بررسی اثر نانوکورکومین دندروزومی بر بیان ژن های POU5F1وNANOGدر رده سلولیCaco-2 سرطان کولون

مرضیه چوری، سهراب بوذرپور^*، عبدالوهاب مرادی و عیسی جرجانی

ایران، گنبد کاووس،دانشگاه گنبد کاووس، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 21/6/96                تاریخ پذیرش: 16/11/96

چکیده

سرطان کولون چهارمین سرطان شایع می‌باشد. با توجه به شیوع بسیار بالای سرطان و مرگ ناشی از آن، اهمیت پرداختن به پژوهش‌های مرتبط با داروها از جمله ترکیبات موثر در پیشگیری، درمان و جلوگیری از عود و بازگشت سرطان کاملا واضح و آشکار است. کورکومین رنگدانه زرد طبیعی جداشده از ریزوم زردچوبه می‌باشد. کورکومین یک کاندید جدید برای درمان سرطان محسوب می‌شود اما دسترسی زیستی و حلالیت کم،  استفاده از آن را با محدودیت روبرو کرده است. بدین منظور اثر نانوحامل دندروزومی در افزایش اثر کورکومین بر روی رده سلولی سرطانی کولون (Caco-2) مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور IC50 با استفاده از روش MTT محاسبه گردید و همچنین تاثیر نانوکورکومین دندروزومی بر بیان ژن‌های POU5F1 و NANOG به وسیله روش Real Time PCR بررسی شد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که نانوکورکومین دندروزومی به صورت وابسته به زمان و غلظت، رشد سلولی را کاهش داده، علاوه بر این بیان ژن‌های  POU5F1وNANOG را در رده سلولیCaco-2سرطان کولون کاهش می‌دهد. به‌طور کلی نتایج نشان داد که نانوکورکومین دندروزومی می‌تواند به طور مؤثر در درمان سرطان کولون با کاهش بیان ژن‌های دخیل در تکثیر نامحدود سلول‌ها دخیل باشد.   

واژه های کلیدی: نانوکورکومین دندروزومی، سرطان کولون، POU5F1 ،NANOG .

* نویسنده مسئول، تلفن: 09126878783 ، پست الکترونیکی:so.boozarpour@gonbad.ac.ir

مقدمه

سرطان یک فرایند چند مرحله‌ای بوده که دوره نهفته آن طولانی ولی در ادامه سریع و پیش‌رونده است (14). با توجه به شیوع بسیار بالای سرطان و مرگ ناشی از آن، اهمیت پرداختن به پژوهش های مرتبط با داروها از جمله ترکیبات موثر در پیشگیری، درمان و جلوگیری از عود مجدد سرطان کاملا آشکار است. سرطان کولون، شایع ترین سرطان دستگاه گوارش می باشد که اگر در مراحل اولیه تشخیص داده شوند قابل درمان است. روش‌های مختلفی برای درمان سرطان کولون مانند جراحی، شیمی‌درمانی و ایمنوتراپی وجود دارد، با این حال، امروزه تحقیقات گسترده ای جهت استفاده از ترکیباتی با منشا گیاهی در حال انجام می باشد (4 و 5 ، 18).

Turmeric یا زردچوبه، نام عامیانه گیاه Curcuma longa عضوی از خانواده زنجبیل می باشد که ریزوم های خشک شده آن به عنوان غذا و همچنین دارو در طب سنتی استفاده می گردد (10). زردچوبه علاوه بر استفاده به‌ عنوان ادویه، طعم دهنده و رنگ دهنده به غذا، به طور سنتی برای درمان بیماری های مختلف از جمله زخم معده، زردی، تصفیه خون، گلودرد، نفخ شکم، تب، بیماری‌های پوستی مانند پسوریازیس، بیماری‌های ریوی مثل آسم، آلرژی، روماتیسم و غیره کاربرد داشته است (18,23,24). با این حال نامحلول بودن، جذب و توزیع بافتی پایین، فعالیت کم، متابولیسم سریع و غیرفعال بودن محصولات حاصل در بدن، استفاده از کورکومین را به‌عنوان یک دارو با محدودیت روبه‌رو کرده است (12). بدین علت راهکارهای متنوعی جهت رفع این محدودیت ها در حال بررسی می باشد از آن جمله می توان به طراحی آنالوگ‌های ساختاری، مهارکننده‌های متابولیسمی و ناقل‌های فسفولیپیدی اشاره کرد (22). دندروزوم ها، نانو ناقل‌های پلیمری شاخه دار مشتق از اولئیک اسید می‌باشند و برای اولین بار در ایران سنتز شدند. پایداری، عدم سمیت، خنثی بودن بار الکتریکی، زیست‌تخریب‌پذیری، تهیه آسان و هزینه اندک تولید از ویژگی های این ناقلین محسوب می شود (26,25).

بر اساس نظریه سلول بنیادی سرطان، سلول های بنیادی بالغ که تقریباً در تمامی بافت های بدن یافت می شوند، منشا پیدایش و توسعه سرطان می باشند. این نظریه با ردیابی رده های سلولی در تومورهای در حال رشد تائید شده است. گزارشات متعددی حاکی از ارتباط مستقیم افزایش بیان ژن های ویژه سلول های بنیادی، پیشرفت و تهاجم سلول های سرطانی وجود دارد (17).

فاکتورهای رونویسی نقش مهمی در بقاء ویژگی های پرتوانی و خودنوزائی سلول های بنیادی دارند که ژن های POU5F1وNANOG جزء مهمترین ژن های دخیل در حفظ خودنوزائی و ویژگی های پرتوانی بوده و ژن های شروع کننده تمایز را مهار می کنند (7).

همچنین مطالعات متعددی بیانگر افزایش بیان این ژن ها در سلول های سرطانی کولون می باشد به طوریکه ژن هایPOU5F1  و NANOGرا به عنوان عامل مهمی در رشد و پیشرفت سلول های سرطانی کولون مطرح کرده است(13).

بنابراین ما در این مطالعه برای بررسی اثرپذیری و کارایی نانوکورکومین دندروزومی بر رده سلولی Caco-2 سرطان کولون بیان این ژن ها را مورد بررسی قرار دادیم.

مواد و روشها

کشت سلولی: به منظور کشت و ازدیاد رده سلولی Caco-2 سرطان کولون در آزمایشگاه از محیط کشت DMEM حاوی 20% FBS (سرم جنینی گاوی) و 1% آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین- استرپستومایین استفاده گردید و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد و CO2 5% انکوبه شدند. محیط کشت سلول ها هر 4 روز تعویض و تقریباً هر دو هفته یکبار سلول ها توسط تریپسین پاساژ داده شدند.

بررسی بقا سلولی پس از تیمار با کورکومین آزاد و نانوکورکومین دندروزومی با استفاده از روش MTT : میزان حساسیت سلول های کولون به داروی نانوکورکومین دندروزومی و کورکومین آزاد با روش MTT بررسی گردید. بدین منظور ده هزار سلول سرطانی(Caco-2) را در هر چاهک از پلیت 96 خانه ای قرار داده و پس از گذشت 24 ساعت، تحت تیمار با غلظت های مختلف نانوکورکومین دندروزومی، قرار داده شدند. همزمان به عنوان شاهد، تیمار با دندروزوم نیز برای بررسی سمیت این حامل بر رده سلولی مورد مطالعه صورت گرفت. در بازه های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار، محیط کشت حاوی دارو حذف و سلول ها با PBS شستشو شدند و سپس 20 میکرولیتر محلول MTT با غلظت 5 میلی گرم در هر میلی لیتر به هر چاهک اضافه شد و نمونه ها به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. سلول های زنده قادر هستند که MTT را احیاء نموده و فورمازان را ایجاد کنند که وجه تمایز سلول های زنده از سلول های مرده می باشد. به منظور بررسی میزان رسوب فورمازان تشکیل شده در سلول، 200 میکرولیتر DMSO به سلول ها اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در دمای محیط انکوبه گردید و سپس شدت رنگ هر چاهک با استفاده از دستگاه الایزا در طول موج 570 نانومتر تعیین گردید. درصد سلول های زنده در هر غلظت، از تقسیم میانگین جذب نوری سلول های تیمار شده با آن غلظت از ماده، بر میانگین جذب نوری کنترل(غلظت صفر دارو) و ضرب عدد حاصل در 100 محاسبه گردید. با این روش، IC50 که به عنوان غلظتی از دارو می باشد که توانایی کشتن نیمی از سلول ها را دارد تعیین شد. نتایج بدست آمده توسط نرم افزار Excel به صورت منحنی های دوز- پاسخ رسم گردید.

استخراج RNA : RNA تام سلول با استفاده از محلول Roche, Germany)) Tripure طبق پروتکل استاندارد کیت از سلول ها، استخراج گردید. بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج شده برای مراحل بعدی آزمایشات به ویژه روش Real time PCR از اهمیت ویژه ای برخوردار است. کمیت RNA به وسیله جذب نوری نمونه ها در 260 نانومتر در دستگاه نانودرآپ تعیین گردید و همچنین کیفیت RNA با بررسی پیوستگی آن در الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. در ادامه برای حذف آلودگی احتمالی DNA نمونه های RNA استخراج شده طبق پروتکل استاندارد با (Thermo Scientific, USA) DNase I تیمار شدند.

بررسی بیان ژن های OCT-4 و  NANOGبا استفاه از روش Real time PCR

واکنش نسخه‌برداری معکوس (سنتز cDNA): سنتز cDNA، با استفاده از آغازگرهای Oligo (dT) و Random Hexamers طبق پروتکل استاندارد کیت  PrimeScript RT reagent Kit (Takara, Japan) صورت گرفت بر این اساس، واکنش نسخه برداری معکوس در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه انجام پذیرفت و در نهایت آنزیم نسخه بردار معکوس در دمای 85 درجه سانتی گراد به مدت 5 ثانیه غیرفعال گردید و نمونه ها به فریزر 20- درجه سانتی گراد منتقل شدند.

برای بررسی میزان بیان ژن ها، پرایمرهای مورد نیاز برای ژن های OCT-4B1، NANOG وGAPDH(ژن مرجع) از مقالات مختلف انتخاب و توسط نرم افزار آنلاین BLAST-Primer بررسی شدند و در نهایت سه جفت پرایمر اختصاصی انتخاب گردید (جدول1). واکنش Real time PCR با استفاده از TAKARA, Japan))Premix Ex Taq TM II SYBR و پرایمرهای اختصاصی انجام گرفت (جدول2). برای به دست آوردن شرایط بهینه، واکنش های مختلف از نظر بازه دمایی صورت گرفت.

جدول 1- توالی و ویژگی های پرایمرهای مورد استفاده

جدول2- برنامه واکنش Real Time PCR

آنالیز داده ها با استفاده از روش ارزیابی نسبی صورت گرفت. این روش بر پایه نسبت بیان ژن مورد نظر به ژن مرجع است. پس از محاسبه کارایی تکثیر آغازگرهای واکنش که به منظور استفاده از روش 14 2-خ”خ”Ct">  انجام شد، آنالیز داده های حاصل از Real time PCR براسـاس چرخـه آسـتانه به دست آمده برای ژن های هدف و مرجـع و محاسـبه   142-خ”خ”Ct">  طبق قانون لیواک انجام گرفت و در نهایت آنالیز داده های Real time PCR با نرم افزار REST و رسم نمودارها توسط نرم افزارExcel صورت گرفت.

نتایج و بحث

بررسی سمیت سلولی نانوکورکومین دندروزومی و کورکومین آزاد بر روی رده سلولی Caco-2 سرطان کولون:به‌منظور بررسی اثرات سمیت سلولی و فعالیت ضد سرطانی کورکومین و نانوکورکومین دندروزومی در شرایط in vitro بر رده سلولی Caco-2 سرطان کولون از تست MTT استفاده شد. بدین منظور غلظت‌های مختلفی از ترکیبات فوق بر روی سلول‌ها اثر داده شد و سلول‌های بدون تیمار نیز به‌ عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. میزان زنده ماندن سلول‌ها به کمک سنجش MTT در سه بازه زمانی 24, 48 و 72 ساعت ارزیابی گردید.

نتایج نشان داد که کورکومین آزاد و نانوکورکومین دندروزومی به شکل وابسته به غلظت و زمان موجب مهار رشد سلول های سرطانی کولون می شوند. همچنین نانوکورکومین دندروزومی در مقایسه با کورکومین آزاد اثر سمیت بیشتری دارد و در غلظت‌های پایین‌تر سبب مرگ سلولی شده درصورتی‌که کورکومین آزاد در غلظت‌های بالاتر سبب مرگ سلولی می‌شود و این نشان‌دهنده حلالیت پایین کورکومین می‌باشد. داده های حاصل نشان می‌دهد که القای مرگ سلولی در سلول‌های Caco-2 سرطان کولون از طریق کورکومین صورت گرفته و دندروزوم حلالیت کورکومین را باعث شده است.

پس از تیمار سلول های سرطانی با کورکومین آزاد میزان مرگ و میر سلول ها تا غلظت30 میکرومولار اندک بود اما در غلظت های بیش از40 میکرومولار، افزایش ناگهانی در مرگ و میر سلول ها مشاهده گردید. به طوری که میزان IC50 در 24 ساعت برابر با60 و در 48 ساعت برابر با 49 میکرومولار محاسبه گردید. پس از تیمار سلول های Caco-2 سرطان کولون با نانوکورکومین دندروزومی در غلظت های 15-10 میکرومولار اثر چندانی بر میزان مرگ و میر سلول ها مشاهده نشد در حالیکه در غلظت های 25-20 میکرومولار افزایش ناگهانی در مرگ سلول ها قابل مشاهده بود این میزان پس از گذشت 48 و 72 ساعت از تیمار سلول ها با نانوکورکومین دندروزومی بیشتر گردید.

با توجه به نتایج بدست آمده، IC50 نانوکورکومین دندروزومی در بازه زمانی 24 ساعت معادل 26 میکرومولار و در 48 ساعت برابر با 22 و در 72 ساعت 18 میکرومولار محاسبه گردید. لذا نتایج ما رفتار وابسته به دوز نانوکورکومین دندروزومی را نشان می دهد.

بررسی بیان ژن های OCT-4B1 و  NANOGتوسط نانوکورکومین دندروزومی: به منظور بررسی اختصاصیت پرایمرهای مورد استفاده از منحنی‌های ذوب آن‌ها استفاده گردید وجود یک پیک نشانه اختصاصیت تکثیر انجام شــده در هر سه پرایمر مورد استفاده می‌باشد (نمودار 1).

نمودار 1- منحنی ذوب مربوط به بررسی بیان ژن های الف)  GAPDH، ب) NANOG ، ج) OCT-4B1 که توسط دستگاه Real-Time PCR (One Step Plus ABI) ثبت شده است. وجود یک پیک در نمودار بیانگر تکثیر اختصاصی ژن های موردمطالعه می باشد.

رسم منحنی استاندارد و محاسبه Efficiency برای ژن های مورد مطالعه: برای هر یک از ژن‌های مورد مطالعه به طور همزمان، یک واکنش Real time PCR انجام شد و پس از اتمام کار، منحنی استاندارد و نمودار تکثیر بر اساس  C_Tهای حاصل از هر یک از این واکنش‌ها به شکل زیر توسط دستگاه رسم گردید (نمودار‌ 2).

کارایی تکثیر ژن GAPDH معادل،121.33 و ژن NANOG، 99.71 می‌باشد و کارایی تکثیر واکنش برای ژن OCT-4B1 معادل 93.91 می‌باشد.

بررسی اثر نانوکورکومین دندروزومی بر بیان ژن های OCT-4B1 و NANOG در سلول های Caco-2 سرطان کولون: داده های حاصل از Real Time PCR نشان داد که ژن های OCT-4B1وNANOGدر ردهسلولی Caco-2 سرطان کولون بیان می شوند که می تواند نشان دهنده نقش این ژن ها در رشد و تکثیر تومورهای کولون باشد. نتایج نشان داد که بیان ژن NANOG پس از تیمار با نانوکورکومین دندروزومی 3.15 برابر و بیان ژن  OCT-4B12.58 برابر کاهش می یابد. در نتیجه تیمار به میزان IC50 نانوکورکومین دندروزومی (26میکرومولار) بیان ژن های مورد مطالعه را به طور معناداری کاهش می دهد (نمودار 3).

با توجه به میزان بالای شیوع سرطان و مرگ ناشی از آن، اهمیت شناسایی داروهای موثر بر سلول های سرطانی واضح و آشکار می باشد. سرطان کولون از جمله سرطان هایی است که شیوع بسیار زیادی دارد (14). بطوریکه، چهارمین سرطان شایع در میان افراد جامعه می باشد. اختلال در مسیرهای پیام رسان متعدد یکی از روندهایی است که موجب بروز سرطان کولون می گردد. نقش کورکومین در مهار مسیر WNT و در نتیجه کاهش تکثیر سلولی در مطالعات مختلف و از طرق گوناگون بررسی و تایید شده است. همچنین تاثیر آن بر مسیرهای PTEN و NFKB از طریق مهار ژن miR-21 تایید شده است. علاوه بر این از آنجاییکه سرطان کولون بیماری است که نقش اپی ژنتیک در آن بارز می باشد لذا ترکیباتی مانند کورکومین که با متیل ترانسفرازها و دیگر آنزیم های دخیل در فرایندهای اپی ژنتیکی بر همکنش دارد کاندید مناسبی برای درمان آن می باشد (15,9).

لذا ما در این تحقیق اثر نانوکورکومین دندروزومی را در مقایسه با کورکومین آزاد مورد مطالعه قرار دادیم نتایج این پژوهش نشان داد که نانوکورکومین دندروزومی در مقایسه با کورکومین آزاد اثر سمیت بیشتری دارد و در غلظت‌های پایین‌تر سبب مرگ سلولی شده در صورتی‌که کورکومین آزاد در غلظت‌های بالاتر سبب مرگ سلولی می‌شود و این نشان‌دهنده حلالیت پایین کورکومین می‌باشد. این داده‌ها نشان می‌دهد که القای مرگ سلولی در سلول‌های Caco-2 سرطان کولون به ‌واسطه کورکومین صورت گرفته و دندروزوم با افزایش حلالیت کورکومین این رسانش را به سلول‌های سرطانی تسهیل کرده است و این در حالی است که دندروزوم به تنهایی فاقد سمیت بر این رده سلولی می باشد.

یافته های حاضر نشان داد که نانوکورکومین دندروزومی اثر مهاری بالقوه ای بر سلول های Caco-2 سرطان کولون داشت که باعث کاهش رشد سلولی گردید. تاثیر مهاری نانوکورکومین دندروزومی به صورت وابسته به زمان و غلظت بود که در مطالعه ما IC50 نانوکورکومین دندروزومی در بازه زمانی 24 ساعت معادل 26 میکرومولار و در 48 ساعت برابر با 22 و در 72 ساعت 18 میکرومولار تعیین گردید.

نتایج مطالعات متعدد بر رده های مختلف سلول های سرطانی از جمله  SW-480(کولون) ، AGS (معده) ،  4T1(سرطان پستان) و 5637(مثانه) هم راستا با مطالعه حاضر ، نشان می دهند که نانوکورکومین دندروزومی با یک الگوی وابسته به غلظت و زمان رشد سلول های سرطانی را مهار می کند (جدول 3) (4,21).

جدول 3- مقایسه IC50 نانوکورکومین دندروزومی در رده های مختلف سلول های سرطانی