نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه پیام نور تهران شرق
2 دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه پیام نور تهران
3 دکتری بیماری شناسی گیاهی وزارت جهاد کشاورزی، معاونت زراعت
چکیده
با گسترش فعالیت قارچهای بیمارگر در گیاهان زراعی، انجام مطالعات دقیق را در بحث کنترل آفات و بیماریهای گیاهی، مهم و ضروری به نظر میرسد. شانکر ساقه گوجهفرنگی که در اثر فعالیت قارچ Alternaria alternata f. sp. lycopersici ایجاد میشود، از مهمترین بیماریهای گوجهفرنگی در ایران است. این قارچ فیتوتوکسینی بنام AAL-toxins تولید میکند که بازدارنده بیوسنتز اسفنگولیپد در گیاه میزبان بوده و باعث شانکر ساقه میشود. مقاومت در برابر پاتوژن و عدم حساسیت به توکسین، توسط جایگاه ژنی ASC1 در گیاه میزبان کنترل میشود. پروتئین حاصل از بیان این ژن، قادر به سم زدایی AAL-Toxin است. این تحقیق با هدف ردیابی این ژن در34 ژنوتایپ مهم مورد استفاده در ایران انجام شد. پس از ساخت آغازگر مناسب برای ردیابی ژن دخیل در مقاومت گوجه فرنگی به بیماری شانکر ساقه و این ژن طی واکنش PCRدر ارقام مورد آزمایش ردیابی گردید. سپس محصول PCR توالییابی شده و نتیجه سکوئنس نشان داد که باند ایجاد شده مربوط به ژن مورد نظر می-باشد که از بین ژنوتایپهای مورد آزمایش ارقام کال جیN3، اکسیر فلات،VF Early urbana ، اوان، هیبریدps515، CHفلات، متین، Bonny Bost، هیبرید ایون، دارای ژن ASC-1بودند و برای اولین بار در ایران با روشهای مولکولی به عنوان ژنوتایپهای دارای ژن مقاوم به شانکر ساقه برای مطالعات بعدی معرفی شدند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Molecular detection of tomato Resistance gene to stem canker disease caused by alternata Alternaria
نویسندگان [English]
1 Payame Noor University
2 Payame Noor University
3 Ministry of Agriculture Jihad, Agriculture Dep. Tehran, I.R. of Iran
چکیده [English]
Abstract
The spread pathogenic fungi activity in crop plants, detailed studies on the control of pests and plant diseases, is considered essential. Tomato stem canker caused by Alternaria alternata f. sp. lycopersici created the most important diseases of tomato in Iran. This pathogen produces phytotoxin called AAL-toxins that is sphingolipid biosynthesis inhibitor in host plants, causing stem canker. Resistance against pathogens and lack of sensitivity to the toxin, by the gene in the host plant is controlled ASC1. The protein product of this gene, is able to detoxify AAL-Toxin.
Therefore, this study aimed to detect canker disease resistance gene in 34 major genotypes used in Iran. PCR products were sequenced the sequencer result showed that the gene is reproduced.
That the genotype of the cultivars Cal Jay N3, Elixir plateau, VF Early urbana, Evan, hybrid ps515, CH Plateau, Matin, Bonny Bost, hybrid ion, had ASC1 gene. Resistant genotypes to stem canker were identified by molecular methods for the first time in Iran for further study.
کلیدواژهها [English]
ردیابی مولکولی ژن مقاومت ژنوتیپهای گوجه فرنگی نسبت به بیماری شانکر ساقه ناشی از قارچ Alternata alternaria
خدیجه پیری فرد1، محمد علی ابراهیمی1* و سعیده پیرایش2
1 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
2 تهران، وزارت جهاد کشاورزی، معاونت زراعت
تاریخ دریافت: 2/5/95 تاریخ پذیرش: 28/9/95
چکیده
با گسترش فعالیت قارچهای بیمارگر در گیاهان زراعی، انجام مطالعات دقیق را در بحث کنترل آفات و بیماریهای گیاهی، مهم و ضروری به نظر میرسد. شانکر ساقه گوجهفرنگی که در اثر فعالیت قارچAlternaria alternata f. sp. lycopersici ایجاد میشود، از مهمترین بیماریهای گوجهفرنگی در ایران است. این قارچ فیتوتوکسینی بنام AAL-toxins تولید میکند که بازدارنده بیوسنتز اسفنگولیپد در گیاه میزبان بوده و باعث شانکر ساقه میشود. مقاومت در برابر پاتوژن و عدم حساسیت به توکسین، توسط جایگاه ژنی ASC1 در گیاه میزبان کنترل میشود. پروتئین حاصل از بیان این ژن، قادر به سم زدایی AAL-Toxin است. این تحقیق با هدف ردیابی این ژن در34 ژنوتیپ مهم مورد استفاده در ایران انجام شد. پس از ساخت آغازگر مناسب برای ردیابی ژن دخیل در مقاومت گوجه فرنگی به بیماری شانکر ساقه و این ژن طی واکنش PCRدر ارقام مورد آزمایش ردیابی گردید. سپس محصول PCR توالییابی شده و نتیجه سکوئنس نشان داد که باند ایجاد شده مربوط به ژن مورد نظر میباشد که از بین ژنوتیپهای مورد آزمایش ارقام کال جیN3، اکسیر فلات،VF Early urbana ، اوان، هیبریدps515، CH فلات، متین، Bonny Bost، هیبرید ایون، دارای ژن ASC-1بودند و برای اولین بار در ایران با روشهای مولکولی به عنوان ژنوتیپهای دارای ژن مقاوم به شانکر ساقه برای مطالعات بعدی معرفی شدند.
واژه های کلیدی: ارقام مقاوم، Alternaria alternata ، شانکرساقه،گوجه فرنگی
* نویسنده مسئول، تلفن: 02122442041 ، پست الکترونیکی:ma_ebrahimi@pnu.ac.ir
مقدمه
با توجه به افزایش میزان کاشت گوجهفرنگی در کشور، انجام مطالعات دقیق در بحث کنترل آفات و بیماریهای گیاهی مهم و ضروری است، از بیماریهای مهم گوجهفرنگی بیماری شانکر ساقه گوجه فرنگی که اولین بار در کالیفرنیای آمریکای جنوبی گزارش شده است. عامل بیماری قارچ Alternaria alternata f. sp. lycopersici میباشد که علائم آن به صورت زخمهای روی ساقه و لکههای بیضوی مایل به سیاه درطوقه، ساقه و شاخههای گیاه در برگها و میوهها به صورت لکههای نکروز دیده میشود. بررسی (12) جدایههای مختلف قارچ به وضوح نشان داد کهA. alternata پاتوژن اولیه میباشد و در این قارچ سمی به نام AAL-toxins تولید میشود که باز دارنده بیوسنتز اسفنگولیپد در گیاه میزبان بوده و باعث شانکر ساقه و از بین رفتن گونههای حساس گوجه فرنگی میشود. فیتوتوکسین AAL-toxins اولین بار توسط بوتینی و همکاران در سال 1981 از قارچlycopersici alternata f. sp.Alternaria جدا شد. این توکسین دارای دو بخش TB و TAاست که بخش سمی TAآن به عنوان دو استر از یک آمینوفنیل ١٩ کربن و تریو کربوکسیلات شناخته شده و بخش TB شبیه به بخش سمی TAبوده و در یک گروه کربوکسیل روی آمینوفنیل متفاوت میباشد. در واقع این توکسین جزء توکسینهای میزبان اختصاصی میباشد (8). مطالعات انجام شده بر روی جمعیتهای در حال تفرق برای ردیابی ژنهای مقاومت به این بیماری نشان داده که بیماری شانکر ساقه گوجهفرنگی در نسلهای در حال تفرق انجام شده است همچنین نشان داده که یک ژن غالب کنترل کننده این بیماری بوده که توسط دانشمندی به نام بارون با کمک مارکر MAS بنام ASC1 شناسایی و توالییابی شد به طوری که این ژن بر روی بازوی بلند کروموزوم 3 قرار دارد. مقاومت در برابر پاتوژن و عدم حساسیت به توکسین توسط جایگاه ژنی ASC1 کنترل میشود (3 و 9). در سایر مطالعات انجام شده وراثت پذیری مقاومت به عامل بیماریزای A. alternataمورد بررسی قرار گرفته و مشخص شده که این بیماری روی ارقام خاصی از گوجه فرنگی خسارتزا است و ژنوتیپهای مختلف دارای طیف وسیعی از واکنش نسبت به این بیماری میباشد (1). تا آنجا در تحقیق مشابهی، وجود اختلاف معنیدار بین ژنوتیپهای گوجهفرنگی نسبت به بیماری شانکر ساقه گوجهفرنگی مشخص شد که از نظر صفات بیماری برخی ژنوتیپها کاملاً مقاوم و برخی ژنوتیپها حساس، تعدادی از ژنوتیپها مقاومت نسبی به بیماری دارند (16). همچنین درجه پاسخ متفاوت به A. alternata با هجده رقم گوجهفرنگی، برای ارزیابی احتمال دخالت فعالیت پروتئاز و پراکسیداز از نتایج قابل ملاحظهای (6) و نیز بررسی واکنش مقاومت و یا حساسیت شش رقم گوجهفرنگی نسبت به بیماری شانکر ساقه با عامل A. alternata f. sp. Lycopersici (8) مورد بررسی قرار گرفت. حال با توجه به اینکه این بررسیها عمدتاً با روشهای تست بیماریزایی انجام شده است (5 و 14) بررسی تنوع ژنتیکی عامل بیماری با استفاده از تکنیکهای مولکولی و مارکرهای مبتنی بر PCRاز جمله RAPD (15) و بررسی رابطه فیلوژنتیکی عامل بیماری نیز با روشهای مبتنی بر PCR نیز با RAPD (11 و 13) نشان داد. که شناسایی ارقام مقاوم با روشهای جدید مولکولی اغلب دارای دقت بالاتر و نیازمند زمان کمتری است، در این تحقیق تلاش میشود شناسایی ارقام مقاوم در سطح34 رقم مهم گوجه فرنگی در ایران و به روش مولکولی انجام پذیرد. شناسایی توالی ژن دخیل در مقاومت گوجه فرنگی به بیماری شانکر ساقه اخیراً انجام شده است و برای اولین بار در این تحقیق از نگاه کاربردی از نتایج حاصل از پژوهش فوق در راستای شناسایی ارقام مقاوم در ایران استفاده شد. ژن ASC1میزان مقاومت و حساسیت گیاه را نسبت توکسین تعیین میکند. بیان ژن ASC1 باعث تولید پروتئینASC-1P شده که با آنزیم سرآمید سنتاز در مسیر اسفنگولپید بوده که با حضور ASC1پروتئین باعث مقاومت گیاه میشود. بررسی نتایج حاصل از تکثیر نشان داد که این پرایمر قدرت تمایز میان ارقام هموزیگوس غالب(Asc/Asc) و ارقام هتروزیگوس (Asc/asc) با ارقام هموزیگوس مغلوب (asc/asc) را دارد. توالی مربوط به ژن ASC1 در بانک ژن ثبت شده است با توجه به یافتههای محققان و اینکه روشهای معمول برای شناسایی و کنترل بیماری زمانبر و هزینهبر است و بسته به نوع آب و هوا شرایط کشت و پرورش متفاوت بوده و احتمال مقاومت به قارچ کشها وجود دارد، مطمئنترین و موثرترین روش کنترل، شناسایی ارقام مقاوم و کاشت آنها است (9 و 17) که برای اولین بار در این تحقیق در ایران در ارقام مهم گوجه فرنگی از روشهای مولکولی به این منظور بهره گرفته شده است.
مواد و روشها
کاشت ارقام گوجه فرنگی 5 رقم بذر اصلاح شدهL1 تا L5 در جدول 4 از مؤسسه تحقیقاتی و اصلاح نهال و بذر کرج، 21 رقم بذر از L6 تا L27 از شرکت فلات و ماباقی بذرها و L22 از شرکت گل سم که از ارقام گوجه فرنگی رایج در کشور تهیه شد. کاشت 34 رقم مختلف گوجهفرنگی در فضای آزاد با خاکpeat moss در گلدان و ماه اردیبهشت در دمای بین 19 تا 29 درجه سانتیگراد صورت گرفت. ارقام مورد آزمایش، در شرایط مناسب کاشته شده و طبق(شکل1) و (جدول1) کدگذاری گردید.
شکل1 - کاشت ارقام گوجه فرنگی
جدول 1- ارقام مورد استفاده در این تحقیق و کد مربوطه
کد |
ارقام گوجه فرنگی |
کد |
ارقام گوجه فرنگی |
1L |
Walter |
20L |
هیبرید پی اس |
2L |
Early ur bana |
21L |
سوپر 2270 |
3L |
Mana pd |
22L |
متین |
4L |
Pate early ch |
23L |
هیبریدفیزنزه |
5L |
Bonny Best |
24L |
هیبرکومودورو |
6L |
شف فلات |
L25 |
پریمو فلات |
7L |
پتو86 |
26L |
هیبریدپتوپراید2 |
8L |
اکسیر فلات |
27L |
سی اچ فلات |
9L |
کینگ استون |
28L |
روژین |
10L |
کنیگ استار |
29L |
کال جی ان 3 |
11L |
ارلی اوربانا وی اف |
30L |
هرمز |
12L |
کیمیا فلات |
31L |
هنگام |
13L |
وای فلات |
32L |
رها |
14L |
هیبریدایون |
33L |
زیومرد |
15L |
اوان |
L34 |
کیان |
16L |
کارون فلات |
|
|
17L |
هیبرید سوپرست |
|
|
L18 |
فلات111 |
|
|
19L |
سوپر شف |
|
|
استخراج DNA: پس از آماده سازی نمونهها، استخراجDNA به روشCTAB انجام گرفت (10) به منظور انجام فرآیند استخراج DNA بافت برگ گیاهچهها را با ازت مایع خرد نموده و سپس کد گذاری کرده و برای نگهداری به دمای 20- تا 80- منتقل گردید. بافر CTAB تهیه و pH= 8 تنظیم شد. نمونههای DNA استخراج شده بر روی ژل آگارز 8/0 درصد بارگذاری گردید و بعد از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید اندازه باند هر DNA خام استخراج شده با مقایسه غلظت مشخصی از نشانگر وزن مولکولی (Gen Ruler DNA Ladder Mix 10kb ) شرکت Fermentas تخمین زده شد. استخراج DNA برای هر رقم در 4 تکرار انجام گرفت و سپسDNA های تمیز و با غلظت مناسب برای PCR از همه ارقام انتخاب شد.
انجام فرآیند واکنش زنجیرهای پلیمراز: برای تهیه 25 میکرولیتر مخلوط اجزای واکنش زنجیرهای پلیمراز به ترتیب از 5/2 میکرولیتر PCR buffer، 75/0 میکرولیتر کلریدمنیزیم، 7/0میکرولیتر dNTP، 2/1 میکرولیتر آغازگر رفت و برگشت، 3/0 میکرولیتر Taq DNA polymerase ، 2 میکرولیتر DNA استفاده شد. جهت انجام این واکنش آغازگر اختصاصی ASC1 ساخت شرکت متابیون آلمان مورد استفاده قرار گرفت. توالی آغازگر مورد استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز برایAsc1f عبارت است از:ATCACATCGCTGCTTCGGTTG و برایAsc1r عبارت است از : ATCCCAGTCCGTTCCTTCT. برنامه حرارتی واکنش زنجیرهای پلیمراز اجرا شده عبارت است از: چرخه نخست، دو دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، 35 چرخه بعدی شامل، 95 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، 56 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه و 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه و چرخه نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه در دستگاه ترموسایکلرگرادیانت Bio rad مدل MycyclerTM انجام گرفت. این واکنش برای هر یک از نمونهها 5 بار تکرار شد ودر این تحقیق برای تعیین وزن باند از DNA Ladder mix 10000 استفاده شده است. برای بررسی تکثیر قطعه ژن مورد نظر، از الکتروفورز محصول PCR در ژل آگارز 2/1 درصد با بافر TBE استفاده گردید.
توالییابی(sequence) : پس از الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز و تکثیر قطعه ژن در برخی ارقام، جهت اطمینان از صحت کار، قطعه تکثیر شده تعیین توالی شد.
نتایج و بحث
استخراج DNA به روش CTAB انجام شد. الگوی الکتروفورزی استخراج DNA در ارقام مختلف گوجه فرنگی در ژل آگارز 8/0 درصد در شکل 2 آمده است. واکنش زنجیرهای پلیمراز طبق شرایط ذکر شده انجام و محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز در ژل آگارز 2/1 درصد با بافر TBE الکتروفورز شد. برخی از ارقام قطعه ژنی به وزنbp 1200 تکثیر کردند. (شکل3) از بین ارقام مورد آزمایش، ارقام کال جیN3، اکسیر فلات،VF Early urbana، اوان، هیبریدps515، CH فلات، متین،Bonny Bost ، هیبرید ایون دارای قطعه ژنASC1 بودند که پروتئین حاصل از بیان آن، قادر به سم زدایی AAL-Toxin بوده و بررسیها نشان داده است که وجود این ژن در گیاه میزبان مانع بروز علائم بیماری شانکر ساقه میشود. تک باند دیده شده در واکنش زنجیرهای پلیمراز، همراه با پرایمر مربوطه برای توالییابی به شرکت پیشگام ارسال شد. نتیجه سکوئنس نشان داد که باند ایجاد شده همان ژن مورد نظر میباشد. که نتیجه این توالی در پیوست نمایه شده است. این نتایج با مطالعات برخی از محققین همسو بود. کمترین میزان شاخص بیماری به رقمهای VF Early urbana و هیبریدps تعلق دارد (1). نتایج این تحقیق وجود ژن مقاومتASC1 را در این ارقام تأیید کرد. نتایج نشان دهنده وجود اختلاف معنی دار بین ژنوتیپها از نظر صفات بیماری (16) که این امر در نتایج این تحقیق تأیید شد.
|
شکل 2- الگوی الکتروفورزی استخراج DNA در ارقام مختلف گوجه فرنگی در ژل آگارز 8/0درصد
|
|
شکل 3- الگوی الکتروفورزی محصول PCR روی ژل آگارز2/1 درصد
پیوست یک
با توجه به تحقیقات براندواج (2002) که بر اساس آن مقاومت به وسیله ژن غالب ASC-1 در برابر قارچ Alternaria alternata f.sp. lycopersiciایجاد میشود میتوان مقاومت ارقام ذکر شده دارای این ژن را تأیید کرد از آنجا که توالی این ژن به تازگی در سایتهای معتبر درج گردیده است این یافتهها به صورت کاربردی برای اولین بار در ایران گزارش میگردد. فیتوتوکسینALL toxin ، که عامل اصلی ایجاد علائم است در تعامل پاتوژن میزبان تولید میشود و صفت مورد بررسی QTL دارای مقاومت عمودی است در سایر ارقام نیز قابل بررسی است. در حالی که اصلاح نباتات سنتی یک نقش محوری در توسعه ارقام مقاوم گوجهفرنگی را ایفا کرده است. لذا با توجه به اینکه گیاه گوجهفرنگی گونهای اقتصادی است و تولید آن به صورت مزرعهای و گلخانهای در کشور مرسوم است. ارقام مختلفی از این گونه در ایران کشت میشود که برخی از آنها به دلیل پرمحصول بودن، زودرس بودن و یا کیفیت میوه بر ارقام دیگر ترجیح دارند همچنین با وجود اینکه اصلاح ژنتیکی بذر گیاهی توانسته است تا حدودی از طریق بهبود جوانه زنی در شرایط نامساعد،عملکرد را تحت تأثیر قرار دهد با اینحال ویژگیهای دیگر این ارقام از نظر تحمل کمبودهای تغذیهای و یا شرایط تنشی نیز توسط محققان مورد بررسی قرار گرفته است تا از تولید گوجه فرنگی در مزرعه با تنشهای مختلف ممانعت شود. که هدف از این پژوهشها علاوه بر معرفی رقمی با تحمل بیشتر نسبت به کمبودها و تنشها و همچنین افزایش مقاومت آنها در برابر شرایط نامساعد محیطی به شمار میرود (2 و 4) اما ردیابی مولکولی ژن ثابت کرد که این روش میتواند یک ابزار بسیار مفید برای شناسایی مقاومت به سایر بیماریها در گوجهفرنگی باشد. با توجه به اینکه برخی ارقام با خصوصیات زراعی مناسب، فاقد ژن مقاوم هستند، با دسترسی به این ژن و انتقال آن به ارقام حساس میتوان به ارقام مقاوم با صفات زراعی مناسب دست یافت. آزمونهای بیماریزایی متعددی قابل طرح است که میتواند تآییدی بر تحقیقات انجام شده بوده و نتایج حاصل را به فضای گلخانه و مزرعه تعمیم دهد. با امید به اینکه این تحقیقات، راهگشایی برای مطالعات جدید در شناسایی سریع و تولید ارقام مقاوم نسبت به بیماریهای مختلف باشد.
5. Andrew M, Peever T, et al. (2009). An expanded multilocus phylogeny does not resolve morphological species within the small-spored Alternaria species complex. Mycologia, 101: 95-109.
6. Amjad H , Akhtar K P, Saleem M Y, et al. (2010). Correlative evidence for peroxidase involvement in disease resistance against Alternaria leaf blight of tomato. Acta Physiologiae Plantarum, 32: 1171-1176.
7. Aneja J , Agarwal A , & Agnihotri A. (2014). Inter and intra-specific diversity in Alternaria species infecting oilseed Brassicas in India. Journal of Oilseed Brassica, 5:102-117.
8. Aminian H, Zad J, Sharifi Tehrani A, Okhovat S M, et al.(2004). A study of tomato stem canker in Busher province. Iranian Journal of Agriculture Sciences 35: 245-252 (in Persian).
9. Barone, A., & Frusciante, L. (2007). Molecular marker-assisted selection for resistance to pathogens in tomato. Marker-Assisted Selection, Current status and future perspectives in crops, livestock, forestry and fish, 153-164
10. Guo, L., Hyde, K., & Liew, E. (2000). Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences. New phytologist, 147(3), 617-630.
11. Meena P, Rani A, Meena R, Sharma P, Gupta R, et al. (2012). Aggressiveness, diversity and distribution of Alternaria brassicae isolates infecting oilseed Brassica in India. African J Microbiol Res, 6:5249-5258..
12. Margaret M T, Shi A, & Kim M. S. (2011). Identification of Alternaria alternata as a causal agent for leaf blight in Syringa species. The Plant Pathology Journal, 27: 120-127.
13. Miguel P A, Luna A , de la Cruz S , González I , Martín R , et al. (2012). PCR-based assay for the detection of Alternaria species and correlation with HPLC determination of altenuene, alternariol and alternariol monomethyl ether production in tomato products. Food Control, 25: 45-52.
14. Naik M K , Chennappa G, Bhat K V, et al. (2014). RESEARCH ARTICLE MOLECULAR AND PATHOGENIC DIVERSITY OF ALTERNARIA SP. SOLATED FROM SESAMUM BY SCAR MARKER. International Journal of Current Research Vol. 6, Issue, 09:8335-8350
15. Reni C, Voorrips R E. (2006). Tomato early blight (Alternaria solani): the pathogen, genetics, and breeding for resistance. Journal of general plant pathology, 72: 335-347.
16. Shahriari D, Kangarlo S, Lak F, Ghasemi M A, et al. ) 2009(.Study on stem canker disease in tomato genotypes. Abstracts of the First National Congress on Tomato Production and Processing Technology. 11-12 February, Iran, Mashhad. page 108 (in Persian).
17. Tiwari S, Kumar S and Gontia I.) 2011(. Biotechnological approaches for sesame (Sesamum indicum L.) and Niger (Guiotia abyssinica L.f. Cass). Asian Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. 19:29.