تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی با استفاده از دو روش مبتنی بر همولوژی­مدلینگ

صفا لطفی^*، مجتبی مرتضوی و علی ریاحی مدوار

کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 29/2/97                تاریخ پذیرش: 17/7/97

چکیده

پروتئین HMGB4 که در سال 2008 شناخته شد از اعضای خانواده پروتئینهای غیرهیستونی HMGB پستانداران است. پروتئینهای HMGB از طریق دو موتیف که بترتیب HMG-box A وHMG-box B نامیده می‌شوند به DNA اتصال می­یابند. پروتئینهای HMGB به DNA تغییر یافته با سیس­پلاتین اتصال یافته و مانع دسترسی عوامل ترمیم برشی DNA به این نقاط می­شوند. HMGB4 در مقایسه با HMGB1 عضو دیگر این خانواده با میل ترکیبی بالاتری به این نوع DNA اتصال یافته و با قدرت بیشتری ترمیم این نقاط آسیب­دیده را مهار می­نماید. بنظر می­رسد که حساسیت بسیار بالای تومورهای سلولهای زایای بیضه نسبت به سیس­پلاتین ناشی از بیان بسیار بالای HMGB4 در بافت بیضه باشد. در این مطالعه ساختار سوم HMGB4 انسانی با استفاده از نرم­افزار مدلر و سرور I-TASSER که هردو بر پایه هومولوژی مدلینگ عمل می­نمایند تعیین گردید. نتایج نشان می­دهد که مدلهای ایجاد شده توسط هردو روش از کیفیت و پایداری مناسبی برخوردار هستند. هرچند مدل I-TASSER در مقایسه با مدلر تفاوت مشاهده شده در ویژگیهای اتصال HMGB1 و HMGB4  به DNA پلاتینه را بهتر توجیه می­نماید. بر اساس نتایج حاصل، والین17 و فنیل­آلانین38 از HMG-box A و لوسین101 و والین120 از HMG-box B بنیانهایی هستند که با وارد شدن بین جفت بازهای شیار کوچک DNA موجب اتصال پروتئین HMGB4 به DNA می­شوند. همچنین نتایج نشان می­دهد که بخش انتهای کربوکسیل HMGB4 فاقد ساختار سوم منظم می­باشد. نتایج حاصل می­تواند به فهم بهتر ارتباط ساختار و عملکرد این پروتئین و همچنین  طراحی داروهای جدید ضدسرطان کمک شایانی نماید.

واژه­های کلیدی: پروتئین HMGB4، سیس­پلاتین، هومولوژی مدلینگ، نرم افزار مدلر، سرور I-TASSER

*  نویسنده مسئول، تلفن: ۰۳۴۳۳۷۷۶۶۱۱، پست الکترونیکی: safalotfi@ut.ac.ir

مقدمه

پروتئین های HMG ( (High Mobility Group (HMG) proteins، که اولین بار در سال 1973 شناسایی شدند بزرگترین گروه پروتئین های غیرهیستونی کروماتین را تشکیل می­دهند (12). پروتئین های HMGB که فراوان ترین گروه پروتئین های HMG در پستانداران می­باشند در تنظیم فعالیت­های متعددی نظیر نسخه برداری، همانندسازی، نوترکیبی V(D)J و ترمیم DNA مشارکت می­نمایند (3، 4، 7 و 29).  خانواده پروتئین­های HMGB متشکل از پروتئین های HMGB1 (HMG1، آمفوترین)، HMGB2 (HMG2)، HMGB3 و HMGB4 است. پروتئین های HMGB1-3 با وزن مولکولی تقریبا 25 کیلودالتون، از دو دومین اتصال یابنده به DNA به نام HMG box-A (باکس A) و HMG  box-B (باکس B)  و یک دم اسیدی طویل در انتهای کربوکسیل تشکیل شده اند (25، 26 و 39). پروتئین HMGB4  با وزن تقریبی 22 کیلودالتون که اولین بار در سال 2008 شناخته شد تنها عضو این خانواده است که فاقد دم اسیدی می­باشد (6). اولین بار مطالعات انجام گرفته در موش نشان داد که بیان پروتئین HMGB4 در بیضه ها بسیار بالا است، این در حالی است که این پروتئین در اغلب بافت ها بیان نمی­شود و یا در معدودی از بافت ها نظیر مغز بمیزان بسیار کمی بیان می‌گردد  (5، 6 و 20).

DNA هدف اصلی داروهای ضدسرطانی حاوی پلاتین (نظیر سیس پلاتین) محسوب می شود (9). این داروها با اتصال به نیتروژن شماره 7 بازهای پورین موجب ایجاد اتصالات متقاطع در ساختار DNA می­شوند (15). پروتئین هایHMGB  با میل ترکیبی بالایی به این ساختارهای متشکل از DNA-پلاتین اتصال یافته و مانع دسترسی عوامل ترمیم  DNAبه این نقاط می شوند و بنابرین اثر ضدسرطانی این داروها را تقویت می نمایند (14، 37). پروتئین HMGB4 در مقایسه با پروتئین HMGB1 با میل ترکیبی بالاتری به این ساختارها اتصال می یابد و همچنین با قدرت بیشتری ترمیم این نقاط آسیب دیده را مهار می نماید. بنظر می رسد که حساسیت بسیار بالای تومورهای سلول های زایای بیضه نسبت به سیس­پلاتین ناشی از بیان بسیار بالای این پروتئین در بافت بیضه باشد (19).

بطور کلی پیش­بینی ساختار سوم یک پروتئین با استفاده از توالی آمینوسیدی آن یک مسئله علمی اساسی محسوب می­شود. از بین انواع روش­های موجود برای تعیین ساختار پروتئین­ها، هومولوژی­مدلینگ بعنوان اولین و سریع ترین روش در نظر گرفته می شود. (31، 34). تا به امروز ساختار سوم HMGB4 در هیچکدام از گونه­های پستانداران تعیین نشده است. در این مطالعه، ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی با استفاده از نرم افزار مدلر و سرور I-TASSER تعیین گردیده است. در مجموع نتایج بدست آمده از این تحقیق می­تواند به فهم بهتر ارتباط بین ساختار و عملکرد این پروتئین و همچنین طراحی داروهای جدید ضد­سرطان کمک نماید.

مواد و روشها

بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی، ابتدا توالی این پروتئین با فرمت FASTA از پایگاه اطلاعاتی UniProt دانلود گردید. UniProt که یک پایگاه اطلاعاتی با کیفیت بسیار بالا است بطور رایگان قابل دسترس می باشد و اطلاعات کاملی را از عملکرد و توالی پروتئین­ها ارائه می دهد. بسیاری از ورودی های اطلاعاتی این سایت از پروژه های تعیین توالی ژنوم مشتق شده است. این سایت مقادیر بالایی از اطلاعات را در مورد عملکرد زیستی پروتئین­ها که از نتایج حاصل از تحقیقات علمی بدست آمده اند در اختیار محققین قرار می دهد (30).

بررسی کلی ساختار HMGB4 با استفاده از سایت PONDR: درگام اول بمنظور پیش­بینی ساختار کلی پروتئین HMGB4 و مشخص نمودن مناطقی از پروتئین که دارای ساختار سوم منظمو یا نامنظماست توالی پروتئین به سایت PONDR داده شد و نتایج بدست آمده مورد بررسی قرار گرفت. تنها داده­ای که PONDR برای پیش بینی مناطق منظم و نامنظم ساختار پروتئین ها به آن نیاز دارد توالی پروتئین مورد نظر است (35).

تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از دو روش مبتنی بر هومولوژی مدلینگ: هومولوژی­مدلینگ بر این واقعیت تکیه دارد که پروتئین­هایی که از لحاظ تکاملی به هم مرتبط هستند ساختار مشابهی را نیز دارا می­باشند. در این روش، ساختار سوم یک توالی پروتئینی خاص (هدف: Target) از طریق همترازسازیآن با توالی یک یا بیش از یک پروتئین با ساختار مشخص (الگو: Template) پیش بینی می­شود. اولین مرحله در هومولوژی­مدلینگ تشخیص کلیه ساختارهای پروتئینی مرتبط با توالی هدف می باشد. سپس از بین این ساختارها، الگوهای مناسب انتخاب می­شوند. سپس توالی پروتئین هدف با توالی الگو(ها) همترازسازی شده و در نهایت مدل­های سه بعدی از پروتئین موردنظر ساخته می شود. در مرحله آخر مدل های ساخته شده مورد ارزیابی قرار می گیرند (10).

تعیین ساختار سوم HMGB4 با استفاده از نرم افزار مدلر: مدلر یک برنامه کامپیوتری است که ساختار سوم پروتئین­ها را بر پایه هومولوژی مدلینگ پیش بینی می­نماید. برای تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4، نسخه 9.15 نرم افزار مدلر مورد استفاده قرار گرفت. تعیین ساختار سوم پروتئین­ها با نرم­افزار مدلر که از زبان برنامه نویسی پایتون استفاده می­نماید شامل چندین مرحله می شود. همه این مراحل ساخت یک فایل پایتون (با پسوند .py) و اجرای آن با استفاده از نرم افزار مدلر را شامل می­شود. در ذیل این مراحل بطور خلاصه ذکر شده است: 1- جستجوی پروتئین­هایی که توالی آمینواسیدی آن ها به HMGB4 شباهت دارد و ساختار سوم آن ها تعیین شده است. 2- انتخاب یکی از این پروتئین ها بعنوان الگوبرای مدل سازی. 3- همتراز کردن توالی الگو و توالی HMGB4. 4- مدل سازی و انتخاب مناسب ترین مدل از بین مدل های ساخته شده. 5- ارزیابی مدل ساخته شده  (10، 11 و 23). بمنظور مشاهده و بررسی مدل های ایجاد شده از نرم افزارهای PyMOL و Swiss PDB Viewer استفاده گردید.

تعیین ساختار سوم HMGB4 با استفاده از سرور I-TASSER : سرور I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) یک سرویس اینترنتی است که با استفاده از یک روش سلسله مراتبی ساختار و عملکرد یک پروتئین را پیش بینی می نماید. I-TASSER عنوان سرور شماره یک را برای  پیش بینی ساختار پروتئین در آزمایش های CASP7، CASP8، CASP9، CASP10 و CASP11  (CASP: Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction)، به خود اختصاص داده است. این سرور همچنین در آزمایش CASP9 بعنوان بهترین سرور برای پیش بینی عملکرد پروتئین شناخته شده است (21، 36 و 38). بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از سرور ­I-TASSER توالی این پروتئین به سرور مورد نظر داده شد. I-TASSER، بمنظور انجام فرایند مدلینگ، از متاسرور LOMETS برای جستجوی الگوهای ساختاری در کتابخانه PDB (Protein Data Bank) استفاده می نماید. این متاسرور متشکل از چندین برنامه threading است. این برنامه­های threading  عبارتند از: 1)MUSTER  2) FFAS-3D  3) SPARKS-X 4) HHSEARCH2 5) HHSEARCH I 6) Neff-PPAS  7) HHSEARCH 8) pGenTHREADER  9) wdPPAS 10)cdPPAS (33). در مجموع پنج مدل برای HMGB4 توسط I-TASSERR ساخته شد که بر اساس C-score بهترین مدل انتخاب گردید. درجه قابل اطمینان بودن یک مدل پروتئینی ایجاد شده توسط I-TASSER به صورت کمی توسط C-score  اندازه گیری می­شود و بنابراین مدلی با بالاترین میزان C-score بهترین مدل شناخته می شود. مقادیر C-score بین 5- تا 2 متغیر است.

نتایج

در مرحله اول بمنظور پیش بینی ساختار کلی پروتئین HMGB4 و تعیین مناطقی از پروتئین که دارای ساختار سوم منظم و یا نامنظم است توالی پروتئین HMGB4 به سرور PONDR داده شد و نتایج مورد بررسی قرار گرفت. نواحی فاقد ساختار مشخص (دارای ساختار نامنظم) می تواند کل یک پروتئین و یا بخش هایی از پروتئین را شامل شود. در واقع این نواحی که اساسا یا بطور نسبی و یا بطور کامل فولد نشده اند فاقد یک ساختار سوم مشخص می باشند. تحقیقات نشان می دهد که این نواحی در فعالیت­های متعددی نظیر تشخیص DNA، تنظیم میل ترکیبی و یا ویژگی اتصال و کنترل طول عمر پروتئین ها نقش دارند. اگر چه این نواحی، در وضعیت های طبیعی فاقد ساختار سوم مشخص هستند اما ممکن است در نتیجه اتصال به مولکول­های دیگر انتقال از حالت نامنظم به منظم را طی نمایند (35).  نتایج بدست آمده از این بخش در شکل 1 نمایش داده شده است. همانطور که  بخوبی در شکل مشخص است محور X شماره آمینواسیدها و محور Y، PONDR Score را مشخص می­نماید. بخش هایی از پروتئین که دارای PONDR Score بالای 5/0 است نشان دهنده مناطقی است که فاقد ساختار منظم است.

 شکل 1- پیش بینی بخش هایی از پروتئین HMGB4 که فاقد ساختار سوم مشخص است با استفاده از سرور PONDR

همانطور که در بخش مواد و روش ها اشاره شد بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی، ابتدا توالی این پروتئین از پایگاه اطلاعاتی UniProt دریافت شد و سپس طی چند مرحله با استفاده از نرم افزار مدلر (نسخه 9.15) ساختار این پروتئین تعیین گردید. در اولین مرحله پروتئین هایی که توالی آمینواسیدی آن ها به HMGB4 شباهت دارد و فایل PDB آن­ها موجود است جستجو شدند. نتایج در شکل 2 نمایش داده شده است. ستون یک کد PDB و نوع زنجیره (A، B و ....)، ستون پنج تعداد بنیان­های آمینواسیدی هر PDB، ستون هفت درصد تشابه توالی HMGB4 و توالی PDB  مورد نظر که بوسیله طول همترازسازی یکدست شده است، ستون هشت مقادیر E-value همترازسازی را نمایش می­دهد. تمام PDBهایی که E-value همترازسازی برابر با صفر دارند در شکل با بیضی های قرمز مشخص شده­اند. با توجه به نتایج بدست آمده 2yrq بهترین الگویی است که می­توان از آن در مدلسازی پروتئین HMGB4 استفاده نمود. زیرا درصد تشابه آن با HMGB4، 17/44%  و E-value همترازسازی آن برابر صفر است. 2yrq درواقع باکس A و B پروتئین HMGB1 انسانی (بنیان­های 166-1) است که از طریق روش NMR تعیین ساختار شده است (28) اگرچه 2rtu و 1j3x درصد تشابه توالی بالاتری نسبت به 2yrq دارند و E-value همترازسازی آن ها نیز صفر است ولی تعداد بنیان های آمینواسیدی آن ها نسبت به 2yrq بسیار کمتر است. زیرا 2rtu تنها باکس A پروتئین HMGB1 انسانی (32) و 1j3x دومین N-ترمینال HMGB2 گراز وحشی (16) را شامل می­شود. پس با توجه به اینکه 2yrq هر دو باکس  A و B  را در بر می­گیرد الگوی کاملا مناسبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب می­شود.

شکل 2- نتایج حاصل از جستجوی پروتئین هایی با ساختار سوم مشخص که درصد تشابه توالی بالایی با پروتئین HMGB4 دارند با استفاده از نرم افزار مدلر. مواردی که با بیضی های قرمز مشخص شده اند همگی دارای E-value همترازسازی برابر با صفر می باشند. اما بدلایلی که در متن ذکر شده است 2yrq بعنوان الگو برای مدلسازی HMGB4 در نظر گرفته شد.

در مرحله بعد توالی 2yrq و HMGB4 با استفاده از روش align2d همتراز­سازی شدند. این روش همترازسازی که توسط نرم­افزار مدلر استفاده می شود بر پایه یک الگوریتم برنامه نویسی پویا بنیان نهاده شده است و با روش­های همترازسازی توالی-توالی متداول تفاوت دارد زیرا align2d بمنظور ایجاد همترازسازی، اطلاعات ساختاری از الگو را نیز مد نظر قرار می­دهد (10). پس از اجرای همترازسازی، مدل­سازی انجام گرفت. در مجموع پنج مدل ساخته شد که بر اساس مقادیر DOPE و GA341 بهترین مدل انتخاب گردید. در واقع مدلی که کمترین میزان DOPE و بیشترین میزان GA341 را داشته باشد بهترین مدل محسوب می شود. مقادیر GA341 بین صفر تا یک متغیر است. با توجه به اینکه مقادیر GA341 پنج مدل بسیار به یکدیگر نزدیک بود و DOPE نسبت به GA341 فاکتور قابل اطمینان تری برای تعیین مدل مناسب محسوب می شود مدل دو با کمترین میزان DOPE (-13290.73340) بعنوان بهترین مدل در نظر گرفته شد.

شکل 3-الف بهترین مدل ایجاد شده توسط نرم افزار مدلر (مدل دو) را که از طریق نرم افزار  PyMOLمشاهده شده است نمایش می دهد. اگرچه 2yrq الگوی مناسبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب می شود اما بیش از 20 اسیدآمینه انتهایی HMGB4 معادلی در 2yrq ندارند و در نتیجه مدلر این بخش انتهایی را بدون استفاده از الگو می سازد. البته با توجه به نتایج بدست آمده از سرور PONDR (شکل 1) بخش انتهایی پروتئین HMGB4 فاقد ساختار سوم مشخص است.

بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از سرور I-TASSER، توالی این پروتئین به فرمت FASTA از پایگاه اطلاعاتی UniProt دریافت شد و در اختیار سرور مورد نظر قرار گرفت. از بین پنج مدل ساخته شده توسط I-TASSER، مدل یک با بیشترین میزان C-score  (76/0-) بعنوان بهترین مدل در نظر گرفته شد. شکل 3-ب مدل یک را که با استفاده از نرم افزار PyMOL مشاهده شده است نمایش می دهد.

شکل 3- بهترین مدل ساخته شده از پروتئین HMGB4 توسط نرم افزار مدلر (الف) و سرور I-TASSER (ب) که با استفاده از نرم افزار PyMOL مشاهده شده است.

همانطور که در بخش مواد و روش­ها اشاره شد فرایند مدلینگ توسط I-TASSER با جستجوی الگوهای ساختاری در کتابخانه PDB توسط LOMETS آغاز می­شود. سرور I-TASSER در مجموع از دو ساختار PDB بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 استفاده نمود (داده ها نمایش داده نشده است). یکی از این ساختارها که توسط هشت برنامه threading سرور LOMETS بعنوان بهترین الگو معرفی شد زنجیره A 2yrq (2yrqA) است که در واقع ساختار محلول باکس A و B پروتئین HMGB1 انسانی (بنیان های 166-1) می باشد (28) و توسط برنامه مدلر نیز بعنوان الگو انتخاب گردید. همچنین زنجیرهA  3tq6 (3tq6A) که ساختار کریستال فاکتور نسخه برداری A میتوکندریایی (TFAM) انسانی است (22) توسط دو برنامه threading بعنوان الگو انتخاب شد. همانطور که قبلا اشاره گردید هرچند 2yrq الگوی بسیار خوبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب می­شود اما بیش از 20 اسیدآمینه انتهایی HMGB4 معادلی در 2yrq ندارند و بنابراین برای ایجاد یک مدل که تمام طول HMGB4 را پوشش دهد نمیتوان فقط از 2yrq بعنوان الگو استفاده نمود. بنابراین سرور I-TASSER بمنظور ایجاد این نوع مدل، 2yrq و 3tq6 را بطور همزمان بعنوان الگوی مدلسازی مورد استفاده قرار داد.

همانطور که قبلا در بخش مقدمه اشاره شد پروتئین­های HMGB از طریق HMG-boxهای  A و B به DNA متصل می شوند. هر دومین HMG-box که تقریبا دارای 75 اسید آمینه است از سه آلفا هلیکس که بفرم L و با زاویه تقریبی 80 درجه فولد شده اند تشکیل شده است. در شکل 3 بخوبی مشخص است که ساختار پروتئین HMGB4 نیز از دو HMG-box A و B  تشکیل شده است. در واقع نحوه اتصال پروتئین­های HMGB به DNA بگونه ای است که بنیان­های آمینواسیدی حجیم هیدروفوب قرار گرفته در سطح مقعر HMG-boxهای A و B بین جفت بازهای شیار کوچک DNA قرار می­گیرند. در پروتئینHMGB1 ، آلانین 17 و فنیل آلانین 38 از باکس A و فنیل آلانین 103 و ایزولوسین 122 از باکس B این مسئولیت را بر عهده دارند (27). بررسی هم­ترازسازی­های انجام شده توسط نرم افزار مدلر و سرور I-TASSER، بنیان­های معادل این بنیان ها را در HMGB4 مشخص می­نماید (هم­ترازسازی­ها نمایش داده نشده است). والین 17 و فنیل­آلانین 38 از باکس A و لوسین 101 و والین 120 از باکس B بنیان های حجیم هیدروفوبی هستند که در اتصال پروتئین HMGB4 به DNA نقش دارند. همانطور که مشخص است از این چهار اسیدآمینه فقط یکی از آنها (فنیل آلانین 38) در هر دو پروتئین HMGB4 و HMGB1 حفظ شده است (19). شکل 4 موقعیت قرارگیری این بنیان های حجیم هیدروفوب را در پروتئین­های HMGB1 (2yrq) و HMGB4 (مدل های ایجاد شده توسط مدلر و I-TASSER) نشان می­دهد.

شکل 4-مقایسه ساختار پروتئین HMGB1 ((2yrqA (الف) با مدل های ایجاد شده از ساختار پروتئین HMGB4 توسط نرم­افزار مدلر (ب)  و سرور I-TASSER (ج). بنیان های حجیم هیدروفوب از HMG-box A و HMG-box B که با وارد شدن به درون شیار کوچک DNA  موجب اتصال این پروتئین­ها به DNA  می شوند به فرم کروی مشخص گردیده اند.

بحث

تعیین ساختار سوم پروتئین ها با استفاده از روش های آزمایشگاهی همیشه بهترین گزینه بشمار نمی رود. زیرا علاوه بر آنکه این روش ها نیازمند صرف زمان و هزینه بالا هستند برای برخی از پروتئین ها قابل اجرا نمی باشند. امروزه روش های مبتنی بر هومولوژی مدلینگ بدلیل آنکه سریع­تر و کم هزینه­تر از روش های آزمایشگاهی هستند از اهمیت بسیار بالایی برای تعیین ساختار پروتئین­ها برخوردار می باشند (31). همچنین پیشرفت­های علمی بدست آمده در این زمینه منجر به افزایش روز­افزون قابلیت اطمینان و دقت این روش ها شده است. تعیین ساختار سوم پروتئین ها از بسیاری از جهات حائز اهمیت فراوان است (34). بسیاری از ترکیباتی که امروزه بعنوان دارو برای درمان بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرند در واقع عملکرد خود را از طریق میانکنش با یک پروتئین خاص انجام می دهند. بمنظور طراحی این نوع داروها ابتدا باید ساختار سوم پروتئین مورد نظر وجود داشته باشد. در ضمن با توجه به اینکه بین ساختار و عملکرد یک پروتئین رابطه تنگاتنگی وجود دارد تعیین ساختار سوم یک پروتئین به فهم بهتر عملکرد آن پروتئین کمک شایانی می­نماید  (2، 10و 31).

پروتئین HMGB4 که در سال 2008 شناسایی شد از اعضای خانواده پروتئین های HMGB است (6). این خانواده که علاوه بر HMGB4 از سه عضو دیگر به نام های HMGB1، HMGB2 و HMGB3 تشکیل شده است فراوان ترین گروه پروتئین های غیرهیستونی HMG را تشکیل می دهد (26). پروتئین HMGB4 بر خلاف سایر اعضای این خانواده که همگی بعنوان فعال کننده های نسخه برداری عمل می نمایند یک مهارکننده توانمند فرایند نسخه برداری محسوب می شود (6). تا به امروز ساختار سوم پروتئین HMGB4 در هیچکدام از گونه های پستانداران تعیین نشده است. در مطالعه حاضر بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی از دو روش که هر دو بر پایه هومولوژی مدلینگ بنا شده اند استفاده گردید. در یکی از این روش ها نرم­افزار مدلر برای تعیین ساختار سوم این پروتئین مورد استفاده قرار گرفت و در روش دیگر از سرورI-TASSER  برای مدلسازی استفاده شد.

همانطور که بخوبی در مدل­های ایجاد شده توسط نرم افزار مدلر (شکل 3-الف) و سرور I-TASSER (شکل 3-ب) مشخص است پروتئین HMGB4 همانند سایر اعضای خانواده پروتئین های HMGB دارای دو دومین HMG-box A و B برای اتصال به DNA می­باشد. این پروتئین ها بمنظور اتصال به DNA،  بنیان های حجیم هیدروفوب قرار گرفته در سطح مقعر این دو دومین را بین جفت بازهای شیار کوچک DNA وارد می نمایند (1 و26). در شکل 4 موقعیت قرارگیری این بنیان­های حجیم هیدروفوب در پروتئین های HMGB1 و HMGB4 مشخص شده است. از بین این چهار بنیان تنها فنیل­آلانین 38 در هر دو پروتئین حفظ شده است. همانطور که در بخش مقدمه اشاره شد پروتئین های HMGB با اتصال به DNA پلاتینه حاصل از میانکنش داروهای ضدسرطان پلاتینه نظیر سیس­پلاتین با DNA مانع دسترسی سیستم ترمیم DNA به این نقاط و در نتیجه موجب تقویت اثر ضدسرطانی این نوع داروها می­شوند. تحقیقات نشان می­دهد که فنیل­آلانین 38 که در HMGB4 موش نیز وجود دارد نقش بسیار مهمی در اتصال پروتئین های HMGB به DNA پلاتینه ایفا می نماید (13، 17، 19 و 24). بررسی نحوه قرارگیری این بنیان در مدل های ایجاد شده توسط مدلر و I-TASSER و مقایسه آن با فنیل آلانین 38 پروتئین HMGB1 (2yrq) اطلاعات جالبی را ارائه می دهد  (شکل 5). در این شکل دو پروتئین HMGB4 و HMGB1 با استفاده از گزینه "iterative magic fit" نرم افزار Swiss PDB Viewer بر روی یکدیگر منطبق شده اند و موقعیت فنیل آلانین 38 در این دو پروتئین مقایسه شده است. در مدل ایجاد شده توسط I-TASSER زنجیره جانبی این بنیان نسبت به بنیان معادلش در HMGB1 بنحو متفاوتی جهت گیری می نماید در حالی که در مدل مربوط به مدلر این جهت گیری متفاوت مشاهده نمی شود. نتایج حاصل از تحقیقات In vitro نشان می دهد که میل ترکیبی HMGB4 و HMGB1 برای اتصال به DNA پلاتینه و همچنین توانایی آنها برای ممانعت از ترمیم این نقاط توسط سیستم ترمیم DNA تفاوت معنی­داری را نشان می­دهد (19). با توجه به اینکه فنیل آلانین 38 نقش بسیار مهمی را در فرایند اتصال این دو پروتئین به DAN پلاتینه ایفا می نماید بنظر می­رسد که مدل ساخته شده توسط I-TASSER در مقایسه با مدلر این اختلاف را بنحو بسیار خوبی توجیه می نماید. همچنین مطالعات انجام گرفته در زمینه مقایسه کیفیت مدل های پروتئینی ساخته شده توسط چندین روش متفاوت مبتنی بر هومولوژی مدلینگ نشان می دهد که سرور I-TASSER در بین این روش ها بهترین عملکرد را دارد که نتایج بدست آمده در این مطالعه با نتایج مربوط به این تحقیق مطابقت دارد (8).

شکل 5- مقایسه نحوه جهت­گیری زنجیره جانبی بنیان فنیل­آلانین 38 در پروتئین HMGB1 ((2yrqA و مدل های ایجاد شده از پروتئین HMGB4 توسط سرور I-TASSER (الف) و نرم افزار مدلر (ب).