت کمی(درصد)

R²T.مجموع کل ضریب تنبین نشانگر­ها آگاهی بخش برای صفات کمی(درصدد)