نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات
2 عضو هیئت علمی/ دانشگاه اصفهان
چکیده
استفاده از گیاهان دارویی در مهار و درمان دیابت از طریق توقیف مکانیزمهای تخریب زیست مولکولها، موضوعی مهم در حیطه زیست پزشکی است. گیاه دارویی Achillea متعلق به خانواده کاسنی (Asteraceae) است و از گذشتههای دور به طور گسترده در طب سنتی استفاده میشود. گونه A. pachycephala یکی از گونههای ارزشمند بومادران است که به عنوان منبع غنی آنتی اکسیدانها محسوب میشود. هدف از اجرای این پژوهش، بررسی اثر مراحل مختلف فنولوژیک شامل پنج برگی، غنچه دهی، %50 گلدهی و %100 گلدهی بر خاصیت آنتیاکسیدانی و ضددیابتی عصاره متانولی گلهایA. pachycephala بود. فعالیت آنتیاکسیدانی با استفاده از مدل سیستم آلفا و آلفا- دی فنیل- بتا- پیکریل هیدرازیل (DPPH) و قدرت احیاکنندگی آهن (FTC) سنجش شد. میزان گلایکه شدن آلبومین نیز براساس درجه قهوهای شدن و پاسخدهی معرف قرمز کنگو ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که خاصیت آنتیگلایکیشنی گیاه در مرحله 50% گلدهی بیشتر از سایر مراحل بود و بیشترین مقدار فنول تام، فلاونوئید تام و فعالیت آنتیاکسیدانی نیز در این مرحله مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که بین خاصیت آنتیاکسیدانی و آنتیگلایکیشن ارتباط مستقیمی وجود دارد. احتمالاً A. pachycephala به واسطه خاصیت آنتی اکسیدانی قوی خود از گلایکه شدن پروتئین جلوگیری مینماید و از اینرو میتواند کاندید مناسبی در کاهش عوارض دیابت معرفی گردد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Influence of different phonological stage of Achillea pachycephala Rech.f. on albumin glycation inhibition, an in vitro study.
نویسندگان [English]
1 Department, of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 8415683111 Isfahan , Iran
2 university of isfahan
چکیده [English]
From biomedicine point of view, the application of medicinal plants to prevent and treat diabetes via intervention in biomolecule degradation mechanisms, is an important issue. Achillea L. belongs to Asteraceae family and have traditional properties with different applications in folk medicine. A. pachycephala is one of the valuable species of Achillea which has been considered as a rich source of antioxidants. The present study aimed to investigate the effect of various phenological stages including five leaves appearance, sprouting, 50% and 100% flowering on antiglycative and antioxidant activity of A. pachycephala flowers extract. Antioxidant activity were evaluated based on 1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl (DPPH) and reducing power (FTC) methods. The inhibitory effect of the extracts was determined in albumin glycation model using Congo red binding and brown staining assays. The results showed that the extracts collected at 50% flowering stage had the highest antiglycative potential, the highest amounts of total phenols, total flavonoids and antioxidant activities. Besides, a direct correlation between antioxidant and anti-glycative activity was suggested. Most likely, A. pachycephala prevents albumin glycation originating from its strong antioxidant properties, therefore it can be considered as a good candidate for reducing complications of diabetes.
کلیدواژهها [English]
تأثیر مراحل فنولوژیک گیاه داروییAchillea pachycephala Rech.f. بر مهار گلایکه شدن آلبومین در شرایط in vitro
مهوش افشاری1، مهدی رحیم ملک1* و مهران میراولیایی2
1 ایران، اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات
2 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 27/4/97 تاریخ پذیرش: 23/10/97
چکیده
استفاده از گیاهان دارویی در مهار و درمان دیابت از طریق توقیف مکانیزمهای تخریب زیست مولکولها، موضوعی مهم در حیطه زیست پزشکی است. گیاه دارویی Achillea متعلق به خانواده کاسنی (Asteraceae) است و از گذشتههای دور به طور گسترده در طب سنتی استفاده میشود. گونه A. pachycephala یکی از گونههای ارزشمند بومادران است که به عنوان منبع غنی آنتی اکسیدانها محسوب میشود. هدف از اجرای این پژوهش، بررسی اثر مراحل مختلف فنولوژیک شامل پنج برگی، غنچه دهی، %50 گلدهی و %100 گلدهی بر خاصیت آنتیاکسیدانی و ضددیابتی عصاره متانولی گلهایA. pachycephala بود. فعالیت آنتیاکسیدانی با استفاده از مدل سیستم آلفا و آلفا- دی فنیل- بتا- پیکریل هیدرازیل (DPPH) و قدرت احیاکنندگی آهن (FTC) سنجش شد. میزان گلایکه شدن آلبومین نیز براساس درجه قهوهای شدن و پاسخدهی معرف قرمز کنگو ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که خاصیت آنتیگلایکیشنی گیاه در مرحله 50% گلدهی بیشتر از سایر مراحل بود و بیشترین مقدار فنول تام، فلاونوئید تام و فعالیت آنتیاکسیدانی نیز در این مرحله مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که بین خاصیت آنتیاکسیدانی و آنتیگلایکیشن ارتباط مستقیمی وجود دارد. احتمالاً A. pachycephala به واسطه خاصیت آنتی اکسیدانی قوی خود از گلایکه شدن پروتئین جلوگیری مینماید و از اینرو میتواند کاندید مناسبی در کاهش عوارض دیابت معرفی گردد.
واژه های کلیدی:خاصیت آنتیاکسیدانی، آنتیگلایکیشن، بومادران، مراحل فنولوژیک.
* نویسنده مسئول، تلفن: 0313313348 ، پست الکترونیکی: mrahimmalek@cc.iut.ac.ir
مقدمه
بسیاری از بیماریها نظیر دیابت، سرطان، آترواسکلروز، آرتریت، اختلالات قلبی عروقی و همچنین صدمات فیزیکی و پیری، ارتباط اساسی با استرس اکسیداتیو دارند (4). رادیکالهای آزاد به دلیل داشتن الکترون آزاد، گونه هایی فعال و در نتیجه ناپایدار هستند. گونههای فعال اکسیژن (ROS) شامل آنیون سوپراکسید، رادیکالهیدروکسیل و پراکسیدهیدروژن به علت تمایل زیاد برای واکنش با سایر مولکولها میتوانند به سلولها و بافتها آسیب برسانند (4). این مولکولها در غلظتهای بالا موجب ایجاد وضعیتی به نام استرس اکسیداتیو میشوندکه در اثر برهم خوردن تعادل بین تولید رادیکالهای آزاد از یک سو و تضعیف سیستم آنتیاکسیدانی ازسوی دیگر ایجاد میشود (2). گیاهان دارویی قادرند تحت استرسهای محیطی با سنتز مواد ﻣﺆثر ثانویه و فعال از جمله پلی فنولها، در پیشگیری و درمان بیماریها ﻣﺆثر واقع شوند. آنها همچنین قدرت پاککنندگی رادیکالهای آزاد و کلاتهکنندگی فلزات را دارند (32). شناسایی شاخصهای کلیدی جهت انجام مطالعات فیتوشیمیایی، آنتیاکسیدانی و خواص درمانی گیاهان دارویی در مهار رادیکالهای آزاد، پیشگیری و درمان بسیاری از بیماریهای شایع التهابی از جمله دیابت و کاهش عوارض آنها امری ضروری است. به همین دلیل مطالعات اتنوفارماکولوژیکی، فیتوشیمیایی و آنتیاکسیدانی در بررسی خواص آنتیدیابتیک گیاهان دارویی مورد توجه ویژه محققین قراردارد (16). از طرفی، میزان و نوع مواد ﻣﺆثر موجود در گیاهان که عمدتاً متابولیتهای ثانویه هستند، در طول دوره رشد و نمو گیاه تغییر میکند. بنابراین، خواص دارویی گیاهان که وابسته به حضور متابولیتهای ثانویه است، نیزممکن است دچار تغییر شوند (17). گیاه بومادران به علت داشتن خاصیت آنتیاکسیدانی و خواص دارویی متنوع در طب سنتی و طب نوین کاربردهای فراوان دارد. نوزده گونه از این گیاه در ایران موجود است که برخی گونههای آن انحصاری هستند (1). از مهمترین گونههای آن میتوان به A. pachycephala اشاره نمود (26و35). گـزارشها حکایت از خواص فارماکولوژیک بومادران، مشتمل بر خصوصیات ضددیابت، ضدقارچ، ضدفشارخون، تب بری، ضدالتهابی و تنظیم کننده سیستم گوارشی دارد. تاکنون گزارشی مبنی بر اثر مراحل مختلف نموی بر فعالیت آنتیاکسیدانی و بررسی خاصیت آنتی گلایکیشن گیاه بومادران گزارش نشده است. همچنین به دلیل آنکه، میزان کل ترکیبات فنولیک و فلاونوئید اثر مهمی روی خواص دارویی این گیاه میگذارد، میتوان بهترین مرحله فنولوژیک را برای افزایش میزان کل ترکیبات فنولیک وآنتی اکسیدان و سایر متابولیت های ثانویه بومادران تعیین نمود. بنابراین، با توجه به اسـتفاده های فزاینـده ایـن گیـاه در طـب سنتی بهعنوان کاهشدهنده قند خـون، در ایـن پـژوهش قدرت آنتی گلایکیشن عصاره A. pachycephalaو ارتباط آن با خاصیت آنتی اکسیدانی،در مراحل مختلف فنولوژیک گیاه ارزیابی شده است.
مواد و روشها
گیاه بومادران (Achillea pachycephala Rech.f.) از طول جغرافیایی'57°53 و عرض جغرافیایی '30°36 (استان گلستان) جمع آوری شد و با شماره نمونه (Voucher specimen number) 12334 در هرباریوم دانشگاه صنعتی اصفهان ثبت گردید. این آزمایش در محوطه کشت دانشگاه صنعتی اصفهان به اجرا درآمده است. عملیات کشت گونههای بومادران در قالب یک طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار با تعداد 8 بوته با فواصل 20 سانتی متر و به صورت غیرجنسی(کلونی) درکرتهایی به ابعاد 2×1، در عمق 10 سانتیمتری سطح خاک اجرا شد. بررسیها و نمونهبرداریها از ژنوتیپ A. pachycephala در چهار مرحله فنولوژیک (شامل پنج برگی، غنچه دهی، 50% گلدهی و 100% گلدهی) انجام گرفت.
نحوه تهیه عصاره از برگ: از ژنوتیپ A. pachycephala در چهار مرحله نموی مقدار 5/2 گرم نمونه خشک تهیه و پس از قرار دادن در متانول 80% عصارهگیری شد. عصارههای تهیه شده فیلتر شده و با استفاده از روش پرکولاسیون، عصارهگیری و با روش تقطیر در خلأ تغلیظ گردیدند. عصارههای خشک شده تا زمان انجام آزمایش در دمای چهار درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
تعیین ترکیبات فنولی: مقدار کل ترکیبات فنولی موجود در عصاره گیاهی بر اساس روش توحیدی و همکاران (33) اندازهگیری شد. به طور خلاصه به 5/0 میلیلیتر از عصارههای مختلف رقیق شده (01/0 گرم در 10 میلیلیتر متانول 80%) مقدار 5/2 میلیلیتر محلول فولین سیوکالتیو 10% افزوده شد و پس از 3 تا 5 دقیقه مقدار 2 میلیلیتر از کربنات سدیم 5/7% اضافه گردید. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، جذب نمونهها در مقابل محلول کنترل متانول در طول موج 765 نانومتر قرائت گردید. همزمان با انجام آزمایش، رقتهای مختلف اسید تانیک تهیه و مانند روش فوق آزمایش و منحنی استاندارد تهیه گردید. جذب نمونهها با منحنی استاندارد مقایسه و مقدار فنول کل هر عصاره بر حسب میلیگرم در هر گرم ماده خشک محاسبه گردید.
بررسی خاصیت آنتیرادیکالی به روش :DPPH برای تعیین قدرت عصاره گیاهی در به دام انداختن رادیکالهای آزاد DPPH بر اساس روش سلامی و همکاران (28) اندازهگیری گردید. برای بررسی بهتر فعالیت آنتیرادیکالی عصاره، از شاخص IC50 استفاده شد. IC50 بیانگر مقدار میلیگرمی از عصاره است که قادر به حذف 50 درصد از رادیکالهای DPPH موجود در محیط باشد. برای محاسبه آن ابتدا نموداری از رابطه میان مقادیر غلظت عصاره و درصد DPPH باقیمانده رسم نموده و با توجه به نمودار حاصل و به صورت ترسیمی غلظتی از عصاره را که قادر است 50 درصد رادیکالهای آزاد را خنثی کند، تعیین میشود. برای بررسی بهتر این فعالیت از آنتیاکسیدان سنتزی (Butylated Hydroxy Toluene)BHT به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.
بررسی قدرت احیاءکنندگی آهن: برای تعیین قدرت احیاکنندگی آهن، محلولی از 1 میکروگرم عصاره در 1 میلیلیتر آب مقطر تهیه گردید. یک میلیلیتر از این محلول با 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 2/0 مولار (5/6pH:) و 5/2 میلیلیتر محلول آبی یک درصد فریسیانید پتاسیم [K3Fe(CN)6] مخلوط و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس 5/2 میلیلیتر محلول 10 درصد اسید تریکلرواستیک به مخلوط اضافه شد. محلول بهدست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت ×g1500 سانتریفوژ شد. در نهایت، 5/2 میلیلیتر از محلول رویی با 5/2 میلیلیتر آب مقطر و 5/0 میلیلیتر محلول کلریدفریک (FeCl3) مخلوط و جذب نمونهها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Hitachi F-2500) در طول موج 700 نانومتر قرائت گردید (11).
اندازهگیری محتوی تام فلاونوئید: محتوی تام فلاونوئیدی با استفاده از معرف کلرید آلومینیم اندازهگیری شد. به نیم میلیلیتر از هر عصاره، 1/0 میلیلیتر از محلول آلومینیمکلراید 10 درصد در اتانول، 1/0 میلیلیتر از استاتپتاسیم یک مولار و 8/2 میلیلیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط نیم ساعت بعد از نگهداری در دمای اتاق، در طول موج 415 نانومتر در مقابل نمونه شاهد قرائت شد (کوئرستین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد). سپس میزان فلاونوئید بر اساس میزان میلیگرم کوئرستین در گرم عصاره ثبت گردید (28).
تعیین درجه گلایکه شدن پروتئین براساس میزان قهوهای شدن نمونه: طیف سنجی مرئی- فرابنفش روشی بسیار مناسب برای بررسی و مطالعه فرآیند قنددار شدن ماکرومولکولها به شمار میآید. با مقایسه جذب نوری آلبومین گلایکه بدون حضور و در حضور عصارهها و متیلگلیاکسال، میزان مهارکنندگی مشخص شد. در این آزمون، آلبومین گاوی (5 میلیگرم بر میلیلیتر) با قند متیلگلیاکسال (10 میلیمولار) و سدیم آزید (%02/0) در بافر فسفات 1/0 مولار) 4/7(pH= انکوبه شد. نمونه کنترل منفی (آلبومین)، کنترل مثبت (آلبومین و متیل گلیاکسال)، نمونهها (آلبومین، متیل گلی اکسال و عصاره بومادران) به مدت سه روز در دمای 50 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. درجه قهوهای شدن نمونه ها شامل پروتئین قنددار شده، نمونه پروتئین قنددار شده در حضور عصاره و نمونه کنترل پروتئین، هر کدام جداگانه در طول موج 340 نانومتر بررسی شدند (7).
تعیین درجه گلایکه شدن پروتئین براساس روش قرمز کنگو: قرمز کونگو، معرف اختصاصی صفحههای بتا است. میزان جذب نوری این ماده در 530 نانومتر در اثر اتصال به ساختارهای بتا افزایش مییابد (21). برای انجام این آزمون 80 میکرولیتر نمونه با 20 میکرولیتر معرف قرمز کنگو مخلوط و پس از 5 دقیقه جذب آن در 530 نانومتر قرائت شد. برای آماده سازی معرف قرمز کنگو (100 میکرومولار) 003/0 گرم قرمز کنگو در 5 میلی لیتر اتانول حل و سپس با محلول PBS به حجم نهایی 50 میلی لیتر رسید و پس از فیلتر شدن در شیشه تاریک و در یخچال نگهداری شد.
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: ارزیابی برای هرکدام از نمونه ها با سه تکرار انجام گردید و داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزارver9.2 SAS, تجزیه و تحلیل شدند. میانگین ها با آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد مقایسه شدند. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار و حروف مشترک بیانگر عدم معنی داری بین نمونه ها است (05/0p≤). برای رسم شکلها از نرم افزار Excel و Graph pad استفاده گردید.
نتایج و بحث
ارزیابی ها مشخص نمود که مقدار فنول و فلاونوئید تام در طی مراحل رویشی به تدریج افزایش، در مرحله 50% گلدهی به بیشترین میزان و در مرحله 100% گلدهی با کاهش همراه بود. بیشترین میزان فنول و فلاونوئید تام در مرحله 50% گلدهی، بترتیب برابر با 01/90 میلیگرم تانیک اسید بر گرم ماده خشک (شکل1)، و 10/12 میلیگرم کوئرستین بر گرم ماده خشک (شکل2)، مشاهده شد.
|
شکل1- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فنول تام در A.pachycephala
مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0 p≤).
شکل2- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فلاونوئید تام در A. pachycephala
مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0 p≤).
عصارههای گیاهی در دورههای مختلف رشد، توانایی آنتی اکسیدانی متفاوتی را بروز دادند و شاخصIC50 تا مرحله 50% گلدهی کاهش و بعد از این مرحله میزان آن افزایش یافت (شکل 3). درحقیقت ارزیابی درجه آنتی اکسیدانی به این روش، در مرحله %50 گلدهی کمترین میزان خود (01/499 میکروگرم بر میلیلیتر حجم عصاره) را نسبت به BHT نشان داد.
شکل3- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روش (IC50) DPPH در
A. pachycephala. BHTبه عنوان استاندارد استفاده شده است. مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0p≤).
نتایج حاکی از آن است که جذب نوری عصارههای ژنوتیپ گلستان (گونه A. pachycephalla) در چهار غلظت متفاوت نیز تا مرحله 50% گلدهی افزایش و پس از این مرحله میزان آن کاهش یافت. کمترین میزان جذب نوری عصارهها در هر چهار غلظت، در مرحله پنج برگی مشاهده شد (شکل 4). همه غلظتهای عصاره نسبت به اکسیدان سنتزی، خاصیت احیاکنندگی بیشتری از خود نشان دادند. غلظتهای 300 و 500 ppm نسبت به غلظتهای دیگر قویتر عمل کردند (شکل 4).
شکل4- تأثیر مراحل مختلف فنولوژیک بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی به روشFTC (قدرت احیاکنندگی آهن) در چهار غلظت متفاوت در
A. pachycephala. BHTبه عنوان استاندارد استفاده شده است. مقایسه میانگین ها (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار) براساس آزمون LSD است. حروف غیر مشترک (d, c, b, a) بیانگر تفاوت معنی دار بین نمونه ها است (05/0p≤).
در طی بلوغ گیاهان، تغییرات فیتوشیمیایی بر فعالیت آنتیاکسیدانی آنها مؤثر است وکیفیت غذایی انواع مختلف میوه و سبزیجات را در زمانهای خاص تحت تأثیر قرار میدهد (20). اغلب، میزان فنول کل با رسیدگی کامل گیاه به طور پیوسته کاهش مییابد که این حقیقت با نتایج حاصل از پژوهش حاضر مطابقت دارد. میزان فنول تام بعد از مرحله 50% گلدهی روند نزولی نشان داد. احتمالاً در مرحله رویشی این گونه گیاهی، ترکیبهای فنولی و یا سایر ترکیبهای آنتیاکسیدانی ناچیز میباشند و به تدریج تا رسیدن به مرحله گلدهی مقدار این ترکیبات به حداکثر خود میرسند و سپس در طی رسیدگی بذر دوباره کاهش مییابند (23). علت افزایش تجمع ترکیبات فنولیک و فلاونوئید در مرحله 50% گلدهی را میتوان مرتبط با سلولها و بافتهایی مثل مزوفیل، اپیدرم و ضخامت کوتیکول، کلروپلاست، کرک و یا تغییرات مهم فیزیولوژیکی و ساختاری طی مراحل نموی دانست (36). همچنین این افزایش را میتوان به همزمانی این مرحله با دمای معتدل هوا در اواسط بهار مرتبط دانست و با نزدیک شدن به تابستان و افزایش دمای هوا و رسیدن گیاه به بلوغ کامل میزان این ترکیبات مجدداً کاهش مییابند. این کاهش میتواند ناشی از تجزیه متابولیتهای ثانویه به حد واسطهای متابولیت ساده اولیه باشد (23). از دیگر دلایل، جلب حشرات گرده افشان و پیشگیری از تأثیرعوامل بیماریزا بر گیاه است. بسیاری از گیاهان متابولیت هایی نظیر ترپن ها، پپتیدها، فنول ها و هورمون ها را به عنوان یک استراتژی دفاعی علیه محرک های ایجاد شده توسط حیوانات یا حشرات سنتز می کنند (14). میزان ترکیبات فنولی در اندام هوایی در مرحله گلدهی و افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی در این مرحله با مطالعات یسر و همکاران (36)، و ماریا جردن و همکاران (18)، در رزماری مطابقت داشت. در چندین گونه گیاهی نظیرOliveria decumbens(10)، Origanum vulgare (24)، Mentha pulegium (29)، Sida cordifolia (34)،Boerhavia diffusa و Hypericum pruinatum (3)،Artemisia chamaemelifolia(12)، و Origanum majorana(30) نیز تأثیر مراحل فنولوژیک بر ترکیب شیمیایی و فعالیت آنتیاکسیدانی بررسی و مشاهده شده است که در مرحله گلدهی کامل میزان پلی فنولها در این گیاهان افزایش مییابد.
غلظت نسبی ترکیبات شیمیایی عصاره پلی فنولیک گیاه نقش مهمی در تعیین قدرت آنتیاکسیدانی دارد که با نتایج این تحقیق همسو بود. چون در اندام هوایی بومادران وجود ترکیبهای فنولی و ارتباط این مواد با خاصیت آنتیاکسیدانی به اثبات رسیده است، این امکان وجود دارد که مقدار این ترکیبات یا اشکال فعال آنها از نظر فعالیت آنتیاکسیدانی در اندامهای مختلف گیاهی در مراحل مختلف نموی افزایش یا کاهش یابند (23). ترکیبات فنولیک دارای گروه عاملی هیدروکسیل متصل به یک هیدروکربن آروماتیک هستند، بنابراین این ویژگی ساختاری فعالیت آنتی اکسیدانی قوی آن ها را تأیید می کند (27). در غلظت های بالای ترکیبات فنولیک، امکان انتقال هیدروژن به رادیکال های آزاد افزایش می یابد و در نتیجه توانایی مهار کنندگی عصاره افزایش می یابد (10). افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی در مرحله گلدهی با مطالعات مقدم و همکاراندر گیاه ریحان (Ocimum ciliatum) (23) و گیاه شاهتره (Fumaria vaillantii) (22) و نیز پژوهشهای چن و همکاران (8)در گیاه نعناع چمنی(prunella vulgaris) ،مطابقت داشت. مطالعات انجام شده توسط ماریا جردنو همکاران (18)نشان داد که مرحله رشد بر ترکیب شیمیایی، خواص آنتیاکسیدانی اسانس رزماری ﻣﺆثر است. بن فرهات و همکاران (5) فعالیت آنتی اکسیدانی گونه ای از مریم گلی (Salvia aegyptiaca) را در سه مرحله نموی بررسی نمودند و گزارش کردند که خاصیت آنتیاکسیدانی در این گیاه در مرحله گلدهی بیشتر از فازرویشی بود و پس از مرحله گلدهی میزان ترکیبات فنولیک کاهش یافت. بنابراین افزایش خاصیت آنتیاکسیدانی در مرحله %50 گلدهی میتواند به بالا بودن محتوای فنول و فلاونوئید در این مرحله مرتبط باشد و در مرحله 100% گلدهی احتمالاً این ترکیبات ثانویه تجزیه شده و در نتیجه خاصیت آنتیاکسیدانی کاهش مییابد. نتایج تجزیه و تحلیل همبستگی (جدول1) نشان داد که همبستگی مثبت و معنی داری بین محتوای فنول و فلاونوئید تام و همچنین سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی به روش FTC (در غلظتهای مختلف) وجود دارد. سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی براساس شاخص IC50 در سطح احتمال 5 درصد با محتوای فنول، فلاونوئید کل و میزان احیاکنندگی آهن همبستگی منفی و معنیداری داشت. بنابراین کاهش شاخص IC50 به معنای افزایش خاصیت آنتیاکسیدانی است. دهقان و همکاران (9) همبستگی مثبتی را بین ترکیبات فنولیک و فعالیت آنتیاکسیدانی در مدل سیستمهای مختلف نظیر آزمون قدرت احیاءکنندگی آهن مشاهده کردند که با نتایج این مطالعه همخوانی داشت. توحیدی و همکاران (33) همبستگی منفی را بین ترکیبات فنولیک و فعالیت آنتیاکسیدانی در مدل سیستم DPPH براساس شاخص IC50 مشاهده نمودند که با نتایج این پژوهش مطابقت نشان داد.
جدول1- همبستگی بین پارامترهای مختلف اندازه گیری شده در مراحل مختلف نموی ژنوتیپ A. pachycephala
|
(1) |
(2) |
(3) |
(4) |
(5) |
(6) |
(7) |
7- FTC (غلظت500) |
*8819/0 |
*9482/0 |
*9064/0- |
*9699/0 |
*9565/0 |
*8826/0 |
1 |
6-FTC (غلظت300) |
*9439/0 |
*9824/0 |
*9411/0- |
*9371/0 |
*9671/0 |
1 |
|
5-FTC (غلظت100) |
*9761/0 |
*9787/0 |
*9838/0- |
**9950/0 |
1 |
|
|
4-FTC (غلظت50) |
*9699/0 |
*9608/0 |
*9819/0- |
1 |
|
|
|
3- IC50 |
**9982/0- |
*9312/0- |
1 |
|
|
|
|
2-محتوای فلاونوئید |
*9229/0 |
1 |
|
|
|
|
|
1-محتوای فنول |
1 |
|
|
|
|
|
٭ و٭٭ به ترتیب معنی دار در سطح احتمال 5 و1 درصد.
تأثیر عصاره گیاه بر میزان گلایکه شدن آلبومین: طی واکنش میلارد نمونههای حاصل از گلایکه شدن تغییر رنگ داده و با گذشت زمان به ترکیباتی با رنگ قهوهای تبدیل میشوند. از این خاصیت میتوان برای تعیین میزان گلایکه شدن پروتئینها و همچنین تأثیر عصاره بومادران بر آلبومین گلایکه شده استفاده کرد (19). در این پژوهش، نمونه های پروتئین آلبومین با متیل گلی اکسال (به عنوان عامل گلایکه کننده) در حضور و عدم حضور عصاره بومادران به مدت سه روز متوالی در دمای 50 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از پایان دوره انکوباسیون، جذب نمونهها در طول موج 340 نانومتر قرائت شد. گلایکیشن، رنگ محلول آلبومین را بعد از سه روز به میزانی تغییر داد که با افزایش جذب در مقایسه با نمونه کنترل مشخص شد. نتایج حاصل از تست Brownish (قهوهای شدن) نشان داد که در طی زمان انکوباسیون، جذب محلولهای پروتئین آلبومین (شکل5، الف) در حضور عامل گلایکهکننده متیلگلیاکسال در قیاس با نمونههای شاهد به طور معنیداری افزایش یافت و به سمت قهوهای شدن پیش رفت که تغییر رنگ ایجاد شده نمایانگر روند گلایکه شدن و تولید محصولات پیشرفته گلایکه بود. کاهش مقدار جذب در حضور عصاره بومادران در مقایسه با نمونه شاهد (آلبومین)، دلیل بر مهار فرآیند گلایکیشن است. کاهش قابل توجه گلایکیشن آلبومین، حاکی از عملکرد عصاره در کاهش واکنش میلارد و مراحل اولیه گلایکیشن پروتئین است. این بدان معنا است که عصاره بومادران از تغییر ساختارهای دوم آلبومین تحت فشار گلایکه شدن ممانعت کرده و این توانایی در A. pachycephala در مرحله %50 گلدهی به حداکثر میزان خود رسید.
قرمز کنگو (CR) معرف اختصاصی شناسایی فیبرهای آمیلوئیدی و تشکیل تودههای لخته مانند است (6). افزایش جذب نوری این ماده در 530 نانومتر میتواند ناشی از اتصال آن به ساختارهای بتا در پروتئین باشد. محققین نشان دادهاند که معرف قرمز کونگو به ساختارهای آمیلوئیدی موجود در قسمتهای بافتی اتصال پیدا میکند. این معرف رنگی، آزوسولفاتدار متقارن با مرکز هیدروفوبیک (شامل یک گروه بیفنیل) است که بین گروههای سولفات باردار قرار دارد. CR همچنین برای توصیف فیبرهای آمیلوئیدی در لوله آزمایش به کار میرود (25). هرچند مکانیسم واکنش بین CR و فیبرهای آمیلوئیدی هنوز به خوبی توصیف نشده است، ولی پیشنهاد شده که برخورد فضائی بین مولکول رنگ و صفحات بتای فیبرهای آمیلوئیدی، باعث ایجاد اتصالات هیدروژنی، اندرکنشهای هیدروفوبیکی و الکترواستاتیکی بین رنگ و فیبرهای آمیلوئیدی میشود. از آنجایی که ساختارهای بتا تشکیل شده در پروتئین های گلایکه شده، تمایل زیادی به معرف قرمز کنگو نشان می دهند (6)، در نتیجه این معرف برای تشخیص ساختارهای Cross-در پروتئین قنددارشده مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در غیاب عصاره، یعنی نمونه آلبومین گلایکه شده با متیلگلیاکسال در قیاس با نمونه شاهد پروتئین، تشکیل ساختارهای بتا در پروتئین قنددار شده به طور معنی داری تشدید شد و به صورت افزایش جذب قابل مشاهده بود (شکل5، ب). همچنین کاهش معنیدار جذب در حضور عصاره میتواند دلیلی بر تأثیر مهارکنندگی عصاره در ممانعت از قنددار شدن آلبومین و تشکیل ساختارهای بتا (تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی) در آن باشد. از طرفی، مشاهدات مبتنی بر اثر مهارکنندگی عصاره در تشکیل ساختارهای بتا آمیلوئیدی را که با کاهش جذب قرمز کنگو مشخص شد، با درجه آنتیاکسیدانی عصاره همسو بود. این همسوئی با مشاهدات آزمایش های قرمز کنگو و ارزیابی تغییرات خواص آنتیاکسیدانی در طی مراحل مختلف فنولوژیک ژنوتیپ
A.pachycephalaدر مرحله %50 گلدهی به بیشترین میزان خود رسید و خاصیت آنتی گلایکیشن نیز تا مرحله %50 گلدهی به طور قابل ملاحظهای افزایش و پس از این مرحله نموی مجدداً کاهش یافت (شکل5، ب).
از آنجا که واکنش های غیرآنزیمی گلیکوزیلاسیون پروتئینها در دیابت، عوارض مزمن ناشی از حضور ترکیبات اکسیدکننده (رادیکالهای آزاد)را تشدید میکنند، بنابراین شناسایی گیاهان دارویی با خواص آنتیاکسیدانی بالا در کاهش عوارض مذکور، بسیار مفید خواهد بود. از مجموع نتایج به دست آمده میتوان استنباط کرد که عصاره هیدروالکلی بومادران اثر مهاری قابل ملاحظهای بر گلایکیشن پروتئین آلبومین داشته که از نقطه نظر مکانیسمی با فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها همسو بود. درحقیقت، عصاره با به دام انداختن رادیکالهای آزاد ایجاد شده در واکنشهای گلیاکسیداسیون، اثر آنتیگلایکیشن خود را اعمال میکند و بدین ترتیب یکی از مهمترین عوارض دیابت، یعنی گلایکیشن پروتئینها را می تواند مهار کند. در پژوهشهای مختلف قدرت آنتی اکسیدانی عصاره گیاهان با خواص آنتی گلایکیشن آن ها بررسی و رابطه تنگاتنگی بین این دو خاصیت پیشنهاد شده است. یزدان پرست و همکاران (35) دریافتند که رابطه مستقیمی بین میزان فلاونوئید و خاصیت آنتیاکسیدانی گیاه بومادران (A. santolina) و درجه آنتی گلایکیشن گیاه وجود دارد. تفسیر ارائه شده در تحقیق حاضر، همچنین با یافته های آنتیاکسیدانی و آنتیگلایکیشن 23 گونه رازیانه و ارائه رابطه مستقیم بین میزان خاصیت آنتیاکسیدانی و آنتی گلایکیشن گیاه مطابقت دارد (28). مطالعات بر روی گونه های گیاه رازیانه نشان داده است که ترکیبات پلی فنولی با به دام اندازی رادیکالهای آزاد، باعث فعالیت ضدگلایکیشنی این گیاه هستند(28). در مریم گلی(Salvia sahendica) (31)، توت وحشی (wildberry) (15) و Houttuynia cordata (37) نیز چنین رابطه مستقیمی بین خاصیت آنتیاکسیدانی و خاصیت آنتیگلایکیشن مشاهده شده است.
شکل 5- الف) طیف سنجی مرئی- فرابنفش در طول موج 340 نانومتر و ب) طیف سنجی 530 نانومتر در حضور معرف کنگوقرمز نمونههای آلبومین کنترل، آلبومین گلایکه شده با متیل گلیاکسال و آلبومین گلایکه شده در حضورA.pachycephala در مراحل مختلف فنولوژیک
نتیجه گیری
بالا بودن قند خون به عنوان اصلیترین عامل در شروع و پیشروی عوارض دیابت معرفی شده است. غلظت بالا و پیوسته قند خون منجر به گلایکه شدن غیر آنزیمی و غیر قابل کنترل تمامی ماکرومولکول های حیاتی شامل پروتئینها، چربی ها و اسید های نوکلئیک میشود. پروتئینهای گلایکه شده نقشی اساسی درتشدید عوارض دیابت ایفا میکنند. در این راستا یافتن مهارکنندههایی با منشأ طبیعی برای ممانعت از فرآیند گلایکیشن ماکرومولکول ها با هدف کاهش این عوارض، ضروری بنظر میرسد. در پژوهش حاضر، با استفاده از روشهای ارزیابی درجه گلایکیشن در شرایط آزمایشگاهی، مشاهده گردید که عصاره هیدروالکلی بومادران بعنوان منبع غنی از آنتی اکسیدان، تأثیر قابل ملاحظهای بر مهار فرآیند گلایکیشن آلبومین دارد. از طرفی فعالیت آنتی اکسیدانی و آنتی گلایکیشن عصاره همسو با یکدیگر عمل نموده و در نتیجه خاصیت آنتیگلایکیشن نمونههای حاوی عصاره با فعالیت آنتیاکسیدانی آنها در ارتباط هستند. مقایسه ویژگی آنتیگلایکیشنی مراحل مختلف نمونهبرداری نشان داد همانگونه که خاصیت آنتیاکسیدانی در طی مراحل فنولوژیکی متغیر است و در مرحله %50 گلدهی به بیشترین میزان خود میرسد، خاصیت آنتیگلایکیشن نیز تا %50 گلدهی بطور قابل ملاحظهای افزایش و پس از این مرحله نموی مجدداً کاهش مییابد. با توجه به این که گیاه بومادران درطب سنتی وگیاهان داروئی بسیار مورد توجه است، زمان برداشت مناسب برای بهره وری بیشتر به عنوان روش مکمل در پیشگیری از بیماریهای ناشی از استرس اکسیداتیو و به ویژه جلوگیری از عوارض وخیم دیابت از اهمیت بالایی برخوردار است.
سپاسگزاری
بدین وسیله از دانشگاه صنعتی اصفهان برای فراهم آوردن هزینههای پژوهش قدردانی می گردد.