نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران
2 عضو هیات علمی دانشگاه رازی، کرمانشاه
چکیده
تیموکوئینون ماده فعال برخی از گیاهان دارویی میباشد. علیرغم مطالعات گسترده در زمینه اثرات زیستی و درمانی تیموکوئینون، هیچ گونه پژوهشی در رابطه با اثر این ترکیب بر سلولهای بنیادی انجام نشده است. بنابراین، هدف از این مطالعه بررسی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای iNos و Cox-1 دخیل در پتانسیل تنظیمکنندگی سیستم ایمنی سلولهای بنیادی مزانشیمی (MSCs) مشتق شده از مغز استخوان موش در سطح رونویسی میباشد. سلولهای MSC از مغز استخوان موشهای نژاد NMRI جدا شدند و پتانسیل بنیادینگی آنها توسط تستهای تمایزی به سمت سلولهای استخوان و چربی تایید شد. نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که غلظت IC50 در بازه زمانی 24 ساعت 8 میکروگرم بر میلیلیتر و در بازههای زمانی 48 و 72 ساعت 4 میکروگرم بر میلیلیتر است. بعلاوه، در غلظتهای مساوی و کمتر از 2 میکروگرم بر میلیلیتر بیش از 90 درصد سلولها زنده ماندند، بنابراین بررسی بیان ژنهای، سلولها با غلظت 2 میکروگرم بر میلیلیتر از تیموکوئینون به مدت 24 ساعت تیمار داده شدند. نتایج بدست آمده از مطالعه بیان ژنهای توسط Real-time PCR نشان دهنده کاهش حدود 655/0 و 615/0 برابری (5/38 و 5/34 درصدی) به ترتیب برای ژنهایی iNos و Cox-1، در نمونههای تیمار شده نسبت به کنترل بود (P<0.05). در نتیجه، این مطالعه نشان میدهد که تیموکوئینون قابلیت اثر بر پتانسیل تنظیمکنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC را دارد. همچنین این مطالعه چشمانداز خوبی را برای مطالعات بیشتر در این زمینه و استفاده از این ترکیب برای اثر بر قابلیتهای سلولهای MSC در سلول درمانی را فراهم کرده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Studing the effect of Thymoquinone on the expression of iNos and Cox-1 genes in mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells
نویسندگان [English]
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Razi University, Kermanshah, Iran
چکیده [English]
Thymoquinone (TQ) is an active compound of some medicinal plants. Although different biological and pharmaceutical activities of TQ are well known, its effect on stem cells has not been clarified yet. Therefore, this study was aimed to investigate the effect of TQ on the expression of iNos and Cox-1 genes, which are involved in immunomodulatory potential of mouse mesenchymal stem cells (MSCs), at transcript level. MSCs were isolated from young NMRI mice and their potency was confirmed using the differentiation assay into osteoblasts and adipocytes. The results of MTT assay indicated that the median inhibition concentration (IC50) values of TQ on the MSCs were 8 μg/ml at 24h and 4 μg/ml at 48 and 72h after treatment. In addition, more than 90% of TQ-treated MSCs were alive after treatment with concentrations ≤2 μg/ml of TQ for 24h. The results of gene expression analysis by real-time PCR showed that iNos and Cox-1 down-regulated 0.655 and 0.615 fold (38.5 and 34.5%), respectively, in the TQ-treated MSCs compared to the untreated MSCs (P < 0.05). In conclusion, this study demonstrates that TQ influences immunomodulatory potential of MSCs. Furthermore, this study provides a good perspective for further efforts in the field and for the use of this compound to affect MSCs capabilities in cell therapy.
کلیدواژهها [English]
بررسی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای iNos و Cox-1 در سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان موش
الهام علیمرادی، سجاد سی سخت نژاد* و حسن اکرمی
کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 16/10/96 تاریخ پذیرش: 10/4/97
چکیده
تیموکوئینون (Thymoquinone) ماده فعال برخی از گیاهان دارویی میباشد. علیرغم مطالعات گسترده در زمینه اثرات زیستی و درمانی تیموکوئینون، هیچ گونه پژوهشی در رابطه با اثر این ترکیب بر سلولهای بنیادی انجام نشده است. بنابراین، هدف از این مطالعه بررسی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای iNos و Cox-1 دخیل در پتانسیل تنظیمکنندگی سیستم ایمنی سلولهای بنیادی مزانشیمی (Mesenchymal stem cells=MSCs) مشتق شده از مغز استخوان موش در سطح رونویسی میباشد. سلولهای MSC از مغز استخوان موشهای نژاد NMRI جدا شدند و پتانسیل بنیادینگی آنها توسط تستهای تمایزی به سمت سلولهای استخوان و چربی تایید شد. نتایج حاصل از آزمون 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide=MTT نشان داد که غلظت IC50(Half-maximal inhibitory concentration)در بازه زمانی 24 ساعت 8 میکروگرم بر میلیلیتر و در بازههای زمانی 48 و 72 ساعت 4 میکروگرم بر میلیلیتر است. بعلاوه، در غلظتهای مساوی و کمتر از 2 میکروگرم بر میلیلیتر بیش از 90 درصد سلولها زنده ماندند، بنابراین بررسی بیان ژنهای، سلولها با غلظت 2 میکروگرم بر میلیلیتر از تیموکوئینون به مدت 24 ساعت تیمار داده شدند. نتایج بدست آمده از مطالعه بیان ژنهای توسط Real-time PCR نشان دهنده کاهش حدود 655/0 و 615/0 برابری (5/38 و 5/34 درصدی) بترتیب برای ژنهایی iNos و Cox-1، در نمونههای تیمار شده نسبت به کنترل بود (P<0.05). در نتیجه، این مطالعه نشان میدهد که تیموکوئینون قابلیت اثر بر پتانسیل تنظیمکنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC را دارد. همچنین این مطالعه چشمانداز خوبی را برای مطالعات بیشتر در این زمینه و استفاده از این ترکیب برای اثر بر قابلیتهای سلولهای MSC در سلول درمانی را فراهم کرده است.
واژه های کلیدی: سلولهای بنیادی مزانشیمی، تیموکوئینون، تنظیم سیستم ایمنی، بیان ژن
* نویسنده مسئول، تلفن: 08334274545، پست الکترونیکی: s.sisakhtnezhad@razi.ac.ir و ssisakhtnezhad@gmail.com
مقدمه
سلولهای MSC بدلیل ویژگیهای منحصر به فردی که دارند به عنوان یکی از پرکاربردترین سلولهای بنیادی بافتی میباشند که بیش از ده سال است بهصورت گسترده جهت مطالعات و کاربرد در زمینه فراهم آوردن امکان درمان بیماریهای مختلفی مانند اختلالات سیستم عصبی مرکزی، کبد، کلیه، انفارکتوس میوکارد، بیماریهای خودایمنی و خیلی از سرطانها بکار برده میشوند (2).
سلولهای MSC از لحاظ ریختشناسی شبیه سلولهای فیبروبلاست هستند، دارای اتصالات انعطافپذیر و نشانگرهای سطحی از قبیل CD73، CD106، CD105، CD44 وCD29 را بیان میکنند. همچنین نشانگرهای مربوط به سلولهای خونی شامل CD45، CD31، CD11b و CD34 در این سلولها بیان نمیشوند (16). از مهمترین ویژگیهای این سلولها که باعث شده امروزه طرفداران زیادی را به خود اختصاص دهند، میتوان به حالت خودنوزایی، چندتوانی (1)، تمایز به ردههای مزودرمی (استخوان، چربی، غضروف)، اندودرمی و اکتودرم، توزیع گسترده در بیشتر بافتها ازجمله استخوان، چربی، ماهیچه، بندناف، شش و پالپدندان، تنظیم سیستم ایمنی (4)، مهاجرت (18)، ترمیم و احیای سلولها و بافتهای آسیبدیده و توانایی توسعه در محیط کشت اشاره کرد (27). سلولهای MSC دارای توانایی مهاجرت به سمت بافتهای آسیب دیده میباشند، که به کمک انواع سایتوکینها و فاکتورهای التهابی آزاد شده از بافت آسیب دیده یا تومور میتوانند به محل آسیب هدایت شده و با ترشح فاکتورهای مختلف موجب ترمیم و بهبود آسیب یا بیماری شوند (10 و 26). علاوه بر نقش سلولهای MSC در تولید انواع مختلف فاکتورها جهت القاء ترمیم و بازسازی بافتها، اصلیترین اثر درمانی سلولهای MSC ناشی از عملکردهای تنظیم سیستم ایمنی و حفظ هموستازی ایمنی میباشد، که این عمل تحت تاثیر شرایط محیطی و اثر غلظتهای متفاوت ترکیبات التهابی در جهت سرکوب یا فعالسازی سیستمایمنی صورت میگیرد (11).
مطالعات قبلی حاکی از آن هستند که برای کاربردهای درمانی، تعداد زیادی از سلولهای MSC نیاز است؛ اما تعداد سلولهای MSC در بافت کم میباشد، بنابراین استخراج و گسترش این سلولها در شرایط آزمایشگاه جهت بکارگیری در زمینه درمان ضروری است. بطورکلی، در مقایسه با سلولهای MSC تازه جدا شده، سلولهای حفظ شده در کشت پتانسیل کاربردی پایینتری دارند (23). در این ارتباط نشان داده شده است که فاکتورهای خارجی میتوانند بر بیان گیرندههای سطحی و دیگر فاکتورهای داخلی در سلولهای MSC نقش داشته باشند، که در نتیجه آن بر روی ویژگیها و عملکردهای آن اثر میگذارند (24). بنابراین ارزیابی دقیق و کنترل شدید ویژگیهای سلولهای MSC کشت شده برای حفظ توان کاربردی در سلول درمانی و پزشکی بازساختی مهم میباشد.
اخیرا محققان از فاکتورهای خارجی برای بهبود عملکرد سلولهای MSC استفاده میکنند. بنابراین تاثیر ترکیبات طبیعی و شیمیایی مختلف بر ویژگیهای سلولهای MSC تحت شرایط آزمایشگاهی و در داخل بدن موجود زنده مورد بررسی قرار گرفته است. تیموکوئینون یکی از ترکیبات زیست فعال موجود در گیاه سیاه دانه، به ویژه در دانههای آن، میباشد. این ترکیب اولین بار توسط کروماتوگرافی بر روی لایه نازک ژل سیلیکا از این گیاه استخراج شد. مطالعات انجام شده بر روی خواص زیستی تیموکوئینون، در آزمایشگاه و نیز در داخل بدن موجود زنده، نشان دهنده اثرات گسترده دارویی و درمانی این ترکیب میباشد. مطالعات مختلف نشان میدهند که تیموکوئینون دارای خواص تنظیم سیستم ایمنی، ضدالتهاب، آنتیاکسیدان، ضدمیکروب، آنتیهیستامین، ضد توموری میباشد. بنابراین پتانسیلهای درمانی بالقوهای برای درمان خیلی از بیماریهای انسان مانند بیماریهای التهابی و سرطان است (6). با این وجود، نیاز به مطالعات بالینی در این زمینه وجود دارد.
علیرغم مطالعات مختلفی که بر روی اثرات زیستشناختی تیموکوئینون در حیطههای مختلف انجام شده است، اما تاکنون در رابطه با اثر آن بر رفتارهای سلولهای بنیادی به ویژه سلولهای MSC و اثر آن بر خاصیت تنظیمکنندگی سیستم ایمنی این سلولها، هیچگونه مطالعهای انجام نشده است. بنابراین هدف از این مطالعه بررسی اثر تیموکوئینون بر پتانسیل تنظیمکنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC جدا شده از مغز استخوان موش، از طریق بررسی اثر آن بر بیان موثر در پتانسیل تنظیم سیستم ایمنی سلولهای MSC، شامل ژنهایی iNos و Cox-1، در سطح رونویسی میباشد.
مواد و روشها
آمادهسازی محلول تیموکوئینون:جهت آمادهسازی غلظتهای مختلف تیموکوئینون (125/0، 25/0، 5/0، 1، 2، 4، 8، 16، 32، 64 میکروگرم بر میلیلیتر) مقدار 10 میلیگرم از تیموکوئینون خالص (سیگما، آلمان) در 200 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (Dimethylsulfoxide=DMSO) (مرک، آلمان) به شکل تازه حل شد و قبل از آنجام آزمایشها با محیط کشت کامل جهت فراهم کردن غلطتهای مناسب رقیقسازی شد. در این مطالعه جهت بررسی اثر تیمارهای مختلف، بقاء هر گروه با کنترل مربوطه (فاقد تیموکوئینون) که حاوی مقادیر یکسانی از دی متیل سولفوکساید بود مقایسه شد. همچنین، در این پژوهش، محلولهای تیموکوئینون برای هر بار استفاده به شکل کاملا تازه تهیه و در شرایط دور از نور مورد استفاده قرار گرفتند.
حیوانات آزمایشگاهی:در این تحقیق از موشهای جوان (8-4) هفتهای نژاد NMRI جهت جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مرانشیمی استفاده شد. این موشها از مرکز نگهداری و پرورش حیوانات آزمایشگاهی گروه زیستشناسی دانشگاه رازی کرمانشاه و اخذ تاییدیه از کمیته اخلاق کار با حیوانات با کد تصویب (010-1-395) تهیه شدند.
استخراج و کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان موش:موشها با استفاده از جابهجایی مهرههای گردنی اتونازی شدند. جهت جداسازی سلولهای MSC، استخوانهای فمور و تیبیا جدا و مغز استخوان آنها از طریق آسپیراسیون بطور کامل استخراج شد و در محیط کشت Dulbecco’s modified Eagle’s medium-High glucose=DMEM-HG حاوی 15 درصد Fetal bovine serum=FBS (گیبکو، اسکاتلند)، محلول 1 x پنیسیلین/ استرپتومایسین (بایو ایده، ایران)، 7 /3 گرم بر لیتر بیکربنات سدیم و دو میلیمولار ال-گلوتامین(سیگما، آلمان) در فلاسکهای T25 کشت داده و در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد دیاکسیدکربن و رطوبت 90 درصد به مدت 3 روز انکوبه شدند. 72 ساعت پس از انکوباسیون سلولها به کف فلاسک چسبیده و محیط کشت آنها جهت حذف سلولهای شناور تعویض شد. بعد از انجام اولین تعویض محیط کشت، تا زمانیکه سلولها کاملا کف فلاسک را پر کنند، هر دو روز یکبار محیط کشت آنها تعویض شد. بعد از 10-7 روز سلولها به تراکم 90-80 درصد رسیده، با استفاده از محلول تریپسین (25/0 درصد)- EDTA (1 میلیمولار) (بایو ایده، ایران) پاساژ داده شدند. سلولهای MSC کشت داده شده هر روز با استفاده از میکروسکوپ فاز معکوس بررسی شدند. برای تایید هویت و خلوص سلولهای MSC جدا شده از بررسی بیان نشانگرهای اختصاصی مثبت (CD44، CD90 و CD105) و منفی (CD34 و CD45) استفاده شد (25).
تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای استخوانی:جهت تایید هویت سلولهای بنیادی مزانشیمی استخراج شده از مغز استخوان موش، از تست تمایز آنها به سمت سلولهای استخوانی استفاده شد. برای این کار 2000 سلول در پلیتهای 6 خانهای کشت داده شد. بعد از اینکه سلولها به تراکم حدود 90 درصد رسیدند، محیط کشت سلولها با محیط القایی تمایز استخوانی )شامل DMEM-HG، 10درصد سرم، 3-10×1 میکرومول بر میلیلیتر دگزامتازون (اسوه، ایران)، 50 میکروگرم بر میلیلیتر آسکوربیک اسید 2-فسفات (سیگما، آلمان) و 1/0 x پنیسیلین/ استرپتومایسین( تعویض شد. سلولها به مدت 21 روز با محیط کشت تمایز استخوان تیمار شدند و در این مدت محیط القایی تمایز استخوان هر سه روز یکبار تعویض میشد. بعد از سه هفته، سلولهای تمایز یافته با متانول 10 درصد تثبیت و در ادامه با آلیزارین رد S (Alizarin-red S) رنگآمیزی شدند. در نهایت رسوب کلسیم توسط استئوبلاستها بوسیله میکروسکوپ فاز معکوس (CETI، انگلیس) مورد بررسی قرار گرفت. تست تمایز استخوان حداقل در 3 تکرار مستقل انجام شد.
تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای چربی:جهت تایید هویت سلولهای بنیادی مزانشیمی استخراج شده، از تمایز آنها به سمت سلولهای چربی استفاده شد. برای اینکار سلولهای MSC پاساژ 3 با تراکم حدود 90 درصد به مدت 3 هفته در محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم، 3-10×1 میکرومول بر میلیلیتر دگزامتازون، 50 میکروگرم بر میلیلیتر آسکوربیک اسید 2-فسفات، 50 میکروگرم بر میلیلیتر ایندومتاسین (سیگما، آلمان) و 1/0 x پنیسیلین/ استرپتومایسین کشت داده شدند. در این مدت محیط القایی تمایز چربی، هر سه روز یکبار تعویض شد. بعد از 21 روز سلولهای تمایز یافته با فرمالین 10 درصد تثبیت و سپس سلولها با استفاده از رنگ اویل رد O (Oil-red O) جهت مشخص شدن واکوئلهای لیپیدی رنگآمیزی شدند. بعد از رنگآمیزی وجود واکوئلهای لیپیدی در سلولها با استفاده از میکروسکوپ فاز معکوس مورد بررسی قرار گرفت. تست تمایز استخوان حداقل در 3 تکرار مستقل انجام شد.
بررسی اثر تیموکوئینون بر بقاء سلولهای MSC:جهت بررسی اثر غلظتهای مختلف تیموکوئینون بر بقاء سلولهای MSC مشتق شده از مغز استخوان در بازههای زمانی 24، 48 و 72 ساعت از آزمون MTT (سیگما، آلمان) استفاده شد. این آزمون یک روش رنگسنجی میباشد که بر اساس احیاء و شکسته شدن کریستالهای زرد رنگ تترازولیوم و تشکیل کرسیتالهای ارغوانی رنگ نامحلول فورمازان صورت میگیرد. بمنظور انجام این آزمون 11 هزار سلول MSC در خانههای پلیتهای 96 خانهای کشت داده شد و پلیتهای حامل سلولها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد دی اکسیدکربن و رطوبت 90 درصد انکوبه شدند. پس از گذشت این مدت، سلولها با غلظتهای مختلف تیموکوئینون (64، 32، 16، 8، 4، 2، 1، 5/0، 25/0 و 125/0 میکروگرم بر میلیلیتر) تیمار و برای هر غلظت حداقل سه تکرار گذاشته شد. اثر تیموکوئینون بر بقاء سلولهای MSC با استفاده از رنگسنجی تترازولیوم در بازههای زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار ارزیابی شد. جهت انجام این آزمون، به کلیه نمونههای تیمار شده با تیموکوئینون و نمونههای کنترل که تنها حاوی دی متیل سولفوکسید با غلظتهای مشابه نمونههای تیمار بودند (غلظت DMSO در نمونههای تیمار و کنترل کمتر از یک درصد بود)، محلول MTT (5 میلیگرم در یک میلیلیتر بافر فسفات) اضافه و تحت شرایط قبلی انکوبه شد. پس از گذشت 4 ساعت از انکوباسیون، کریستالهای ارغوانی رنگ فورمازان که از نمک تترازولیوم زرد رنگ توسط آنزیمهای میتوکندریایی سلولهای فعال متابولیک ایجاد شدهاند، با 150 میلیلیتر دی متیل سولفوکسید حل شدند. نهایتا جذب نوری کلیه خانههای پلیت (شامل نمونههای تیمار شده و بدون تیمار) توسط دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر خوانده شد و از پلیتها نیز عکس گرفته شد. آزمون MTT برای هر کدام از غلظتهای تیموکوئینون در تکرارهای سهتایی و حداقل در شش تکرار مستقل انجام شد. نهایتا درصد سلوهای زنده در مقایسه با سلولهای کنترل در تیمارهای مختلف از فرمول زیر استفاده شد:
درصد بقاء سلولهای MSC = (میانگین جذب سلولهای MSC تیمار شده با تیموکوئینون در هر خانه/ میانگین جذب سلولهای کنترل) × 100
بررسی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای دخیل در پتانسیل تنظیم سیستم ایمنی سلولهایMSC:در این مطالعه، سلولهای MSC با غلظت 2 میکروگرم بر میلیلیتر از تیموکوئینون به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس بمنظور بررسی کمی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای دخیل در پتانسیل تنظیم سیستم ایمنی سلولهای MSC (شامل دو ژن iNos و Cox-1) از تکنیک کمی Real-time PCR استفاده شد. جهت آنالیز بیان ژنها در سطح رونویسی، RNA تام سلولهای MSC تیمار شده با تیموکوئینون و کنترل با استفاده از کیت RNX-Plus (سینا کلون، ایران) استخراج شد. جهت حذف آلودگیهای احتمالی DNA، RNAهای تام استخراج شده با آنزیم RNase-free DNase I (کیاژن، آمریکا) تیمار شدند. در مرحله بعد یک میکروگرم از هر کدام از RNAهای تیمار شده با DNase، با استفاده از آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (فرمنتاز، آلمان) و طبق دستورالعمل کیت به cDNA تبدیل شدند. در ادامه تکنیک Real-time PCR با استفاده از کیت سایبرگرین (تاکارا، ژاپن) بمنظور بررسی کمی بیان ژنهای مورد بررسی در سلولهای MSC تیمار شده با تیموکوئینون در مقایسه با سلولهای کنترل استفاده شد. سنجش کمی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ( جدول 1) ژنهای مورد مطالعه انجام گرفت. آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژنهای iNOSو Cox-1 توسط نرم افزار Allele ID طراحی شدند. پس از تایید اختصاصیت آغازگرها توسط NCBI-Primer BLAST برای ژنهای هدف، از طریق شرکت دنازیست آسیا جهت سنتز به شرکت میکروژن کره سفارش داده شد. واکنش Real-time PCR به شکل تکرارهای دوتایی برای هر ژن در حجمهای ده میکرولیتر با استفاده از برنامه شاتل دو مرحلهای به صورت 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد و 30 ثانیه در دمای 60 درجه سانتیگراد در 40 سیکل انجام شد. در این مطالعه، ژن β-actin به عنوان استاندارد و کنترل، جهت نرمالایز کردن سطح بیان رونویسی ژنهای مربوطه، استفاده شد. در پایان روش آستانه نسبی Ct(15) برای ارزیابی کمی بیان ژنها در سلولهای MSC تیمار شده با تیموکوئینون در مقایسه با نمونههای کنترل استفاده شد.
جدول 1- آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی بیان ژنهای iNos و Cox-1 با استفاده از روش Real-time PCR. |
||||
ردیف |
کد دسترسی به توالی |
نام آغازگر |
توالی آغازگر |
منبع |
1 |
NM_007393 |
B-actin |
5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′ |
(5) |
5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′ |
||||
2 |
iNos |
5′-CTCAGCCAAGCCCTCACCTAC-3′ |
- |
|
5′-CTCCAATCTCTGCCTATCCGTCTC-3′ |
||||
3 |
NM_008969 |
Cox-1 |
5′-TGTTCCGAGCCCAGTTCCAATATC-3′ |
- |
5′-CAACCCCATAGTCCACCAGCATAG-3′ |
آنالیزآماری:جهت انجام آنالیز آماری از نرم افزار SPSS، نسخه 20 استفاده شد. جهت آنالیز دادههای بیانی و بررسی معنادار بودن تغییرات رونویسی ژنهای مورد بررسی در نمونههای تیمار شده با تیموکوئینون در مقایسه با نمونههای کنترل از روش Student’s t-test استفاده شد.کلیه دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند و مقدار P < 0.05 به عنوان سطح معنی دار جهت یافتن تفاوتهای معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
استخراج و گسترش سلولهای MSC:در این مطالعه، سلولهای MSC از مغز استخوان موش استخراج و در فلاسکهای T25 کشت داده شدند. سلولهای مشتق شده از مغز استخوان به کف فلاسک چسبیدند و در شرایط مناسب کشت داده شدند (شکل1a ). سلولهای MSC بعد از گذشت 10-7 روز به تراکم 100-80 درصد رسیدند، که پاساژ داده شدند. در نهایت از سلولهای MSC پاساژ 3 (شکل 1b) برای مطالعات بعدی استفاده شد.
شکل 1- کشت اولیه و سلولهای MSC حاصل از مغز استخوان موش. کشت اولیه حاصل از مغز استخوان موش، 72 ساعت پس از کشت و تعویض محیط کشت (a). سلولهای MSC مشتق شده از مغز استخوان موش در پاساژ 3 (b).
پتانسیل تمایز سلولهای MSC به سلولهای استخوانی:توانایی استخوانزایی سلولهای MSC بوسیله ارزیابی تمایز آنها به سمت سلولهای استخوانی بررسی شد. سلولهای MSC با استفاده از محیط القایی استخوانزایی به سمت استخوان تمایز یافتند. پس از رنگآمیزی با آلیزارین رد سلولهای استخوانی حاصل از تمایز سلولهای MSC به رنگ قرمز مشاهده شدند، که نشان دهنده رسوب کلسیم توسط این سلولها میباشد (شکل 2a)، اما در سلولهای کنترل هیچگونه رسوب کلسیمی مشاهده نشد (شکل 2b).
شکل 2- تمایز سلولهای MSC جدا شده از مغز استخوان موش به سلولهای استخوانی. رنگ قرمز نشان دهنده رسوب کلسیم توسط استئوبلاستها میباشد (a). رسوب کلسیمی در سلولهای MSC کشت داده شده در محیط کشت نرمال مشاهده نمیشود (b).
پتانسیل تمایز سلولهای MSC به سلولهایچربی:نتایج حاصل از تست تمایز چربی نشان داد که سلولهای MSC کشت شده در محیط القایی تمایز چربی به سمت چربی تمایز پیدا کردند. پس از گذشت سه هفته از کشت سلولهای MSC در محیط القایی تمایز چربی، سلولها با Oil-red O رنگآمیزی شدند. نتایج حاصل از مشاهدات میکروسکوپی حاکی از وجود واکوئلهای لیپید در سلولهای تمایز یافته (شکل 3a) بودند، اما این واکوئلها در نمونههای کنترل مشاهده نشدند (شکل 3b).
شکل 3- تمایز سلولهای MSC جدا شده از مغز استخوان موش به سلولهای چربی. واکوئلهای قرمز رنگ چربی در سلولهای MSC تمایزیافته به سلولهای چربی قابل مشاهده میباشند (a)، اما این واکوئلها در سلولهای MSC کنترل قابل مشاهده نیستند (b).
بررسی سمیت تیموکوئینون بر سلولهای MSC:در این مطالعه، از آزمون MTT جهت بررسی اثر غلظتهای مختلف تیموکوئینون بر بقاء سلولهای MSC در بازههای زمانی 24، 48 و 72 ساعت استفاده شد. نتایج حاصل از این آزمون نشان داد که IC50سلولهای MSC در بازه زمانی 24 ساعت 8 میکروگرم بر میلیلیتر و در بازههای زمانی 48 و 72 ساعت 4 میکروگرم بر میلیلیتر است. همچنین در غلظتهای کمتر یا مساوی 2 میکروگرم بر میلیلیتر بیش از 90 درصد سلولها زنده بودند (شکل 4). بنابراین در ادامه، از غلظت 2 میکروگرم بر میلیلیتر برای ارزیابی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای مورد بررسی در سلولهای MSC استفاده شد.
شکل 4- بررسی میزان بقاء سلولهای بنیادی مزانشیمی در حضور غلظتهای مختلف تیموکوئینون با سطح معناداری P<0.05.
بررسی اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای سلولهای MSC:بعد از تعیین IC50وغلظتی که بیش از 90 درصد سلولهای MSC زنده بودند، سلولهای MSC با غلظت 2 میکروگرم بر میلیلیتر از تیموکوئینون به مدت 24 ساعت تیمار شدند. استخراج RNA و سنتز cDNA از سلولهای تیمار و کنترل صورت گرفت. در ادامه بیان ژنهای iNos و Cox-1 در نمونههای تیمار شده با تیموکوئینون و نمونههای کنترل مورد بررسی گرفت. نمودار ذوب و منحنی تکثیر مربوط به یکی از نمونهها مورد بررسی برای ژنهای iNos (شکل 5a-b) و Cox-1 (شکل 5c-d) در شکل 5 ارائه شده است. نتایج حاصل از آنالیز بیان ژنها در سطح رونویسی با استفاده از روش Real-time PCR نشان دهنده کاهش 655/0 و 615/0 برابری، بترتیب برای بیان ژن iNos و Cox-1، در نمونههای تیمار شده نسبت به کنترل بود (P<0.05) (شکل 5e). این نتایج بترتیب نشاندهنده کاهش 5/38 و 5/34 درصدی بیان ژنهای iNos و Cox-1، در نمونههای تیمار شده نسبت به کنترل است.
شکل 5- آنالیز بیان ژنهای iNos و Cox-1 در سلولهای تیمار شده یا تیموکوئینون نسبت به سلولهای کنترل بدون تیمار. نمودار ذوب (a) و منحنی تکثیر (b) ژن iNosدر مقایسه با B-actinبه عنوان ژن استاندارد. نمودار ذوب (c) و منحنی تکثیر (d) ژن Cox-1و نیزB-actinبه عنوان ژن استاندارد. نمودار آنالیز بیان ژنهای iNos و Cox-1 در سلولهای تیمار شده یا تیموکوئینون نسبت به سلولهای کنترل (e). نتایج به صورت میانگین ± انحراف از معیار بیان شده اند. تفاوت معنی دار بین بیان ژنها در سلولهای تیمار شده با تیموکوئینون در مقایسه با سلولهای کنترل بدون تیمار با (*) نشان داده شده است (P < 0.05).
بحث
در این مطالعه برای اولین بار اثر تیموکوئینون بر بیان ژنهای دخیل در پتانسیل تنظیم سیستم ایمنی سلولهای MSC در شرایط آزمایشگاهمورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از مطالعاتی که در سالهای اخیر صورت گرفته نشان میدهند که اصلیترین اثر درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی ناشی از توانایی آنها در تنظیم سیستم ایمنی بدن موجود زنده میباشد (30). بنابراین با توجه به قابلیتها و تواناییهای سلولهای MSC به ویژه پتانسیل تنظیم کنندگی سیستم ایمنی توسط آنها و نیز اثرات زیستی متنوع تیموکوئینون، در این مطالعه بررسی اثر این ترکیب بر خواص تنظیم کنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور، اثر تیمار تیموکوئینون بر بیان دو ژن iNos و Cox-1 که دخیل در پتانسیل تنظیم کنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC میباشند، مورد بررسی قرار گرفت.
پتانسیل تنظیم کنندگی سیستم ایمنی سلولهای MSC ، بوسیله مولکولهایی همانند سایتوکاینها و کموکاینهای التهابی تحریک میشود. همچنین ارتباطات سلول-سلول نقش مهمی در این فرآیند دارند (10 و 26). کموکاینها و سایتوکاینهای ترشح شده بوسیله بافتهای آسیب دیده، منجر به جذب سلولها MSC به سمت محل آسیب و ترمیم آن میشوند (7). علاوه بر این، عملکرد تنظیم سیستم ایمنی سلولهای MSC تحت تاثیر شرایط محیطی و اثر غلظتهای متفاوت ترکیبات التهابی قرار میگیرد (11). این تغییر مفهومی، پیامدهای مهمی برای کاربردهای بالینی سلولهای MSC میتواند بهمراه داشته باشد. در این ارتباط، امروزه توجه زیادی به استراتژیهای جدید جهت القاء یکدست فنوتیپهای پیشالتهابی (MSC1) و یا ضدالتهابی (MSC2) از سلولهای MSC میشود. پیشبینی میشود که MSC1 و MSC2 میتوانند به سلولدرمانی ایمن و موثر جهت درمان بیماریهای انسان کمک کنند (4).
گزارش شده است که مولکولهای مختلفی نظیر iNOS، Indoleamine 2,3-dioxygenase=IDO، TGF-β، PGE2و گالکتین در عملکرد سرکوب سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC نقش دارند. iNos در سلولهای MSC موش و IDO در سلولهای MSC انسان نقش مهمی در سرکوب سیستم ایمنی دارند. همچنین این سلولها به تنهایی دارای توانایی مهار سیستم ایمنی نمیباشند، بلکه در ترکیب با سایتوکینهای التهابی مانند TNF-α، IFN-ϒ، IL-1b و یا IL-1α فعال میشوند (11). TGF-β با مهار iNos در موش و IDO در انسان موجب مهار سرکوب سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC میشود. در مطالعهای که در این زمینه صورت گرفت مشخص شد که TGF-β از طریق مسیر سیگنالینگ وابسته به SMAD موجب مهار رونویسی iNos در سلولهای MSC موش و در نتیجه مهار سرکوب سیستم ایمنی سلولهای MSC میشود (29). فاکتورهای هستهای مانند NF-κB و AP-1 نقش مهمی در کنترل فعالیت iNos در سطح رونویسی دارند. در این رابطه NF-κB موجب القاء رونویسی تعداد زیادی از ژنهای التهابی از جمله iNos میشود. iNos نیز موجب تولید مقادیر زیادی از NO در طولانی مدت میشود. NO دارای اثر سمی در مقابل پاتوژنهای تهاجمی سیستم ایمنی میباشد و باعث القاء التهاب میشود. با این حال در مطالعات مختلف گزارش شده است که بیان بالای iNos در سلولهای MSC و به دنبال آن تولید بیش از حد NO موجب ایجاد فنوتیپ پیشالتهابی و اثرات پاتوژنیک میشود (4). فعالیت بیش از حد NO موجب تولیدگونههای نیتروژن فعال و آنیون سوپراکسید میشود که در پی آن باعث آسیبهای اکسیداتیو در ترکیبات بیولوژیک و تنظیم ژن میشود. بنابراین مهار فعالیت یا بیان iNos ممکن است نقش مهمی در درمان بیماریهای التهابی داشته باشد (20). در این ارتباط نتایج حاصل از مطالعه ما نشان میدهد که تیموکوئینون باعث کاهش بیان ژن iNos در سلولهای MSC تیمار شده با این ترکیب میشود. بنابراین از مطالعات قبلی و نیز مطالعه حاضر، میتوان نتیجه گرفت که شاید تیموکوئینون از طریق افزایش بیان ژن iNos مانع از تولید بیش از حد NO و در نتیجه مهار تولیدگونههای نیتروژن فعال و آنیون سوپر اکسید میشود، هرچند که این احتمال باید در مطالعات بعدی مورد بررسی قرار گیرد. همچنین میتوان بیان کرد که ممکن است تیموکوئینون از طریق کاهش بیان iNos باعث کاهش تولید NO و در نتیجه القاء فنوتیپ پیشالتهابی (MSC1) و فعال شدن سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC شود؛ هر چند که در این ارتباط نیاز به انجام مطالعات بیشتر و دقیقتری میباشد.
سیکلواکسیژنازها آنزیمهای اصلی در تبدیل آراشیدونیک اسید به پروستاگلاندین میباشند. در سالهای اخیر دو ایزوفرم از این آنزیمها به نامهای COX-1 و COX-2 شناسایی شده است. طی مطالعات مختلف، بیان هر دو ایزوفرم در سلولهای MSC و نقش آنها در تولید پروستوگلاندینها نشان داده شده است (14 و 21). پروستوگلاندینها نه تنها در القاء فنوتیپ پیشالتهابی و در نتیجه فعال شدن سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC نقش دارد، همچنین در القاء تکثیر این سلولها نیز نقش دارند (14). علاوه بر این، مطالعات حاکی از آن هستند که COX-1 نقش مهمی در سرطانزایی دارد. علیرغم مشاهده بیان COX-1 در بسیاری از سرطانها مانند پروستات (17)، سینه (12)، سرویکس (22)، تخمدان (28)، سر و گردن (8) و کبد (13)، افزایش سطح بیان این آنزیم تنها در برخی از سرطانهای مانند سرویکس (22)، تخمدان (28)، سر و گردن (8) گزارش شده است. همچنین برخی گزارشات در رابطه با افزایش بیان این آنزیم در موشهای آزمایشگاهی مبتلا به سرطان ریه گزارش شده است (3). بعلاوه مهار بیان COX-1 منجر به کاهش خطر سرطان شده است (19). افزایش تومورزایی در سلولهای اندوتلیال پیوند زده به موش اغلب در ارتباط با افزایش بیان Cox-1 میباشد. افزایش بیان Cox-1در سرطان سلولی فلسی (Squamous cell carcinoma) و آدنوکارسینومای سرویکس انسان پیشنهاد میکند که هر دو آنزیم COX یا محصولات آنها ممکن است تنظیم کننده تومورزایی و بیان فاکتورهایی مرتبط با نئوپلازی سلولها باشند. در این ارتباط استفاده از مهار کنندههای انتخابی مختلف جهت مهارCox-1موجب تضعیف و مهار سرطان در مسیر وابسته به این آنزیم میشود (9). نتایج حاصل از مطالعه ما نشان میدهد که تیموکوئینون میتواند بیان ژن Cox-1 را در سلولهای MSC مشتق شده از مغز استخوان موش کاهش دهد. بنابراین با توجه به اینکه محصول این ژن در ارتباط با فنوتیپ ضدالتهابی و القاء پتانسیل فعال کنندگی سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC است، بنابراین میتوان نتیجه گرفت که ممکن است تیموکوئینون از طریق کاهش بیان ژن Cox-1، باعث القاء فنوتیپ ضدالتهابی و در نتیجه مهار شدن سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC شود.
نتیجه گیری
در این مطالعه تاثیر تیموکوئینون بر بیان ژنهای دخیل در پتانسل تنظیم سیستم ایمنی سلولهای MSC مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این بررسی بیانگر کاهش بیان ژنهای iNos و Cox-1 در سلولهای MSC تیمار شده با تیموکوئینون است. بنابراین میتوان از تیموکوئینون جهت القاء ویژگی پاسخهای سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC و درمان بیماریهای مرتبط با سیستم ایمنی استفاده کرد. بعلاوه با توجه به مطالعات قبلی و نیز مطالعه حاضر، از نظر مکانیسمی میتوان پیشنهاد کرد که تیموکوئینون ممکن است از طریق کاهش بیان iNos و در نتیجه کاهش تولید NO و همچنین از طریق کاهش بیان Cox-1 و متعاقبا کاهش بیان پروستوگلاندینها باعث القاء فنوتیپ ضدالتهابی (MSC-2) و در نتیجه مهار شدن سیستم ایمنی توسط سلولهای MSC شود. با این وجود، جهت تایید دقیقتر مکانیسم اثر تیموکوئینون بر رفتارها و عملکرد سلولهای MSC ، به ویژه بر پتانسیل تنظیم سیستم ایمنی این سلولها، مطالعات بیشتری لازم است.
تشکر و قدردانی
این پروژه تحقیقاتی بوسیله گرنت ستاد توسعه فناوریهای سلول بنیادی حمایت شده است (شماره گرنت: REP208) و نویسندگان این مقاله بر خود لازم میدانند از مسولین محترم آن ستاد به خاطر فراهم آوردن این حمایت تشکر و قدردانی نمایند. همچنین نویسندگان این مقاله از خانمها مژده حیدری و مریم یزدانی به خاطر کمکهایی که کردهاند تشکر و قدردانی مینمایند.