نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تحصیلات تکمیلی در علوم پایه زنجان

چکیده

کمپلکس‌های منفذ هسته (NPCs) ‌گذرگاه‌های دوطرفه انتخابی بین هسته و سیتوپلاسم هستند. درحالیکه مولکول‌های کوچک می‌توانند آزادانه از میان NPCها انتشار ‌یابند، مولکول‌های بزرگ تنها به واسطه اتصال به گیرنده‌های انتقالی، می‌توانند از خلال آنها عبور کنند. کانال مرکزی NPC با پروتئین‌های نامنظم غنی از تکرارهای فنیل آلانین-گلایسین (FG) پوشیده شده است که به عنوان ناپِ FG شناخته می‌شوند و ادعا می‌شود این پروتئین‌ها مسئول عملکرد انتخابی NPCها هستند. در این مقاله رفتار انفرادی و دسته‌جمعی Nsp1، به عنوان نماینده‌ای از ناپ‌هایِ FG، با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی درشت‌دانه مطالعه شده است. در مدل درشت‌دانه ما، قدرت آبگریزی متفاوت آمینواسیدها به خوبی لحاظ شده است. نتایج شبیه‌سازی‌های ما نشان می‌دهد ناپ‌هایِ FG انفرادی، در حالت تعادل ساختارهای گلبولی دارند در حالیکه آرایه‌ای از ناپ‌هایِ FG متصل شده به یک سطح، ساختارهایی کشیده و برس‌مانند تشکیل می‌دهند. همچنین گیرنده‌ انتقالی NTF2 علاوه بر نفوذ به درون ساختار برسی منجر به فروریختگی آن نیز می‌شود. این مشاهدات نشان‌ می‌دهند مدل دروازه مجازی می‌تواند مدل پیشنهادی مناسبی برای سازوکار انتقال انتخابی از میان NPCها باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigating the Mechanism of Selective Transport through the Pore Complex of the Cell Nucleus Using Molecular Dynamics Simulation

نویسندگان [English]

  • Zeinab Ghesmati
  • sarah mohammadinejad

چکیده [English]

Nuclear pore complexes (NPCs) are selectively gated pathways between nucleoplasm and cytoplasm. Whereas small molecules can diffuse freely through NPCs, large molecules can pass only when bound to transport receptors. The NPC central channel is filled with disordered proteins, rich in phenylalanine-glycine (FG) repeats, called FG-nups which are claimed to be responsible for selective function of NPCs. In this paper, the individual and collective behavior of Nsp1, as a representative of FG nups, has been studied using coarse-grained molecular dynamics simulations. In our coarse-grained model, detailed hydrophobic properties of amino acids are considered. Our simulation results show that individual FG-nups form globular structures, whereas arrays of FG-nups tethered to a planar surface, form extended and brush-like structures. Moreover, NTF2, as a transport receptor is observed to penetrate inside brush and also leads to its collapse. These observations indicate that virtual-gate model could be a suitable model for describing selective transport through NPCs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nucleus pore complex
  • coarse-grained molecular dynamics simulation
  • selective transport
  • brush-like structure
  • transport receptors

بررسی ساز و کار انتقال انتخابی از میان کمپلکس منفذ هسته سلول با استفاده ازشبیه‌سازی دینامیک مولکولی 

زینب قسمتی و سارا محمدی­نژاد*

زنجان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی علوم پایه زنجان، دانشکده علوم زیستی

تاریخ دریافت: 18/3/95                تاریخ پذیرش: 11/8/95

چکیده

کمپلکسهای منفذ هسته (NPCs) ‌گذرگاههای دوطرفه انتخابی بین هسته و سیتوپلاسم هستند. درحالی که مولکولهای کوچک می­توانند آزادانه از میان NPCها انتشار ‌یابند، مولکولهای بزرگ تنها بواسطه اتصال به گیرنده‌های انتقالی، می­توانند از خلال آنها عبور کنند. کانال مرکزی NPC با پروتئینهای نامنظم غنی از تکرارهای فنیل آلانین-گلایسین (FG) پوشیده شده است که به عنوان ناپِ FG شناخته می‌شوند و ادعا می‌شود این پروتئینها مسئول عملکرد انتخابی NPCها هستند. در این مقاله رفتار انفرادی و دسته‌جمعی Nsp1، به عنوان نماینده‌ای از ناپهای FG، با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی درشت‌دانه مطالعه شده است. در مدل درشت‌دانه این تحقیق، قدرت آبگریزی متفاوت آمینواسیدها به خوبی لحاظ شده است. نتایج شبیه‌سازیها نشان می­دهد ناپهایِ FG انفرادی، در حالت تعادل ساختارهای گلبولی دارند در حالی که آرایه­ای از ناپهایِ FG متصل شده به یک سطح، ساختارهایی کشیده و برس­مانند تشکیل می­دهند. همچنین گیرنده‌ انتقالی NTF2 علاوه بر نفوذ به درون ساختار برسی منجر به فروریختگی آن نیز می‌شود. این مشاهدات نشان‌ می‌دهند مدل دروازه مجازی می­تواند مدل پیشنهادی مناسبی برای سازوکار انتقال انتخابی از میان NPCها باشد.

واژه‌های کلیدی: کمپلکس‌ منفذ هسته، شبیه‌سازی دینامیک مولکولی درشت‌دانه، انتقال انتخابی،‌ ساختار برس­مانند

* نویسنده مسئول، شماره تلفن: ۰۲۴33153313، پست الکترونیکی: [email protected] 

مقدمه

 

هسته سلول به وسیله غشایی دولایه به نام پوشش هسته احاطه شده است که فضای درون هسته را از فضای سیتوپلاسم جدا می­کند و در حفظ ماده ژنتیکی درون هسته کمک می‌کند. با این وجود حیات سلول، همواره به تبادل کنترل ‌شده  مواد بین هسته و سیتوپلاسم وابسته است. این تبادل از طریق منافذ بزرگی به نام کمپلکسهای منفذ هسته‌ای (NPC) (Nuclear Pore Complexes) انجام می‌شود که روی سطح پوشش هسته‌ به تعداد فراوان یافت می‌شوند (2۳ و 2۴). به عنوان مثال، ورود پروتئینها از سیتوپلاسم به هسته و خروج  mRNA  از هسته به سیتوپلاسم از طریق این منافذ انجام می‌شود. مولکولهای کوچک و یونها با قطری کمتر از 9 نانومتر به وسیله انتشار ساده از میان NPCها انتقال می­یابند، در حالی که مولکولهای بزرگتر با قطر حدود 9 تا 40 نانومتر مانند RNAها و بعضی از پروتئینها، نیازمند انتشار تسهیل شده ای هستند که از خلال NPCها و به وسیله اتصالشان به گیرنده‌های انتقالی فراهم می­شود. این گیرنده‌‌ها عبور محموله­های بزرگِ دارای توالی نشانه صحیح را از NPCها مدیریت می‌کنند و به این ترتیب فرآیند انتقال از خلال NPCها یک فرآیند انتخابی است (1۶، 2۳، 2۴، 2۹ و ۳۰).

NPCها از 30 نوع پروتئین به نام نوکلئوپورین‌ تشکیل شده‌اند که به اختصار ناپ (nup) نامیده می­شوند. تمام NPCها اساس ساختاری مشابهی دارند و از یک کانال مرکزی استوانه­ای، هشت رشته  سیتوپلاسمی و یک سبد هسته­ای تشکیل شده‌اند (۸ و 2۵). کانال مرکزی که نقش کلیدی در انتقال انتخابی دارد، دارای قطر nm 38 و طول  nm37 است (۳، ۴ و 2۲). این کانال با ناپهایی غنی از توالیهای تکراری فنیل‌آلانین-گلیسین به نام ناپهایِ FG فرش شده‌ است (۶، ۲۱ و 2۵). ناپهایِFG  بسیار انعطاف­پذیر هستند و خصوصیات نوعیِ پروتئینهای نامنظم و تانخورده دارند (۹ و 1۸). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ناپهایِ FG فرش‌کننده کانال مرکزی مسئول عملکرد انتخابی NPCها هستند (۲۵). برهمکنش بین ناپهایِ FG در کانال مرکزی NPC و گیرنده‌های انتقالی، کلید اساسی برای انتقال انتخابی از NPC است. گیرنده‌های انتقالی، بین محموله­هایی با توالی نشانه NLS (Nuclear localization signal) برای ورود محموله­ها به هسته و توالی نشانه NES (Nuclear export signal) برای خروج از هسته و مولکولهای بدون توالی نشانه تمایز قائل می­شوند و به این ترتیب انتقال انتخابی انجام می‌شود. NTF2 (Nuclear Transport Factor2) یک گیرنده ‌ انتقالیِ مهم در NPC است (1۶ و 2۷).

نتایج کارهای تجربی و شبیه­سازی­ پیشین نشان می‌دهند که گیرنده‌های انتقالی از طریق ایجاد برهمکنش آبگریزی با ناپهایِ FG فرآیند انتقال را امکان‌پذیر می‌کنند (۵، 1۳، 14، 1۵، ۲۰ و 2۶). اگرچه تاکنون سازوکار دقیقی که تمامی جنبه‌های انتقال انتخابی از میان NPCها را توضیح دهد پذیرفته نشده است، اما مدلهای متعددی برای آن ارائه شده است. از جمله پرکاربردترین این مدلها می‌توان مدل دروازه مجازی و مدل فاز ژل و مدل کاهش ابعادی را نام برد.

در مدل دروازه مجازی، ناپهایِ FG با آرایشی متراکم به سطح درونی کانال مرکزی NPC متصل شده‌اند و آرایشی شبیه برس ‌پلیمری تشکیل می‌دهند. در حالتی که قطعات پلیمر در کنار هم با چگالی بالا روی سطح نشانده شوند برای اینکه بتوانند بیشترین تعداد پیکربندی ممکن را اتخاذ کنند و به عبارتی آنتروپی خود را بیشینه کنند، به صورت موازی در کنار هم قرار می‌گیرند تا به این ترتیب فضای در دسترسِ هر پلیمر بیشینه مقدار ممکن باشد. به چنین ساختارهایی که پلیمرهای نشانده روی سطح به دلیل بیشینه کردن آنتروپی به صورت موازی هم آرایش پیدا می‌کنند، برس آنتروپیک گفته می‌شود.

در شرایط عادی، ناپهایِ FG، کشیده‌ شده و به صورت یک سد آنتروپیک عمل می‌کنند و مانع از ورود مولکولهای بزرگ می‌شوند. اما اگر یک مولکول‌ بزرگ به یک گیرنده‌‌ انتقالی متصل شود، برهمکنش گیرنده‌ انتقالی با توالیهای تکرار FG در ناپها، منجر به جمع شدن ناپها و در نتیجه باز شدن فضایی برای عبور محموله می‌شود. اما مولکولهای بزرگی که فاقد گیرنده‌ انتقالی باشند، قادر به عبور از NPC نیستند (۲۵). در مدل فاز ژل، ناپهایِ FG در شرایط عادی از طریق برهمکنشهای آبگریزی ضعیف بین زنجیره‌های جانبی فنیل‌آلانین در تکرارهای FG، یک شبکه سه‌بعدی ژل‌مانند در داخل کانال مرکزی NPC تشکیل می‌دهند. گیرنده‌‌های انتقالی در یک فرآیند رقابتی با ایجاد برهمکنش آبگریزی قوی‌تر و جداکردن موقتی اتصال بین تکرارهای FG، از میان این شبکه ژل‌مانند عبور می­کنند (۱۰ و ۱۱). در مدل کاهش ابعادی، تکرارهای FG کانال مرکزی NPC را با یک سطح پیوسته از FG می‌پوشانند. گیرنده‌های انتقالی می‌توانند از میان کانال مرکزی NPC توسط سُرخوردن از روی سطح FG به شکل حرکت تصادفی دوبعدی به جای حرکت تصادفی سه‌بعدی عبور کنند (2۸). با وجود اهمیت فهمیدن نحوه عملکرد این کمپلکسها، ماهیت نامنظم و همچنین نبود روشهای تصویربرداری با کیفیت بالا چالشی برای فهمیدن جزئیات عملکرد NPC با روشهای آزمایشگاهی ایجاد می‌کنند. در چنین شرایطی، روش شبیه‌سازی­ دینامیک مولکولی ابزاری مناسب برای مطالعه دقیق‌تر این ساختارهای بیومولکولی نامنظم فراهم‌ می‌کند (1۲). همچنین  با توجه به اینکه روش شبیه‌سازی دینامیک  مولکولی روشی قدرتمند در بررسی جزئیات ساختاری در پروتئینهاست (۱) بنابراین  با استفاده از آن سعی شده است  تا ارتباط  بین ساختار و عملکرد  NPC مورد بررسی قرار گیرد.

در این مقاله، به مطالعه سازوکار انتقال انتخابی از میان کمپلکس منفذ هسته پرداخته شده است. برای این منظور با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی، رفتار انفرادی و دسته‌جمعی یکی از ناپهای FG پرتکرار در منافذ غشای هسته­ مخمرها، به نام Nsp1، را به عنوان یک پروتئینِ نوعیِ فرش‌کننده NPCها مورد بررسی قرار گیرد. سپس در ادامه، چگونگی برهمکنش این ناپ با NTF2، به عنوان نمونه‌ای از یک گیرنده انتقالی، مورد مطالعه قرار می‌گیرد. برای مقایسه، برهمکنش یک مولکول غیرگیرنده با این ساختارها نیز مورد مطالعه قرار می‌گیرد. نتایج تحقیق حاضر، تأییدی بر مدل دروازه مجازی برای سازوکار انتقال انتخابی منافذ هسته است.

مواد و روشها

در تحقیق حاضر رفتار انفرادی و دسته‌جمعی Nsp1، به عنوان یک پروتئینِ نوعیِ فرش‌کننده NPCها مورد مطالعه قرار گرفت. برای این منظور از روش دینامیک مولکولی درشت‌دانه و بسته نرم‌افزاری اسپرسو استفاده شد. از آنجا که به دلیل بزرگ بودن سیستم شبیه‌سازی، امکان شبیه‌سازی جزئیات اتمی پروتئین وجود ندارد. بنابراین در قدم اول باید مدل درشت‌دانه‌ای برای مدل‌سازی پروتئین انتخاب شود که علاوه بر دقت کافی، بازدهی مناسبی نیز داشته باشد. برای این منظور، از مدل درشت‌دانه تریستن و همکارانش برای پروتئینها استفاده ‌‌شد (۷) که در آن هر آمینواسید با ۴ کره مدل می‌شود (شکل 1). کره اول گروه آمینو (NH3)، کره دوم گروه کربن آلفا (Cα)، کره سوم گروه زنجیره جانبی (Cβ) و کره چهارم گروه کربوکسیل (COOH) هر آمینواسید هستند. کره‌های اول، دوم و چهارم اسکلت زنجیره  پروتئین را تشکیل می‌دهند و در تمامی آمینواسید‌ها مشابهند. تفاوت بین آمینواسیدها که به زنجیره جانبی آنها برمی‌گردد، در کره سوم لحاظ شده است.

 

شکل ۱- مدل درشت‌دانه استفاده شده برای مدل کردن Nsp1. در این مدل هر آمینواسید با 4 کره  مدل می‌شود (5).

در این مدل، برهمکنشهای پیوندی و غیرپیوندی مختلفی بین کره‌های سازنده آمینواسیدها، درنظر گرفته می‌شود. برهمکنشهای پیوندی در این مدل شامل سه برهمکنش است: ۱) برهمکنش دوذره‌ای هارمونیک جهت اعمال قدرت و طول پیوند بین‌ کره‌های مجاور، ۲) برهمکنش سه‌ذره‌ای زاویه پیوندی برای درنظر گرفتن سختی خمشی زنجیره پروتئینی و ۳)‌ برهمکنش چهارذره‌ای دوووجهی جهت اعمال زوایای دووجهی مربوط به زنجیره پروتئینی. برهمکنشهای غیرپیوندیِ درنظر گرفته شده در این مقاله نیز شامل سه برهمکنش است: ۱) برهمکنش لناردجونز برای اعمال حجم اشغالی کره‌ها، ۲) برهمکنش آبگریزی برای اعمال جاذبه آبگریزی بین زنجیره جانبی آمینواسیدهای مختلف که برای ۲۰ آمینواسید  قدرت متفاوتی دارد و ۳)‌ برهمکنش هیدروژنی بین  گروه آمید از یک آمینواسید با گروه کربوکسیل از یک آمینواسید دیگر که زمانی مقدار قابل توجهی دارد که گروه آمید و گروه کربوکسیل تقریباً در یک راستا قرار گرفته باشند. برای اطلاع از جزئیات بیشتر در مورد روابط و مقادیر پارامترهای مربوط به این برهمکنشها به مقاله تریستن (۷) رجوع شود.

مزیت این مدل درشت‌دانه نسبت به مدلهای دیگر دقت بالای آن می‌باشد. همان طور که پیداست تفاوت بین آمینواسید‌ها اعم از قدرت برهمکنش آبگریزی و تمایل به برهمکنش هیدروژنی در زنجیره‌های جانبی آنها در این مدل به خوبی لحاظ شده است و گزینه مناسبی برای مدل کردن زنجیره پروتئینی است زیرا دارای جزئیات مناسبی از خصوصیات هر آمینواسید است.

توالی مربوط به ناپ Nsp1 از پایگاه داده UniProt با کد مشخصه p14907 دانلود شد و با استفاده از مدل درشت‌دانه توضیح داده شده در بالا و شبیه‌سازی دینامیک مولکولی، رفتار انفرادی و دسته‌جمعی آن مطالعه شد. در این شبیه‌سازیها برای جلوگیری از  اثرات سطحی از شرایط مرزی دوره‌ای استفاده ­شد. ابعاد جعبه شبیه‌سازی  Å130 × Å130 × Å416 در نظر گرفته شد. شبیه‌سازیها با استفاده از ترموستات لانژون در دمای ثابت  انجام شدند. محیط آبی به صورت یک محیط پیوستار در نظر گرفته شد و شبیه‌سازیها برای مدت زمانی ۵ میکروثانیه اجرا شدند.

نتایج

به منظور بررسی سازوکار انتقال انتخابی از خلال کانال مرکزی NPC با جزئیات بیشتر، در ابتدا رفتارهای انفرادی و دسته‌جمعی  ناپ Nsp1 با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی در سطح درشت‌دانه مطالعه می‌شود. سپس گیرنده‌ انتقالی NTF2 به ساختارهای نهایی حاصل اضافه می­شود و برهمکنش آن با Nsp1 مورد مطالعه قرار می­گیرد.

قطعات انفرادی Nsp1: برای بررسی رفتار انفرادی از آنجا که شبیه‌سازی تمام آمینواسیدهای Nsp1 به طور همزمان از نظر کامپیوتری زمان‌بر است، در ابتدا توالی یک پروتئین Nsp1 به 6 قطعه 100 تایی با نامگذاریهای ,S1 ,S2 ,S3 ,S4 S5 و  S6(جدول ۱) تقسیم‌بندی شده و شبیه‌سازی برای هر کدام از این ۶ قطعه به طور مجزا انجام شد. در ابتدای شبیه‌سازی، ساختار اولیه به صورت کاملاً کشیده در نظر گرفته ‌شد که در آن ستون فقرات پروتئین در راستای محور z در دستگاه مختصات دکارتی قرار دارد (شکل 2 الف). ساختار اولیه بعلاوه ساختارهای تعادلی این قطعات در شکل 2 الف نشان داده شده است که مشاهده می‌شود با وجود حالت اولیه کاملاً کشیده، این قطعات در حالت تعادل ساختاری کروی را اتخاذ می‌کنند. تحول زمانی شعاع ژیراسیون این ۶ قطعه در نمودار شکل ۲ ب نشان داده شده است. همان طور که در این نمودار دیده می‌شود، با گذشت زمان شعاع ژیراسیون زنجیره‌ها کاهش می‌یابد که بیانگر این موضوع است که زنجیره‌ها از حالت کشیده به حالت جمع‌شده گلبولی در می‌آیند. میانگین شعاع ژیراسیون تعادلی حاصل از شبیه‌سازی برای هر ۶ قطعه به همراه تعداد تکرارهای FG در هر قطعه، در جدول ۱ آورده شده است. با در نظر گرفتن شعاع ژیراسیون تعادلی برای هر قطعه، حجم ساختارهای کروی از طریق رابطه πRg3  محاسبه شد و  با تقسیم تعداد تکرارهای FG در هر قطعه بر حجم آن، چگالی تکرار FG برای هر ۶ قطعه نیز محاسبه شد که در جدول ۱ ارائه شده است.

 

جدول 1- اطلاعات مربوط به شبیه‌سازی 6 قطعه Nsp1 انفرادی. شماره توالی هر قطعه، طول زمان شبیه‌سازی، شعاع ژیراسیون حاصل از شبیه‌سازی و تعداد‌ و چگالی تکرار FG در هر قطعه.

قطعات

شماره توالی

زمان شبیه‌سازی (sμ)

شعاع ژیراسیون (Å)

تعداد تکرارهای FG

چگالی تکرار FG (FG-repeat/nm3)

S1

100-1

5

05/13

7

75/0

S2

200-101

5

6۸/12

6

70/0

S3

300-201

5

90/13

4

35/0

S4

400-301

5

4۸/13

5

39/0

S5

500-401

5

۱۰/15

5

34/0

S6

600-501

5

۵۰/14

5

39/0

 

 

(الف)

 

(ب)

 


 

شکل ۲- الف) ساختار اولیه کشیده و ساختارهای تعادلی گلبولی 6 قطعه Nsp1 که به طور انفرادی شبیه‌سازی شده­اند.  ب) تحول زمانی شعاع ژیراسیون قطعات انفرادی. با گذشت زمان شعاع ژیراسیون در حال کاهش است که نشان دهنده تحول ساختاری زنجیره‌ها از حالت کشیده به حالت گلبولی می‌باشد.

 

میانگین چگالی تکرار FG در این ۶ قطعه، مقدار 4۹/0 تکرار FG بر هر نانومتر مکعب به دست می‌آید که تقریباً ۶ برابر چگالی تکرار FG اندازه‌گیری شده در NPC واقعی مخمر می‌باشد. تعداد تکرار FG بر هر نانومتر مکعب در NPC واقعی مخمر،  08/0 اندازه‌گیری شده است (۵). از آنجا که چگالی به دست آمده برای ۶ قطعه انفرادی در مقایسه با مقدار واقعی به طور قابل توجهی بزرگتر است، به نظر می‌رسد نحوه قرارگیری این ناپها در شرایط واقعی NPC، متراکم‌تر از حالت انفرادی است. بنابراین در ادامه رفتار دسته‌جمعی این ناپهایِ FG مورد بررسی قرار می گیرد.

آرایه­ی دسته‌جمعی از Nsp1: در کانال مرکزی NPC مشاهده شده که ناپهایِ FG با تراکم بالا درون کانال را فرش می‌کنند و برای ایجاد فضای بیشتر جهت بیشینه کردن تعداد پیکربندیهای خود (به عبارتی افزایش آنتروپی)، در جهت عمود بر سطح کشیده می‌شوند و ساختاری شبیه برس پلیمری اتخاذ می‌کنند. همان طور که در قسمت مقدمه ذکر شد چنین ساختار برس‌مانندی منشاء یک مدل شناخته شده برای سازوکار عملکرد انتخابی NPC نیز شناخته می‌شود.

بر این اساس در این قسمت قطعاتی از Nsp1 مطابق شکل قرارگیری آنها در کانال مرکزی NPC، کنار هم روی سطحی قرار داده و رفتار دسته‌جمعی آنها مورد بررسی قرار می گیرد.  Nsp1به عنوان نوکلئوپورینی که در کانال مرکزی NPC، رفتار دسته‌جمعی برس‌مانند دارد، مطابق جدول ۲ به ۲۵ قطعه 100 آمینواسیدی که با هم همپوشانی دارند تقسیم گردید. سپس این ۲۵ قطعه به صورت آرایه 5×5 و با فاصله  Å 26 از همدیگر به سطح یک صفحه ثابت شدند. انتخاب این فاصله برای آرایش قطعات پروتئینی در کنارِ هم بر اساس نتایج حاصل از مرجع ۲۸ مقاله و چگالی واقعی اتصال نوکلئوپورین‌ها به سطح کانال NPC انجام شده است. شکل ۳ الف و ب نحوه آرایش این رشته‌ها را به صورت نما از بالا و کنار این آرایه را نشان می‌دهد. در این شبیه‌سازی نیز در حالت اولیه، پپتیدها به صورت کشیده در نظر گرفته شدند به طوری که ستون فقرات آنها در راستای محور z و عمود بر صفحه اتصال قرار گرفته‌اند. به این ترتیب آرایه 5×5 به عنوان حجم نماینده‌ای از ناپهایِ FG در کانال مرکزی NPC، مورد مطالعه شبیه‌سازی این تحقیق ما قرار گرفت.

در حالت تعادل، قطعات نشانده شده روی سطح با اینکه از حالت اولیه کاملاً کشیده شده مقداری جمع می‌شوند و ارتفاع آنها نسبت به حالت اولیه کاهش می­یابد، اما همچنان با حالتی کشیده و با تشکیل دسته‌هایی از چند قطعه در کنار هم ساختاری شبیه برس را به خود می‌گیرند (شکل ۳ پ). دلیل به وجود آمدن این ساختار برس مانند این است که برهمکنش حجم اشغالی بین قطعات باعث می‌شود با کنار هم قرار گرفتن به صورت موازی بیشترین حجم ممکن را برای آزادی خود داشته باشند و به این ترتیب با اتخاذ ساختار برس‌مانند آنتروپی سیستم بیشینه می‌شود. به همین دلیل به چنین ساختاری، برس آنتروپیک نیز گفته می‌شود. تشکیل این ساختار برس­مانند تأکیدی بر مدل دروازه مجازی پیشنهاد شده برای NPC است. همچنین در ساختار برس­مانند نهایی مشاهده می‌شود که دسته­های چندتایی تشکیل می­شود که فضای مناسب برای عبور مولکولهای کوچک را فراهم می­آورند. علاوه بر این در نتایج شبیه‌سازیها مشاهده شد که بیش از نصف تکرارهای FG روی سطح برس قرار می‌گیرند که یک محیط مناسب برای انتقال گیرنده‌های انتقالی را فراهم می­آورند.

 

جدول 2- توالیهای 25 قطعه Nsp1 که برای آرایه 5×5 استفاده می­شود.

نام توالی

     توالیNsp1

S1

100-1

S2

120-21

S3

140-41

S4

160-61

S5

180-81

نام توالی

توالیNsp1

S6

200-101

S7

240-141

S8

260-161

S9

280-181

S10

300-201

نام توالی

توالیNsp1

S11

320-221

S12

340-241

S13

360-261

S14

380-281

S15

400-301

نام توالی

توالیNsp1

S16

420-321

S17

440-341

S18

460-361

S19

480-381

S20

500-401

نام توالی

توالیNsp1

S21

520-421

S22

540-441

S23

560-461

S24

580-481

S25

600-501

 

 

(پ)

 

(ب)

 

(الف)

 

Å 26

 

Å 26

 

 

شکل ۳- طرح شماتیک آرایه 5×5 مربوط به ساختار برس‌مانند. الف) نما از بالا و ب) نما از کنار. اولین آمینواسید هر ۲۵ قطعه به سطح ثابت شده‌اند و فاصله بین قطعات Å 26 در نظر گرفته شده است. پ) ساختار برس­مانند بعد از رسیدن به حالت تعادلی. 25 قطعه با رنگهای مختلف نشان داده شده‌اند.

 

شبیه‌سازی آرایه‌ دسته‌جمعی برای دو اجرای مختلف با سری اعداد تصادفی متفاوت انجام شد و ارتفاع متوسط برس محاسبه شد. مقادیر به دست آمده برای میانگین ارتفاع تعادلی حاصل از این دو اجرا، به صورت Å 8۶/118 و Å 20/117 به دست آمد که این اعداد در مقایسه با مقادیر شعاع ژیراسیون به دست آمده برای قطعات منفرد، به مقدار قابل توجهی بزرگتر هستند و نشان می‌دهند که قطعات Nsp1 در کنار هم و به صورت دسته‌جمعی ساختارهای کشیده‌تری دارند کشیدگی قطعات Nsp1 به صورت عمود بر سطح کانال و به سمت محور کانال می‌باشد. نتایج پژوهشهای اخیر نشان داده‌اند که نوکلئوپورین‌ها درون کانال NPC، دو منطقه مجزا با ساختارهای مختلف تشکیل می‌دهند: برس‌مانند و ژل مانند. ساختار برس‌مانند در اطراف سطح کانال و ساختار ژل‌مانند در وسط کانال مرکزی مشاهده می‌شود.  نتایج این تحقیق تشکیل ساختار برس مانند برای آرایه‌ای متراکم از Nsp1ها را که به سطح کانال متصل شده‌اند، تأیید می‌کند.

با در نظر گرفتن تعداد تکرار‌های FG موجود در توالیهای سازنده ساختار برس­مانند و حجم جعبه متشکل از ساختار برس­مانند، چگالی تعداد FG برای این ساختار برس­مانند‌ به صورت 07/0 تعداد تکرار FG بر هر نانومتر مکعب محاسبه شد که به مقدار واقعی چگالی تکرار FG در NPC واقعی مخمر که 08/0 تعداد تکرار FG بر هر نانومتر مکعب گزارش شده، نزدیک می‌باشد (۵).

برهمکنش NTF2 با ساختار دسته‌جمعی: در این قسمت برهمکنش گیرنده‌ انتقالی  NTF2، با ساختار برس تعادلیِ حاصل از قسمت قبل بررسی می‌شود. گیرنده‌ انتقالی NTF2 یک پروتئین ۲۵۴ آمینواسیدی است که یکی از شناخته‌شده‌ترین گیرنده‌‌های انتقالیِ مسئول انتقال انتخابی از کانال مرکزی NPC محسوب می‌شود. بنابراین در ادامه در دو اجرا با سری اعداد مختلف و با پیکربندی اولیه متفاوت، مولکول NTF2 به ساختار برس­ متعادل شده از شبیه‌سازیهای قبلی اضافه ‌شد و تغییرات ارتفاع ساختار برس‌مانند و میزان نفوذ آن به درون ساختار بررسی شد.  تحولات زمانی مربوط به ارتفاع برس‌ و عمق نفوذ NTF2 به درون ساختار حاصل از این دو اجرا در شکل ۴ نشان داده شده است (NTF2+Brush1,2). همان طور که در قسمت الف شکل مشاهده می‌شود ارتفاع ساختار برس بعد از اضافه شدن NTF2 تا حدودی کاهش می‌یابد. این کاهش ارتفاع نشان می‌دهد که در کانال مرکزی NPC، ناپهایِ FG که در کنار هم با تشکیل ساختار برس­مانند  به صورت مانعی برای عبور محموله عمل می‌کنند، در اثر رویارویی با گیرنده‌های انتقالی مانند NTF2، دچار فروریختگی شده و در نتیجه محیطی مناسب برای عبور گیرنده‌های انتقالی را فراهم می­کنند.

شکل ۴ ب، عمق نفوذ گیرنده‌ انتقالی NTF2 اضافه‌شده به دو موقعیت مختلف ساختار برس­ را نشان می­دهد. همان طور که دیده می‌شود NTF2 تمایل به نفوذ به درون ساختار برس‌ دارد. در مطالعات قبلی نشان داده شده است که این گیرنده انتقالی در حالت تعادل، روی سطح خود دارای ۶ نقطه برای ایجاد برهمکنش آبگریزی با تکرارهای FG است (۱۴). در این تحقیقات نیز ساختار تعادلی شبیه‌سازی شده از  NTF2، وجود این ۶ نقطه اتصال روی سطح NTF2 تأیید گردید. علاوه بر این، تحول زمانیِ موقعیت فضایی NTF2 نسبت به آرایه برسی، تمایل این ۶ نقطه به برهمکنش با آرایه را به طور کیفی نشان می‌دهد. بنابراین دلیل حرکت NTF2 به درون ساختار برس­مانند می‌تواند مربوط به وجود نقاط اتصالی آبگریز روی سطح NTF2 باشد که با فنیل‌آلانینهای بیشمار موتیف تکرار FG در سطح ساختار برس برهمکنش آبگریزی دارند و به این ترتیب حرکت NTF2 به داخل ساختار برس تسهیل می‌شود.

برای آزمودن ضرورت اثر آبگریزی در ورود گیرنده‌‌های انتقالی به کانال مرکزی NPC،‌ به جای گیرنده‌ انتقالی یک پروتئین غیرگیرنده‌ با وزن مشابه NTF2 به نام اگزونوکلئاز بر روی ساختار برس تعادلی قرار داده شد. اگزونوکلئاز یک مولکول ۲۶۸ آمینواسیدی است و وزن مولکولی تقریباً مشابه با NTF2 دارد. بنابراین می‌توان مقایسه قابل اطمینانی بین نتیجه ارتفاع برس و عمق نفوذ این مولکول با NTF2 انجام داد. شکل ۴ الف تحولات زمانی ارتفاع برس بعد از اضافه شدن اگزونوکلئاز را نیز نشان می‌دهد. همان طور که در این شکل دیده می‌شود در مقایسه با NTF2، اگزونوکلئاز تغییر چندانی در ارتفاع برس ایجاد نمی‌کند. نمودار عمق نفوذ اگزونوکلئاز به درون ساختار برس (شکل ۴ ب) نیز نشان می‌دهد مولکول اگزونوکلئاز، تمایل چندانی به نفوذ ندارد که این موضوع به دلیل فقدان نقاط اتصالی کافی برای برهمکنشهای آبگریزی با توالیهای تکرار FG است.

 

 

(الف)

 


 

(ب)

 

شکل ۴- الف) تغییرات زمانی ارتفاع ساختارهای برس­مانند بعد از اضافه شدن NTF2 و اگزونوکلئاز. ب) عمق نفوذ مولکول NTF2 و اگزونوکلئاز به درون ساختارهای برس­مانند. نمودارهای سبز و آبی نتایج شبیه‌سازیهای مربوط به اضافه شدن NTF2 به برس در دو ارتفاع متفاوت از برس و نمودار قرمز نتیجه شبیه‌سازی مربوط به اضافه شدن اگزونوکلئاز به برس است.

 

بحث و نتیجه­گیری

 

(پ)

در این مقاله رفتار انفرادی و دسته‌جمعی قطعات Nsp1، به عنوان نماینده‌ای از پروتئینهای فرش کننده NPC، با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی (۱) در سطح درشت‌دانه برای مدت زمانی ۵ میکروثانیه مورد مطالعه قرار گرفت. مدل درشت‌دانه استفاده شده برای زنجیره پروتئینی دارای جزئیات مناسبی از خصوصیات هر آمینواسید است و تفاوت بین آمینواسید‌ها اعم از قدرت آبگریزی و برهمکنش هیدروژنی در این مدل به خوبی لحاظ شده است. نتایج این مطالعه نشان دادند که قطعات انفرادی Nsp1 از حالت اولیه کاملاً کشیده، به صورت ساختارهای تعادلی گلبولی در می‌آیند. با توجه به شعاع ژیراسیون به دست آمده برای حالت تعادلی این قطعات، چگالی تکرار FG در این قطعات مقدار 4۹/0 تکرار FG بر هر نانومتر مکعب محاسبه شد که چند مرتبه بزرگتر از مقدارِ اندازه‌گیری شده است. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که این پروتئینها در NPC متراکم‌تر هستند و در شرایط واقعی فضای محدودتری نسبت به پیکربندی درنظر گرفته شده در حالت انفرادی دارند.

بنابراین برای آزمودن این ادعا، رفتار دسته‌جمعی Nsp1 با شبیه‌سازی ۲۵ قطعه Nsp1 متصل شده به یک سطح صفحه‌ای در یک آرایه 5×5 مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج شبیه‌سازی‌ این تحقیق نشان داد که قطعات Nsp1، در کنار هم ساختاری کشیده به خود می‌گیرند. با درنظر گرفتن ارتفاع برس‌ها و تعداد تکرار‌های FG  قرار گرفته در کل سیستم، چگالی تکرار FG محاسبه شد که با مقدار چگالی واقعی تکرار FG اندازه‌گیری شده در NPC مخمر همخوانی دارد (۵).

در توضیح رفتار برس‌مانند مشاهده شده برای حالت دسته‌جمعی می‌توان گفت قطعات متصل شده نزدیک به هم در آرایه 5×5 برای کم کردن برهمکنشهای حجم اشغالی و حفظ آنتروپی خود، ساختار کشیده برس‌مانند را اتخاذ می‌کنند که این مشاهده فرضیه سد آنتروپی ارائه شده در مدل دروازه مجازی را حمایت می‌کند. در پژوهشهای آزمایشگاهی پیشین با روش AFM نیز ساختار برس‌‌مانند مشابهی برای ناپهای FG مشاهده شده بود (1۸ و 1۹). علاوه‌ بر این در نتایج شبیه‌سازی‌ مشاهده شد که بیش از نصف تکرارهای FG روی سطح برس قرار می‌گیرند که یک محیط مناسب برای انتقال گیرنده‌های انتقالی را فراهم می­آورند.

در نهایت، برای تکمیل بررسی سازوکار عبور محموله از خلال NPC، برهمکنش ساختارهای برس­مانند‌ تشکیل شده با گیرنده‌ انتقالی NTF2 و یک مولکول غیرگیرنده‌ اگزونوکلئاز نیز مورد مطالعه قرار گرفت که نتایج به دست آمده همخوانی خوبی با نتایج کارهای تجربی دارد (1۷). NTF2 علاوه بر اینکه باعث سقوط ارتفاع ساختار برس­مانند می‌شود، امکان ورود به درون ساختار برس را نیز پیدا ‌می‌کند. اما مولکول اگزونوکلئاز در مقایسه با NTF2 تغییر چندانی در ارتفاع برس ایجاد نمی‌کند، علاوه بر این نفوذ قابل توجهی به درون ساختار نیز از خود نشان نمی‌دهد. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که ساختار برس بین گیرنده‌ انتقالی NTF2 و مولکول غیرگیرنده‌ اگزونوکلئاز تبعیض قائل می‌شود. دلیل اصلی وارد شدن NTF2 به ساختار برس مانند، به خاطر برهمکنشهای آبگریزی بین نقاط اتصالی آبگریز در سطح NTF2 با فنیل‌آلانینهای تکرار FG می‌باشد. بنابراین حضور برهمکنشهای آبگریزی برای ورود گیرنده‌های انتقالی به درون ساختار برس‌مانند ضروری می‌باشد. به این ترتیب نتایج شبیه‌سازیهای این تحقیق نشان دادند که مدل دروازه مجازی می­تواند مدل پیشنهادی مناسبی برای سازوکار انتقال انتخابی از میان NPCها باشد.

ایجاد جهشهایی در ناپها نیز می تواند با تأثیر  بر روی ساختار و عملکرد NPC باعث  کاهش  یا از بین رفتن فعالیت آن شوند (۲). بنابراین  بررسی چگونگی تأثیر جهشها بر فعالیت و عملکرد NPC و همچنین  تجزیه و تحلیل ساختار  NPC  جهش یافته در تحقیقات آینده نیز ضروری به نظر می‌رسد.

۱- گنجعلی خانی. م.، رنجبر، م.، ۱۳۹۱. مطالعه دینامیک مولکولی و حرکات عملکردی آنزیم لیپازA از گونه باسیلوس سوبتیلیس. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی، جلد۲۷: ۲۹۶-۳۰۷
۲- صفرزاده .م.، پاژنگ، م. ، مهرنژاد، ف. ، دوستدار، ف. ، چاپارزاده، ن. ، ربیعی فرادنبه، د. ، یاری خسرو شاهی، ا. ، محمدپور، ا. ، ۱۳۹۴. بررسی نحوه تأثیر جهش‌ها بر غیر فعال شدن آنزیم پیرازین آمیداز با شبیه سازی دینامیک مولکولی. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی، جلد۲۸: ۲۶۶-۲۷۸
 
3.    Alber, F., Dokudovskaya, S., Veenhoff, L.M., Zhang, W., Kipper, J., Devos, D., Suprapto, A., Karni-Schmidt, O., Williams, R., Chait, B.T., Rout, M.P., and Sali, A., 2007. Determining the architectures of macromolecular assemblies. Nature, 450(7170): p. 683-694.
4.    Alber, F., Dokudovskaya, S., Veenhoff, L.M., Zhang, W., Kipper, J., Devos, D., Suprapto, A., Karni-Schmidt, O., Williams, R., Chait, B.T., Sali, A., and Rout, M.P., 2007. The molecular architecture of the nuclear pore complex. Nature, 450(7170): p. 695-701.
5.    Bayliss, R., Littlewood, T., Strawn, L.A., Wente, S.R., and Stewart, M., 2002. GLFG and FxFG Nucleoporins Bind to Overlapping Sites on Importin-β. Journal of Biological Chemistry. 277(52): p. 50597-50606.
6.    Beck, M., Förster, F., Ecke, M., Plitzko, J.M., Melchior, F., Gerisch, G., Baumeister, W., and Medalia, O., 2004. Nuclear Pore Complex Structure and Dynamics Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 306(5700): p. 1387-1390.
7.    Bereau, T. and Deserno, M., 2009. Generic coarse-grained model for protein folding and aggregation. The Journal of chemical physics, 130(23): p.235106-235106.
8.    Cronshaw, J.M., Krutchinsky, A.N., Zhang, W., Chait, B.T., and Matunis, M.J., 2002. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. The Journal of Cell Biology. 158(5): p. 915-927.
9.    Denning, D.P., Patel, S.S., Uversky, V., Fink, A.L., and Rexach, M., 2003. Disorder in the nuclear pore complex: The FG repeat regions of nucleoporins are natively unfolded. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100(5): p. 2450-2455.
10.  Frey, S., Richter, R.P., and Görlich, D., 2006. FG-Rich Repeats of Nuclear Pore Proteins Form a Three-Dimensional Meshwork with Hydrogel-Like Properties. Science. 314(5800): p. 815-817.
11.  Frey, S. and Görlich, D., 2007. A Saturated FG-Repeat Hydrogel Can Reproduce the Permeability Properties of Nuclear Pore Complexes. Cell. 130(3): p. 512-523.
12.  Gumbart, J., Wang, Y., Aksimentiev, A., Tajkhorshid, E., and Schulten, K., 2005. Molecular dynamics simulations of proteins in lipid bilayers. Current Opinion in Structural Biology. 15(4): p. 423-431.
13.  Isgro, T.A. and Schulten, K., 2005. Binding Dynamics of Isolated Nucleoporin Repeat Regions to Importin-β. Structure. 13(12): p. 1869-1879.
14.  Isgro, T.A. and Schulten, K., 2007. Association of Nuclear Pore FG-repeat Domains to NTF2 Import and Export Complexes. Journal of Molecular Biology. 366(1): p. 330-345.
15.  Isgro, T.A. and Schulten, K., 2007. Cse1p-Binding Dynamics Reveal a Binding Pattern for FG-Repeat Nucleoporins on Transport Receptors. Structure. 15(8): p. 977-991.
16.  Jamali, T., Jamali, Y., Mehrbod, M., and Mofrad, M.R.K., 2011. Chapter six - Nuclear Pore Complex: Biochemistry and Biophysics of Nucleocytoplasmic Transport in Health and Disease, in International Review of Cell and Molecular Biology, W.J. Kwang, Editor, Academic Press. p. 233-286.
17.  Jovanovic-Talisman, T., Tetenbaum-Novatt, J., McKenney, A.S., Zilman, A., Peters, R., Rout, M.P., and Chait, B.T., 2009. Artificial nanopores that mimic the transport selectivity of the nuclear pore complex. Nature. 457(7232): p. 1023-1027.
18.  Lim, R.Y.H., Huang, N.-P., Köser, J., Deng, J., Lau, K.H.A., Schwarz-Herion, K., Fahrenkrog, B., and Aebi, U., 2006. Flexible phenylalanine-glycine nucleoporins as entropic barriers to nucleocytoplasmic transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(25): p. 9512-9517.
19.  Lim, R.Y.H., Fahrenkrog, B., Köser, J., Schwarz-Herion, K., Deng, J., and Aebi, U., 2007. Nanomechanical Basis of Selective Gating by the Nuclear Pore Complex. Science. 318(5850): p. 640-643.
20.  Liu, S.M. and Stewart, M., 2005. Structural Basis for the High-affinity Binding of Nucleoporin Nup1p to the Saccharomyces cerevisiae Importin-β Homologue, Kap95p. Journal of Molecular Biology. 349(3): p. 515-525.
21.  Macara, I.G., 2001. Transport into and out of the Nucleus. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65(4): p. 570-594.
22.  Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., and Medalia, O., 2012. The Human Nuclear Pore Complex as Revealed by Cryo-Electron Tomography. Structure. 20(6): p. 998-1006.
23.  Miao, L. and Schulten, K., 2009. Transport-Related Structures and Processes of the Nuclear Pore Complex Studied through Molecular Dynamics. Structure. 17(3): p. 449-459.
24.  Miao, L. and Schulten, K., 2010. Probing a Structural Model of the Nuclear Pore Complex Channel through Molecular Dynamics. Biophysical Journal. 98(8): p. 1658-1667.
25.  Michael P. Routa , J.D.A., Adisetyantari Supraptoa, Kelly Hjertaasb, Yingming Zhaoa, and Brian T. Chaita., 2000. The Yeast Nuclear Pore Complex: Composition, Architecture, and Transport Mechanism. The Journal of cell biology. 148(4): p. 635-652.
26.  Morrison, J., Yang, J.-C., Stewart, M., and Neuhaus, D., 2003. Solution NMR Study of the Interaction Between NTF2 and Nucleoporin FxFG Repeats. Journal of Molecular Biology. 333(3): p. 587-603.
27.  Pemberton, L.F. and Paschal, B.M., 2005. Mechanisms of Receptor-Mediated Nuclear Import and Nuclear Export. Traffic. 6(3): p. 187-198.
28.  Peters, R., 2005. Translocation Through the Nuclear Pore Complex: Selectivity and Speed by Reduction-of-Dimensionality. Traffic. 6(5): p. 421-427.
29.  Suntharalingam, M. and Wente, S.R., 2003. Peering through the Pore. Developmental Cell. 4(6): p. 775-789.
30.  Yang, W. and Musser, S.M., 2006. Nuclear import time and transport efficiency depend on importin β concentration. The Journal of Cell Biology. 174(7): p. 951-961.