تهیه هیدروژل درجا تشکیل شونده آنزیمی از کتیرای اصلاح شده شیمیایی برای مهندسی بافت غضروف

مسلم توکل¹، ابراهیم واشقانی فراهانی^2*، مسعود سلیمانی^3،4، سمیره هاشمی نجف آبادی² و آتنا حجاری‌زاده⁵

¹ ایران، یزد، مجتمع پژوهشی ایران مرکزی، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای

² ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده مهندسی شیمی، گروه زیست‌پزشکی

³ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده پزشکی، گروه خون‌شناسی

⁴ ایران، تهران، مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته، گروه نانوتکنولوژی و مهندسی بافت

⁵ ایران، تهران، مرکز تحقیقات فناوری بن‌یاخته، گروه بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک

تاریخ دریافت: 27/8/96           تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

در مطالعه حاضر، یک سامانه درجا تشکیل شونده آنزیمی از کتیرای اصلاح شده شیمیایی تهیه و برای استفاده در مهندسی بافت غضروف ارزیابی شده است. برای این کار ابتدا گروههای تیرامینی با روش آمینولیزیز در محیط غیرهمگن به گروههای متیل استری کتیرا پیوند زده شد. سپس برای تهیه هیدروژل، آنزیم هرس رادیش پراکسیداز و هیدروژن پراکسید با محلول پلیمری، با استفاده از سرنگ‌دوتایی مجهز به مخلوط کن، مخلوط شدند. در ادامه، ضمن بررسی برخی خواص فیزیکوشیمیایی هیدروژل، آزمونهای برون‌تنی توانایی زنده ماندن و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی کپسول شده در داربست به سلولهای غضروف‌ساز انجام شد. با مخلوط شدن عوامل تشکیل ژل، ایجاد گروههای رادیکالی هیدروکسی فنولی در اثر واکنش آنزیمی، موجب ایجاد پیوند کوالانسی بین گروههای تیرامینی و تشکیل هیدروژل گردید. زمان ژل شدن هیدروژلها، قابل تنظیم در بازه کمتر از 2 دقیقه بود. بیش از 95 درصد سلولهای مزانشیمی انسانی در حین فرآیند کپسوله شدن زنده ماندند و در مدت زمان 21 روز گرماگذاری، بیش از 75 درصد از سلولها توانایی زنده ماندن خود را حفظ کردند. همچنین نتیجه آزمونهای بیان ژن، هیستولوژی و ترشح گلوکزآمینوگلیکان، نشان داد تمایز سلولهای مزانشیمی کپسول شده در هیدروژل به سلولهای غضروف‌ساز در مجاورت محیط تحریک کننده تمایز، در طول دوره تمایز برون‌تنی، رخ داده است.

واژه های کلیدی: هیدروژل درجا تشکیل‌ شونده آنزیمی، کتیرا، تیرامین، مهندسی بافت غضروف، تمایز سلولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 82883338-021، پست الکترونیک: evf@modares.ac.ir

مقدمه

پلیمرهای طبیعی با توجه به خواص مطلوبشان، جایگزینی مناسب برای پلیمرهای سنتزی در مصارف زیست‌پزشکی مانند مهندسی بافت محسوب می‌شوند (1, 28). کتیرا پلی‌ساکاریدی طبیعی است که از دسته‌ای از گونهای روینده در محدوده ترکیه تا افغانستان تراویده می‌شود. این صمغ از یک بخش محلول و یک بخش نامحلول متورم شونده در آب تشکیل شده است. بخش نامحلول تورم پذیر، باسورین و بخش محلول، تراگاکانتین یا تراگانتیک اسید نام داده شده است. واحدهای مونوساکاریدی تشکیل دهنده کتیرا، شامل دی-گالاکترونیک اسید، دی-گالاکترونیک اسید متیل استر، ال-آرابینوز، دی-زایلوز، دی-گالاکتوز و ال-فوکوز هستند. بدنه اصلی تراگانتیک اسید از مونومرهای گالاکترونیک اسید تشکیل شده که در برخی از آنها یک یا چند شاخه‌ جانبی شامل دو یا سه مونوساکارید، جایگزین هیدروژن گروه هیدروکسیل شده‌ است (17 و 31). ترکیب درصد مونوساکاریدها، درجه متیل استری شدن گروههای اسیدی و درجه استیلی شدن در صمغ تراویده از گونه‌های مختلف گیاه کتیرا متفاوت هست. این صمغ از دیرباز کاربرد زیادی در صنایع غذایی، داروسازی و طب سنتی داشته است. با توجه به خواص مطلوب شیمیایی و بیوشیمیایی کتیرا، پژوهشها‌ در زمینه گسترش کاربردهای این صمغ در زیست پزشکی و صنایع غذایی در سالهای اخیر رشد زیادی داشته است (26). از مطالعات انجام شده می‌توان به تهیه هیدروژل حساس به pH از کوپلیمر پیوندی کتیرا-پلی‌آکریلیک اسید (24) برای رهایش دارو، تهیه نانوالیاف از آمیزه فیزیکی کتیرا و پلی وینیل‌الکل (23) برای درمان زخم و تهیه نانوذرات کامپوزیتی کتیرا-الیگو کیتوسان (9) برای رهایش ژن اشاره کرد. مطالعات برون‌تنی پژوهشگران نشان داده که سمیت کتیرا بر روی سلولهای بنیادی انسانی در محیط برون‌تنی نسبت به پلیمرهای زیستی مانند کیتوزان و زایلوگلوکان کمتر است (8 و 28).

نتایج مطالعه فتاحی و همکاران (8) نشان داد که چسبندگی سلولهای L929 انسانی به کتیرای گونه اصفهان شبکه‌ای شده یونی نسبت به آلژینات شبکه‌ای شده یونی، بهتر است. دلیل این امر به برهمکنش مناسب سلولها با مونوساکاریدهای موجود در شاخه‌های جانبی کتیرا، مانند فوکوز، نسبت داده شده است (8).

حائری و همکاران (10) تمایز استئوژنیک سلولهای مزانشیمی انسانی کشت داده شده بر روی داربست هیدروژلی تهیه شده از کتیرای ژل شده یونی را بررسی کردند. مطالعه آنها نشان دهنده نقش مثبت کتیرا در فرآیند تمایز استئوژنیک سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی بود به گونه‌ای که در طول فرآیند تمایز، فعالیت آلکالین فسفاتاز و محتوای کلسیم و همچنین میزان بیان ژنهای Runx2، Osteonectin و Osteocalcin در مقایسه با کشت بر روی کلاژن بیشتر بوده است.

پیشتر، تیم پژوهشی حاضر پس از پیوندزنی تیرامین به ساختار کتیرا، تهیه هیدروژلهای شبکه‌ای شده شیمیایی تشکیل شونده در محل (In-situ forming hydrogel) با استفاده از واکنش آنزیمی را بررسی کردند (6، 27 و 28). برای تهیه هیدروژل، هیدروژن پراکسید و آنزیم هرس‌رادیش پراکسیداز با محلول پلیمر عامل دار مخلوط شدند. هرس‌رادیش پراکسیداز موجب تجزیه پراکسید هیدروژن به رادیکالهای پراکسید می‌گردد و این رادیکالها با حمله به اتم هیدروژن هیدروکسیل فنولی، موجب تشکیل جایگاه واکنش‌پذیر رادیکال آزاد بر روی گروههای تیرامینی می‌شود. در نتیجه واکنش دیمریزه شدن بین ساختارهای رادیکالی یاد شده، با تشکیل چندین پیوند کوالانسی دی‌تیرامینی بین زنجیره‌های پلیمر عامل دار، شبکه‌ سه بعدی هیدروژل شکل می‌گیرد.

هیدروژلهای تشکیل شونده در محل، به شکل مایع به بدن تزریق می‌شوند و در شرایط بدن به شکل جامد/ شبه جامد در می‌آیند. تشکیل این هیدروژلها به کمک روشهای مختلف شیمیایی و فیزیکی انجام می‌شود (2 و 18). در دهه اخیر استفاده از واکنش‌ آنزیمی برای تهیه این هیدروژلها مورد توجه قرار گرفته، زیرا واکنشهای آنزیمی در شرایط متعارف بدن رخ می‌دهد، احتمال واکنشهای جانبی کم است و سرعت آنها غالباً بالاتر از دیگر واکنشهای شیمیایی است (18).

بافت غضروف مفصلی شامل سلولهای کندروسیت توزیع شده در شبکه برون سلولی غنی از پروتئوگلیکان‌ها و فیبر کلاژنی است. سلولهای غضروف‌ساز (کندروسیت) تنها سلولهای پاسخ‌گوی ترمیم و نگهداری شبکه برون سلولی یاد شده هستند. سالانه انسانهای زیادی در اثر صدمات فیزیکی، پیری و ... دچار ضایعه‌های غضروفی می‌شوند. از طرفی بافت غضروف به دلایلی مانند نداشتن رگ و اعصاب، توانایی محدودی در ترمیم آسیبها دارد. بنابراین روشهای مختلفی برای درمان آسیبهای مفصلی پیشنهاد شده است. از مهم‌ترین روشهای درمانی می‌توان به کاشت اندام مصنوعی، کاشت بافت غضروفی ساخته شده در محیط برون‌تنی و ترمیم درجای بافت با تزریق سلولها به محل عارضه اشاره کرد (4 و 12). روشهای درمانی که نیاز به جراحی برای جاگذاری بافت پیش‌ساخته یا اندام مصنوعی دارند، موجب ایجاد زخم و نارضایتی در بیماران می‌شوند. همچنین تولید بافت غضروف در محیط برون‌تنی با اندازه و ویژگیهای ناحیه آسیب دیده بافت دشوار است. از طرفی تزریق سلولها به صورت فشرده (قرص فشرده سلولی (Cell pellet) و یا توده سلولی(Micromass)) به محل عارضه به دلیل محدودیت حجمی و چسبندگی سلولها به محل عارضه و تزریق تعلیق سلولی (Cell suspension) به دلیل مشکل نگهداشت سلولهای آسیب دیده در محل تزریق، در مرحله بالینی مفید به نظر نمی‌رسد. بنابراین، در سالهای اخیر توجه بسیاری از پژوهشگران بر استفاده از سامانه‌های تشکیل شونده در محل به عنوان داربست تزریقی سه‌بعدی برای حمل و کپسول کردن سلولها متمرکز شده است. در این فرآیند، با تزریق تعلیق سلول در محلول پلیمر و عوامل فعال زیستی به بدن، داربست سلولی سه بعدی شکل می‌گیرد که فضای خالی محل تزریق را پر می‌کند و نقش ماتریس برون سلولی را برای سلولهای کپسول شده ایفاء می‌کند. در طول زمان درمان، به تدریج سلولها ماتریس برون سلولی مورد نیاز خود را ترشح می‌کنند و داربست در صورت زیست‌تخریب‌پذیر بودن، مصرف شده یا از بدن دفع می‌شود (2، 3، 12 و 25). منابع سلولی که عمدتاً برای مهندسی بافت غضروف استفاده شده‌اند، شامل کندروسیتها و سلولهای بنیادی مزانشیمی هستند. هر چند استفاده از سلولهای کندروسیت، یک روش ارزنده برای ترمیم آسیبهای غضروفی است، محدودیتهایی برای این روش وجود دارد. برای مثال، برای استخراج کندروسیتهای اتولوگ نیاز به روشهای تهاجمی و برداشتن قسمتی از بافت مفصل است، دسترسی به این سلولها محدود است و با این روش تعداد کمی سلول به دست می‌آید، این سلولها (سلولهای کاملاً تمایز یافته) دارای قدرت تکثیر پایینی هستند و همچنین تکثیر سلولهای کندروسیت در آزمایشگاه ممکن است موجب تمایز زدایی آنها شود. در این بین، سلولهای بنیادی مزانشیمی همواره مورد توجه بوده‌اند، زیرا این سلولها دارای قدرت رشد و تکثیر بالایی هستند، در صورت قرار گرفتن در شرایط مناسب، می‌توانند به غضروف تمایز یابند و دسترسی به آنها راحت است (13). در سالهای اخیر چندین مطالعه در مورد تمایز برون‌تنی سلولهای مزانشیمی کپسول شده در داربستهای سه بعدی تزریقی به سلولهای کندروسیت انجام شده است (5، 7، 16، 20 و 21).

در پژوهش حاضر، پس از تهیه هیدروژل درجا تشکیل شونده آنزیمی، بررسی برخی خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن انجام شده و در ادامه میزان زنده‌ماندن سلولهای مزانشیمی کپسول شده در هیدروژل در مدت زمان 21 روز گرماگذاری و همچنین تمایز برون‌تنی سلولهای کپسول شده در هیدروژل به سلولهای کندروسیت در حضور عوامل تمایز دهنده ارزیابی شده است.

مواد و روشها

مواد: کتیرای خام ایرانی تراویده از گونه‌ اصفهان (Astragalus gossypinus) از بازار تهیه و پس از جداسازی ناخالصیها، آسیاب و ذخیره شد. هرس‌رادیش ‌پراکسیداز، هیدروکسی‌فنیل‌اتیل‌آمین (تیرامین)( 2-(4-hydroxyphenyl) ethylamine (tyramine)) ، آکریدین نارنجی(Acridine orange (AO))، پروپیدیوم یدید (Propidium iodide (PI))، دگزامتازون، انسولین-ترانسفورمین-سلنیوم (Insulin-transfermin-selenium (ITS)) و آسکوربیک بی‌فسفات (Ascorbic acid bi-phosphate) از شرکت سیگما-آلدریچ، هیدروژن پراکسید از شرکت مرک، فاکتور رشد نوترکیب انسانی (TGF-β₁= Recombinant human transforming growth factor-beta 1) از شرکت پپروتک و محیط کشت سلولی (Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)) از شرکت اینویتروژن تهیه شدند. دیگر مواد آزمایشگاهی و حلالها، همگی از درجه آزمایشگاهی تهیه و بدون خالص‌سازی استفاده شدند. پیوندزنی تیرامین به کتیرا، با استفاده از روش آمینولیزیز غیرهمگن در متانول مطابق روش شرح داده شده در مقالات پیشین (27) انجام شد و میزان عامل داروسازی با اسپکتروفوتومتری فرابنفش با استفاده از روش پیشنهادی ساکای و همکاران (19) محاسبه شد.

تهیه هیدروژل و زمان ژل شدن: برای تهیه هیدروژل، ابتدا محلول آنزیم با غلظت مشخص به محلول کتیرای عامل دار افزوده شده و سپس این محلول با استفاده از سرنگ دوتایی جفت با محلول هیدروژن پراکسید مخلوط شد. برای تعیین زمان ژل شدن از روش وارونه کردن لوله آزمایش استفاده شد (14). مشاهده نشدن تغییر شکل پس از یک دقیقه وارونه کردن میکروتیوب 5 میلی‌لیتری، نشانه تشکیل ژل در نظر گرفته شد.

تورم تعادلی: برای اندازه‌گیری تورم تعادلی، یک میلی‌لیتر هیدروژل خشک شده با روش انجمادی، وزن شد (M₀) و سپس به محلول بافر فسفات 1/0 مولار (4/7pH=) منتقل و در گرمخانه با شدت لرزش 150 دور بر دقیقه و دمای 37 درجه سلسیوس گرماگذاری شد. پس از 48 ساعت، هیدروژل بیرون آورده شده و پس از خشک کردن آب سطحی توسط کاغذ صافی، وزن گردید (M_t). میزان تورم تعادلی با تقسیم اختلاف وزن هیدروژل در هر زمان و وزن اولیه هیدروژل خشک بر وزن اولیه هیدروژل خشک مطابق رابطه 2 به دست آمد.

رابطه (2)

تورم/تخریب برون تنی: برای بررسی رفتار تورم/تخریب هیدروژل در محیط برون‌تنی، پس از تهیه هیدروژل به حجم 1 میلی‌لیتر (با وزن W₀) در میکروتیوب 5 میلی‌لیتری، 2 میلی‌لیتر بافر فسفات به هیدروژل اضافه و محیط در گرمخانه لرزان با شدت لرزش 150 دور بر دقیقه در دمای 37 درجه سلسیوس گرماگذاری شد. در بازه‌های زمانی معین، پس از خارج کردن محیط رویی، هیدروژل وزن شد (W_t). نسبت وزنی هیدروژل با تقسیم وزن هیدروژل در هر زمان بر وزن اولیه هیدروژل مطابق رابطه 1 محاسبه گردید.

رابطه (1)        

کپسول کردن سلولها در هیدروژل: برای کپسوله کردن سلولها در هیدروژل، سلولهای مزانشیمی کشت داده شده در فلاسک‌، توسط تریپسین جدا و پس از شمارش سانتریفیوژ شد. سپس مقدار مشخص محلول پلیمر عامل دار افزوده و تعلیق سلولی برای یکنواخت شدن چندین بار خیلی آرام پیپتاژ شد. سپس مواد مورد نیاز، در شرایط سترون با استفاده از سرنگ دوتایی مخلوط و به چاهکهای صفحه 24 خانه‌ای منتقل و در گرمخانه گذاشته شدند. پس از گذشت 10 دقیقه، یک میلی‌لیتر محیط کشت به هیدروژل افزوده شده و صفحه‌ها دوباره به گرمخانه منتقل شدند. در طول فرآیند کشت یا تمایز، هر دو یا سه روز یک بار 80 درصد حجمی از محیط کشت رویی با محیط کشت مناسب جایگزین شد.

توانایی زنده ماندن سلولهای کپسول شده در هیدروژل: برای بررسی توانایی زنده ماندن سلولهای کپسوله شده در هیدروژل، از روش رنگ‌آمیزی مرده-زنده با آکریدین نارنجی و پریمیدیوم یداید مطابق دستورالعمل شرح داده شده توسط لی و همکاران (15) استفاده شد. پس از دو بار شستشوی هیدروژل با بافر فسفات، 300 میکرو‌لیتر محلول آکریدین نارنجی و پریمیدیوم یداید در بافر فسفات با غلظت 30 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر به هیدروژل، در شرایط تاریک، اضافه شد. پس از 5 دقیقه، هیدروژل سه بار با بافر فسفات شستشو یافت و 500 میکرولیتر بافر بر روی هیدروژل اضافه شد. سپس، سریعاً از 10 مقطع هیدروژل، به صورت تصادفی توسط میکروسکوپ فلورسانس مجهز به فیلترهای سبز و قرمز تصویربرداری شد. برای تعیین تعداد سلولهای زنده یا مرده، از تعداد کل سلولهای زنده و مرده شمارش شده از 10 مقطع رنگ‌آمیزی شده میانگین گرفته شد. زنده مانی سلولی از تقسیم تعداد کل سلولهای زنده تقسیم بر مجموع تعداد سلولهای زنده و مرده محاسبه شد. تصاویر با تلفیق فیلتر سبز و قرمز تهیه شدند.

تمایز غضروفی: برای بررسی تمایز سلولهای مزانشیمی انسانی استخراج شده از مغز استخوان به سلولهای غضروف‌ساز (کندروسیت)، پس از کپسوله کردن این سلولها (در پاساژ سوم) با غلظت ⁶ 10 سلول بر میلی‌لیتر در هیدروژل، محیط عاری از سرم جنین گاوی اضافه و پس از 24 ساعت گرماگذاری، سلولها با محیط تمایزی دارای 10 نانوگرم فاکتور رشد نوترکیب انسانی تی‌جی‌اف بتا یک، 50 میکروگرم آسکوربیک اسید بی فسفات، ^7-10 مول دگزامتازون و 10 نانوگرم فاکتور رشد انسانی بی‌اف‌جی‌اف در میلی‌لیتر تغذیه شد. در مدت زمان آزمون (21 روز) هر 3 روز یک بار محیط کشت با محیط تمایزی جدید جایگزین گردید. همچنین برای مقایسه، تمایز برون‌تنی قرص فشرده سلولی بررسی شد. برای این کار، پس از جدا کردن سلولهای مزانشیمی (پاساژ سوم) از سطح فلاسک، فالکون 15 میلی‌لیتری حاوی تعلیق سلولی به تعداد حدود 200-300 هزار سلول، با شدت 13000 دور بر دقیقه (g 400) به مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس، برای شکل گرفتن قرص سلولی، محیط به مدت یک شب به همان صورت گرماگذاری گردید. در ادامه، محیط رویی خارج و با 700 میکرولیتر محیط تمایزی جایگزین شد. در طول فرآیند تمایز، هر 3 روز یک بار 500 میکرولیتر از محیط رویی با محیط تمایزی جدید جایگزین شد.

بیان ژنهای مرتبط با تمایز: سلولهای کپسوله شده پس پایان دوره معین تمایز، برای بررسی بیان ژنهای مرتبط از گرمخانه خارج شدند. استخراج ریبونوکلئیک اسید با استفاده از کیت استخراج ریبونوکلئیک اسید شرکت کیاژن انجام شد. برای این‌کار، پس از شستشوی هیدروژل با بافر فسفات، هیدروژل توسط اسکراپر سترون قطعه قطعه شد. سپس 2 مرتبه، 2 میلی‌لیتر بافر فسفات اضافه و پس از چندین بار پیپتاژ، محیط به مدت 8 دقیقه با شدت 25000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی خارج شد. در ادامه، یک میلی‌لیتر بافر لیز کننده به نمونه اضافه و محیط به مدت 5 دقیقه توسط دستگاه لیز کننده بافت شدیداً همزده شد. سپس با استفاده از کلروفرم، ایزوپروپانل، اتانول 75 درصد و آب دی‌یونیزه و مطابق با راهنمای کیت، استخراج محتوای ریبونوکلئیک اسید سلولها انجام گرفت و غلظت آن با استفاده از اسپکتروفوتومتر فرابنفش مشخص شد. تهیه کتابخانه ژنی (cDNA) با استفاده از کیت سنتز کتابخانه ژنی (ترانس‌کریپتاز وارون) شرکت اینویتروژن و مطابق دستورالعمل کیت انجام شد. در این مرحله از پرایمر رندوم هگزامر، بافر مربوط، dNTP و آنزیم ترانسکریپتاز وارون (Reverse transcriptase enzyme) استفاده شد. پس از اتمام مراحل، محلول کتابخانه ژنی ساخته شده در دمای 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. در مرحله بعدی، از مسترمیکس ساخت شرکت اینویتروژن، آنزیم برچسب زده شده و محلول پرایمر مرتبط برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (PCR thermo cycler) بمنظور تکثیر ژنهای مرتبط با فرآیند تمایز (کلاژن I، کلاژن II، ساکس 9 و اگرکان)( Collagen I, collagen II, SOX9 and aggrecan.) استفاده شد. سپس برای ارزیابی بیان ژنهای مرتبط، فرآیند الکتروفورز با استفاده از ژل 2 درصد وزنی آگارز انجام و تصویربرداری از ژل با استفاده از دستگاه UVIDoc انجام  شد.

بافت  شناسی  (هیستولوژی)  و  بررسی  ترشح  گلوکز

آمینوگلیکان: برای بافت‌شناسی و بررسی کیفی میزان ترشح گلوکزآمینوگلیکان، نمونه‌های مورد نظر پس از شستشو با بافر فسفات، در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. سپس به صورت مرحله‌ای با غلظتهای مختلف اتانول آبگیری و برای مراحل بعدی در پارافین نگهداری شدند. در مرحله بعد، برش مقطعی از نمونه‌ها تهیه و آنها با هماتوکسیلین و ائوسین (Hematoxylin and eosin stain) برای بافت شناسی و سافرانین-او (Safranin-O) برای بررسی کیفی میزان ترشح گلوکز آمین رنگ‌آمیزی شدند. سطح مقطع رنگ‌آمیزی شده برای ارزیابی کیفی توسط میکروسکوپ نوری بررسی و تصویربرداری شد.

نتایج و بحث

در فرآیند کپسول کردن سلولها در داربست هیدروژلی شکل گیرنده در محل آنزیمی، تعلیق سلولی در محلول پلیمر و عوامل تشکیل ژل در محل مورد نظر تزریق می‌گردد و در آن ‌جا داربست سلولی سه بعدی شکل می‌گیرد که فضای خالی محل تزریق را پر می‌کند. داربست یاد شده توانایی نگهداری و همراهی سلولها را در طول زمان درمان دارد و در صورت زیست‌تخریب‌پذیر بودن با گذشت زمان، در حالی که سلولها ضمن تکثیر و تمایز ماتریس برون سلولی مورد نیاز خود را ترشح می‌کنند، تجزیه می‌گردد. یک داربست مطلوب باید در زمان مناسب شکل بگیرد، دارای محتوای آب و تخلخل مناسب برای تبادل مواد مورد نیاز و مهاجرت سلولها باشد، چسبندگی لازم برای اتصال به بافت اطراف را داشته باشد، دارای گروههای فعال مورد نیاز برای اتصال سلولها باشد، زیست‌تخریب‌پذیر و زیست‌سازگار باشد و از نظر استحکام مکانیکی و فعالیت زیستی قادر بهمراهی سلولها در حین فرآیند رشد و ترشح ماتریس برون‌سلولی باشد.

تهیه هیدروژل و زمان ژل شدن: مطابق نتایج طیف‌سنجی فرابنفش، میزان عامل دارسازی تیرامین روی کتیرا 9/3 درصد وزنی بود. در فرآیند تهیه هیدروژل، هرس‌رادیش پراکسیداز موجب تجزیه پراکسید هیدروژن به رادیکالهای پراکسید می‌گردد و با حمله این رادیکالها به گروه فنولی کتیرای عامل دار، رادیکالهای آزاد فنوکسی شکل می‌گیرند. در نتیجه واکنش بین ساختارهای رادیکالی یاد شده، چندین پیوند کوالانسی بین زنجیرهای پلیمری ایجاد شده و شبکه‌ سه بعدی هیدروژل تشکیل می‌گردد. زمان ژل شدن نمونه‌ها با تنظیم غلظت پلیمر، آنزیم و هیدروژن پراکسید، قابل تنظیم در محدوده کمتر از 2 دقیقه بود. این زمان برای استفاده سامانه تشکیل شونده در محل برای کاربردهای بالینی مطلوب است. داربستهای هیدروژلی تشکیل شونده در محل باید در زمان مناسب شکل بگیرند تا از پخش محلول در بافت اطراف جلوگیری شده و سلولها فرصت رسوب پیدا نکرده و به صورت یکنواخت در شبکه هیدروژل قرار بگیرند (27).

تورم تعادلی: درجه تورم تعادلی هیدروژلهای تهیه شده از کتیرای عامل دار در بازه مورد مطالعه بسته به غلظت پلیمر، آنزیم و هیدروژن پراکسید در محدوده 16-22 متغیر بود. با افزایش غلظت هیدروژن‌پراکسید و آنزیم، به دلیل افزایش دانسیته شبکه‌ای شدن، درجه تورم تعادلی هیدروژل کاهش یافت. همچنین، با افزایش غلظت پلیمر به دلیل افزایش فشار تورمی ناشی از افزایش تعداد گروههای کربوکسیلی آزاد، درجه تورم تعادلی افزایش یافت.

تورم/ تخریب پذیری برون تنی: رفتار هیدروژل از نظر سرعت و میزان جذب آب و همچنین تخریب‌پذیری از ویژگیهای تأثیرگذار در انتخاب آن برای استفاده در زیست‌پزشکی است. نمودار رفتار جذب آب/ تخریب هیدروژل در بافر فسفات سدیم (pH=7.4) در شکل 1 نشان داده شده است.

در چند ساعت ابتدایی به دلیل نفوذ آب برای آب‌پوشی کامل زنجیره‌های پلیمری، هیدروژل با جذب آب متورم شده و نسبت وزنی هیدروژل افزایش می‌یابد. در ادامه، به دلیل تخریب برخی نقاط اتصال شیمیایی و کاهش چگالی شبکه، حجم شبکه هیدروژل و در نتیجه نسبت وزنی هیدروژل افزایش پیدا می‌کند. از طرف دیگر به تدریج تخریب بیشتر شبکه و همچنین تجزیه و حل شدن زنجیره‌های پلیمری، موجب فروپاشی تدریجی شبکه سه بعدی در قسمتهایی از هیدروژل گشته و نهایتاً روند کاهش نسبت وزنی هیدروژل شروع می‌گردد.

شکل 1- رفتار تورمی هیدروژل کتیرا-تیرامین در بافر فسفات با pH برابر 4/7؛ Polym: پلیمر (درصد وزنی)، Enz: آنزیم (واحد بر میلی‌لیتر)، Pr: هیدروژن پراکسید (میلی‌مولار)

این روند تا تخریب و حل شدن کامل شبکه ادامه پیدا می‌کند. همان طور که در شکل 1 مشاهده می‌گردد، سرعت جذب آب و در ادامه سرعت تخریب هیدروژل با افزایش غلظت هیدروژن پراکسید کاهش یافت. این مسئله می‌تواند به افزایش چگالی شبکه‌ای شدن نسبت داده شود. از طرف دیگر، هیدروژلهای تهیه شده در غلظتهای بالاتر پلیمر با سرعت بیشتری متورم شده و پایداری بالاتری در مقابل تخریب از خود نشان دادند. افزایش سرعت جذب آب در غلظتهای بالاتر کتیرای عامل دار می‌تواند به افزایش فشار تورمی ناشی از گروههای کربوکسیلی یونیزه شده روی زنجیره‌های پلیمری نسبت داده شود (29).

توانایی زنده ماندن سلولهای کپسول شده در هیدروژل: تصاویر حاصل از رنگ‌آمیزی سلولهای کپسول شده در هیدروژل تهیه شده با غلظت 5/2 درصد وزنی کتیرای عامل دار، 5 واحد بر میلی‌لیتر هرس‌رادیش پراکسیداز و 15 میلی‌مولار هیدروژن پراکسید در طول دوره تمایز در شکل 2 نشان داده شده است.

در حالی که زنده مانی سلولها پس از گذشت 2 ساعت از بارگذاری به صورت میانگین 96 درصد اندازه‌گیری شد، این عدد پس از 2، 12 و 21 روز گرماگذاری به ترتیب به 94 درصد، 82 درصد و 75 درصد درصد کاهش یافت. مطابق نتایج مطالعه انجام شده توسط پارک و همکاران (22)، تقریباً تمامی سلولهای کپسول شده در هیدروژل تهیه شده از آمیزه شیمیایی تترونیک-سوکسینیک انهیدرید- تیرامین (Tetronic-succinic anhydride-tyramine) در شرایط استفاده از غلظت کمتر از 5/18 میلی‌مولار هیدروژن پراکسید، پس از 2 ساعت گرماگذاری زنده ماندند. همچنین ژو و همکاران گزارش کردند که 9/76 درصد از سلولهای مزانشیمی کپسول شده در ژل فیزیکی آلژینات، در روز بیست و یکم تمایز زنده ماندند (30). این نتایج نشان دهنده زیست‌سازگاری مناسب هیدروژل تهیه شده از کتیرا است.

تمایز غضروفی: در این مطالعه تمایز سلولهای مزانشیمی کپسول  شده  در هیدروژل در محیط درون‌تنی با تمایز این

سلولها در شکل قرص فشرده سلولی مقایسه شده است.

شکل2- تصویر سلولهای کپسول شده در هیدروژل پس از (الف) 2 و (ب) 12 روز گرماگذاری (اندازه مقیاس: 200 میکرومتر) و نمودار زنده‌مانی سلولهای کپسول شده در هیدروژل در طول دوره تمایز برون‌تنی. نقاط سبز نشان دهنده سلولهای زنده و نقاط قرمز نشان دهنده سلولهای مرده هستند.

سامانه کشت قرص فشرده سلولی برای تمایز غضروف بر اساس      فرآیند ایجاد غضروف‌ در دوران جنینی طراحی شده است. در دوران جنینی اساس تمایز غضروفی، تراکم سلولی در سلولهای مزانشیمی محل تشکیل غضروف و در نتیجه افزایش تعامل سلولی است. در فرآیند تهیه قرص فشرده سلولی، تراکم سلولی با سانتریفیوژ کردن سوسپانسیون سلولها افزایش می‌یابد. این سیستم و سیستمهای مشابه مانند کشت توده سلولی (میکرومس) به دلیل محدودیت جرم و حجم، نمی‌توانند به صورت مستقیم در بسیاری از درمانهای بالینی استفاده شوند (7). داربستهای هیدروژلی با داشتن ساختار مشابه ماتریس خارج سلولی، به عنوان یک راه‌کار مناسب برای ایجاد محیط سه بعدی مورد نیاز سلولها در مهندسی بافت غضروف مطرح شده‌اند. هیدروژلهای تشکیل شونده در محل، به صورت محلول، با سهولت نسبی می‌توانند در محل عارضه تزریق شوند و در فرآیند تشکیل ژل ضمن کپسول کردن سلولهای معلق شده در محلول، فضای خالی محل تزریق را پر کنند. با توجه به خواص مطلوب فیزیکومکانیکی و بیولوژیکی داربستهای هیدروژلی‌ به عنوان یک محیط سه بعدی مساعد برای رشد، تکثیر و تمایز سلولی، تاکنون چندین مطالعه در خصوص تمایز برون‌تنی سلولهای مزانشیمی کپسول شده در هیدروژلهای تشکیل شونده در محل در حضور عوامل تحریک کننده تمایز انجام شده است. با توجه به نتایج این مطالعات، سلولهای مزانشیمی کپسول شده در محیط سه بعدی هیدروژل‌، در حضور عوامل تحریک کننده تمایز، در طول زمان تمایز نشانه‌های تمایز غضروفی مانند بیان ژنهای مرتبط با فرآیند تمایز غضروفی و ترشح گلوکزآمینوگلیکان را نشان داده‌اند (7، 11 و 21). در مطالعه حاضر، تمایز سلولهای مزانشیمی در حالت قرص فشرده سلولی و حالت کپسول شده در هیدروژل تشکیل شونده در محل تهیه شده از کتیرای اصلاح شده شیمیایی، به صورت کیفی مقایسه شده است. برای اثبات انجام تمایز غضروفی، روشهای متنوعی استفاده می‌شود که از این موارد می‌توان به بررسی بیان ژنهای مرتبط با تمایز غضروفی (کلاژن II، اگرکان و ساکس 9)، بررسی ترشح گلوکزآمینوگلیکان و کلاژن نوع II و آنالیز هیستولوژی اشاره کرد.

بیان ژنهای مرتبط با تمایز غضروفی: تصویر ژل الکتروفورز مربوط به بیان ژنهای کلاژن I، کلاژن II، اگرکان و ساکس 9 در سلولهای مزانشیمی، قرص سلولی فشرده و سلولهای کپسول شده در هیدروژل پس از 21 روز گرماگذاری برون‌تنی در حضور عوامل تمایز در شکل 3 نشان داده شده است.

اندازه قطعه محصول تکثیر شده توسط پرایمرهای اگرکان، کلاژن I، کلاژن II و ساکس 9 به ترتیب 190، 85، 121 و 263 جفت باز و اندازه شاخص 1000 جفت‌بازی است. در سلولهای مزانشیمی بیان کلاژن I به خوبی مشاهده شد و نشانه‌ای از کلاژن II، اگرکان و ساکس 9 مشاهده نشد. پس از 21 روز گرماگذاری قرص فشرده سلولی در حضور محیط تمایزی، ژنهای کلاژن II و ساکس 9 به خوبی بیان شد، اگرکان بیان ضعیف‌تری نشان داد و کلاژن I بیان نشد. در شرایط یکسان پس از 21 روز گرماگذاری سلولهای کپسول شده در هیدروژل، ژنهای کلاژن II و ساکس 9 بیان شدند ولی اگرکان بیان مناسبی نداشت. پیشتر پژوهشگران گزارش کردند که سلولهای مزانشیمی کپسول شده در هیدروژل تشکیل شونده در محل تهیه شده از صمغ ژلان، تنها در صورت مواجهه با عوامل تمایزی، ژنهای مربوط به تمایز غضروفی را بیان می‌کنند (7).

جدول 1- اثر عوامل مختلف بر درجه تورم تعادلی هیدروژل

شکل 3- تصویر ژل الکتروفورز آگارز مربوط به بیان ژنهای تمایزی کندروسیت: سلولهای مزانشیمی کپسول شده در هیدروژل (الف)، قرص فشرده سلولی (ب) و سلولهای مزانشیمی (ج)

هیستولوژی: در این مطالعه از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوسین برای بررسی هیستولوژی و مشاهده مورفولوژی سلولها استفاده شد (شکل 4).

همان‌گونه که در شکل 4 مشاهده می‌شود، در قرص فشرده سلولی چگالی سلولها بیشتر است و در هر دو نمونه سلولها تقریباً به صورت یکنواخت در سطح مقطع پخش شده‌اند. همچنین در هر دو نمونه سلولها تقریباً دارای مورفولوژی کروی هستند. تغییر مورفولوژی از حالت نسبتاً کشیده به کروی و بزرگ‌تر شدن اندازه سلولها به عنوان نشانه‌ای از انجام فرآیند تمایز بیان شده است (11 و 30).

ترشح گلوکز آمینوگلیکان: در شکل 5 رنگ‌آمیزی گلوکزآمینوگلیکان مقطع گرفته شده از نمونه‌های قرص فشرده سلولی و هیدروژل حاوی سلول در طول دوره تمایز نشان داده شده است.

همان‌گونه که مشاهده می‌شود، در نمونه هیدروژل بدون سلول، زمینه رنگ شده مشاهده نمی‌گردد. چگالی ترشح گلوکزآمینوگلیکان با افزایش زمان تمایز در هر دو مورد نمونه قرص فشرده سلولی و نمونه سلولهای کپسول شده در هیدروژل، افزایش یافته است.

شکل 4- تصویر رنگ آمیزی H&E سلولهای موجود در قرص فشرده سلولی (الف) و کپسول شده در هیدروژل (ب)، پس از 21 روز تمایز (ردیف بالا: اندازه مقیاس 200 میکرومتر و بزرگنمایی × 10 و ردیف پایین: اندازه مقیاس 50 میکرومتر و بزرگنمایی × 40).

همچنین، در نمونه‌ سلولهای کپسول شده در هیدروژل که با محیط کشت عاری از عوامل تمایز دهنده تغذیه شده، میزان ترشح گلوکزآمینوگلیکان نسبت به نمونه تغذیه شده با محیط تمایزی بسیار ناچیز است. این مسئله نشان‌دهنده نقش تعیین کننده عوامل بیوشیمیایی تحریک کننده تمایز (فاکتورهای رشد) در فرآیند تمایز غضروفی است. تمایز نیافتن سلولهای کپسول شده در هیدروژل و همچنین قرص فشرده سلولی در صورت تغذیه نشدن با عوامل تمایز دهنده، در مطالعات منتشر شده پیشین نیز گزارش شده است (7).

شکل 5- تصویر رنگ‌آمیزی گلوکزآمینوگلیکان نمونه‌ها. اندازه مقیاس: 200 میکرومتر و بزرگنمایی برابر × 20