مروری بر سیستم CRISPR/Cas9بعنوان ابزار ویرایش ژنوم کارآمد در توسعه گیاهان تراریخته

شهنوش نیری¹، مسعود توحیدفر²، عباس سعیدی^3*

تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فنآوری زیستی ، گروه علوم و زیست فناوری گیاهی

تاریخ دریافت: 28/6/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

سیستم تناوب‌های کوتاه پالیندروم فاصله‌دار منظم خوشه‌ای Cas9 (CRISPR/Cas9) یکی از روش‌های موثر و جدید ویرایش هدفمند ژنوم است که در جهت ارتقای کیفیت و عملکرد گیاهان زراعی و ایجاد صفات جدید گیاهی مورد استفاده است. سازوکار CRISPR/Cas9 بطور گسترده در ویرایش ژنوم، خاموشی ژن، کنترل فرآیند رونویسی همراه با اختصاصیت بالا و کاهش اثرات توالی‌های غیرهدف توسط برش‌های دورشته ای (DSBs) در DNA ژنومی و تغییر در توالی نوکلئوتیدی ژن هدف در بسیاری از سیستم‌های گونه‌های متنوع گیاهی و جانوری توسعه یافته است. در این مقاله مروری، جنبه‌های وسیع کاربرد سیستم CRISPR/Cas9 در ویرایش هدفمند ژنوم جهت توسعه گیاهان ویرایش ژنتیکی شده، دستیابی به تطابق محیطی و کشاورزی بیوانرژیک و ملاحظات زیست محیطی و مقبولیت جوامع بشری این سیستم را به اجمال مرور می‌شود. توسعه گیاهان زراعی ویرایش ژنتیکی (GE) به طور کامل مشابه با گیاهان زراعی اصلاحی معمول نشاندهنده کارآمدی و پایداری این محصولات در شرایط مختلف آب‌وهوایی بوده، از نظر پذیرش اجتماعی، ملاحظات زیست محیطی و سلامت انسان، تراریخته در روند آزادسازی در اولویت مصرف هستند.

واژه های کلیدی: گیاهان زراعی ویرایش ژنتیکی شده، ویرایش ژنوم گیاهی، Cas9/gRNA، CRISPR/Cas9

^* نویسنده مسئول ، تلفن: 29903244-021 ، پست الکترونیکی: abbas.saidi@gmail.com

مقدمه

ویرایش هدفمند ژنوم با استفاده از نوکلئازهای اختصاصی پتانسیل بسیار بالایی را برای بهبود کیفیت و عملکرد گیاهان زراعی در جهت تامین نیاز غذایی مردم جهان و فراهم کردن یک سیستم کشاورزی پایدار و پرمحصول ایجاد کرده است (52). در اصلاح نباتات سنتی، گیاهان زراعی توسط روش‌های معمول اصلاح نباتات، دورگ‌گیری و تلاقی‌های برگشتی و جهش اصلاح می‌شوند. در حال حاضر بدلیل اثرات انکارناپذیر اصلاح نباتات سنتی از جمله کاهش تنوع گیاهی، نبود ژرم پلاسم، نیاز به وجود گونه‌های خویشاوند و سازگار جنسی گیاه هدف، صرفه هزینه بالا و زمان‌بر بودن فرآیندهای اصلاحی، از ایرادهای این روش اصلاحی است (6). چراکه، امروزه تولید غذا، هم از ابعاد کمی و کیفی و نیز تولیدات جدید گیاهی در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته، نمی‌تواند صرفا به کشاورزی سنتی متکی باشد. تامین امنیت غذایی جامعه و نیاز به افزایش مداوم تولیدات کشاورزی بستگی به مسلح شدن و در آمیختن موثر اصلاح نباتات سنتی با زیست فناوری نوین و ابزار قوی مهندسی ژنتیک دارد. مهندسی ژنتیک پیچیده‌ترین شاخه زیست فناوری است که شامل روش‌های انتخاب ژن مورد نظر، مکان‌یابی، جداسازی، خالص‌ سازی، تکثیر و انتقال ژن‌ها و ارزیابی بروز آنها در موجود زنده است. در حال حاضر، اهمیت و توانایی بسیار بالای مهندسی ژنتیک با ایجاد تغییر و تحول هدفمند در ژنوم گیاهان و جانوران در جهت رفع بسیاری از محدودیت‎‌های اصلاح نباتات سنتی، ایجاد خصوصیات جدید و بهبود کمیت و کیفیت محصولات غذایی توسط تولید گیاهان زراعی و باغی تراریخته بر کسی پوشیده نیست. اگرچه، زیست فناوری نوین به عنوان یکی از راه‌های تولید محصولاتی که کاربردهای گسترده‌ای در پزشکی، کشاورزی و صنعتی دارند، مورد قبول واقع شده است ولی در نظر گرفتن جنبه‌های ایمنی موجودات زنده اصلاح شده ژنتیکی یا تراریخته (LMO) و فرآورده‌های حاصل از آنها نیز باید قبل از استفاده دقیقا مورد بررسی قرار گیرد. از مهمترین ملاحظات تاثیرگذار در بهره‌برداری از محصولات تراریخته، دخول قطعات DNA غیر گیاهی به ژنوم گیاه والد، فرار ژن و انتقال عمودی ژن هدف، ژن‌های گزینشگر مانند ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک و علف‌کش نام برده می‌شود (26، 27 و 47). بنابراین، نیاز به استفاده از روش‌های پیشرفته تولید گیاهان تراریخته مانند تناوب‌های کوتاه پالیندروم فاصله‌دار منظم خوشه‌ای Cas9 (CRISPR/Cas9) که نوعی روش ویرایش ژنوم است، جهت بهبود کیفیت و عملکرد موثر گیاهان زراعی با کارایی بالا بیش از پیش احساس می‌شود. به طوری که این سیستم با ایجاد جهش‌هایی در مکان‌های ژنی چندگانه و ایجاد حذف‌های بزرگ می‌تواند اصلاح گیاهان را بدون انتقال ژن خارجی شتاب دهد. این روش می‌تواند عملکرد و فعالیت ژن‌های گیاهی را بهبود بخشیده و صفات جدید ایجاد کند (58). در طول 3 سال گذشته، فرآیند این تکنیک‌ پیشرفته به طور گسترده‌ای توسط مثال‌های متعددی از ایجاد جهش‌های هدفمند و تنظیم کنترل فرآیند نسخه‌برداری در انواع گیاهان زراعی مورد بررسی قرار گرفته است و این امر جنبه تاثیرگذار این سیستم جدید را به نمایش گذاشته است (30). تاکنون سیستم Cas9 به طور گسترده در خاموشی ژن، جایگزینی ژن، ویرایش چندگانه ژن‌ها، شناسایی عملکرد ژن و در تنظیم فرآیند نسخه‌برداری در جانوران و گیاهان مورد استفاده قرار گرفته است (31).

در اینجا، بر آن داریم که جنبه‌های وسیع کاربردی آنزیم نوکلئاز Cas9 در ویرایش هدفمند ژنوم گیاهان جهت توسعه گیاهان تراریخته را به صورت اجمالی مرور کنیم. در این مقاله، همچنین فرصت‌های ویرایش هدفمند ژنوم توسط سیستم Cas9/short guide (sg)RNA برای دستیابی به تطابق محیطی و کشاورزی بیوانرژیک و توسعه گیاهان تراریخته توسط این فناوری پیشرفته در موازات رفع شک و تردیدهای ایمنی زیستی، نگرانی زیست محیطی و مقبولیت جوامع بشری مورد بررسی قرار گرفته است.  

مروری بر سازوکار سیستم CRISPR/Cas9 : سیستم CRISPR/Cas برای اولین بار در سال 1987 در ژنوم باکتری Escherichia coli به عنوان یک سیستم ایمنی اکتسابی در برابر هجوم باکتریوفاژها و ورود DNA خارجی مانند پلاسمیدها به درون سلول باکتری شناسایی شد و به دنبال آن در سال 2000 میلادی خانواده‌های ژنی CRISPR در تمام پروکاریوت‌ها شناسایی شد (21 و 38). بر اساس دانسته‌های برگرفته از پایگاه داده‌های CRISPRdb (http//: www.crispr.i2bc.paris-saclay.fr)، مکان ژنی CRISPR در حدود 84% در ژنوم archaea و 45% در ژنوم باکتری‌ها وجود دارد (14). سیستم CRISPR از دو ناحیه شامل ژن‌های رمز کننده آنزیم‌های نوکلئازی Cas و مکان ژنی آرایه‌های CRISPR (CRISPR array) حاوی توالی‌های تکراری (repeat sequence) و توالی‌های فاصله دهنده (spacer sequence) مابین آنها تشکیل شده است. طول توالی‌های تکراری در حدود 50-25 جفت باز و به تعداد بیش از 249 عدد و ناحیه فاصله دهنده محتوی توالی‌های غیر تکراری در حدود 72-26 جفت بازی است (31). همچنین توالی رهبر به طول تقریبی 500-200 جفت باز از توالی‌های غنی از AT تشکیل شده که به عنوان یک توالی پیشبر (Promoter) برای نسخه برداری آرایه‌های مکان ژنی CRISPR ضروری است. ژن‌های (Cas) CRISPR associated به تعداد 4 عدد (Cas 1-4) در نزدیک ناحیه CRISPR array قرار گرفته‌اند که رمز کننده پروتئین‌های ضروری جهت القای پاسخ ایمنی توسط باکتری در برابر حمله ویروس هستند (شکل 1(الف)) (31 و 45).

شکل 1- مکان ژنی CRISPR و ژن‌های Cas بهمراه سازوکار CRISPR/Cas. الف) A) مکان ژنی CRISPR شامل توالی‌های تکراری پالیندرومیک به طول 47-24 جفت باز (مربع‌های قرمز) که توسط توالی فاصله دهنده به طول 72-26 جفت باز از هم جدا شده اند (مربع‌های آبی). بیشترین تعداد توالی‌های تکراری 249 عدد است. B) ژن‌های پروتئین Cas در نزدیکی مکان ژنی CRISPR (31 و 45). ب) در مرحله اول انتهای ′3 توالی protospacer به مکان ژنی کروموزومی CRISPR در موقعیت مابین توالی رهبر و توالی تکرار شونده اول قرار می‌گیرد. سپس یک واکنش ترانس – استریفیکاسیون (TES) (فلش زرد 1) توسط پروتئین نوکلئاز Cas1 انجام شده و توالی protospacer به انتهای ′5 توالی تکراری 1 می‌پیوندد. در برخی از مواقع واکنش معکوس این مرحله هم می‌تواند رخ دهد. در مرحله 2، یک واکنش TES دیگر (فلش زرد 2) رشته دیگر protospacer  را به انتهای ′5 رشته sense توالی تکراری اول متصل می‌کند که منجر به ایجاد یک فضای خالی در دوپلکس DNA می‌شود. در مرحله 3، فضای خالی دوپلکس توسط سیستم تکثیر DNA سلول میزبان ترمیم شده و درنتیجه یک قطعه DNA فاصله دهنده جدید در موقعیت اول اضافه می‌شود (43). ج) در مرحله انطباق توالی protospacer سازوکار CRISPR، این توالی دو رشته‌ای می‌تواند تحت تاثیر پروتئین هلیکازی Cas3 قرار گرفته و تبدیل به سوبسترای مناسبی برای پروتئین Cas4 باشد. فعالیت پروتئین Cas4 منجر به ایجاد دو انتهای تک رشته‌ای ′3 در protpspacer می‌شود که امکان درج آن را در مکان ژنی CRISPR کروموزومی ایجاد می‌کند (57). د) تنوع سازوکار‌های پردازش crRNA. در سیستم CRISPR نوع II، توالی tracrRNA با توالی‌های تکراری pre-crRNA دورگ شده و تشکیل دوپلکس gRNA را می‌کنند که این دوپلکس gRNA می‌تواند سوبسترای مناسبی برای تجزیه اندونوکلئازی توسط یک آنزیم RNaseIII (PDB ID: 2EZ6) بهمراه Cas9 باشد. در مرحله بعد انتهای ′5 توالی تکراری توسط آنزیم‌های نوکلئازی نامشخص (فلش‌های قرمز) ویرایش می‌شود (49).  

به طور کلی سیستم طبیعی CRISPR/Cas از سه مرحله تشکیل شده است:

1 - مرحله انطباق (Adaptation): زمانی که سلول باکتریایی مورد هجوم باکتریوفاژها قرار می‌گیرد، ژنوم ویروس وارد سلول میزبان شده و قسمت کوچکی از ژنوم ویروس به طول تقریبی 72-26 جفت باز به نام protospacer در مکان ژنی CRISPR مابین اولین توالی تکراری (inverted repeats) و انتهای ناحیه پیشبری مکان ژنی CRISPR به عنوان توالی spacer غیرتکراری جدید درج می‌شود. نحوه انجام این مرحله به طور کامل مشخص نیست. با این حال دو نوع از پروتئین‌های Cas به نام‌هایCas1  و Cas2 تشکیل یک ساختار پروتئینی تترامی را می‌دهند که توالی DNA protospacer (به طول تقریبی 71-26 جفت باز) ویروس را از ناحیه موتیف مجاور protospacer (PAM) شناسایی کرده و طی یک واکنش آنزیمی به انتهای ′3 توالی رهبر (leader) اضافه می‌کند. در مرحله بعدی توسط آنزیم‌های پلیمرازی و آنزیم لیگاز موجود در باکتری عمل ویرایش و سنتز رشته مکمل توالی‌های تکراری انجام می‌شود (شکل 1(ب)) (19 و 43). البته این سیستم ادغام توالی protospacer در مکان ژنی CRISPR با شبهاتی همراه است. بر اساس مطالعات انجام گرفته علاوه بر پروتئین‌های نوکلئازی Cas1 و Cas2، نوع دیگری از پروتئین Cas به نام Cas4 شناسایی شده است که با فعالیت اگزونوکلئازی در جهت ′5 به ′3 و با ایجاد 3′-overhang امکان ادغام protospacer به مکان ژنی CRISPR را فراهم می‌کند (شکل 1(ج)) (57).

2 - مرحله سنتز و پردازش crispr RNA (crRNA): درنتیجه انجام فرآیند نسخه برداری از مکان ژنی CRISPR یک توالی RNA تک رشته‌ای به هم پیوسته از توالی‌های تکراری (حاوی نواحی پالیندرومیک) و توالی‌های spacer غیرتکراری ایجاد می‌شود. به طوری که نواحی پالیندرومیک ساختار ساقه-حلقه یا pre-crRNA یا CRISPR RNA اولیه را تشکیل می‌دهند. در نهایت پردازش crRNA اولیه (CRISPR RNA processing) توسط نوکلئازی پروتئین‌های Cas انجام گرفته و crRNAهای بالغ را ایجاد می‌کند. در سیستم CRISPR/Cas به طور کلی سه نوع سیستم پردازش و سنتز crRNA به نام سازوکار‌های پردازش I، II و III در باکتری‌ها شناسایی شده است که توسط پروتئین‌های نوکلئازی مختلف Cas ایجاد می‌شوند. بر اساس پژوهش‌های صورت گرفته، سازوکار تیپ II مبتنی بر پروتئین SpCas9 مستخرج از باکتری
Streptococcus pyogenes بطور گسترده در ویرایش ژنوم گونه‌های متنوع و انواع مختلف سلول‌ها مانند سلول‌های انسانی، باکتریایی، مخمر، موش آزمایشگاهی، مگس سرکه، نماتد، گیاهان زراعی، حشرات، میمون مورد استفاده قرار گرفته است. در سازوکار پردازش نوع II (crRNA processing mechanism type II) توالی (tracrRNA) trans activating crRNA  به توالی‌های تکراری متصل شده و ایجاد کمپلکس crRNA/tracrRNA می‌کند. سپس توسط پروتئین Cas9 و با فعالیت آنزیم RNaseIII، crRNA های بالغ را تولید می‌کند. این سیستم پردازش بسیار شناخته شده بوده و در مهندسی ژنتیک و ویرایش ژنوم بسیار مورد استفاده می‌کند. crRNAهای تولید شده دارای توالی‌های 20 نوکلئوتیدی در انتهای ′3 خود هستند (شکل 1(د)) (19 و 49). شکل 2(الف) مکان ژنی CRISPR بهمراه مکان ژنی کد کننده پروتئین‌های Cas9 و tracrRNA در باکتری S. pyogenes نشان می‌دهد. در این سیستمcrRNA های بالغ پس از نسخه برداری توالی
pre-crRNA از مکان ژنی CRISPR و توسط پروتئین Cas9 تولید می‌شود (7، 24 و 37).

3 - مرحله تداخل (Interference): در مرحله بعدی توالی tracrRNA که دارای یک ناحیه T شکل (20 نوکلئوتیدی) و سه ناحیه حلقه است به ناحیه توالی تکراری crRNA متصل شده و تشکیل یک دوپلکس tracrRNA/crRNA به نام RNA راهنما (gRNA) می‌دهد (23 و 39). سپس بین gRNA و کمپلکس Cas9 بر همکنش انجام می‌شود (24). همانطور که درشکل 2(ب) نشان داده شده است کمپلکس غیرفعال Cas9 دارای 6 دمین است که شامل 1- دمین RECI: بزرگترین دمین پروتئین Cas9 است و در اتصال gRNA دخالت دارد. 2- دمین RECII: فعالیت دمین RECII نامشخص است. 3- دمین برهمکنشPAM : فعالیت این دمین در شناسایی توالی PAM و اتصال gRNA است. 4- دمین Bridge-helix: غنی از نوکلئوتیدهای گوانوزین در نگهداری gRNA و امکان ایجاد برش توسط دمین‌های HNH و RuvC را در ایجاد هیبریداسیون بین gRNA و DNA  هدف ایجاد می‌کند. در هنگام ایجاد کمپلکس بین پروتئین Cas9 و gRNA کنفورماسیون دمین های RECII، HNH وRuvC  تغییر کرده و تولید کمپلکس فعال Cas9 را می‌کنند.

شکل2- الف) مکان ژنی CRISPR بهمراه مکان ژنی کد کننده پروتئین‌های Cas9 و tracrRNA در باکتری S. pyogenes. ب) پروتئین Cas9. فعالیت پروتئین Cas9 در حضور RNA راهنما (gRNA). اتصال gRNA باعث ایجاد تغییر در ساختار کونفورماسیونی پروتئین Cas9 شده و باعث فعال سازی پروتئین Cas9 می‌شود (24). در پایین شکل (ب) تصویر کریستالوگرافی شکل فعال پروتئین Cas9 ثبت شده در پایگاه PDB (PDB ID: 4UN3) (3). ج) سازوکار‌های HDR و NHEJ در ویرایش ژنوم و سیستم CRISPR/Cas9 (19).

دمین‌های HNH و RuvC 4-3 نوکلئوتید در بالادست توالی PAM را برش می‌دهند. در واقع 18-12 جفت باز بالادست توالی PAM ناحیه seed region نامیده می‌شود که بین توالی gRNA و DNA هدف هیبریداسیون ایجاد می‌شود. اختصاصیت این ناحیه در میزان کارایی سیستم CRISPR/Cas9 بسیار حائز اهمیت است. کمپلکس Cas9 با ایجاد برش‌های دورشته ای (DSBs) در DNA ژنومی باعث ایجاد ویرایش ژنوم در توالی ژن هدف می‌شود (24 و 39).

پرده برداری از سازوکار CRISPR/Cas9 در سال 2012 باعث شناسایی کاربردهای گسترده این فناوری در ویرایش محتوای ژنوم موجودات با عنوان نوکلئازهای مبتنی بر RNA مهندسی شده (RGENs) است که به عنوان نوکلئازهای اختصاصی در برش توالی نوکلئوتیدی و تغییرات ژنتیکی دخیل هستند. RGENها به عنوان نوکلئازهای برنامه‌پذیر متشکل از دو جز کمپلکس Cas9 و gRNA تشکیل شده است که در سلول برای انجام ویرایش ژنوم بیان می‌شود (8، 11 و 34). برش با Cas9 منجر به دو نوع فرآیند ویرایش شامل سازوکار‌های Non-Homologous End Joining (NHEJ) و Homologous Directed Repair (HDR) می شود. در سازوکار NHEJ تنها DSBs در توالی ژنوم ایجاد شده و در توالی حذف و اضافه (indels) مشاهده می‌شود؛ این درحالی است که در سازوکار HDR که توسط نوترکیبی همولوگ موضعی انجام می‌شود توالی جدید به این ناحیه برش یافته اضافه می‌شود (شکل 2(ج)) (7 و 19).

ویرایش هدفمند ژنوم جهت ایجاد تغییرات هدفمند در ژنوم مانند خاموشی ژن، جایگزینی ژن، ویرایش ژن‌ها، شناسایی عملکرد ژن و در تنظیم فرآیند نسخه‌برداری توسط RGENها انجام می‌شود (31). پس از ایجاد DSB، سازوکار بازسازی نوترکیبی همولوگ می‌تواند در بازه وسیعی از موجودات و انواع سلول‌ها تغییرات نوکلئوتیدی دلخواه را ایجاد کند (8). این فناوری به عنوان یک فناوری نوپا و بدیع بدلیل طراحی ساده و استفاده آسان پژوهش‌ها ژنتیک و زیست شناسی مولکولی را تحت تاثیر قرار داده است. درحال حاضر انواع متنوعی از توالی gRNA در دسترس است که می‌تواند در شاخه بیوتکنولوژی گیاهی کاربردهای وسیعی داشته باشند (29).

تنوع RNA راهنما: علاوه بر تغییرات اعمال شده در سیستم اصلی پروتئین Cas9، برخی تغییرات نیز در gRNA سیستم CRISPR/Cas9 اعمال شده است که میزان کارایی و اختصاصیت این فناوری را از بسیاری جهات افزایش می‌دهد (29). از جمله این تغییرات در gRNA می‌توان به 1- gRNA ناقص (truRNA): قادر است با توالی ژن هدف تنها 17 نوکلئوتید همولوژی داشته باشد و به این ترتیب میزان اختصاصیت نوکلئاز Cas9 و نوکلئاز Cas9n نیکاز از طریق کاهش تعداد توالی‌های غیرهدف افزایش می‌یابد (12). 2- Polycistronic tRNA-gRNA (PTG/Cas9): در این سیستم gRNA حاوی واحدهای متناوب از چندین tRNA-gRNA است که مابین آنها توالی‌های فاصله‌دهنده اختصاصی هدف برای هدفگیری چندین جایگاه در توالی ژنوم است (53). پس از نسخه‌برداری از PTG، نسخه اولیه آن از طریق سیستم پردازش tRNA و آنزیم‌های RNaseP و RNaseZ به gRNA بالغ تبدیل می‌شود و در سلول موجود زنده آزاد می‌شود. هر یک از این gRNAهای بالغ با پروتئین Cas9 برهمکنش داده و بدلیل تعداد بسیار زیاد با اختصاصیت بالایی می‌توانند چندین ژن را مورد هدف قرار دهند. این سیستم کارایی سیستم ویرایش ژنوم را به میزان زیادی در گیاهان افزایش داده است. به طوری که Xie و همکارانش (2015) دریافتند که هدفگیری یک ژن توسط چندین gRNA در سیستم CRISPR/Cas9 می‌تواند کارایی ویرایش ژنوم در مقایسه خاموشی کامل ژن هدف بسیار افزایش دهد (53).

اختصاصیت سیستمCRISPR/Cas9 : همانطور که در بالا اشاره شد، در سیستم CRISPR/Cas9 توالی ژن هدف توسط توالی PAM شناسایی می‌شود که توالی موتیف به طور معمول در باکتری Streptococcus pyogenes به صورت زیر 5′-NGG است. این توالی در ژنوم انسان به ازای هر 8 نوکلئوتید به طور میانگین توسط پروتئین کمپلکس Cas9 قابل شناسایی است. در جدول 1 انواع توالی اختصاصی PAM در سویه‌های مختلف
 S. pyogenes و سایر گونه‌های باکتریایی شناسایی شده ارائه شده است.

جدول1- انواع توالی‌های PAM در سویه های مختلف S. pyogenes و سایر جنس و گونه های باکتریایی (1).

براساس پژوهش‌های صورت گرفته، افزایش طول توالی PAM میزان اختصاصیت سیستم CRISPR/Cas9 را در هدفگیری DNA ژن هدف را افزایش می‌دهد (1).

طراحی gRNA و ناقل‌های مبتنی بر CRISPR/Cas9 : به طور کلی، سیستم CRISPR/Cas9 از دو جزء اساسی یعنی gRNA و پروتئین Cas9 تشکیل یافته است. کمپلکس Cas9/gRNA می‌تواند جهت ایجاد یک شکستگی دو رشته‌ای در ناحیه مشخصی از ژن هدف مورد استفاده قرار گیرد. سلول‌های گیاهی به طور معمول از سیستم NHEJ جهت القای DSBها در سازوکار ترمیم DNA در ژن‌های داخلی استفاده می‌کنند. اگرچه، گاهی استفاده از دو شکستگی دورشته ای جداگانه می‌تواند به سادگی باعث خاموشی ژن هدف شود، ولی حذف قسمتی از توالی ژن هدف و غربال‌گری آن بسیار ساده‌تر از ایجاد جهش‌های کوچک و ایجاد خاموشی است. به طور کلی جهت فعال سازی سازوکار CRISPR/Cas9 در سلول‌های گیاهی استفاده از کاست‌های حاوی ژن‌های Cas9 و gRNA ضروری است. به طوری که ادغام پایدار این کاست در ژنوم گیاهی احتمال ایجاد جهش‌های indels را بدلیل ایجاد DSBهای مکرر افزایش داده و در نتیجه آن، احتمال ترمیم DNA کاهش یافته و ژنوم ناقص خواهد بود (40). به طور کلی جهت انتقال این کاست sgRNA-Cas9 به درون سلول گیاهی توسط روش‌های انتقال مستقیم و غیرمستقیم مهندسی ژنتیک نیاز به طراحی ناقل‌های بیانی اختصاصی CRISPR/Cas9 است. این ناقل‌ها دارای یک ساختار عمومی متشکل از توالی sgRNA تحت پیشبر
U6 ubiquitin promoter و توالی ژن Cas9 تحت پیشبر 35S CaMV هستند که در شکل 3(الف) نشان داده شده است (28).

شکل3- ساختار ناقل بیانی CRISPR/Cas9. الف) توالی gRNA (قطعه قرمز تیره) همسانه‌سازی شده در ناقل راهنما pCas (28). ب) مراحل ساخت کاست و ناقل بیانی CRISPR/Cas9 حاوی کاست multiple gRNA مربوط به ژن های CABs و α/β satellites (20).

همان طور که قبلا نیز اشاره شد توالی gRNA از دو بخش crRNA و tracrRNA تشکیل یافته است. بیشتر شرکت‌های تجاری فعال در زمینه تولید وکتورهای بیانی مانند Sigma (www.sigmaaldrich.com/crisprs‎)، Addgene (https://www.addgene.org/crispr/)، Thermofischer scientific (www.thermofisher.com/tz/en/crispr-cas9-technology-information.html) و... انواع وکتورهای اختصاصی CRISPR/Cas9 در سیستم‌های گیاهی، جانوری، مخمر و مگس سرکه را تولید می‌کنند که توالی ژن‌های Cas9 و tracrRNA در ناقل‌های بیانی وارد شده و تنها توالی crRNA و پیشبر بیانی U6 promoter مستخرج از Arabidopsis thaliana همسانه سازی می‌شود. پیشبر مورد استفاده در بالادست ژن‌های کد کننده پروتئین Cas9 به طور معمول پیشبر همیشه بیانی 35S CaMV promoter است. با توجه به ساختار ناقل‌های مبتنی بر CRISPR/Cas9 مهم‌ترین و کلیدی ترین بخش، طراحی ناحیه crRNA است که به طور اختصاصی از توالی ژن هدف طراحی شده و در ناقل CRISPR/Cas9 همسانه سازی می‌شود. توالی crRNA متشکل از یک توالی ژن هدف به طول 20 جفت باز است که در انتهای ′3 آن توالی موتیف PAM (5′-NGG-3′) قرار گرفته است (40). جهت طراحی gRNAهایی با میزان off-target  پایین، ابتدا توالی ژن مورد نظر را در پایگاه های طراحی gRNA (جدول 2) وارد شده تا توالی‌های gRNA بر اساس شناسایی توالی موتیف PAM (NGG) طراحی شود (29).