نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو هیات علمی دانشگاه فناوریهای نوین آمل
2 معاون پژوهشی،آموزشی پژوهشگاه رویان- جهاد دانشگاهی
3 گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه مازندران، کدپستی:95447- 47416، بابلسر، ایران
چکیده
سلولهای بنیادی اسپرم ساز سلولهایی هستند که در غشاء پایه لوله های اسپرم ساز قرار گرفته و قادر به تولید اسپرم در طول حیات مردان می-باشند. مطالعات مختلف آزمایشگاهی نشان داد این سلولها بعد از جداسازی از بافت بیضه، تحت شرایط های خاص قادر به کشت هستند. در این مطالعه سلولهای بیضه موش های نر5-7 روزه نژاد NMRIپس از تیمار با آنزیمهای هضم کننده کلاژناز تیپIV، DNAse و دیسپاز، جداسازی شدند. سپس تعداد تقریبی106 سلول در محیط های حاوی فاکتورهای رشد با شرایط کشت چسبنده، روی فیبروبلاست جنینی موش و کشت غیر چسبنده، روی آگارز 1 درصد، کشت داده شدند. نتایج نشان داد سلولهای بیضوی کشت شده در شرایط غیرچسبنده قادر به تشکیل کلنیهایی بوده که همانند کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز تشکیل شده در شرایط کشت چسبنده، مارکرهای سلولهای جنسی را بیان می-کنند. مطالعه میکروسکوپ الکترونی کلنیها نشان داد، هر دو نوع کلنی همانند سلولهای اسپرم ساز واقع در غشاء پایه لولههای اسپرم ساز دارای هسته بزرگ اما سیتوپلاسم کوچک میباشند. رنگآمیزی ایمونوفلورسانس وجود کلنیهای β1-Integrin، α6-Integrin و Oct4 مثبت را تایید کرد. آنالیزهای Real-time PCR نیز تفاوت معنیداری در بیان ژنهای سلولهای جنسی این کلنیها با سلول سوماتیکی نشان داد. از طرف دیگر افزایش بیان Ki67 در هر دو نوع کلنی با استفاده از بررسی ایمونوسیتوشیمی مشاهده شد که بیانگر خاصیت تکثیرپذیری این قبیل از سلول-ها است. این نتایج نشان میدهد سیستم کشت غیر چسبنده میتواند بعنوان یک روش جدید برای کشت کوتاه مدت سلولهای جنسی مشتق شده از بیضه مورد توجه محققین در تحقیقات بعدی قرار گیرد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Investigation of Spermatogonial Stem Cells in Adherent and Non-Adherent Culture
نویسندگان [English]
1 Biotechnology Dept., Amol University of Special Modern Technologies, Amol, I.R. of Iran
2 royan institute research&educational deputy
3 Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Basic Sciences, University of Mazandaran, Babolsar, Cod-Post: 47416-95447, Iran
چکیده [English]
Spermatogonial stem cells are the undifferentiated cells in the basal membrane of the seminiferous tubules and are able to produce sperm in male testis. Different experimental studies proved the capatility of undifferentiated spermatogonial stem cells to culture under different conditions, after isolation of the testes. In this study mouse neonate testicular cells (5-7 days-old NMRI strain) isolated by digestive enzymes include Collagenase IV, Dispase and DNAse. Then, approximately 106 cells were cultured in both adherent on MEF feeder layer and non-adherent culture system on 1% agarose with condition mediums that contained growth factors. Studies demonstrates that testicular cells cultured in a non-adherent condition (non-adherent colonies) were able to form colonies similar to spermatogonial stem cell colonies in adherent condition (adherent colonies) and clearly expressed germ cell marker. Electron microscope analyses made evident that both types of colonies were similar to localized spermatogonial stem cells on the basement membrane of seminiferous tubules and showed a high nucleus/cytoplasm ratio. Immunocytochemistry assays proved that both of colony expressed germ cell markers β1-Integrin, α6-Integrin and Oct4 positive. Real-time PCR analysis revealed significant differences in the expression of germ cell genes Oct4, Sox-2, CD9 and EPCAM, between these colonies and somatic cells. On the other hand, high expression of Ki67 in these colonies showed that these cells have proliferative characteristics. These results proved that a non-adherent culture system similar to adherent culture could provide a favorable method for in vitro short-term culture of spermatogonial stem-like cell colonies.
کلیدواژهها [English]
بررسی کشت سلولهای بنیادی اسپرم ساز در شرایط چسبنده و غیر چسبنده
حسین عزیزی1، عبدالحسین شاهوردی2* و اباصلت حسین زاده کلاگر3
1 آمل، دانشگاه تخصصی فناوری های نوین، دانشکده زیست فناوری
2 تهران، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده سلولهای بنیادی و زیست شناسی تکوینی
3بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی
تاریخ دریافت: 23/3/96 تاریخ پذیرش: 5/9/96
چکیده
سلولهای بنیادی اسپرم ساز سلولهایی هستند که در غشای پایه لوله های اسپرم ساز قرار گرفته و قادر به تولید اسپرم در طول حیات مردان میباشند. مطالعات مختلف آزمایشگاهی نشان داد این سلولها بعد از جداسازی از بافت بیضه، تحت شرایط خاص قادر به کشت هستند. در این مطالعه سلولهای بیضه موشهای نر5-7 روزه نژاد NMRIپس از تیمار با آنزیمهای هضم کننده کلاژناز تیپIV، DNAse و دیسپاز، جداسازی شدند. سپس تعداد تقریبی106 سلول در محیطهای حاوی فاکتورهای رشد با شرایط کشت چسبنده، روی فیبروبلاست جنینی موش و کشت غیر چسبنده، روی آگارز 1 درصد، کشت داده شدند. نتایج نشان داد سلولهای بیضوی کشت شده در شرایط غیرچسبنده (کلنی های غیر چسبنده) قادر به تشکیل کلنیهایی بوده که همانند کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز تشکیل شده در شرایط کشت چسبنده (کلنی های چسبنده)، مارکرهای سلولهای جنسی را بیان میکنند. مطالعه میکروسکوپ الکترونی کلنیها نشان داد، هر دو نوع کلنی همانند سلولهای اسپرم ساز واقع در غشای پایه لولههای اسپرم ساز دارای هسته بزرگ اما سیتوپلاسم کوچک میباشند. رنگآمیزی ایمونوفلورسانس وجود کلنیهای β1-Integrin، α6-Integrin و Oct4 (octamer-binding transcription factor 4) مثبت را تأیید کرد. آنالیزهای Real-time PCR نیز تفاوت معنیداری در بیان ژنهای سلولهای جنسی این کلنیها شامل: Oct4، Sox-2 (Sex determining region Y-box 2)، CD9، EPCAM (Epithelial cell adhesion molecule) را با سلول سوماتیکی نشان داد. از طرف دیگر افزایش بیان Ki67 در هر دو نوع کلنی با استفاده از بررسی ایمونوسیتوشیمی مشاهده شد که بیانگر خاصیت تکثیرپذیری این قبیل از سلولهاست. این نتایج نشان میدهد سیستم کشت غیر چسبنده میتواند به عنوان یک روش جدید برای کشت کوتاه مدت سلولهای جنسی مشتق شده از بیضه مورد توجه محققین در تحقیقات بعدی قرار گیرد.
واژه های کلیدی: سلولهای بنیادی اسپرم ساز؛ کشت سلول جنسی؛ بیان ژنهای جنسی؛ آنتی ژن Ki67
* نویسنده مسئول، تلفن: 02122339909 ، پست الکترونیکی: shahverdi@royaninstitute.org
مقدمه
فرآیند اسپرماتوژنز به وسیله جمعیت محدودی از سلولهای بنیادی اسپرم ساز شروع شده و حفظ میشود. برآورد میشود تقریباً در بیضه جوندگان بالغ از بین سلولهای سوماتیکی و همچنین سلولهای تمایز یافته اسپرم ساز، سلولهای بنیادی اسپرم ساز بین 02/0 تا 03/0 درصد کل تعداد سلولها را تشکیل دهند (9، 23 و 38). سلولهای بنیادی اسپرم ساز به غشای پایه لولههای اسپرم ساز متصل بوده و معیارهای مورفولوژیک آن به مکان قرارگیری در غشای پایه، ارتباط با دیگر سلولهای لوله اسپرم ساز، سیتوپلاسم روشن و نسبت بزرگی هسته به سیتوپلاسم مشخص میشود. هسته سلولهای بنیادی اسپرم ساز دارای ظاهری خالدار با لکههای تیره از نوع هتروکروماتینی میباشد(6). قابلیت خود نوسازی و تمایزی سلولهای بنیادی اسپرم ساز آنها را قادر میسازد تا فرآیند اسپرماتوژنز را حفظ کنند.
امروزه محققان از چندین روش برای جداسازی سلولهای بنیادی اسپرم ساز استفاده میکنند. یکی از روشها، استفاده از ماتریکس خارج سلولی مانند لامینین و کلاژن میباشد (1، 7، 19و30). علاوه براین از تکنیکهای FACS و MACSبر علیه تعدادی از مارکرهای سطح سلولی مختلف از جمله α6-Integrin (CD49) وβ1-Integrin (CD29) اینتگرین، CD9، E-cadherin ، THY-1 (CD90) و GFRa1 که در سطح سلولهای بنیادی اسپرم ساز بیان میشود هم در جداسازی این سلولها کاربرد دارد (17، 27، 28، 39و42). علاوه بر این روشها، شناسایی مورفولوژی سلولهای جنسی پس از کشت کل سلولهای بیضه از دیگر روشهای ارزشمند برای جداسازی سلولهای جنسی میباشد (18، 24و 26).
لایه تغذیه کننده به عنوان یکی از فاکتورهای اصلی برای رشد سلولهای بنیادی اسپرم ساز در نظر گرفته میشود. ویژگیهای لایه های تغذیه کننده مختلف پژوهشگران را قادر میسازد تا نتایج مناسبی از رشد و نگهداری سلولهای بنیادی به دست آورند. اخیراً از لایه تغذیه کننده فیبروبلاست جنینی موش یا MEF (Mouse embryonic fibroblasts) در بسیاری از محیطهای کشت سلولهای بنیادی اسپرم ساز استفاده میشود. مشخص شده لایههای تغذیه کننده بیضه حاوی سلولهای CD34 مثبت (33)، STOیا سلولهای سرتولی (13، 24و 27) میتوانند به عنوان سلولهای لایه تغذیه کننده از تکثیر سلولهای بنیادی اسپرم ساز حمایت کرده اما رده سلولهای سوماتیکی سرتولی TM4 یا SF7، حفظ و بقای تعدادی از سلولهای بنیادی جنسی را کاهش میدهد (24). بررسیها نشان داد ماتریکس خارج سلولی نانوفیبریلار نیز میتواند از حفظ و بقای سلولهای بنیادی اسپرم ساز موشهای نوزاد در طی
کشت کوتاه مدت حمایت کند (34 و 35).
علاوه بر موارد ذکر شده، سلولهای بنیادی اسپرم ساز میتواند تحت شرایط بدون سرم یا بدون سلولهای تغذیه کننده در پلیتهای پوشیده شده با لامینین تکثیر یابد اما در غیاب هر دو (سرم و سلولهای تغذیه کننده) این سلولها قابل تکثیر نمیباشند (14 و 15) با توجه به این تحقیقات، پتانسیل تکثیری سلولهای زایشی تحت شرایط سرم و بدون لایه تغذیه کننده (feeder free) کاهش مییابد (11). فاکتورهای رشد محلول میتواند نقشی حیاتی در کشت سلولهای بنیادی اسپرم ساز ایفا کند. مطالعات نشان داد ترکیبی از فاکتورهای رشد همچون GDNF، EGF، bFGF سلولهای بنیادی اسپرم ساز را در حالت غیر تمایز یافته حفظ مینماید (40).
علی رغم شرایط کشت چسبنده، کشت حالت سوسپانسیون سلولهای بنیادی اخیراً گزارش شد. این سیستم کشت میتواند از تکثیر، خود نوزایی و همچنین پر توانی سلولهای بنیادی پرتوان بدون تمایز به سلولهای با منشاء لایههای اکتودرمی، مزودرمی و اندودرمی حمایت کرده و این سلولها را در حالت غیر تمایز یافته حفظ کند (1، 2 و 36). سلولهای شناور در کشت سوسپانسیون نشانگرهای (مارکرهای) پرتوانی را بیان کرده و این قابلیت را دارد تا به سلولهای سه لایه جنینی تمایز یابد (36). لاریجانی و همکارانش سلولهای پر توان hESCs و hiPSCs را در شرایط کشت سوسپانسیون با روش micro-carrier-free گسترش دادند. به طور مشابه ای کشت سوسپانسیون hESCs هم در محیط کشت mTeSR انجام شد (36). همان طور که در بالا ذکر شد، برخی از تحقیقات نشان داد که کشت آزمایشگاهی سلولهای بنیادی اسپرم ساز طی کشت چسبنده، دارای محدودیتهایی در حفظ حالت خودنوزایی در سلولهای بنیادی اسپرم ساز است (12). به منظور غلبه بر این مشکل از کشت سوسپانسیون که مشخص شده دارای مزایای متعددی نسبت به کشت چسبنده است برای کشت سلولهای جنسی استفاده میشود(4، 8و31). در مطالعه قبلی این تحقیق نشان داده شده که کلنی های سلولهای بنیادی اسپرم ساز در شرایط غیر چسبنده (در پلیتهای کشت پوشیده شده با آگارز) قابل شکل گیری بوده و این کلنیها مارکرهای سلولهای بنیادی جنسی را بیان میکنند (4) در مطالعه حاضر کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز تشکیل شده در شرایط کشت چسبنده و غیر چسبنده مورد مقایسه قرار گرفته و میزان بیان مارکرهای جنسی در این سلولها با سلولهای سوماتیکی مشتق شده از بیضه ارزیابی شد.
مواد وروشها
جداسازی و کشت سلولهای بافت بیضه: روش جداسازی سلولهای بیضه از بافت بیضه به روش عزیزی و همکاران انجام شد(3). در این روش بیضه موش نر (نژاد NMRI) 5-7روزه بعد از جداسازی از حیوان، در محلول نمکی بافر فسفات قرار داده شد. سپس لولههای اسپرم ساز بیضه از کپسول بیضه جدا شده و به قطعات کوچکتر تقسیم شدند. بافت خرد شده در معرض mg ml-1 5/0 آنزیم کلاژناز تیپ IV؛ mg ml-1 5/0 آنزیم DNAse؛ و mg ml-1 8/0 از دیسپاز قرار داده شد. سوسپانسیون تک سلولی به دست آمده حاصل از هضم آنزیمی بافت بیضه، پس از عبور از فیلتر نایلونی μm 70 به مدت 10 دقیقه در rpm 1500 سانتریفیوژ شدند. محلول رویی حذف شد و در شرایط کشت غیر چسبنده حدود 106سلول بیضه در پلیتهای کشت پوشیده با آگارز 1 درصد حاوی [2%, FBS؛40 نانوگرم بر میلیلیتر ازGDNF (Glial derived neurotrophic factor)؛ 20 نانوگرم بر میلیلیتر از فاکتورEGF (Epidermal growth factor)؛ و 20 نانوگرم بر میلیلیتر از فاکتور FGF (Fibroblast growth factors)] قرار گرفت. سلولهای زنده با استفاده از روش رنگ سنجی عمومی Trypan blue شناسایی شد. در شرایط کشت چسبنده، سلولها در پلیتهای پوشیده با فیبروبلاست جنینی موش کشت داده شد. سلولهای بیضه در دمای 37 درجه سانتی گراد و CO2 5 درصد نگهداری شدند.
انجماد و ذوب سلولهای جنسی: سلولهای جنسی مشتق شده از بیضه در محلول فریز که حاوی 30%, DMEM، 60%, FBS و 10%, DMSO بود، قرار گرفته و سپس بلافاصله به ظروف انجماد حاوی ایزوپروپانول منتقل شده تا در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شود. بعد از 24 ساعت ویال به تانک نیتروژن منتقل شدند. در زمان ذوب، سلولها پس از انتقال به محیط کشت گرم شده DMEM ذوب شده و بعد از سانتریفیوژ و حذف محیط رویی در محیط کشت معمول خود کشت داده شد.
رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی: همانند پروتکل اشاره شده در رفرنس(4)، سلولهای کشت داده شده با پارافورمالدئید 4 درصد فیکس شده و بعد از نفوذ پذیری (permeabilized) با 2%,Triton، به مدت یک شبانه روز با آنتی بادی های اولیه انکوبه شد. پس از شستشو این روند با انکوبه کردن سلولها با گونه های خاص آنتی بادیهای ثانویه نشاندار ادامه یافت. در نهایت از میکروسکوپ فلورسنس (BX51, Olympus Co. Japan) و کونفوکال (LSM 700, Zeiss Co. Germany) برای بررسی سلولهای نشان دار شده استفاده گردید.
بررسیها با میکروسکوپ الکترونی: کلنیها دو بار با محلول PBSشسته شده سپس با بافر گلوتارآلدئید 5/2 درصد به مدت 2 ساعت تثبیت شد. مرحله بعدی تثبیت در تترا اکسید اسمیوم آبی به مدت 90 دقیقه انجام شد. نمونهها از طریق افزایش درصد اتانول (29 و 30) آبگیری شده سپس در دستگاه خشک کننده هوا خشک شد. سطح نمونه با لایه نازکی از طلا پوشیده شد و با میکروسکوپ الکترونی روبنده یا نگاره (VEGA\TESCAN, Czech Republic) مشاهده شد.
آنالیزهای بیان کمی ژن با روش FluidigmBiomark: از
این روش برای اندازه گیری بیان چندین ژن مخصوص سلولهای جنسی مانند Oct4، Sox-2، CD9، EPCAM و همچنین ژن خانه دار GAPDH برای سلولهای جنسی کشت داده شده استفاده شد. در این آزمایش سلولها به صورت مکانیکی و با استفاده از میکروپیپتهای مخصوص یا میکرومنیپولاتور جداسازی و بلافاصله منجمد شده و در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد. نمونهها با استفاده از بافر لیز کننده خاص لیز شده و در ادامه با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس mRNA به cDNA تبدیل شده و مقدار ترانس کریپتهای با استفاده از پرایمرهای مخصوص و با دستگاه Fluidigmتعیین کمیت گردید. به منظور تحلیل داده ها، Ct به دست آمده با بیان ژن GAPDH و همچنین بیان mRNA ژنها در سلولهای تغذیه کننده MEF نرمال سازی شده و آنالیز داده ها هم توسط نرم افزارهای GenEx، Exel و SPSS مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
در این مطالعه در شرایط کشت غیر چسبنده حدود 106 سلول بیضه موش در پلیتهای کشت cm210 پوشیده با آگارز 1 درصد و در حالت کشت چسبنده سلولهای جنسی بیضه روی ژلاتین و لایه تغذیه MEF کشت داده شد. سپس کلنیهای تشکیل شده در این دو شرایط مورد بررسی قرار گرفت (شکل های 1و2).
شکل1- بررسی کلنیها در شرایط غیر چسبنده: تشکیل کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در شرایط غیر چسبنده (A1 و A2)؛ تصویر میکروسکوپ الکترونی از کلنیهای اسپرم ساز (A3)؛ رنگآمیزی DAPI β1-Integrin, و ادغام آنها (B)؛ رنگآمیزی Oct4, α6-Integrin و ادغام آنها (C)؛ رنگآمیزی C-kit, Ki67 و ادغام آنها با DAPI (D). |
مشاهدات نشان داد که کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی حدود 7 روز پس از کشت در سیستم غیر چسبنده تشکیل شدند (شکل۱- A1وA2).
آنالیزهای میکروسکوپ الکترونی نشان داد که کلنیهای به دست آمده در حالت غیرچسبنده همانند سلولهای بنیادی اسپرم ساز قرار گرفته در غشای پایه لولههای اسپرم ساز، دارای ضریب نوکلئوپلاسمی (حجم هسته به سیتوپلاسم) بالا هستند (شکل1-A3). خصوصیات کلنیهای به وجود آمده در شرایط غیر چسبنده، 21 روز پس از کشت و با روش ایمونوسیتوشیمی مشخص شد. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس وجود کلنیهای β1-Integrin، α6-Integrin و Oct4 مثبت را تأیید کرد (شکل1-B وC).
همچنین با بررسی بیان مارکر تکثیر سلولی Ki67 در کلنیها، مشخص خواهد شد که آیا کلنیهای به وجود آمده در کشت غیر چسبنده میتوانند در این شرایط کشت، تکثیری داشته باشند؟ رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس بیان Ki67 را در کلنی های c-kit مثبت تأیید کرد (شکل 1-D و E). پروتئین Ki67 یک پروتئین غیرهیستونی هستهای است که در طی تکثیر سلولها بیان میشود (32).
نتایج به دست آمده در شرایط کشت غیر چسبنده با حالت چسبنده مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. تحت شرایط کشت چسبنده، کلنی سلولهای بنیادی جنسی در پلیتهای کشت پوشیده شده با ژلاتین تشکیل شده و سپس ادامه کشت این کلنیها در پلیتهای کشت جدید پوشیده با لایه تغذیه MEF انجام شد (شکل2- A و B). نتایج ذوب و انجماد نشان داد کلنیهای سلولهای جنسی به دست آمده از بافت بیضه در شرایط چسبنده و غیر چسبنده، بعد از انجماد دوباره شکل گرفت. آنالیز های میکروسکوپ الکترونی نشان داد این کلنیها همانند کلنیهای تشکیل شده در شرایط غیرچسبنده دارای هسته بزرگ اما سیتوپلاسم کوچک میباشد (شکل2-E). بررسیهای ایمونوسیتوشیمی بیان مارکرهای سلولهای جنسی Oct4، Sox2، Vasaو همچنین آنتی ژن Ki67را در کلنیهای به دست آمده تأیید کرد (شکل2-C، D وE). در این بررسی بیان Ki67 در کلنیهای Vasa مثبت نشان داد (شکل2-C).
آنالیز Fluidigm Realtime PCR افزایش معنی دار بیان mRNAی ژنهای Oct4، Epcam و Sox2 را در کلنیهای سلولی جدا شده در شرایط غیر چسبنده و چسبنده نسبت به سلول سوماتیکی بیضه نشان داد اما در سطح بیان Cd9 افزایش معنی داری مشاهده نشد (شکل3). همچنین این بررسی نشان میدهد کلنیهای سلولی جدا شده در شرایط غیر چسبنده و چسبنده نسبت به هم در بیان ژنهای Epcam ، Oct4، Cd9 و Sox2 تفاوت معنی داری ندارد (شکل3).
بحث
در این مطالعه کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز به دست آمده در شرایط کشت غیر چسبنده در مطالعه قبلی(4) با کلنیهای سلولهای اسپرم ساز تشکیل شده در شرایط کشت چسبنده مورد مطالعه قرار گرفت. بررسیها نشان داد کلنی سلولهای بنیادی اسپرم ساز جدا شده در شرایط کشت غیر چسبنده همانند کلنیهای به دست آمده در کشت چسبنده، مارکرها و ویژگیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز را نشان دادند. در شرایط کشت غیر چسبنده، به منظور ممانعت از چسبندگی سلولهای بیضه به بستر ظرف، سلولهای بیضه موش در محیط کشت حاوی فاکتورهای رشد و همچنین ظروف پوشیده شده با آگارز کشت داده شد(4). در شرایط کشت چسبنده سلولهای جنسی بیضه روی ژلاتین و لایه تغذیه MEF کشت داده شد. استفاده از فاکتورهای رشد GDNF و FGF2یا EGFنشان داد که این فاکتورها برای خودنوزایی تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی اسپرم ساز ضروری است (5 و 21).
از آنجائی که در مطالعات قبلی تأثیر کشت سوسپانسیون روی سلولهای بنیادی نشان داده شد (20، 22 و 36) و اخیراً محققان از سوسپانسیون بیوراکتور برای افزایش سلولهای زایا بیضه استفاده کردند (8 و31). نتایج این تحقیق نیز نشان داد که کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی جدا شده در هر دو شرایط کشت چسبنده و غیر چسبنده به وضوح مارکرهای سلول زایا را بیان میکنند. از سوی دیگر این تحقیق نشان داد کلنیها در محیط کشت غیرچسبنده همانند کلنیهای سلولهای اسپرم ساز در شرایط چسبنده ویژگیهای تکثیر پذیری را از خود نشان میدهند (34 و 37).
شکل2- بررسی کلنیها در شرایط چسبنده: تشکیل کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در شرایط چسبنده (A و B)؛ تصویر میکروسکوپ الکترونی از کلنیها (EM)؛ رنگآمیزی Ki67,Vasa و ادغام آنها (C)؛ رنگآمیزی Sox2, DAPI و ادغام آنها (D)؛ رنگ آمیزی Oct4, DAPI و ادغام آنها (E).
شکل3- آنالیز Fluidigm Realtime PCRبرای بررسی بیان ژنهای Epcam ، Oct4، Cd9 و Sox2
بررسیها نشان داد مسیر سیگنالینگ Nodal در سلولهای اسپرم ساز در حال تکثیر فعال میباشد (10). در مسیر سیگنالینگ Nodal، فعال شدن این مسیر با بیان ژنهای Smad2/3 و Oct4 همراه میباشد. با توجه به نتایج به دست آمده و بیان ژن Oct4، به نظر میرسد در کلنیهای سلولی جدا شده در شرایط غیر چسبنده و چسبنده مسیر سیگنالینگ Nodal فعال باشد.
در سلولهای اسپرم ساز مولکولهای مختلف مانند melanoma cell adhesion molecule،epithelial cell adhesion molecule وCD9 در چسبندگی و اتصالات سلولی نقش داشته به طوریکه از این عوامل در جداسازی این سلولها هم استفاده می شود (11و12). اگرچه بررسیهای مختلف نشان داد CD9 به عنوان یک مولکول سطح سلولی در سلولهای اسپرم ساز وجود دارد (3 و12). آنالیز های مولکولی ما در کلنی های سلولی جدا شده در شرایط غیر چسبنده و چسبنده نشان داد مارکر CD9 علاوه بر سلولهای اسپرم ساز در سلولهای سوماتیکی هم بیان میشود. سلولهای سوماتیکی بیضه با ترشح فاکتورهای رشد مختلف تکثیر و تمایز سلولهای اسپرم ساز را القاء میکند (29، 33 و41).
نتیجه گیری نهایی
سلولهای بیضه موشهای نر در محیطهای حاوی فاکتورهای رشد در شرایط غیرچسبنده قادر به تشکیل کلنیهایی بوده که همانند کلنیهای سلولهای بنیادی اسپرم ساز تشکیل شده در شرایط کشت چسبنده، مارکرهای سلولهای جنسی را بیان میکنند. مورفولوژی کلنیهای به دست آمده در شرایط غیرچسبنده با بررسیهای میکروسکوپ الکترونی مورد تأیید قرار گرفت. علاوه بر این، مطالعات ایمونوسیتوشیمی و Real-time PCR نیز بیان مارکرهای و همچنین تکثیر پذیری سلولهای جنسی این کلنیها را همانند کلنیهای چسبنده این آزمایش تأیید کرد. این نتایج میتواند تأیید کننده این باشد که کلنیهای سلولهای اسپرماتوگونی علاوه بر کشت چسبنده، در سیستمهای غیرچسبنده هم شکل گرفته که میتواند منجر به حفظ و بقای سلولها از طریق بیان ژنهای مرتبط شود. بنابراین میتوان در این شرایط کشت، فاکتورهای رشد مختلف و همچنین القای مسیرهای سیگنالینگ مرتبط را روی کلنی سلولهای اسپرم ساز، دور از تأثیرات سیتوکاینهای مترشحه از سلولهای لایه تغذیه کننده آنالیز کرد. با توجه به نتایج این تحقیق می توان پیشنهاد کرد: اگرچه سیستم غیر چسبنده میتواند مدل مناسبی برای بررسی اثر فاکتورهای مختلف بدون تأثیر سلولهای لایه تغذیه کننده باشد اما این روش برخلاف شرایط کشت چسبنده نمی تواند با ازدیاد کلنی های سلولهای بنیادی اسپرم ساز همراه باشد.
تشکر
نویسندگان از آقای حسین معینی و خانم فاطمه فلاح که در تهیه برخی از مواد و آنالیزهای آماری این پژوهش کمک نمودند، تشکر مینمایند. همچنین از حمایتهای مالی پژوهشگاه رویان (تهران) و همچنین مرکز مطالعات و همکاریهای علمی بینالملل وزارت علوم که به این پژوهش داشتهاند، تشکر میگردد.